NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN hóa học PHÂN đoạn ít PHÂN cực ở cây cà NA (elaeocarpus hygrophilus kurz), họ côm (elaeocarpaceae) ở hậu GIANG

LỜI CẢM ƠN ----- Trong quá trình thực hiện luận văn, để có được kết quả như hôm nay ngoài sự nổ lực của bản thân thì tôi đã nhận được sự quan tâm, hướng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô

BỘ MÔN SƯ PHẠM HÓA HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Ngành SƯ PHẠM HÓA HỌC

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN ÍT PHÂN CỰC

Ở CÂY CÀ NA (Elaeocarpus hygrophilus Kurz),

HỌ CÔM (Elaeocarpaceae) Ở HẬU GIANG

Sư phạm hóa học K38 MSSV: B1200646

Cần Thơ, 2016

LỜI CẢM ƠN  -

Trong quá trình thực hiện luận văn, để có được kết quả như hôm nay ngoài sự

nổ lực của bản thân thì tôi đã nhận được sự quan tâm, hướng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô, sự động viên to lớn từ gia đình và các bạn lớp sư phạm Hóa học khóa 38 Vì vậy với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến:

Thầy Ngô Quốc Luân, Bộ môn Sư phạm Hóa học - Khoa Sư Phạm, Trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm quý báu và đầy tâm huyết trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài Thầy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Quý Thầy cô Bộ môn Sư phạm Hóa học, Khoa Sư phạm, Trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt những kiến thức hữu ích làm nền tảng cho tôi thực hiện đề tài và đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đến lúc hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Các anh chị, các bạn - những người đã đồng hành cùng tôi đã động viên, giúp

đỡ, góp ý cho tôi rất nhiều trong suốt thời gian qua

Ba mẹ và gia đình cũng đã giúp đỡ tôi cả tinh thần và vật chất, luôn động viên, khích lệ tôi thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN iv

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1 v

DANH MỤC CÁC HÌNH x

DANH MỤC CÁC BẢNG xi

TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN xii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ NA 2

1.1.1 Khái quát phân loại thực vật 2

1.1.3 Nguồn gốc, phân bố, sinh thái 3

1.1.4 Giá trị của cây Cà na 3

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CÂY CÀ NA 4

1.2.1 Tác dụng dược lý 4

1.2.2 Các nguyên cứu về thành phần hóa học 4

1.2.3 Tổng hợp nghiên cứu về thành phần hóa học của cây cà na 5

Chương 2 THỰC NGHIỆM 10

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 10

2.1.1 Nguyên liệu 10

2.1.2 Hóa chất 11

2.1.3 Thiết bị phương pháp sắc ký bản mỏng 11

2.2 ĐỊNH TÍNH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA VỎ CÂY CÀ NA 12

2.2.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất steroid 12

2.2.2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid 12

2.2.3 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alcaloid 12

2.2.4 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin 13

2.2.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin 14

2.2.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycoside 14

2.2.7 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất coumarine 15

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.3.1 Phương pháp chiết xuất các hợp chất 15

2.3.2 Phương pháp cô lập các hợp chất 15

2.3.3 Các phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất 16

2.4 ĐIỀU CHẾ CAO THÔ VÀ CÔ LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO THÔ 17

2.4.1 Điều chế cao thô 17

2.4.2 Cô lập và tinh chế hợp chất từ cao EA 18

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 ĐỊNH TÍNH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 22

3.2 NHẬN DANH HỢP CHẤT EHBE02 23

3.2.1 Xác định tính chất vật lý EHBE02 23

3.2.2 Xác định cấu trúc và nhận danh hợp chất EHBE02 23

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30

4.1 KẾT LUẬN 30

4.2 KIẾN NGHỊ 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO xiii PHỤ LỤC PL1 Phụ lục 1.1 Phổ UV của hợp chất EHBE02 PL1 Phụ lục 1.2 Phổ IR của hợp chất EHBE02 PL2 Phụ lục 1.3 Phổ MS của hợp chất EHBE02 PL3

Phụ lục 1.4 Phổ 1H-NMR của hợp chất EHBE02 PL4Phụ lục 1.5 Phổ 1H-NMR dãn rộng của hợp chất EHBE02 PL5 Phụ lục 1.6 Phổ 13C-NMR của hợp chất EHBE02 PL6 Phụ lục 1.7 Phổ 13C-NMR dãn rộng (1) của hợp chất EHBE02 PL7 Phụ lục 1.8 Phổ 13C-NMR dãn rộng (2) của hợp chất EHBE02 PL8 Phụ lục 1.9 Phổ DEPT của hợp chất EHBE02 PL9 Phụ lục 1.10 Phổ DEPT dãn rộng của hợp chất EHBE02 PL10 Phụ lục 1.11 Phổ HMBC của hợp chất EHBE02 PL11 Phụ lục 1.12 Phổ HMBC giãn rộng (1) của hợp chất EHBE02 PL12 Phụ lục 1.13 Phổ HMBC dãn rộng (2) của hợp chất EHBE02 PL13 Phụ lục 1.14 Phổ HMBC dãn rộng (3) của hợp chất EHBE02 PL14 Phụ lục 1.15 Phổ HMBC dãn rộng (4) của hợp chất EHBE02 PL15 Phụ lục 1.16 Phổ HSQC của hợp chất EHBE02 PL16 Phụ lục 1.17 Phổ HSQS dãn rộng (1) của hợp chất EHBE02 PL17 Phụ lục 1.18 Phổ HSQC dãn rộng (2) của hợp chất EHBE02 PL18 Phụ lục 2.1 Hình ảnh định tính các hợp chất trong vỏ cây Cà na PL19

