Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc và chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự tăng trưởng Thài lài tím (tradescantia pallida)

Đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật và ánh sáng đơn sắc lên sự tăng trưởng cây Thài lài tím (Tradescantia pallida)” nhằm các mục đích: tìm hiểu tác động của một số chất điều hòa tăng trưởng thực vật cũng như ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc LED lên sự tăng trưởng thông qua một số chỉ tiêu cụ thể và thông qua đó bước đầu tìm hiểu anthocyanin và một số hợp chất liên quan tổng hợp trong quá trình tăng trưởng in vitro ở cây Thài lài tím.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- -

DƯƠNG THỊ NGỌC ÁNH

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA TĂNG TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ ÁNH SÁNG ĐƠN SẮC LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG CÂY

THÀI LÀI TÍM (Tradescantia pallida)

KHÓA LUẬN CỬ NHÂN SINH HỌC NGÀNH SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: SINH LÝ THỰC VẬT

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC ThS PHAN NGÔ HOANG

TP HỒ CHÍ MINH - 2016

LỜI CẢM ƠN - -

Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Sinh lý Thực vật, Khoa Sinh học - Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố

Hồ Chí Minh

Để hoàn thành khóa luận này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất:

Thầy Phan Ngô Hoang, thầy đã luôn theo sát, hướng dẫn tận tình và động viên, cổ vũ em trong suốt thời gian ngoại khóa và định hướng, hướng dẫn em thực hiện đề tài này

TS Trần Thanh Hương - trưởng bộ môn Sinh lý thực vật, TS Đỗ Thường Kiệt - trưởng phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, thầy cô luôn giúp đỡ chúng em cả

về kiến thức và phương pháp cũng như các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

PGS.TS Bùi Trang Việt, PGS.TS Võ Thị Bạch Mai, PGS.TS Nguyễn Du Sanh, ThS Trịnh Cẩm Tú đã giảng dạy cho em những kiến thức bổ ích và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học

Quý Thầy Cô đang công tác tại khoa Sinh học - Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh đã luôn nhiệt tình giảng dạy cho em nhiều kiến thức cơ bản trong suốt thời gian qua

Em cảm ơn các anh chị: ThS Huỳnh Thị Xuân Quỳnh, Chị Hoàng Thị Thu Thấm, anh Lê Anh Tuấn, chị Trần Hoài Nguyên, chị Phạm Thị Hồng Ánh và chị Nguyễn Thị Kim Anh đã chia sẻ và giúp đỡ em rất nhiều

Các anh chị cao học khóa 23, 24, 25, các bạn nhóm chuyên ngành và tập thể lớp 12SHH luôn hỗ trợ động viên, chia sẻ với nhau trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn PTN vệ tinh của Trung tâm LAFTRC-CBNU (Hàn quốc) tại Trường ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐHQG-HCM; Công ty cổ phần bóng đèn phích nước Rạng Đông đã tài trợ thiết bị đèn LED sử dụng cho nghiên

cứu này

Con vô vùng biết ơn bố mẹ, người đã sinh thành, nuôi dưỡng và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con được theo đuổi điều con mong ước Em cảm ơn hai chị đã luôn bên cạnh, chia sẻ mọi khó khăn và động viên em trong suốt thời gian học tập

và cuộc sống xa nhà

TP Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2016

Dương Thị Ngọc Ánh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

MỤC LỤC 3

BẢNG CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT 6

DANH MỤC BẢNG 7

DANH MỤC HÌNH 8

DANH MỤC ẢNH 9

LỜI MỞ ĐẦU 10

TỔNG QUAN 12

1.1 Tổng quan về cây Thài lài tím 12

1.1.1 Phân loại 12

1.1.2 Đặc điểm hình thái 12

1.1.3 Tác dụng dược lý của Tradescantia pallida 13

1.1.4 Sơ lược về lịch sử nghiên cứu Tradescantia pallida 13

1.2 Nguồn sáng nhân tạo trong nghiên cứu thực vật và ứng dụng 14

1.2.1 Nguồn sáng nhân tạo 14

1.2.2 Ứng dụng đèn LED trong nghiên cứu quang hợp 14

1.3 Phát sinh hình thái thực vật 16

1.3.1 Khái niệm 16

1.3.2 Sự phát sinh chồi 17

1.3.3 Vai trò của ánh sáng trong phát sinh hình thái thực vật 18

1.3 Tăng trưởng ở thực vật 19

1.3.1 Thuật ngữ tăng trưởng 19

1.3.2 Các yếu tố tác động lên sự tăng trưởng thực vật 19

1.4 Các hợp chất biến dưỡng thực vật 23

1.4.1 Anthocyanin 23

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp anthocyanin 25

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 28

2.1 Vật liệu 28

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 28

2.1.2 Vật liệu sinh trắc nghiệm 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Ảnh hưởng của TDZ và chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên khả năng tạo cụm chồi 28

2.2.2 Ảnh hưởng của của TDZ và ánh sáng đơn sắc đèn LED lên sự phát sinh chồi 29

2.2.3 Sự tăng trưởng của Thài lài tím in vitro dưới nguồn sáng đơn sắc đèn LED 29

2.2.4 Ly trích và xác định hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh 30

2.2.5 Đo cường độ quang hợp, cường độ hô hấp 33

2.2.6 Quan sát hình thái giải phẫu 33

2.2.7 Ly trích và đo hàm lượng một số hợp chất thứ cấp 33

2.2.8 Xử lý số liệu 35

KẾT QUẢ 36

3.1 Ảnh hưởng của TDZ và chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên khả năng tạo cụm chồi 36

3.2 Ảnh hưởng của TDZ và ánh sáng đơn sắc đèn LED lên sự phát sinh chồi 40

3.3 Sự tăng trưởng của Thài lài tím in vitro dưới nguồn sáng đơn sắc đèn LED 45

THẢO LUẬN 55

1 Ảnh hưởng của TDZ và chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên khả năng tạo cụm chồi 55

