LUẬN văn tốt NGHIỆP KHẢO sát QUY TRÌNH xác ĐỊNH hàm LƯỢNG ETHOXYQUIN TRÊN THỨC ăn CHĂN NUÔI BẰNGSẮC ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Kết quả phân tích hàm lượng chất chống oxy hóa ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi .... Phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi đã thu thập bằng phương pháp s

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA SƯ PHẠM

BỘ MÔN HÓA HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ETHOXYQUIN TRÊN THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG SẮC

KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Chuyên ngành: Sư phạm Hóa Học

Giáo viên hướng dẫn:

TS Nguyễn Thị Thu Thủy

CN La Văn Thái

Sinh viên thực hiện:

Đặng Thị Xuân Hoa

Lớp: Sư phạm Hóa Học K38 MSSV: B1200580

CẦN THƠ - 2016

LỜI CẢM ƠN

Thời gian làm luận văn tôi đã luôn học tập và tích lũy được nhiều kiến thức, nhiều kinh nghiệm làm hành trang vững chắc giúp tôi bước đi trên con đường sắp tới Để đạt được những kết quả như ngày hôm nay ngoài nổ lực bản thân; tôi luôn nhận được sự động viên, giúp đỡ của gia đình, thầy cô, bạn bè vào những lúc khó khăn Vì thế tôi xin dành trang đầu tiên này để gửi lời cảm ơn chân thành đến:

 Cô Nguyễn Thị Thu Thủy – Bộ môn Sư Phạm Hóa Học đã trực tiếp hướng dẫn, dành thời gian quý báu tận tình chỉ dạy, quan tâm, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện tốt luận văn tốt nghiệp

 Xin cảm ơn tất cả các quý thầy cô trường Đại học Cần Thơ nói chung, bộ môn Hóa Khoa Sư Phạm nói riêng đã truyền dạy những kiến thức, kỹ năng quý báu cũng như đã tạo điều kiện cho chúng tôi có được môi trường học tập tốt nhất

 Thầy Hồ Hoàng Việt cố vấn lớp Hóa K38 đã dẫn dắt, định hướng và giúp

đỡ tận tình lớp Hóa của chúng tôi trong suốt bốn năm học qua

 Chân thành cảm ơn Ban giám đốc Trung Tâm Phân Tích và Giám Định Vinacert Control Cần Thơ đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết

bị, dụng cụ, hóa chất để tôi hoàn thành tốt luận văn

 Anh La Văn Thái - trưởng phòng Trung Tâm Phân Tích – Giám Định Vinacert Control Cần Thơ, chị Võ Thị Thúy An, chị Bùi Thị Quỳnh Hoa và các anh chị trong trung tâm, đặc biệt là anh chị trong phòng sắc ký đã nhiệt tình hướng dẫn, chia sẻ cho tôi những kinh nghiệm bổ ích

 Cuối cùng, cảm ơn gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc, yêu thương, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn cũng như chương trình học của mình Cảm ơn tập thể lớp Hóa K38 đặc biệt là những người bạn đã luôn bên cạnh ủng hộ, quan tâm, giúp đỡ mình trong thời gian qua

Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 15 tháng 05, năm 2016

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

- -

Cần Thơ, ngày tháng năm 2016 Chữ kí cán bộ hướng dẫn

Nguyễn Thị Thu Thủy

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

- -

Cần Thơ, ngày tháng năm 2016 Chữ kí cán bộ phản biện

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

- -

Cần Thơ, ngày tháng năm 2016 Chữ kí cán bộ phản biện

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ii

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN iii

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH SÁCH BẢNG BIỂU x

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích 1

3 Mục tiêu 2

4 Đối tượng nghiên cứu 2

5 Giới hạn đề tài 2

6 Các bước thực hiện đề tài 2

NỘI DUNG 3

Chương 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT 3

1.1 CƠ SỞ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Các phương trình và đại lượng cơ bản trong HPLC 3

1.1.3 Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao 7

1.1.3.1 Sắc ký pha thường 7

1.1.3.2 Sắc ký trao đổi ion 7

1.1.3.3 Sắc ký hấp phụ 7

1.1.3.4 Sắc ký pha đảo 8

1.1.4 Các cách rửa giải trong HPLC 8

1.1.5 Giới thiệu thiết bị HPLC 9

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHẤT BÉO (LIPIT) VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA ETHOXYQUIN 16