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: ThS Ngô Quốc Luân

2 Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn ít phân cực ở cây Cà na

(elaeocarpus hygrophilus kurz), họ côm (elaeocarpaceae) ở Hậu Giang

3 Sinh viên thực hiện: Đào Văn Vàng MSSV: B1200646

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:

Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

Luận văn gồm 31 trang chính, không kể phần phụ lục, có bố cục rõ rang, chia làm 5

phần: Mở đầu 1 trang, Tổng quan 6 trang, Thực nghiệm 13 trang, Kết quả và bàn

luận 9 trang, Kết luận 2 trang Cách hành văn đúng phong cách khoa học

b Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài:

 Đánh giá đúng nội dung thực hiện đề tài: Trình bày ngắn gọn, đầy đủ chi tiết quá trình thực hiện và kết quả của công trình nghiên cứu Nội dung chuyên môn phù hợp kết quả nghiên cứu tìm ra được 1 hợp chất mới trong loài, đáp ứng tốt yêu cầu của một luận văn tốt nghiệp đại học

 Những vấn đề còn hạn chế: còn một số lỗi đánh máy

c Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài

Sinh viên Đào Văn Vàng có năng lực nghiên cứu, cần cù, cẩn thận, chính xác và nghiêm túc trong công việc Vì vậy, các kết quả nghiên cứu có thể tin cậy và sử dụng được cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo sau này

d Kết luận, đề nghị và cho điểm

 Đạt yêu cầu, đề nghị hội đồng thông qua

 Sinh viên nên phát huy khả năng nghiên cứu để học tập nâng cao trình độ

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1

1 Sinh viên thực hiện: Đào Văn Vàng, MSSV: B1200646, Lớp SP Hóa Học K38

2 Cán bộ hướng dẫn: ThS Ngô Quốc Luân

3 Tên đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn ít phân cực ở cây Cà

na (elaeocarpus hygrophilus kurz), họ côm (elaeocarpaceae) ở Hậu Giang.”

4 Nội dung nhận xét

a Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

• Luận văn gồm có 31 trang chính, không bao gồm phần tài liệu tham khảo (14

tài liệu tham khảo) và phần phụ lục phổ và hình ảnh, được chia làm 4 phần chính: Tổng quan (6 trang), Thực nghiệm (13 trang), Kết quả và bàn luận (9 trang) và

phần Kết luận và kiến nghị (1 trang)

• Văn phong đơn giản, bố cục trình bày rõ rang, dễ hiểu và ít lỗi chính tả

b.Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:

• Đánh giá nội dung thực hiện đề tài: trình bày ngắn gọn và khá đầy đủ chi tiết

quá trình thực hiện và kết quả của quá trình nghiên cứu Nội dung chuyên môn phù hợp với đề tài nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên

• Kết quả: từ 10kg bột vỏ than cây Cà na tác giả đã điều chế được 600g cao thô EtOH từ đó tác giả đã tiến hành định tính các nhóm hợp chất cơ bản có trong cao như: steroid, flavonoid, alkaloid, saponin, glycoside,… Quan trọng là tác

giả đã cô lập và xác định được cấu trúc của hợp chất tinh khiết methylellagic acid 4'-O-α-L-rhamnopyranoside) với số lượng lớn 320 mg

(3-O-• Kết quả đáp ứng tốt yêu cầu của một LVTN Đại học

• Những mặt còn hạn chế: về hình thức và lỗi đánh máy

○ Tên khoa học của cây cà na phải in nghiêng

○ Thiếu nhiều phần tài liệu tham khảo (Phần mở dầu, tổng quan và biện luận phổ)

○ Chưa định dạng thống nhất hết toàn luận văn

○ Phần tổng quan của cây cà na nên chăng chia ra 2 phần: nghiên cứu về thành phần hóa học và phần hoạt tính sinh học

○ Lỗi và câu hỏi trong các trang 6, 8, 9, 11, 14-16, 18-30

c Kết luận, đề nghị và điểm:

• Đạt yêu cầu một LVTN, đề nghị hội đồng thông qua

• Sinh viên nên cố gắng phát huy khả năng nghiên cứu để tiếp tục học tập nâng cao trình độ

• Chỉnh sửa lại luận văn theo yêu cầu về định dạng và lỗi chính tả

• Điểm số: 9/10

Cần Thơ, ngày 18 tháng 5 năm 2016

Cán bộ phản biện 1

Nguyễn Phúc Đảm

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 2

1 Sinh viên thực hiện: Đào Văn Vàng, MSSV: B1200646, Lớp SP Hóa Học K38

2 Cán bộ hướng dẫn: ThS Ngô Quốc Luân

3 Tên đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn ít phân cực ở cây Cà

na (elaeocarpus hygrophilus kurz), họ côm (elaeocarpaceae) ở Hậu Giang.”