2 Ảnh hưởng của TDZ và ánh sáng đơn sắc đèn LED lên sự phát sinh chồi 55

3 Sự tăng trưởng của Thài lài tím in vitro dưới nguồn sáng đơn sắc đèn LED 56

KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC 64

BẢNG CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

- -

DANH MỤC BẢNG

- -

Bảng 3.1.1 Số lượng chồi mới hình thành theo thời gian 36 Bảng 3.1.2 Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng nội sinh ở cụm chồi trên các

môi trường sau 4 tuần nuôi cấy 39

Bảng 3.2.1 Ảnh hưởng của TDZ và ánh sáng đơn sắc đèn LED lên sự hình

thành cụm chồi sau 2 tuần 42

Bảng 3.2.2 Ảnh hưởng của TDZ và ánh sáng đơn sắc đèn LED lên sự hình

thành cụm chồi sau 4 tuần 42

Bảng 3.2.3 Ảnh hưởng của TDZ và ánh sáng đơn sắc đèn LED lên sự hình

thành cụm chồi sau 6 tuần 43

Bảng 3.2.4 Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh ở cụm chồi in

vitro trên môi trường MS ½ bổ sung TDZ 0,05mg/l dưới các nguồn sáng khác

nhau 44

Bảng 3.3.1 Số rễ của cây Thài lài tím in vitro tăng trưởng trên môi trường MS

½ theo thời gian dưới các ánh sáng khác nhau 48

Bảng 3.3.2 Chiều dài rễ (cm) cây Thài lài tím in vitro tăng trưởng trên môi

trường MS ½ theo thời gian dưới các ánh sáng khác nhau 48

Bảng 3.3.3 Số lá của cây Thài lài tím in vitro tăng trưởng trên môi trường MS

½ theo thời gian dưới các nguồn sáng khác nhau 49

Bảng 3.3.4 Cường độ quang hợp và hô hấp của lá cây Thài lài tím in vitro tăng

trưởng trên môi trường MS ½ sau 4 tuần dưới các nguồn sáng khác nhau 49

Bảng 3.3.5 Trọng lượng tươi, trọng lượng khô cây in vitro tăng trưởng trên

môi trường MS ½ sau 4 tuần dưới nguồn sáng khác nhau 50

Bảng 3.3.6 Hoạt tính chất điêu hòa tăng trưởng thực vật nội sinh cây 4 tuần

tuổi tăng trưởng trên môi trường MS ½ dưới các nguồn sáng khác nhau 51

Bảng 3.3.7 Hàm lượng anthocyanin ở lá các cây in vitro tăng trưởng trên môi

trường MS ½ sau 4 tuần dưới các nguồn sáng khác nhau 53

DANH MỤC HÌNH

- -

Hình 1.1 Sắc tố quang hợp và trung tâm phản ứng (diệp lục tố a) 15

Hình 1.3 Các bước sóng ánh sáng và sự hấp thu các bước sóng bởi các loại sắc tố quang hợp và cường độ quang hợp của Anacharis sp 16

Hình 1.4 Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin 25

Hình 1.5 Hai con đường sinh tổng hợp anthocyanin 27

Hình 1.6 Sơ đồ ly trích chất điều hòa tăng trưởng nội sinh 31

Ảnh 3.2.1 Cụm chồi trên môi trường MS ½ bổ sung TDZ 0,05mg/l dưới ánh

sáng huỳnh quang sau 1 tuần (A), 2 tuần (B), 4 tuần (C) và 6 tuần (D) 40

Ảnh 3.2.2 Cụm chồi trên môi trường MS ½ bổ sung TDZ 0,05mg/l dưới ánh

sáng LED vàng (A), LED xanh (B), LED đỏ (C), LED hồng (D) sau 6 tuần 41

Ảnh 3.3.2 Cây Thài lài tím in vitro tăng trưởng trên môi trường MS ½ dưới

các nguồn sáng khác nhau: huỳnh quang (A), LED trắng (B), LED vàng (C),

LED đỏ (D), LED xanh (E) sau 4 tuần 46

Ảnh 3.3.3 Cây Thài lài tím in vitro tăng trưởng trên môi trường MS ½ dưới các

nguồn sáng khác nhau: huỳnh quang (A), LED trắng (B), LED vàng (C), LED

đỏ (D), LED xanh (E), sau 6 tuần 47

Ảnh 3.3.4 Cấu trúc lá cây in vitro sau 4 tuần tăng trưởng trên môi trường MS

½ dưới các nguồn sáng khác nhau: huỳnh quang (A), LED trắng (B), LED vàng

(C), LED xanh (D), LED đỏ (E) 52

LỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam có một nền y học dân tộc lâu đời với các tri thức sử dụng các loại dược liệu, các bài thuốc có giá trị dùng để chữa các bệnh thông thường và nan y Nền y học cổ truyền độc đáo đó bảo vệ sức khỏe cho dân tộc ta suốt chiều dài lịch

sử với phương châm "Nam dược trị nam nhân" Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), khoảng 80% dân số hiện nay trên thế giới vẫn dựa vào thuốc có nguồn gốc tự nhiên trong chăm sóc sức khoẻ cộng đồng

Tuy nhiên, hiện nay nguồn dược liệu trong tự nhiên đang bị khai thác nhanh chóng dẫn đến tình trạng nguy cơ khan hiếm một số loại dược liệu thông dụng Anthocyanin ngoài chức năng đem lại màu sắc cho thực vật còn có những lợi ích thiết thực cho sức khỏe con người nhờ có nhiều hoạt tính sinh học quý Các nghiên cứu gần đây tập trung vào hiệu quả điều trị ung thư của anthocyanin và các giá trị dinh dưỡng đối với cơ thể người và các hoạt tính sinh học của chúng

Bên cạnh nguồn nguyên liệu để li trích anthocyanin chủ yếu là rau, củ, quả

và các bộ phận khác của các loại thực vật như nho, các loại dâu, bắp cải tím, táo, củ cải rất đắt tiền và không đủ nguồn nguyên liệu cung ứng thì Thài lài tím cũng là một trong những nguyên liệu hữu hiệu không những trong công nghệ thực phẩm mà cả dược phẩm dược liệu trong tương lai