1.3 TÌM HIỂU CHUNG VỀ ETHOXYQUIN 17

1.3.1 Công thức phân tử, công thức cấu tạo và một số tính chất của ethoxyquin 17

1.3.2 Tác hại của ethoxyquin 18

1.3.3 Một số ứng dụng chủ yếu của ethoxyquin 18

1.3.4 Tình hình nghiên cứu về Ethoxyquin 18

1.3.4.1 Tình hình sử dụng ethoxyquin trong thức ăn thuỷ sản 18

1.3.4.2 Một số nghiên cứu về ethoxyquin 19

1.3.4.3 Qui định mức dư lượng tối đa của ethoxyquin 20

Chương 2: THỰC NGHIỆM 21

2.1 DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 21

2.1.1 Thiết bị, dụng cụ 21

2.1.2 Hóa chất 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.2.1 Phương pháp thu mẫu 22

2.2.2 Phương pháp phân tích 22

2.2.2.1 Phạm vi, mục đích 22

2.2.2.2 Nguyên tắc 22

2.2.2.3 Phương pháp phân tích 22

2.2.2.4 Điều kiện chạy máy HPLC 25

2.2.2.5 Phương pháp tính kết quả 25

2.2.2.6 Các biện pháp đảm bảo chất lượng kết quả thử nghiệm 26

2.2.2.7 Phương pháp đánh giá 26

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ 30

3.1.1 Khoảng tuyến tính 30

3.1.2 Độ lặp lại 31

3.1.3 Khảo sát hiệu suất thu hồi 33

3.1.4 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), giới hạn phát hiện của phương pháp (MLOD), giới hạn định lượng của phương pháp (MLOQ) 34

3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG ETHOXYQUIN 35

3.2.1 Một số qui định về giới hạn cho phép (MRL) của ethoxyquin trong thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam 35

3.2.2 Kết quả phân tích hàm lượng chất chống oxy hóa ethoxyquin trên nền mẫu thức

ăn chăn nuôi 35

3.2.2.1 Kết quả phân tích hàm lượng chất chống oxy hóa ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn cho tôm 36

3.2.2.2 Kết quả phân tích hàm lượng chất chống oxy hóa ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn cho cá 38

3.2.2.3 Kết quả phân tích hàm lượng chất chống oxy hóa ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn gia cầm và thức ăn cho heo 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

1 Kết luận 43

2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 48

AOAC Association Of Analytical Communities

CRM Certified reference material – Mẫu chuẩn được chứng nhận

HPLC High Performance Liquid Chromatography– Sắc ký lỏng hiệu

năng cao

LOD Limit of detection – Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantitation – Giới hạn định lượng

MLOD Method limit of detection – Giới hạn phát hiện của phương pháp

MLOQ Method limit of quantitation – Giới hạn định lượng của phương

pháp

ml milliliters

ppb parts per billion

ppm parts per million

PTN Phòng Thí Nghiệm

QC Quality Control – Kiểm soát và kiểm tra chất lượng

QUECHERS Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe – Nhanh, dễ, rẻ,

hiệu quả, ổn định, an toàn

UV Ultra Violet – Cực tím

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình1.1 Thời gian lưu của cấu tử phân tích. 4

Hình 1.2 Pic sắc ký 6

Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 9

Hình 3.1 Đường chuẩn ethoxyquin nồng độ từ 1 – 40 ppm 30

Hình 3.2 Đường chuẩn xác định hàm lượng ethoxyquin trong TACT ( từ TACT 1 – TACT 8) 37

Hình 3.3 Đường chuẩn xác định hàm lượng ethoxyquin trong TACT ( từ TACT 9 – TACT 23) 37

Hình 3.4 Đường chuẩn xác định hàm lượng ethoxyquin trong TACC ( từ TACC 1 – TACC 17) 38

Hình 3.5 Đường chuẩn xác định hàm lượng ethoxyquin trong TACC ( từ TACC 18 – TACC 37) 38

Hình 3.6 Đường chuẩn xác định hàm lượng ethoxyquin trong TAGC và TACH 40

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Trang

Bảng 1.1 Qui định giới hạn cho phép của ethoxyquin trong thức ăn chăn nuôi, thực

phẩm 20

Bảng 2.1 Số lượng các mẫu thức ăn chăn nuôi được phân tích 22

Bảng 2.2 Độ lặp lại chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 27

Bảng 2.3 Độ thu hồi chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 28

Bảng 3.1 Tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chuẩn Ethoxyquin 30