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR : Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance (phổ cộng hưởng từ hạt

E : M : Ethyl acetate : Methanol

EtOAc : Ethyl acetate(CH3COOC2H5)

EtOEt : Diethyl ether (C2H5OC2H5)

EtOH : Ethanol (C2H5OH)

g : Gram

H : E : n-Hexane : Ethyl acetate

HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correelation

HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence

MHz : Mega Hertz

mp : Melting point (Nhiệt độ nóng chảy)

MPLC : Medium Pressure Liquid Chromatography (Sắc ký cột trung áp)

MS : Mass Spectrum/Spectrometry (Phổ khối lượng)

NMR : Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

PĐ : Phân đoạn

PE : Petroleum Ether (Ete dầu hỏa)

ppm : Part per million (Phần triệu)

q : Quartet (Mũi bốn)

Rf : Retention factor

Rha : Rhamnoglucosyde

s : Singlet (Mũi đơn)

t : Triplet (Mũi ba)

TLC : Thin Layer Chromatography (sắc ký bản mỏng)

UV-Vis : Ultraviolet Visible Spectroscopy (phổ tử ngoại khả kiến)

δ : Chemical shift (độ dời hóa học)

λmax : Maximum absorption wavelength (bước sóng cực đại hấp thu)

ν : Frequency (tần số dao động)

IC50 : Nồng độ ức chế 50%

KLPT : Khối lượng phân tử

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Cây Cà na và lá Cà na 2

Hình 1.2 Quả cà na và hoa Cà na 3

Hình 2.1 Vỏ cây Cà na 10

Hình 2.2 Bột vỏ cây Cà na 10

Hình 2.3 Quy trình điều chế cao thô từ vỏ cây Cà na 18

Hình 3.1 Tinh thể EHBE02 23

Hình 3.2 Vết TLC của EHBE02 23

Hình 3.3 Cấu tạo khung hợp chất EHBE02 25

Hình 3.4 Một số tương quan HMBC trong cấu trúc EHBE02 29

Hình 3.5 Cấu trúc hợp chất EHBE02 29

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số hợp chất phân lập từ cây Cà na 5-9

Bảng 2.1 Kết quả sắc ký cột phân đoạn trên cao EA 19

Bảng 2.2 Kết quả sắc ký cột phân đoạn PĐ6 20

Bảng 2.3 Kết quả sắc ký cột phân đoạn PDD6-4 21

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm hợp chất trong vỏ cây Cà na 22

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của EHBE02 26

Bảng 3.3 So sánh dữ liệu phổ NMR của EHBE02 và 3-methyl ellagic acid 4'-rhamnoside 28

TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN

Bài luận văn gồm các phần sau đây:

Mở đầu Nêu lí do chọn đề tài và mục tiêu của đề tài

Chương 1 Tổng quan về cây Cà na

Chương 2 Thực nghiệm tập trung vào các nội dung chính sau:

Từ nguyên liệu chính là vỏ cây Cà na được thu hái ở huyện Châu Thành, tỉnh Hậu Giang, sau nhiều công đoạn xử lý để điều chế bột vỏ cây Cà na

Tiến hành định tính các nhóm hợp chất chính có trong vỏ cây Cà na Kết quả cho thấy trong vỏ cây Cà na có sự hiện diện của các nhóm hợp chất sau: Steroid, flavonoid, alkaloid, saponin, tanin, glycoside, coumarine

Từ bột vỏ cây Cà na tiến hành điều chế cao ethyl acetate Sử dụng phương pháp sắc ký cột trên cao ethyl acetate và các phân đoạn kết hợp với sắc ký lớp mỏng

để cô lập được một chất sạch

Chương 3 Kết quả và biện luận

Việc nhận danh và xác định cấu trúc dựa trên các tính chất vật lý (màu sắc, dạng tinh thể, Rf , t°nc) và từ các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC) kết hợp so sánh với tài liệu đã công bố Kết quả nhận

danh chất cô lập được là 3-O-methyl ellagic acid 4'-O-α-L-rhamnopyranoside thuộc

nhóm dilacton của hexahydroxydiphenic acid

Chương 4 Kết luận và kiến nghị

Khẳng định lại các kết quả nghiên cứu và kiến nghị cho những nghiên cứu tiếp theo

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Từ xưa, để chống lại bệnh tật ông cha ta đã biết tìm đến các loài thảo mộc trong

tự nhiên Hệ thực vật nước ta vốn đa dạng, phong phú về loài cũng như đặc tính sinh học do đó chúng dần được con người ứng dụng, bào chế và cho ra nhiều bài thuốc quý, đặc trị hữu hiệu với nhiều căn bệnh Vì thế hướng nghiên cứu các loại thảo dược, các loài cây có hoạt tính sinh học đang được nhiều người quan tâm Nghiên cứu hóa học từ hợp chất thiên nhiên đã có nhiều đóng góp những thành tựu to lớn, như trong điều trị bệnh ung thư: một số hợp chất taxol trong cây thông đỏ, viblastin, vincristine trong cây dừa cạn; trị bệnh sốt rét: artemisinin từ cây thanh hao hoa vàng; trong điều trị bệnh tiểu đường: charatin từ cây mướp đắng