Nâng cao chất lượng cây giống đồng thời giảm giá thành sản xuất là mục tiêu hàng đầu mà các phòng thí nghiệm vi nhân giống đang hướng tới Tuy nhiên, hầu hết các phòng vi nhân giống lại đang sử dụng hệ thống đèn huỳnh quang tiêu tốn nhiều điện năng, chiếm khoảng không gian lớn và nhiều mặt hạn chế

Việc sử dụng ánh sáng đơn sắc trong nuôi cấy in vitro có thể khắc phục được

các nhược điểm mà hệ thống chiếu sáng truyền thống đang gặp phải Hơn nữa, hệ thống chiếu sáng đơn sắc này có thể cải thiện được chất lượng cây trồng, có nhiều

ưu thế hơn đến sự sinh trưởng, phát triển và các phản ứng sinh lý tích cực đối với nhiều loại cây trồng khác nhau Tuy vậy, việc xác định chất lượng tia sáng nào phù

hợp cho loài thực vật nào hay giai đoạn nào của một cá thể cụ thể sẽ là một vấn đề cần đặt ra để nghiên cứu một cách nghiêm túc

Đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật và ánh

sáng đơn sắc lên sự tăng trưởng cây Thài lài tím (Tradescantia pallida)” nhằm các

mục đích: tìm hiểu tác động của một số chất điều hòa tăng trưởng thực vật cũng như ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc LED lên sự tăng trưởng thông qua một số chỉ tiêu

cụ thể và thông qua đó bước đầu tìm hiểu anthocyanin và một số hợp chất liên quan

tổng hợp trong quá trình tăng trưởng in vitro ở cây Thài lài tím

TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Thài lài tím

1.1.1 Phân loại

Giới: Plantae Lớp: Magnoliopsida Bộ: Commelinales Họ: Commelinacea Chi: Tradescantia

Loài: T pallida Tên khoa học: Tradescantia pallida

Tên khác: trai tím, trai đỏ, trai thái lan,

Thài lài tím có nguồn gốc vùng vịnh Mexico, sau đó phân bố rộng khắp thế giới mà chủ yếu là châu Á, châu Mỹ Ngày nay, Thài lài tím được trồng ở nhiều nơi như một loại cây cảnh hay nguyên liệu cho những bài thuốc dân gian

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Thài lài tím thuộc cây thân thảo sống hằng năm, mọc nằm, bò dài 20-30cm, thân tía có sọc xanh Lá dày, đỏ ở mặt dưới, tím ở mặt trên, mép có lông dài, gân dễ thấy ở mặt dưới Cụm hoa ở ngọn thân, có 2 lá bắc to, hoa đỏ thắm, nở sớm mai đến trưa, dài 2cm, cánh hoa cỡ 1cm, chỉ nhị có ít lông (Võ Văn Chi, 2012)

Cây có nguồn gốc từ vùng bán nhiệt đới và ôn đới ẩm Ở Việt Nam, cây mọc

tự nhiên và rải rác trên các vùng núi, ven vách đá, chịu hạn tốt Cây có sức sống mạnh và sinh trưởng nhanh vào mùa mưa Ở vùng thiếu nước thân cây bò dài, rụng

lá và tàn lụi vào mùa khô Hoa Thài lài tím không có khả năng sinh sản Cây mới sẽ mọc lại lên từ phần rễ khi cây mẹ bị chết đi

Ảnh 1.1 Cây Thài lài tím

(Tradescantia pallida L.)

1.1.3 Tác dụng dược lý của Tradescantia pallida

Theo các sách Đông y ghi chép, thài lài tím là cây có tính hàn, vị ngọt mát, hơi có vị chát nhẹ Cây có thể giúp cơ thể thanh nhiệt, giải độc, khỏi bí tiểu, giảm

ho, táo bón, giảm thiểu mụn nhọt Cây còn giúp chữa các chứng đau đầu hay viêm cầu thận

 Một vài bài thuốc dân gian

Chữa đái buốt: Thài lài tím 30g, mộc thông 20g, mã đề 15g, rau má 12g Sắc lấy nước uống, chia ngày 3 lần, dùng 3- 5 ngày liên tiếp

Chữa kiết lỵ: Thài lài tím 25g, lá mơ 20g, vỏ quả lựu 10g, rau má 5g Sắc lấy nước uống, chia 3 lần trước khi ăn, dùng 5 ngày liên tiếp

Chữa táo bón: Thài lài tím 30g, lá khoai lang non 25g Hai nguyên liệu này rửa sạch đun sôi kĩ, ăn cả nước lẫn cái Ngày ăn 1 lần vào buổi sáng

Chữa mụn nhọt sưng đau: Thài lài tím 30g, lá sống đời 25g Hai nguyên liệu rửa sạch giã nhỏ, cho nước sôi để nguội khuấy đều, lọc lấy nước uống và bã đắp vào chỗ đau, ngày uống 2 lần, trong 3 ngày liên tiếp

1.1.4 Sơ lược về lịch sử nghiên cứu Tradescantia pallida

Elder Antonio Sousa Paiva và cộng sự (2003) đã nghiên cứu ảnh hưởng của

cường độ sáng lên hình thái giải phẫu và nội dung sắc tố của Thài lài tím Tradestica

pallida

SHI và cộng sự (1992) đã ly trích và đo hàm lượng anthocyanin từ

Tradestica pallida, bước đầu xem chúng như một phẩm màu tiềm năng

Ngoài ra Tradestica pallida có thể xem là một loài phát hiện ô nhiễm không

khí với khả năng phân biệt các khu vực ô nhiễm khác nhau chính xác tới 97,5% bằng các phân tích, chiếu xạ cho thấy hàm lượng các nguyên tố vi lượng độc hại (Nairo Massakazu Sumita và cộng sự 2003)