Bảng 3.2 Độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi 31

Bảng 3.3 Hiệu suất thu hồi của ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi 33

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát MLOD và MLOQ trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi 35

Bảng 3.5 Kết quả phân tích hàm lượng chất chống oxy hóa ethoxyquin trên 84 mẫu thức ăn chăn nuôi 36

Bảng 3.6 Kết quả phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn cho tôm 37

Bảng 3.7 Kết quả phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn cho cá 39

Bảng 3.8 Kết quả phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn gia cầm (bao gồm gà và vịt) 41

Bảng 3.9 Kết quả phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn cho heo 41

Ethoxyquin là một chất chống oxy hoá được sử dụng rộng rãi trong thức ăn chăn nuôi Từ lâu ethoxyquin đã bị cấm sử dụng trong thức ăn dành cho người (trừ một số gia vị như bột ớt, …) Nhưng con người có thể tiếp xúc với ethoxyquin thông qua vật nuôi từ thức ăn chăn nuôi có chứa hàm lượng cao chất chống oxy hoá ethoxyquin Trong những năm gần đây, việc xuất khẩu tôm của nước ta sang các thị trường

Mỹ, EU, …, và đặc biệt là Nhật Bản gặp nhiều khó khăn Nguyên nhân chủ yếu là do

dư lượng ethoxyquin trong tôm vượt quá giới hạn cho phép Để khắc phục tình trạng trên, Tổng cục Thuỷ sản đã thông báo và yêu cầu các cơ sở sản xuất, kinh doanh đã đăng kí lưu hành sản phẩm thức ăn chăn nuôi có chứa thành phần ethoxyquin phải công bố về thành phần và hàm lượng ethoxyquin trên nhãn sản phẩm theo qui định của Thông tư 66/2011/TT-BNNPTNT ngày 10/10/2011 của Bộ Nông nghiệp và PTNT qui định chi tiết một số điều Nghị định số 08/2010/NĐ-CP ngày 05/02/2010 của Chính phủ về thức ăn chăn nuôi Trên cơ sở đó, các nghiên cứu được tiến hành tìm hiểu về các phương pháp phát hiện và định lượng ethoxyquin trong thức ăn chăn nuôi Trong các phương pháp phân tích ethoxyquin trong thức ăn chăn nuôi thì phương pháp phân tích bằng HPLC được xem là đạt hiệu quả cao và phù hợp với các yêu cầu đặt ra Vì

vậy, đề tài được chọn nghiên cứu: “Khảo sát quy trình xác định hàm lượng ethoxyquin trên thức ăn chăn nuôi bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)”

2 Mục đích

Tìm hiểu phương pháp phân tích ethoxyquin trên thức ăn chăn nuôi bằng HPLC Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích (bao gồm hiệu suất thu hồi, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng) Xác định hàm lượng của chất chống oxy hoá – Ethoxyquin trong 84 mẫu thức ăn chăn nuôi (trong đó

3 Mục tiêu

Trình bày quy trình phân tích ethoxyquin trên thức ăn chăn nuôi bằng HPLC Khảo sát các điều kiện thích hợp cho phân tích (bao gồm hiệu suất thu hồi, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng)

Phân tích hàm lượng ethoxyquin trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi đã thu thập bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

4 Đối tượng nghiên cứu

Đề tài thực hiện trên 84 mẫu thức ăn chăn nuôi (bao gồm 23 mẫu thức ăn cho tôm, 37 mẫu thức ăn cho cá, 14 mẫu thức ăn gia cầm và 10 mẫu thức ăn cho heo)

5 Giới hạn đề tài

Khảo sát trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi do phòng thí nghiệm hoá Trung Tâm