Theo thống kê trên thế giới có khoảng 250.000 loại thực vật bậc cao phần lớn trong số này chưa được khảo sát Nước ta được xếp hạng 16 trên thế giới sự phong phú

của các loài thực vật Cây Cà na hay Côm háo ẩm, Côm cánh ướt (Elaeocarpus

hygrophilus Kurz) là một loài thực vật phân bố ở Đông Nam Á Ở Việt Nam cây Cà na

mọc hoang dại hoặc được trồng ven sông rạch thuộc Miền Tây Nam Bộ Quả Cà na được sử dụng làm thực phẩm ở một số nước Đông Nam Á, vỏ cây bổ và lọc máu dùng nấu nước cho phụ nữ mới sinh uống trong vòng 15 ngày sau khi sinh Hiện có rất ít

nghiên cứu nào về thành phần hóa học của cây Cà na (Elaeocarpus hygrophilus Kurz)

ở Việt Nam và trên thế giới Vì vậy, đề tài Nghiên cứu thành phần hóa học cây Cà na

(Elaeocarpus hygrophilus Kurz), Họ Côm (Elaeocarpaceae) ở Hâụ Giang để góp phần

nhỏ vào việc nghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên từ cây Cà na, qua đó

có thể làm sáng tỏ những ứng dụng y học của loài cây này

2 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

 Cây Cà na

2.2 Phạm vi nghiên cứu

 Nghiên cứu trong quy mô phòng thí nghiệm

 Cao ethyl acetate của cây Cà na (Elaeocarpus hygrophilus Kurz) trồng tại tỉnh

Hậu Giang

Chương 1

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ NA

1.1.1 Khái quát phân loại thực vật

Tên khoa học: Elaeocarpus hygrophilus Kurz [2]

Tên khác: Elaeocarpus madopetalus Pierre

Elaeocarpus glandulosus Wall ex Merr

Tên Việt Nam: Côm háo ẩm, Côm cánh ướt [10], Cơm suối [8], Trám xanh (Miền Bắc)

Tên tiếng Anh: Elaeocarpus, Ma-kok-nam [15] (Thái), Spanish plum [11]

Phân loại khoa học [9]

Giới (regnum): Thực vật (Plantae)

Ngành: Thực vật có hoa (Angiospermae)

Lớp: Thực vật hai lá mầm (Eudicots)

Bộ (odro): Chua me đất (Oxalidales)

Họ (family): Côm (Elaeocarpaceae)

Chi (genus): Côm (Elaeocarpus)

Loài (species): Elaeocarpus hygrophilus

1.1.2 Mô tả thực vật [10]

Hình 1.1 Cây Cà na và lá Cà na

Thân: Cà na là cây thân gỗ cao từ 10−25 m, có thể đến 30 m

Rễ: Rễ phát triển mạnh, lan tỏa rộng trong đất bùn, ở gốc thân có nhiều rễ khí

sinh mọc thành chùm

Lá: Lá có phiến hình trái xoan ngược, dài 7−9 cm và rộng 2−3 cm, đầu tù, gốc

thót lại trên cuống, mép có răng cưa rất nhẵn, gần như dai, mặt trên màu lục, mặt dưới

màu nhạt hơn, gân bên 6 đôi, cuống lá dài 1 cm

Hạt: Hạt hình thoi, có vỏ hạt cứng, mỗi quả có 1 hạt

1.1.3 Nguồn gốc, phân bố, sinh thái [9, 10]

Trong nước: Đồng Nai (Biên Hoà), Long An (Vĩnh Hưng, Tân Hưng, Tân Thạnh, Thạnh Hóa), Tiền Giang (Tân Phước), Đồng Tháp, Khánh Hòa, Lâm Đồng, Bình Dương

Thế giới: Thái Lan, Mianma, Campuchia, Lào

Mùa hoa tháng 6−7, có quả tháng 8−10, tái sinh bằng hạt, mọc ở dọc các bờ kênh rạch vùng đất phèn Đồng Tháp Mười, chịu được nước ngập mùa nước lũ

1.1.4 Giá trị của cây Cà na [10]

Cây gỗ đặc trưng của vùng đất phèn Đồng Tháp Mười, chịu được nước ngập 3−6 tháng, mùa khô cạn vẫn xanh tốt Rễ, quả, lá người dân dùng làm thuốc có tác dụng thanh nhiệt, giải độc Vỏ cây có tinh dầu và tanin dùng tắm ghẻ, chống dị ứng sơn và hóa chất bảo vệ da Uống nước sắc của lá và rễ có tác dụng lọc máu, bảo vệ gan Quả dùng làm mứt, muối dưa, ô mai

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CÂY CÀ NA

1.2.1 Tác dụng dược lý [1]

Trái Cà na thanh nhiệt giải độc, lợi phế thông họng, thường dùng để chữa các

chứng thông họng sưng đau, ho lưỡi khô miệng khát, thổ huyết, kiết lị, ngộ độc rượu,

cá và cua

Vỏ cây bổ và lọc máu dùng nấu nước cho phụ nữ mới sinh uống trong vòng 15

ngày sau khi sinh

Bài 1: Cà na 6 gam, trà xanh 6 gam, mật ong 1 thìa Cho trám vào đun sôi 5 phút, kế đó cho trà xanh vào sắc tiếp trong 15 phút, sau đó lấy phần nước hòa với mật ong rồi uống dần từng ngụm Có công dụng chữa viêm họng mạn tính hay khản giọng, sưng rát