1.2 Nguồn sáng nhân tạo trong nghiên cứu thực vật và ứng dụng

1.2.1 Nguồn sáng nhân tạo

Ánh sáng là từ dùng để chỉ các bức xạ điện từ có bước sóng nằm trong vùng quang phổ nhìn thấy được bằng mắt thường (tức là từ khoảng 380 nm đến 720 nm) Giống như mọi bức xạ điện từ, ánh sáng có thể được mô tả như những đợt sóng hạt

chuyển động gọi là photon Ánh sáng do mặt trời tạo ra còn được gọi là ánh nắng

(hay còn gọi là ánh sáng trắng bao gồm nhiều ánh sáng đơn sắc biến thiên liên tục

từ đỏ đến tím) Ánh sáng có hai tính chất là sóng và hạt

Ánh sáng mặt trời là một dạng năng lượng (quang năng) thường được gọi là bức xạ hay năng lượng điện từ Năng lượng điện từ du hành trong không gian ở dạng sóng, khoảng cách giữa hai đỉnh sóng kề nhau được gọi là độ dài sóng, dãy sóng điện từ đầy đủ được gọi là phổ điện từ Mắt người có thể phân biệt được các màu khi chiếu ánh sáng qua lăng kính hay khi nhìn cầu vồng, đó là các màu: đỏ, cam, vàng, lục, lam, chàm, tím (theo độ dài sóng giảm dần, tức năng lượng tăng dần) Ánh sáng mặt trời giống như một làn mưa photon có độ dài sóng khác nhau,

mà mắt người chỉ nhìn thấy được một vùng hẹp Năng lượng ánh sáng tỉ lệ nghịch với độ dài sóng Trong các phản ứng quang hóa, mỗi phân tử (của một chất) nhận một photon, để chuyển sang trạng thái kích hoạt và tham gia vào phản ứng (Bùi Trang Việt, 2005) Ánh sáng – một nhân tố quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, nó tham gia vào nhiều quá trình sinh lý của thực vật mà cơ bản nhất là quá trình quang hợp, ngoài ra còn có quang phát sinh hình thái, đáp ứng hướng sáng

1.2.2 Ứng dụng đèn LED trong nghiên cứu quang hợp

Quang hợp là quá trình tổng hợp nhờ ánh sáng của thực vật, tảo và một số vi khuẩn để tạo ra các hợp chất carbon phục vụ bản thân cũng như làm nguồn thức

ăn cho hầu hết các sinh vật trên trái đất Về bản chất hóa học, quang hợp là quá trình oxy hóa khử, trong đó H2O bị oxy hóa và CO2 bị khử, năng lượng dùng cho quá trình này là quang năng và sản phẩm tạo ra là các hợp chất hữu cơ Có thể khái quát quang hợp bằng phương trình sau:

Phân tử (CH2O)n là năng lượng để xây dựng và tổng hợp các thành phần khác trong cơ thể thực vật

Các bước sóng ánh sáng được sử dụng trong quang hợp chỉ là một phần nhỏ của toàn bộ quang phổ điện từ Ở thực vật bậc cao, ánh sáng đỏ, tím, xanh điều khiển quá trình quang hợp hiệu quả nhất Những màu này nằm trong vùng ánh sáng khả kiến có bước sóng trong khoảng từ 380 đến 750 nm Khả năng kích thích các electron của ánh sáng liên quan đến bước sóng hơn là cường độ của chùm sáng nên chỉ có một phần nhỏ ánh sáng được thực vật thực sự hấp thu Do đó có thể loại bỏ một số loại bước sóng không cần thiết bằng cách sử dụng nguồn sáng đơn sắc từ đèn LED (Light emitting diodes)

Ánh sáng

Hình 1.1 Sắc tố quang hợp và trung tâm phản ứng (diệp lục tố a)

Ngoài ra, chiếu sáng LED so với các nguồn chiếu sáng khác có những ưu điểm cơ

bản sau:

- Hiệu suất năng lượng sinh học cao: quang hợp của cây chủ yếu ở bước sóng

610 – 720 nm, hấp thụ sinh lý khoảng 55% và ở bước sóng ánh sáng xanh (400- 510 nm) hấp thụ sinh lý khoảng 8% Các độ dài bước sóng khác hoặc ít tác dụng đến các quá trình quang hợp hoặc gây hại đến sự sinh trưởng cuả cây

- Tiết kiệm điện năng: sử dụng đèn LED cho hiệu quả tiết kiệm 50- 80% lượng điện tiêu thụ

- Phát sinh cơ quan trực tiếp: chồi nách, chồi ngọn,

Hình 1.3 Các bước sóng ánh sáng và sự hấp thu các bước sóng bởi các loại sắc

tố quang hợp và cường độ quang hợp của Anacharis sp

- Phát sinh cơ quan gián tiếp bao gồm sự hình thành chồi và rễ trực tiếp từ mẫu cấy không thông qua giai đoạn mô sẹo

Phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc vào hai quá trình căn bản:

- Sự điều hòa hướng kéo dài tế bào

- Sự kiểm soát vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia tế bào

Chính kiểu tăng trưởng của mọi tế bào riêng rẽ quyết định hình thái cơ quan

Các chồi nách thường bị cản phát triển do bị chồi ngọn ức chế (hiện tượng

ưu thế ngọn) Hiện tượng này có thể là do auxin tổng hợp ở ngọn di chuyển xuống chồi nách và cản sự phát triển của chồi nách Hoặc có sự cạnh tranh dinh dưỡng (chồi ngọn thu hút dinh dưỡng mạnh về phía nó) Hoặc auxin kích thích sự tiết chất cản (ethylene hoặc ABA) cản sự phát triển chồi

Các chồi bên có thể được cảm ứng phát triển bằng việc loại bỏ ưu thế ngọn

Cắt bỏ chồi ngọn để chồi nách phát triển Trong nuôi cấy in vitro, các chồi nách có

thể được kích thích phát triển mạnh bỏi việc bổ sung cytokinin vào môi trường Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu thế ngọn để các chồi bên phát triển

 Sự hình thành chồi bất định

Chồi bất định không chỉ liên hệ với mô phân sinh chóp (ngọn) mà còn có thể xuất hiện gần vết thương, gần chỗ vết cắt, gần vùng phát sinh libe - mộc hoặc ngoài biểu bì, vì vậy, chồi có thể có nguồn gốc nội sinh hay ngoại sinh do sự khử phân hóa các tế bào trưởng thành Chúng cũng khởi sự bằng những phân chia tế bào và

sắp xếp tế bào giống như mô phân sinh ngọn và có mạch gắn liền với mạch của thân (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001)