Phân Tích Dịch Vụ Thí Nghiệm Vinacert Cần Thơ cung cấp

6 Các bước thực hiện đề tài

 Giai đoạn 1: Nhận đề tài, tìm tài liệu có liên quan đến đề tài, viết đề cương

 Giai đoạn 2: Thực hiện đề tài

 Giai đoạn 3: Thu thập kết quả, xử lý số liệu, viết bài, báo cáo

Nơi thực hiện đề tài: phòng thí nghiệm hoá Trung Tâm Phân Tích Dịch Vụ Thí

Nghiệm Vinacert Cần Thơ

NỘI DUNG

Chương 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT

1.1 CƠ SỞ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.1.1 Khái niệm[12, 18]

HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967 – 1968 trên cơ

sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử) Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

1.1.2 Các phương trình và đại lượng cơ bản trong HPLC[1, 2, 12, 18]

1.1.2.1 Hệ số phân bố K

Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình:

X pha tĩnh  X pha động Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K

S M

CK=

CTrong đó: CS là nồng độ mol chất tan trong pha tĩnh

CM là nồng độ mol chất tan trong pha động

Trị số K càng lớn chất tan phân bố càng nhiều trong pha tĩnh và di chuyển càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn

1.1.2.2 Thời gian lưu (t R )

Thời gian lưu của một chất là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại

Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu

sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn Vì vậy thời gian lưu là đại lượng

để phát hiện định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

 Bản chất sắc ký của pha tĩnh

 Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

 Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

 Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động

Trong một phép phân tích nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì pic bị doãng và độ lặp lại của pic kém, thời gian phân tích dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích

Hình1.1 Thời gian lưu của cấu tử phân tích

'

t = t - t Thời giant là thời gian lưu thực của một cấu tử 'R

Thời gian t0 của các chất không lưu giữ được gọi là thời gian lưu chết

1.1.2.3 Hệ số dung lượng k

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng

Nếu k nhỏ thì t cũng nhỏ và sự tách kém Nếu kR  lớn thì pic bị doãng Trong thực tế k từ 1 - 5 là tối ưu

1.1.2.4 Hệ số chọn lọc α

Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi 2 chất A, B có kA và

kB khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc

' B A

kα=

k' (Với điều kiện

' B

k ˃ k' nên α luôn lớn hơn 1) AThường chọn α dao động trong khoảng 1,05 – 2 Nếu α lớn quá thời gian phân tích sẽ dài

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc

ký nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều cao H Lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động

Bề dày H phụ thuộc vào:

 Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh

 Tốc độ và độ phân cực của pha động

Trong đó: t : thời gian lưu R

W: chiều rộng của pic sắc ký ở đáy.

Hay

' B

Trong đó (t ) , R A (t )R B: lần lượt là thời gian lưu của chất A và chất B

WA, WB: lần lượt là chiều rộng đáy pic sắc ký của chất A và chất B N: số đĩa lý thuyết

α: độ chọn lọc

' B

k : hệ số dung lượng của chất B

Trong thực tế các pic cân đối thì độ phân giải tối thiểu RS = 1 Trong phép định lượng RS = 1,5 là phù hợp Nếu độ phân giải quá thấp thì các pic chưa tách hẳn

1.1.3 Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao[1, 8, 12]

1.1.3.1 Sắc ký pha thường

Pha tĩnh lỏng phân cực như triethylene glycol, nước, silica, amino, cyano

Pha động là dung môi ít phân cực hơn như hexane, isopropyl ether, isooctane, ethyl acetate

Cấu tử có độ phân cực càng cao càng lưu giữ mạnh, độ lưu giữ giảm đi khi độ phân cực của pha động tăng lên

Ứng dụng: phân tích tốt các cấu tử kỵ nước, các đồng phân, dung môi pha mẫu không phân cực

1.1.3.2 Sắc ký trao đổi ion

Sắc ký trao đổi ion dựa vào lực hút của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên pha tĩnh Chất trao đổi anion có nhóm mang điện tích dương trên pha tĩnh hút anion chất tan Chất trao đổi cation có nhóm mang điện tích âm trên pha tĩnh sẽ hút cation chất tan

Pha tĩnh có các nhóm trao đổi ion: sulfonate, tetraalkyl ammonium…

Pha động là dung dịch đệm trong nước

Ứng dụng: phân tích tốt các đối tượng là anion, cation cả vô cơ và hữu cơ trong dung dịch nước

1.1.3.3 Sắc ký hấp phụ

Pha tĩnh là chất rắn phân cực Ở các vị trí hấp phụ chất phân tích tranh chấp với pha động Lưu giữ chất phân tích là do lực hấp phụ