Bài 2: Cà na tươi 10 quả, hạt cải xanh 10 gam, sắc uống Có tác dụng chữa viêm hầu họng cấp tính

Bài 3: Cà na tươi 60 gam bỏ hạt, hành 15 gam, gừng tươi 10 gam, tử tô 10 gam Tất cả đem sắc với 1.200 ml nước, cô còn 500 ml thì cho thêm một chút muối ăn, lấy phần nước uống Có công dụng giải khát thanh nhiệt, bồi bổ sức khỏe, điều hòa nội tạng, dùng cho các chứng đau đầu, đau họng, trướng bụng đau quặn và phong hàn cảm mạo

Bài 4: Cà na 12 gam, vỏ quýt 9 gam, đun lửa to hấp cách thủy cho chín rồi uống, mỗi ngày 1 lần, dùng để chữa chứng nôn mửa khi có thai

Bài 5: Cà na 100 gam đem sắc với 200 ml nước cô còn 100 ml thì lọc bỏ bã lấy nước, uống mỗi ngày 3 lần, mỗi lần khoảng 25−30 ml Có công dụng chữa bệnh kiết

lỵ

Bài 6: Cà na tươi 50 gam, rửa sạch bỏ hạt sao chín, sắc uống Có công dụng giải độc cá nóc

Bài 7: Cà na tươi 10 quả sắc lấy nước uống có tác dụng giải rượu

Bài 8: Cà na 5 quả sắc lấy nước uống hoặc ngậm quả Cà na, nuốt lấy nước Có công dụng chữa hóc xương cá

Bài 9: Cà na tươi 480 gam, uất kim hương 24 gam, phèn chua 24 gam Trước tiên, đập nát Cà na rồi cho nước vào sắc kỹ, lấy bỏ hạt rồi lại cho uất kim vào sắc cùng, cuối cùng cho phèn chua sắc tiếp, cô còn chừng 500 ml, uống mỗi ngày 20 ml vào buổi sáng sớm với nước ấm Có tác dụng chữa bệnh động kinh

Bài 10: Cà na tươi 1.000 gam sắc với 1.000 ml nước bằng lửa nhỏ, sau đó lọc

bỏ bã lấy nước ngâm để chữa các bệnh lý ngoài da có viêm loét, viêm phần phụ…

1.2.2 Các nguyên cứu về thành phần hóa học

1.2.2.1 Các nghiên cứu ở nước ngoài

Năm 2002, các tác giả Duangporn Benjanarasut et al (Thailand) đã công bố kết

quả bước đầu khảo sát nhóm -hydroxy acid từ dịch chiết chloroform/methanol của

quả cà na bằng kỹ thuật sắc ký bản mỏng 2 chiều kết hợp với phổ IR cho thấy có sự hiện diện của malic acid [14]

Năm 2007, các tác giả Atiya Ruangchakpet, Tanaboon Sajjaanantakul (Thailand) có báo cáo công trình khảo sát hàm lượng tổng phenolic, flavonoid và khả năng kháng oxy hóa của cây Cà na theo độ tuổi Kết quả cho thấy cây Cà na 6 tháng tuổi cho tổng hàm lượng các nhóm hợp chất này là cao nhất (345,8 mg gallic acid/100g và 49,0 mg catechin/100 g trọng lượng mẫu tươi), và tổng khả năng kháng oxy hóa cũng cao nhất ở 6 tháng tuổi là 24,4 micromol TE/100 g trọng lượng mẫu tươi) [11]

Năm 2011, Jittawan Kubola, Sirithon Siriamornpun, Naret Meeso có công bố một khảo sát về thành phần vitamin C, phenolic acid, flavoniod và đường trong quả Cà

na bằng phương pháp đo quang, HPLC và thử hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết bằng 3 phương pháp FRAP, DPPH, AEAC Kết quả cho thấy quả Cà na có tổng hàm lượng vitamin C đạt 0,49 ± 0,01 mg/g; tổng hàm lượng các loại đường ở mức 70,27 ± 2,00 mg/g; tổng hàm lượng phenolic (gallic acid, p-hydroxy benzoic acid, chlorogenic acid, vanillic acid, caffeic acid, syringic acid, p-cormaric acid, ferulic acid, sinapicnic acid) ở mức 52,94 ± 13,78 mg/g; tổng lượng flanoviod (rutin, myricetin, quercetin, apigenin) là 15,22 ± 3,19 mg/g Đặc biệt, dịch chiết quả cà na có hoạt tính kháng oxi hóa rất mạnh (ức chế 97,05% DPPH) [15]

Năm 2012, Sasikan Kuposak, Masiri Manomaiwajee đã chiết xuất từ lá Cà na được gallic acid, epigallocatechin, catechin và gallocatechin [16]

1.2.2 4 Các nghiên cứu trong nước

Cho đến nay, chưa có công trình nào trong nước công bố về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây Cà na