Trước khi phân hóa để hình thành tầng phát sinh chồi, tế bào đã phân hóa phải trải qua quá trình tái hoạt động Sự tái hoạt động trải qua hai giai đoạn: khử phân hóa và tái phân hóa

- Trong giai đoạn khử phân hóa, tế bào tái lập hoạt tính phân chia, tế bào đã

phân hóa bắt đầu phân chia, ti thể và lạp thể tạo thành các bóng nhỏ, tiểu hạch lớn dần, các cơ quan bên trong tế bào biến đổi trở về trạng thái của các tế bào mô phân sinh thứ cấp

- Sau đó, tế bào tiếp tục phân chia, không bào phân đoạn, kích thước tế bào

giảm dần, vách mỏng, tế bào chất đậm đặc, tiểu hạch và hạch nhân rất lớn, tế bào chuyển sang trạng thái tế bào mô phân sinh sơ cấp có khả năng sinh cơ quan

- Trong giai đoạn tái phân hóa, đầu tiên, không bào trương nước hợp thành không bào trung tâm, tế bào tăng kích thước, ti thể có dạng đặc trưng dần, tế bào trở lại trạng thái tế bào mô phân sinh cấp 2 hoạt động; sau đó, các lạp phân hóa, tổng hợp các chất, tế bào phân hóa

1.3.3 Vai trò của ánh sáng trong phát sinh hình thái thực vật

Sự phát sinh hình thái thực vật bị ảnh hưởng bởi các nhân tố của môi trường như: tuổi mô cấy, môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, CO2, chất dinh dưỡng, chất lượng ánh sáng, thời gian và cường độ chiếu sáng

Quang phát sinh hình thái là quá trình kiểm soát sự sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái của thực vật dưới ánh sáng Debergh và cộng sự (1992) và Ziv (1991) đã chứng minh rằng cường độ chiếu sáng có tác dụng điều hòa kích thước lá

và thân cũng như con đường phát sinh hình thái đồng thời ảnh hưởng đến sự hình thành sắc tố và thủy tinh thể của cây con Chất lượng ánh sáng có ảnh hưởng quan trọng trên một số đặc tính hình thái như sự kéo dài ở cây Cúc và cây Cà chua (Mortensen và Stromme, 1987), sự hình thành chồi bất định ở cây Nho (Chee, 1986;

Chee và Pool, 1989), hình thái giải phẫu lá và kích thước lá ở cây Phong (Soebo và

cộng sự, 1995) và sự phát sinh rễ giả ở cây Lê (Bertazza và cộng sự, 1995)

1.3 Tăng trưởng ở thực vật

1.3.1 Thuật ngữ tăng trưởng

Tăng trưởng là sự gia tăng không hoàn nghịch về kích thước (chiều dài, chiều rộng, diện tích, thể tích) hay trọng lượng (tươi hay khô) Trong một cơ thể đa bào, sự tăng trưởng xảy ra nhờ sự phân chia tế bào (gia tăng số tế bào) và gia tăng kích thước tế bào (sự kéo dài tế bào) Sự phân chia tế bào xảy ra ở mô phân sinh, sự tăng kích thước tế bào xảy ra theo mọi hướng nhưng thường hơn tế bào kéo dài theo trục dọc cơ thể, vùng kéo dài của thân không ngừng kéo dài ra Ở đơn tử diệp, sự tăng trưởng theo đường kính được thực hiện nhờ sự phát triển của các tổ chức sơ cấp có nguồn gốc từ mô phân sinh ngọn Thuật ngữ tăng trưởng để chỉ các biến đổi xảy ra ở các cơ quan dinh dưỡng (rễ, thân, lá) và ở các cơ quan sinh sản (hoa, trái, hột) (Bùi Trang Việt, 2000)

Trong quá trình tăng trưởng, cơ thể thực vật cũng không ngừng phân hóa tạo những thay đổi về chất Hơn nữa, hai hiện tượng này xảy ra đồng thời trong cơ quan hay cơ thể thực vật Sự tăng trưởng ở mức độ nào đó luôn bao gồm sự phân hóa ở mức thấp hơn (Bùi Trang Việt, 2000)

1.3.2 Các yếu tố tác động lên sự tăng trưởng thực vật

 Ánh sáng

Tổng lượng ánh sáng mà cây thu nhận trong suốt quá trình chiếu sáng có tác động trực tiếp lên quang hợp, sự tăng trưởng và năng suất của cây Mức độ ảnh hưởng của yếu tố ánh sáng tới thực vật phụ thuộc vào cả cường độ, chất lượng và thời gian chiếu sáng (Dương Tấn Nhựt, 2011)

 Chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Thuật ngữ chất điều hòa tăng trưởng thực vật được dùng để chỉ một cách tổng quát những hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật

và các hợp chất nhân tạo) có tác dụng kích thích hay cản, nói cách khác là làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở nồng độ thấp Chúng không phải là chất dinh dưỡng, tức những vật liệu cung cấp năng lượng hay những nguyên tố khoáng

Ở thực vật, các chất điều hòa tăng trưởng bao gồm chất điều hòa tăng trưởng nội sinh và ngoại sinh Tìm hiểu về các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh cần ly trích, cô lập trên một hay nhiều vật liệu thực vật khác nhau Để ly trích các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh, người ta thay đổi pH của dịch hòa tan

và các dung môi thích hợp (ether, butanol bão hoà nước), trước khi áp dụng các phương pháp sắc kí để cô lập

Sinh trắc nghiệm dựa vào tác động riêng biệt của mỗi nhóm hormone chuyên biệt: Sự kéo dài khúc cắt diệp tiêu lúa để đo hoạt tính auxin; sự tăng trưởng trụ hạ diệp cây mầm xà lách (giberelin), sự tăng trưởng lá mầm dưa leo (cytokinin), sự tách rời các khúc cắt vùng rụng (acid abscisic), hay ứng động của cuống lá cà chua (etilen)

Việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa tăng trưởng thực vật như auxin, cytokinin và giberelin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng, bản chất của các chất điều hòa tăng tưởng thực vật (Bùi Trang Việt, 2000)