Pha tĩnh thường dùng là silic oxide (silica) và aluminum oxide

Pha động ảnh hưởng đến hệ số phân bố của chất phân tích, để rửa giải các chất đã

bị hấp phụ người ta dùng pha động có sức rửa giải khác nhau

Ứng dụng: tách các đồng phân vị trí các hợp chất hữu cơ; phân tích các chế phẩm dầu mỏ, thực phẩm, dược phẩm

1.1.3.4 Sắc ký pha đảo

Phân tách các cấu tử dựa trên sự phân bố của các cấu tử giữa pha tĩnh không phân cực và pha động phân cực

Pha tĩnh thường dùng: C18, C8, phenyl, C3…

Pha động: là hỗn hợp dung dịch nước (đệm) với các dung môi hữu cơ tan trong nước như acetonitrile (ACN), methanol (MeOH), tetrahydrofuran (THF)… nhằm đảm bảo tương tác với chất tan để tách pha đảo hỗn hợp nhiều chất

Ứng dụng: sắc ký pha đảo được sử dụng phổ biến để phân tích các chất thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau như dược, hoá sinh, thực phẩm, môi trường…

1.1.4 Các cách rửa giải trong HPLC[1, 16]

Trong HPLC có hai chế độ rửa giải là isocratic và gradient:

1.1.4.1 Rửa giải với chế độ isocratic

Theo cơ chế này thành phần pha động không đổi trong suốt qua trình rửa giải

Ưu điểm:

 Thành phần pha động chính xác

 Hệ thống phân tích đơn giản, rẻ tiền

 Đường nền ổn định do thành phần không đổi nên sử dụng tốt cho các đầu

dò thành phần nền ảnh hưởng nhiều đến tín hiệu

 Thành phần pha động có thể trộn trước bằng tay

Nhược điểm:

 Khả năng tách kém, thời gian phân tích dài

 Thay đổi thành phần pha động phù hợp với thành phần mẫu không thể thực hiện nhanh

 Do pha động phải trộn trước nên thành phần có thể thay đổi theo thời gian khi để lâu

1.1.4.2 Rửa giải với chế độ gradient

Theo chế độ này pha động sẽ có thành phần thay đổi trong quá trình chạy Pha động là hỗn hợp nhiều dung môi, thường là 2 – 4 loại được đựng trong các bình khác nhau có tỉ lệ thành phần thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định

Ưu điểm:

 Có khả năng tách tốt

 Có khả năng phân tích những mẫu phức tạp

 Pha động có thành phần chính xác, có thể thay đổi rất nhiều thành phần,

độ chính xác ổn định theo thời gian

 Thời gian phân tích khá ngắn

 Tăng độ bền của cột sắc ký do loại bỏ được những cấu tử có độ lưu giữ mạnh

1.1.5 Giới thiệu thiết bị HPLC[1, 2, 17]

Do bản chất của chất phân tích khác nhau nên có nhiều kiểu sắc ký lỏng để tách

và định lượng chất phân tích Mặc dù vậy, nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống nhau, gồm các bộ phận cơ bản sau:

Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1 Bình chứa dung môi pha động

1.1.5.1 Bình chứa dung môi pha động

Bình chứa dung môi pha động thường là bình thuỷ tinh Hiện nay, máy HPLC

thường thiết kế có 4 đường dung môi và cho phép người sử dụng 4 bình chứa dung

môi cùng một lần để rửa giải theo mong muốn Tuỳ theo tính chất của chất phân tích mà số lượng đường dung môi được sử dụng khác nhau, thường thì chỉ sử dụng 2

hoặc 3 đường dung môi để pha động luôn được đồng nhất và đơn giản

Có hai cách dùng pha động rửa giải: đẳng dòng (isocratic) và gradient Hiện nay,

4 đường dung môi chủ yếu để phục vụ cho chế độ rửa giải gradient

Dung môi dùng cho HPLC tất cả đều là dung môi tinh khiết và có ghi rõ là dùng

cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích Trước khi sử dụng, cần lọc (màng lọc