1.2.3 Tổng hợp nghiên cứu về thành phần hóa học của cây cà na

Qua các tài liệu đã công bố các hợp chất phân lập từ cây Cà na được thống kê

2

C15H14O6

M = 290u

OHO

OH

OH

OH

OH OH

HO

OH O O

OH OH

Chlorogenic acid

Quả

H3CO

OCH3Sinapicnic acid

Quả

12

C10H10O4

M = 194u

OHHO

HO

Vitamin C 2-oxo-L-threo-hexono-1,4-lactone-2,3-enediol

O

OHO

O

OH

OH

OOHHO

O

OHHO

Myricetin

Quả

Chương 2

THỰC NGHIỆM

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu vỏ Cà na được thu hái ở tỉnh Hậu Giang

Thời gian thu hái: 07/2015

Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy lại khoảng 40ºC Vỏ cây Cà na sau khi sấy được say thành bột mịn Đây là nguyên liệu trong đề tài

Hình 2.1 Vỏ cây Cà na

Hình 2 2 Bột vỏ cây Cà na

2.1.2 Hóa chất

- Ethanol 96o, Việt Nam

- Silicagel 60 F254, Scharlau, đường kính hạt 0.04-0.06 mm

- n-hexane, Trung Quốc

- Methanol, Trung Quốc

- Chloroform, Trung Quốc

- Ethyl acetate, Trung Quốc

- Na2SO4 khan, Trung Quốc

- Máy đánh siêu âm

- Cân phân tích AB 265-S và cân kỹ thuật PB 602-S

- Bếp điện dùng để nướng bản mỏng Blacker®

2.2 ĐỊNH TÍNH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA VỎ CÂY CÀ NA

2.2.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất steroid

Cân 1g bột khô, cho vào 20mL CHCl3 và ngâm trong 2 giờ Sau đó lọc lấy dịch trong là mẫu thử

- Thuốc thử Salkowsky: Nếu dung dịch có màu đỏ đến nâu đỏ là dương tính

- Thuốc thử Libermann-Burchard: Nếu thấy xuất hiện một vòng ngăn cách giữa hai lớp chất lỏng có màu từ hồng đến xanh lá là dương tính

2.2.2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid

Đun hoàn lưu 5g bột mẫu trong 50mL EtOH 95% trong 30 phút Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử

Thuốc thử: HClđđ + Mgbột + alcol isoamylic, dung dịch (CH3COO)2Pb bão hòa, dung dịch FeCl3 1%

Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1mL dịch mẫu, thêm vài giọt HClđđ, sau đó cho một ít bột Mg vào và lắc Thêm từ từ từng giọt alcol isoamylic, để yên quan sát nếu thấy xuất hiện vòng màu hồng hay dung dịch có màu tím thì có flavonoid trong mẫu Dung dịch mẫu tạo kết tủa màu xanh lục đen với dung dịch FeCl3 1%, kết tủa trắng với dung dịch (CH3COO)2Pb bão hòa

2.2.3 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alcaloid

Cân 5g bột khô ngâm với 80mL HCl 1% trong 4-6 giờ Lọc lấy dịch trong làm thuốc thử

Thuốc thử:

- Wasicky: p-dimethyl amino benzaldehyde (20g), H2SO4đđ (60g), H2O (10mL)

- Bouchardat: I2 (2,5g), KI (5g), H2O (10mL)

Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch mẫu, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến hết 1mL các thuốc thử theo thành ống nghiệm, lắc đều, để yên, quan sát

- Thuốc thử Wasicky: Có kết tủa hình bông sao là dương tính

- Thuốc thử Bouchardat: Cho kết tủa màu nâu hoặc vàng đậm là dương tính

2.2.4 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin

2.2.4.1 Dựa vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin

Cơ sở của phương pháp: Dược điển của Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao bọt 1cm sau khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện quy định

Cách tiến hành: Cân 1g bột dược liệu cho vào erlen 500mL chứa sẵn 100mL nước sôi Tiếp tục cho nước trong erlen sôi trong 30 phút nữa Lọc, để nguội, thêm nước cất cho đến 100mL Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đường kính 16mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5, , 10 mL dịch lọc Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10mL Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong

15 giây Mỗi giây lắc 2 lần Để yên trong 15 phút Sau đó đo chiều cao các cột bọt Chỉ số bọt được tính theo công thức:

2.2.4.2 Dựa vào các phản ứng đặc trưng

Cân 5g bột khô, thêm vào 50mL EtOH 70° và đun cách thủy sôi trong 5 phút rồi lọc Cô cạn dưới áp suất kém đến cặn khô Cặn khô này dùng làm mẫu thử

Thuốc thử: Libermann-Burchard: (CH3CO)2O, H2SO4 đđ

Tiến hành: Hòa mẫu bằng 1mL (CH3CO)2O, thêm từ từ 0,3-0,5mL H2SO4 đđ Nếu xuất hiện vòng ngăn cách:

- Có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ nhận định có saponin triterpenoid

CSB = 100.(10/i)

{

Trong đó:

- Có màu xanh lá cây thì sơ bộ nhận định có saponin steroid

2.2.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin

Cân 5g bột khô, thêm vào 100mL nước cất, đun sôi trong 10 phút Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử

Thuốc thử:

- Dung dịch (CH3COO)2Pb: Pha đến bão hòa trong nước

- Dung dịch FeCl3: Pha nồng độ 1% trong nước

Tiến hành: Lấy 2mL dung dịch lọc, thêm 2-4 giọt dung dịch thuốc thử

- Dung dịch (CH3COO)2Pb: Nếu thấy xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt là dấu hiệu dương tính