Auxin là một chất điều hòa tăng trưởng thực vật điển hình cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên có vai trò quan trọng trong sự phát triển hình thái thực vật Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn

và lóng) và lá non (tức các nơi có sự phân chia tế bào nhanh), trừ tryptophan được tổng hợp trong lá trưởng thành dưới ánh sáng, sau đó auxin di chuyển xuống rễ và tích tụ trong rễ

Auxin có tác động mạnh mẽ lên sự tăng trưởng của tế bào, sự acid hóa vách

tế bào, cảm ứng sự phân chia tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo, sự phát triển

rễ và kích thích sự phân hóa mô dẫn (Bùi Trang Việt, 2000)

Sự di chuyển của auxin có vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và phân hóa Sự vận chuyển thụ động (không trực tiếp cần năng lượng), không có tính hữu cực (lên hay xuống trong cơ thể thực vật) chủ yếu trong mô libe Ngoài ra, theo sự

định hướng của mô, hầu như mọi tế bào sống đều ít có khả năng vận chuyển auxin theo hướng hữu cực (từ ngọn đến gốc) theo mô hình hóa thẩm thấu cần năng lượng

Auxin (phối hợp với cytokinin) giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô Tuy nhiên, ở nồng độ cao, auxin cản sự phát triển của các phác thể chồi vừa được thành lập hay của chồi nách; các chồi đi vào trạng thái tiềm sinh Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ (phác thể non của rễ), nhưng cản sự tăng trưởng của các sơ khởi này

Trong nuôi cấy in vitro, tùy theo mục đích mà lựa chọn loại và nồng độ

auxin thích hợp: cần xem xét kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu, hàm lượng auxin của mẫu cấy, sự tác động qua lại giữa auxin nội sinh và ngoại sinh

có cytokinin ngoại sinh Cytokinin giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein Trong thân và rễ, cytokinin cản sự kéo dài, nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào (sự tăng trưởng củ)

Tỉ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô Đối với sự phát sinh phôi, tạo mô sẹo và rễ cần có tỉ lệ auxin/cytokinin cao, ngược lại thường kích thích sinh sản chồi bất định và chồi nách Hiệu quả khác nhau của việc sử dụng cytokinin phụ thuộc vào đối tượng, nồng độ và tỉ lệ của nó

trên auxin Trong nuôi cấy in vitro, cytokinin cần cho sự phân hóa chồi từ mô sẹo

của cytokinin trong môi trường còn có thể ức chế sự hình thành rễ và sự kéo dài chồi (Bùi Trang Việt, 2000) Ở nồng độ cytokinin cao sẽ đưa đến kết quả là tạo thành các cụm chồi Tuy nhiên số lượng chồi hình thành là tùy thuộc vào nồng độ cytokinin

TDZ (N- phenyl-N’-1,2,3 - thidiazol-5-ylurea) là một hợp chất thay thế phenyllurea, được dùng trong thu hoạch cơ giới cây bông vải, ngày nay được sử

dụng như một chất điều hòa sinh học hiệu quả trong sự phát sinh hình thái in vitro ở

nhiều loài thực vật TDZ là chất có tác dụng của cả auxin và cytokinin lên sự phân hóa của các mẫu nuôi cấy tuy về cấu trúc nó khác hoàn toàn với auxin và cytokinin gốc purine Trong phân tử TDZ có hai nhóm chức là phenyl và thidiazol, thay thế một trong hai nhóm chức dẫn đến thay đổi hoạt tính của TDZ Tuy nhiên cơ chế hoạt động của TDZ chưa được biết rõ nhưng nhiều công trình nghiên cứu cũng cho thấy TDZ có thể hoạt động giống như chất điều hòa tăng trưởng thực vật (Murthy

và cộng sự, 1998)

 Giberelin

Giberelin là một terpenoid, kiểm soát hướng đặt của vi sợi celluloz trong vách tế bào giúp kéo dài tế bào Giberelin được tạo ra trong những lá non, các cực của thân rễ, trong phôi của những hạt đang nảy mầm (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001) Giberelin kích thích sự kéo dài tế bào do hạ thấp nồng độ Ca2+ trong vách do đó giúp sự kéo dãn vách, vì Ca2+ cản sự kéo dài vách ở dicot (không cản ở monocot) Giberelin kích thích mạnh sự phân chia của tế bào nhu mô vỏ và biểu bì, sự phân chia tế bào mô phân sinh lóng, kéo dài các tế bào dẫn xuất từ mô phân sinh lóng Giberelin kích thích sự tăng trưởng chồi, gỡ sự ngủ của chồi và phôi, cảm ứng nhiều cây tăng trưởng nhanh và trổ hoa, kích thích sự tăng trưởng trái của một số loài

Acid abscisis được sản xuất ở hầu hết các bộ phận của cây: rễ, lá trưởng thành, trái non và hột (Bùi Trang Việt, 2000)

Là chất đối kháng của giberelin, acid abscisic cản sự nảy mầm, kéo dài sự ngủ của chồi và hột, làm chậm sự kéo dài lóng Acid abscisic cản sự tăng trưởng của diệp tiêu và mô nuôi cấy (đối nghịch với auxin) (Bùi Trang Việt, 2000) Mặc dù ABA tham gia vào nhiều quá trình sinh lý của toàn bộ cây và được coi là một chất

ức chế tăng trưởng thực vật, do đó nó được sử dụng như một chất làm chậm tăng trưởng trong nuôi cấy mô thực vật Tuy nhiên, các tác giả khác nhau đã chỉ ra rằng trong khi ABA ngoại sinh một mình ngăn chặn sự tái sinh chồi, khi thêm vào một

hệ thống nuôi trồng kết hợp với chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác, nó có tác dụng thúc đẩy (Manoj K Rai và cộng sự, 2011)

1.4 Các hợp chất biến dưỡng thực vật

Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm có giá trị Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002) Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside

Các glycoside bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm và dược phẩm (Lee, 2001)

1.4.1 Anthocyanin

Anthocyanin là hợp chất màu hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên, thuộc nhóm flavonoid, có màu đỏ, đỏ tía, tạo màu cho cả bề mặt, viền sọc, hay các vết đốm trên các bộ phân khác nhau của cây, đặc biệt ở thân, lá, hoa, quả Chúng được tìm thấy

trong không bào của tế bào biểu bì, mô mạch dẫn (Hooijmaijers và cs 2007) Dựa vào các nhóm OH của vòng B, có ba nhóm anthocyanin chính được tìm thấy trong thiên nhiên là pelargonidin, cyanidin và delphinidin Methyl hóa cyanidin và delphinidin tạo ra thêm ba nhóm anthocyanin bổ sung nữa là peonidin, petudin và malvidin Trong các chất màu thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên thì anthocyanin là

họ màu phổ biến nhất và tìm thấy được trong nhiều loại rau, hoa, quả, hạt có màu từ

đỏ đến tím như: quả nho, quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, hoa hibicut, đậu đen, quả cà tím, gạo nếp than, gạo đỏ

Theo các nghiên cứu khoa học được công bố trong những năm gần đây, anthocyanin còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quí như: khả năng chống oxy hóa cao nhờ hạn chế sự hình thành các gốc tự do, tăng cường sức đề kháng, có tác dụng làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư; tác dụng chống các tia phóng xạ

Sinh tổng hợp anthocyanin ở lá được tăng cường để đáp ứng với stress môi trường: hạn, ánh sáng mạnh, UV-B, nhiệt độ cao, thiếu nitơ và photpho, nhiễm nấm

và vi khuẩn, tổn thương, côn trùng, ô nhiễm (Winkel-Shirley 2002) Chúng còn giữ vai trò rất quan trọng trong tế bào thực vật: tạo điều kiện cho sự thụ phấn và phát tán hạt nhờ màu sắc sặc sỡ trên cánh hoa và quả

Anthocyanin là những glucozit do gốc đường glucose, glactose và một số gốc khác kết hợp với gốc aglucon có màu (anthocyanidin), (hình 1.4) Các gốc đường có thể được gắn vào vị trí 3, 5, 7; thường được gắn vào vị trí 3 và 5 còn vị trí

7 rất ít Phân tử anthocyanin gắn được vào vị trí 3 gọi là monoglycozit, ở vị trí 3 và

5 gọi là diglycozit

Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh tế hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực Màu sắc của anthocyanin luôn thay đổi phụ thuộc vào pH, các chất màu có mặt và nhiều yếu tố khác, tuy nhiên màu sắc của anthocyanin thay đổi mạnh nhất phụ thuộc pH môi trường Thông thường khi pH <

7 các anthocyanin có màu đỏ, khi pH > 7 thì có màu xanh Ở pH = 1 các anthocyanin thường ở dạng oxonium màu cam đến đỏ, ở pH = 4 ÷ 5 chúng có thể chuyển về dạng bazo cacbinol hay bazo chalcon không màu, ở pH = 7 ÷ 8 lại về dạng bazo quinoidal anhydro màu xanh (Huỳnh Thị Kim Cúc và cộng sự, 2004)

Có hai con đường sinh tổng hợp anthocyanin: Cả hai con đường đều bắt đầu

từ acetat (có 2 đơn vị cacbon) có nguồn gốc từ quang hợp Con đường thứ nhất là con đường acid shikimic để tạo ra amino acid phenylalanine (hình 1.5) Con đường khác là từ acetat ( có 2 đơn vị Cacbon) tạo ra 3 Malonyl CoA (có 3 đơn vị cacbon) Hai con đường này được liên kết với nhau bởi enzyme (CHS) để tạo ra Chalcone sau đó là tạo ra naringenin và cuối cùng tạo ra anthocyanin Có hơn 5 enzyme cần thiết tham gia tổng hợp anthocyanin Bất kỳ sự gián đoạn sinh tổng hợp enzyme nào

do di truyền hay do môi trường đều ngưng sản xuất anthocyanin

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp anthocyanin

Hàm lượng anthocyanin tích lũy càng tăng khi nồng độ đường tăng cao trong môi trường nuôi cấy Khi bổ sung sucrose vào trong môi trường nuôi cấy tế bào nho

Hình 1.4 Cấu trúc cơ bản aglucon của anthocyanin

(Huỳnh Thị Kim Cúc và cộng sự, 2004)

diện nồng độ đường cao cũng cảm ứng sinh tổng hợp anthocyanin ở nhiều loài thực vật khác (Shlatmann và cộng sự, 1994) Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thông thường để cảm ứng tạo anthocyanin trong nuôi cấy tế bào, auxin và cytokinin được sử dụng riêng rẽ hay kết hợp Các auxin như 2,4-D, AIA, NAA thường được

sử dụng riêng rẽ hay phối hợp với BA, hay Kinetin (Mori và cộng sự, 1993; Mori và Sakurai, 1994; Ozeki và Komanine, 1986)

Hình 1.5 Hai con đường sinh tổng hợp anthocyanin

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Cây Thài lài tím (Tradescantia pallida L.) thu hái tại khu du lịch Bửu Long,

tỉnh Đồng Nai

Ảnh 2.1 Cây Thài lài tím trong tự nhiên

2.1.2 Vật liệu sinh trắc nghiệm

Auxin – ABA: diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.)

Cytokinin: tử diệp dưa chuột (Cucumis sativus L.)

Giberellin: cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Ảnh hưởng của TDZ và chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên khả năng tạo cụm chồi

Khúc cắt thân mang chồi ngủ dài 1cm tăng trưởng trên môi trường MS ½, sau10 ngày được cô lập và đặt cấy vào các môi trường:

Mẫu cấy được đặt trong điều kiện ánh sáng với cường độ 45µmol photon/m2/s (12/12), nhiệt độ 27 ± 2oC, ẩm độ không khí 65 ± 5 % Ghi nhận số chồi mới hình thành trên mẫu cấy theo thời gian

2.2.2 Ảnh hưởng của của TDZ và ánh sáng đơn sắc đèn LED lên sự phát sinh

chồi

Khúc cắt thân mang chồi ngủ dài 1cm được khử trùng và đặt cấy vào các môi trường MS ½; MS ½ bổ sung TDZ 0,05 hoặc 0,1mg/l và nuôi cấy dưới điều kiện nguồn sáng

Đèn huỳnh quang có 3 đỉnh hấp thu ở các bước sóng 436 nm, 544 nm và 610

nm (λ436; λ544; λ610)