- Dung dịch FeCl3: Nếu dung dịch chuyển thành màu xanh đen hoặc lục đen (do tạo phức) là dấu hiệu dương tính

2.2.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycoside

Lấy 10g bột khô loại các chất không phân cực bằng PE Tiếp theo chiết với EtOH 50% Dịch lọc được loại tạp chất bằng (CH3COO)2Pb cho đến khi không còn trầm hiện Sau đó loại (CH3COO)2Pb dư bằng Na2SO4 bão hòa Cô cạn dịch lọc được cao glycoside thô Hòa tan cao này bằng EtOH 90% và lấy dung dịch này làm mẫu thử Thuốc thử:

- Tollens: dung dịch AgNO3 10% (1mL) + dung dịch NaOH 10% (1mL) + dung dịch NH4OH 25% từ từ từng giọt

- Fehling:

+ Dung dịch A: CuSO4.5H2O (40g) + H2O, định mức vừa đủ 1 lít

+ Dung dịch B: KNaC4H4O6.4H2O (200g) + NaOH (150g) + H2O, định mức vừa đủ 1 lít

Khi sử dụng thì trộn hai dung dịch lại với nhau

Tiến hành: Lấy 1mL mẫu thử, cho vào từng giọt cho đến hết 1mL các thuốc thử

- Thuốc thử Tollens: Nếu thấy xuất hiện kết tủa màu bạc là dấu hiệu dương tính

- Thuốc thử Fehling: Đun sôi ống nghiệm trên đèn cồn trong 1 phút Nếu thấy xuất hiện kết tủa màu đỏ là dương tính

2.2.7 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất coumarine

Đun hoàn lưu 5g bột mẫu trong 50mL EtOH 95% trong 30 phút Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử

Thuốc thử: dung dịch NaOH 10% (0,5mL), HClđđ (vài giọt), H2O (12mL), dung dịch Na2CO3 10% (2mL)

Tiến hành:

- Phản ứng mở vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2mL dịch thử, thêm vào 1 trong 2 ống 0,5mL dung dịch NaOH 10% Đun cả hai ống trên bếp cách thủy đến sôi, lấy ra để nguội, thêm vào mỗi ống 4mL H2O Nếu chất lỏng trong ống có kiềm trong hơn ống không kiềm có thể xem là dương tính Tiếp tục đem acid hóa ống có kiềm với vài giọt HClđđ, nếu dung dịch đang trong suốt lại xuất hiện vẩn đục hoặc kết tủa thì đó là dấu hiệu dương tính

- Phản ứng diazo hóa: Lấy 1 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội Sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử diazo Nếu dung dịch trong ống chuyển sang màu vàng, cam, hồng đỏ (tùy cấu trúc) là dương tính

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp chiết xuất các hợp chất [4]

Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu

Phương pháp chiết sử dụng trong đề tài này là phương pháp chiết ngâm dầm (Maceration) Kỹ thuật này không đòi hỏi thiết bị phức tạp, có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây Ngâm nguyên liệu trong một bình chứa thủy tinh hoặc bằng thép

môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp phụ trơ

Bình sắc ký là chậu, lọ, bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy Pha tĩnh

là một lớp mỏng silicagel khoảng 25nm phủ lên bề mặt một tấm nhôm phẳng

Mẫu cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau

Sử dụng khoảng 1L dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình

Pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi duy chuyển chầm chậm dọc theo tấm bản mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển lên cao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau,

đi phía sau mức dung môi Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào hiện tượng hấp phụ của pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi

2.3.2.2 Sắc ký cột

Sử dụng phương pháp sắc ký cột hấp thu (Absorption chromatography)

Pha động là chất lỏng, pha tĩnh là chất rắn Ở phương pháp sắc ký này, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu hoặc dính lên bề mặt của pha tĩnh Các chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động Kết quả là trong quá trình pha động di chuyển qua pha tĩnh, chúng sẽ tách nhau ra

Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực, do sự tương tác giữa những phân tử có mang những nhóm phân cực đối với pha rắn là chất rất phân cực Trong sắc ký cột hấp thu pha rắn thường là những hạt silicagel Trên bề mặt những hạt này có mang nhiều nhóm –OH nên đây là pha tĩnh có tính rất phân cực

2.3.3 Các phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất [3]

Sử dụng phương pháp phổ để có thể xác định cấu trúc của một hợp chất hữu cơ

2.3.3.5 Phổ 13 C-NMR

Cho thông tin về khung carbon của phân tử Các tín hiệu phổ 13C-NMR xuất hiện trong khoảng thang chia độ rộng (0-250 ppm) (có thể đến 600 ppm cho trường hợp đặc biệt) nên các tín hiệu tách rõ ràng, mũi đơn dễ quan sát Mỗi loại carbon trong hợp chất hữu cơ có độ dịch chuyển hóa học khác nhau Dựa vào độ dịch chuyển hóa học của carbon trong phổ 13C-NMR, có thể dự đoán được loại carbon và liên kết của carbon đó

Phổ 13C-NMR DEPT cũng là một dạng phổ 13C-NMR, thực hiện đồng thời cả 2 phổ 1H-NMR và 13C-NMR Kỹ thuật này cho các tín hiệu carbon gắn với 1, 2 hoặc 3 hydro

2.3.3.6 Phổ HSQC và HMBC

Khảo sát hạt nhân 1H ghép cặp với 13C

Phổ HSQC cho tín hiệu tương tác của proton và carbon gắn trực tiếp nhau, nghĩa

là tương tác ngang qua 1 nối hóa trị

Phổ HMBC cho biết tương tác xa, ngang qua 2 hoặc 3 nối hóa trị và không xuất hiện tín hiệu tương tác ngang qua 1 nối hóa trị

2.4 ĐIỀU CHẾ CAO THÔ VÀ CÔ LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO THÔ

2.4.1 Điều chế cao thô

Bột vỏ cây cà na (10 kg) được trích với 30 lít EtOH 96% bằng phương pháp ngâm dầm, lọc bỏ bã, phần dịch chiết được cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao EtOH dạng sệt 600 gam, đun cách thủy ở 70C để đuổi bớt dung môi

Hình 2.3 Quy trình điều chế cao thô từ vỏ Cà na

Cao EtOH hòa tan bằng nước ấm, đem chiết lần lượt với các dung môi có độ

phân cực tăng dần: n-hexane, EtOAc, acetone

Lọc lấy phần dịch tan sau khi chiết với 30 lít n-hexane đem cô loại dung môi bằng máy cô quay chân không thu được cao n-hexane (23 gam)

Bột vỏ Cà na (10kg)

- Chiết với EtOAc (40 lít)

- Cô cạn dưới áp suất thấp

- Chiết với n-hexane (30 lít)

- Cô cạn dưới áp suất thấp

Cao acetone (10g) Phần không tan

− Loại nước

− Chiết với acetone

− Cô loại dung môi

Cao EtOH (600g)

Phần không tan trong n-hexane tiếp tục được chiết với 30 lít EtOAc Lọc lấy

phần dịch chiết đem cô loại dung môi bằng máy cô quay chân không thu được cao EtOAc có khối lượng là 80 gam

Phần không tan trong EtOAc đem loại nước bằng 5 lít MeOH, sau đó chiết với

10 lít acetone, đem cô loại dung môi bằng máy cô quay chân không thu được cao acetone có khối lượng là 10 gam

Quá trình thực hiện được tóm tắt ở Hình 2.3

2.4.2 Cô lập và tinh chế hợp chất từ cao EA

2.4.2.1 Cô lập hợp chất từ cao EA

56g cao EA được trộn với 500g silicagel, sấy khô tuyệt đối sau đó được nghiền

mịn bằng cối sứ, tiếp theo là tiến hành sắc kí cột cổ điển với hệ dung môi giải ly

nhexane:EtOAc (H:E) với các tỉ lệ thay đổi theo hướng tăng dần độ phân cực (0% 100% EtOAc), hệ EtOAc:MeOH (E:M) với độ phân cực tăng dần (0%-100% MeOH)

-Bảng 2.1 Kết quả sắc ký cột trên cao EA

Hiệu suất thu hồi cột sắc ký: H% = (49,54×100%)/56 = 88,46%

Các thông số cột:

- Đường kính trong của cột: d = 4,6cm

Phân đoạn Số lọ Khối lượng

(g) Hệ dung môi Kết quả kiểm tra với TLC

- Chiều dài của cột: l = 80cm

- Khối lượng silicagel nhồi cột: 500g

- Khối lượng cao EA sử dụng: 56g

- Tốc độ dòng: 10ml/phút

- Hứng bằng erlen 100mL

- Hệ dung môi giải ly: H : E với tỉ lệ tăng dần độ phân cực (0% -100% EtOAc) Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ có dung tích 100mL và được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối, hơ nóng trên bếp điện Các lọ cho kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau (về màu sắc và Rf) được gom thành một phân đoạn

2.4.2.2 Tinh chế phân đoạn PĐ6

Sắc ký bản mỏng của phân đoạn PĐ6 nhận thấy có nhiều vết đậm Tiếp tục tiến hành sắc ký cột phân đoạn PĐ6

Bảng 2.2 Kết quả sắc ký cột phân đoạn PĐ6

Phân đoạn Số lọ Khố lượng (g) Hệ dung môi Kết quả kiểm tra với

Phân đoạn PĐ6-4 tiếp tục sắc ký cột silicagel như sau:

Bảng 2.3 Kết quả sắc ký cột phân đoạn PĐ6-4

Phân đoạn Số lọ Khối lượng (mg) Hệ dung môi giải ly cột Kết quả kiểm tra với TLC

PĐ6-4-1 1-5 54 C:M (85:15) Nhiều vết PĐ6-4-2 6-13 80 C:M (83:17) Nhiều vết

PĐ6-4-3 14-22 320 C:M (8:2) Một vết chính

PĐ6-4-4 23-28 110 C:M (75:25) Nhiều vết PĐ6-4-5 29-31 178 100% MeOH Nhiều vết Tổng cộng 31 742

Phân đoạn PĐ6-4-3, kết tinh lại nhiều lần trong (C-M) = (8:2) thu được chất rắn

dạng bột trắng (320 mg), đặt tên là EHBE02