Đèn LED vàng có 2 đỉnh hấp thu ở bước sóng 453 nmvà 601 nm (λ453; λ601)

Đèn LED hồng có 2 đỉnh hấp thu ở bước sóng 459 nm và 658 nm (λ459; λ658)

Đèn LED xanh có đỉnh hấp thu ở bước sóng 445 nm (λ445)

Đèn LED đỏ có đỉnh hấp thu ở bước sóng 675 nm (λ675)

Mẫu cấy được đặt trong điều kiện ánh sáng với cường độ 45µmol photon/m2/s (12/12), nhiệt độ 27 ± 2oC, ẩm độ không khí 65 ± 5 %

2.2.3 Sự tăng trưởng của Thài lài tím in vitro dưới nguồn sáng đơn sắc đèn

LED

Khúc cắt thân mang chồi ngủ 10 ngày tuổi tăng trưởng trên môi trường MS

½, các chồi có cùng chiều cao, số lá mở được cô lập và đặt cấy vào môi trường MS

½ Mẫu cấy được theo dõi tăng trưởng dưới các điều kiện nguồn sáng:

Huỳnh quang có 3 đỉnh hấp thu ở các bước sóng 436 nm, 544 nm và 610 nm (λ436; λ544; λ610)

Đèn LED trắng có 2 đỉnh hấp thu ở bước sóng 451 nm và 558 nm (λ451; λ558) Đèn LED vàng có 2 đỉnh hấp thu ở bước sóng 453 nmvà 601 nm (λ453; λ601)

Đèn LED xanh có đỉnh hấp thu ở bước sóng 445 nm (λ445)

Đèn LED đỏ có đỉnh hấp thu ở bước sóng 675 nm (λ675)

Mẫu cấy được đặt trong điều kiện ánh sáng với cường độ 45µmol photon/m2/s (12/12), nhiệt độ 27 ± 2oC, ẩm độ không khí 65 ± 5 %

Các chỉ tiêu tăng trưởng cần xác định gồm: số rễ, chiều dài rễ, số lá được ghi nhận theo thời gian; trọng lượng tươi, khô và hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh được ghi nhận tại thời điểm 4 tuần nuôi cấy

2.2.4 Ly trích và xác định hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội

sinh

Hoạt tính của các chất auxin (AIA), cytokinin (zeatin), giberelin (GA3) và acid abscisic (ABA) xác định thông qua sinh trắc nghiệm (Bùi Trang Việt, 1989)

 Ly trích chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Các chất điều hoà tăng trưởng nội sinh của cụm chồi từ chồi ngủ cô lập 4 tuần tuổi trên ba môi trường MS ½, MS ½ bổ sung TDZ 0,05mg/l và MS ½ bổ sung IAA 1mg/l kết hợp BA 1mg/l; cụm chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ 4 tuần tuổi

trên môi trường MS ½ bổ sung TDZ 0,05mg/l và cây in vitro 4 tuần tuổi trên môi

trường MS ½ nuôi dưới các điều kiện nguồn sáng khác nhau được ly trích và phân đoạn

Nghiền 1g mẫu vật trong 40ml methanol 80% và ngâm trong 24 giờ Lọc và rửa 2 lần với methanol 80% Dịch lọc được cô cạn

Sự ly trích và phân đoạn được tiếp tục theo sơ đồ:

Dịch eter

B

Dịch nổi B

Nghiền Ngâm methanol 80% 24 giờ, lọc 3 lần

Cô cạn, còn 1ml + H 2 O = 10ml

Chỉnh pH 2,5

Sắc kí bản mỏng Sinh trắc nghiệm zeatin

Lóng KHCO 3 8%,

2 lần

Khóa luận cử nhân Sinh học - 2016

Sắc ký: xác định vị trí auxin, cytokinin, giberelin và ABA được thực hiện bằng phương pháp sắc ký bản mỏng silicagel (F254) để phân tác các chất điều hoà tăng trưởng thực vật, với hệ dung môi di chuyển là Isopropanol : Amoni hydroxid :

H2O (tỷ lệ theo thể tích 10:1:1), thực hiện ở nhiệt độ 30 ± 2°C

 Sinh trắc nghiệm

Hoạt tính auxin và acid abscisic được đo bằng sinh trắc nghiệm khúc cắt diệp

tiêu lúa (Oryza sativa L.) Hạt lúa gieo trên bông gòn ẩm trong tối ở nhiệt độ 28±

20C sau 3 ngày tách lấy diệp tiêu trong phòng tối Khúc cắt diệp tiêu trong các sinh trắc nghiệm được để trong tối nhiệt độ 28 ± 20C và đo chiều dài sai biệt sau 24 giờ Hoạt tính auxin tỷ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài khúc cắt diệp tiêu so với dung dịch chuẩn IAA tinh khiết 1 mg/L Hoạt tính acid abscisic tỷ lệ nghịch với sự sai biệt chiều dài khúc cắt diệp tiêu so với dung dịch chuẩn ABA tinh khiết 1 mg/L

Hoạt tính cytokinin được đo dựa trên sự gia tăng trọng lượng tươi của tử diệp

dưa chuột (Cucumis sativus L.) Hạt dưa chuột được gieo trên bông ẩm,đặt trong

tối, nhiệt độ 28 ± 20C, khi rễ mầm vừa nhú ra khỏi vỏ hạt, thu các tử diệp Tử diệp dưa chuột trong các sinh trắc nghiệm được để dưới ánh sáng liên tục 2500 ± 500 lux, nhiệt độ 28 ± 20C, đo trọng lượng sai biệt sau 48 giờ Hoạt tính cytokinin tỷ lệ thuận với trọng lượng sai biệt của tử diệp dưa chuột so với chuẩn là nước cất và BA tinh khiết 1 mg/L

Hoạt tính giberelin được đo bằng sinh trắc nghiệm cây mầm xà lách (Lactuca

các hạt có rễ vừa nhú ra khỏi vỏ Cây mầm xà lách trong các sinh trắc nghiệm được

để dưới ánh sáng liên tục 2500 ± 500 lux, nhiệt độ 28 ± 20C, đo chiều dài sai biệt