0,45 µm) và đuổi khí hoà tan trong pha động Nhằm mục đích bảo vệ cột, tránh tạo ra

các pic tạp, làm nhiễu đường nền trong quá trình phân tích

1.1.5.2 Bộ phận khử khí

Pha động trong bình chứa có thể chứa một lượng nhỏ khí hoà tan trước khi cho

chạy trong máy cần qua bộ phận khử khí để loại bỏ bọt khí Khí hoà tan có thể làm cho

tỉ lệ pha động ở các đường dung môi không còn chính xác từ đó làm biến dạng pic,

giảm hiệu lực cột, nhiễu đường nền; trường hợp nếu khí hoà tan còn quá nhiều bơm sẽ

không hút được dung môi lúc đó áp suất không lên máy sẽ ngưng hoạt động

1.1.5.3 Bơm sắc ký lỏng

Mục đích để bơm pha động vào cột để thực hiện quá trình tách sắc ký

Bơm trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:

 Tạo được áp suất đủ cao để đưa mẫu và pha động vào cột với tốc độ

dòng mong muốn và tạo dòng liên tục Bơm hoạt động phải đạt được áp

suất cao khoảng 250 – 500 atm

 Đảm bảo bơm có lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,1 đến 9,999 ml/phút

 Có khả năng chịu tác động của nhiều loại dung môi khác nhau

Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt Hiện nay thường sử dụng bơm có 2 pittong để thay phiện nhau đẩy dung môi liên tục

1.1.5.4 Bộ phận tiêm mẫu

Bộ phận tiêm mẫu có nhiệm vụ đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp

không ngừng dòng chảy Mẫu ở dạng lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha

động cao áp ngay ở đầu cột mà không cần dừng dòng Van tiêm có vòng chứa mẫu, vòng này có dung tích khác nhau thường sử dụng loại 0,5 đến 20 µl, ngoài ra còn có

loại lớn hơn

Có hai cách lấy mẫu vào trong cột: tiêm mẫu bằng thủ công và tiêm mẫu tự động Dùng van tiêm sẽ thuận tiện cho việc tự động hoá Phần mềm máy tính dễ điều khiển và kiểm soát hệ tiêm mẫu Sai số khi tiêm mẫu bằng van thấp khoảng 0,5% Nếu tiêm mẫu bằng bơm tiêm qua tấm đệm ở đầu cột thì khi tiêm phải dừng dòng

và áp suất trong cột không cao Với cách tiêm này độ lặp lại thấp và sai số lớn

Chất nhồi cột cho sắc ký lỏng được chế tạo từ silica bằng cách làm kết tụ các hạt silica để tạo ra các hạt có kích thước lớn hơn và đường kính đều nhau Ngoài ra còn có các chất nhồi khác như: aluminum oxide, polyme xốp, nhựa trao đổi ion,… tuỳ thuộc vào loại hình sắc ký

1.1.5.6 Đầu dò (detector)

Đầu dò là bộ phận quan trọng để phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại đầu dò thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích

Để phát hiện chất phân tích có thể dựa vào:

 Đáp ứng chọn lọc với chất phân tích khi detector hấp thụ bức xạ UV hoặc huỳnh quang

 Tính chất chung của chất phân tích trong pha động

 Đầu dò trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:

 Đáp ứng nhanh và lặp lại

 Độ nhạy cao có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặc nồng độ rất thấp

 Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng

 Khoảng hoạt động tuyến tính rộng

 Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

Hiện nay có nhiều loại đầu dò, nhưng thường thì sử dụng các loại đầu dò sau:

b Đầu dò huỳnh quang

Đây là loại đầu dò có độ chọn lọc cao hơn và nhạy hơn Do có độ nhạy cao nên đầu dò huỳnh quang được sử dụng cho phân tích vi vết trong kiểm soát môi trường, giám định pháp y…

Đầu dò huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên, các dẫn chất có huỳnh quang như: hợp chất thơm đa vòng, dẫn chất quinoline, steroid

và alkaloid

Rất nhạy với nhiệt độ và không chạy được với chế độ gradient dung môi

Đầu đò chỉ số khúc xạ kém nhạy, lại có khoảng tuyến tính hẹp nên phạm vi sử dụng bị hạn chế

d Đầu dò tán xạ bay hơi

Chất phân tích được phát hiện nhờ ánh sáng tán xạ tạo ra tín hiệu điện, phù hợp với chế độ rửa giải gradient

Độ nhạy khá, đáp ứng với bất kỳ chất phân tích nào kém bay hơi hơn so với pha động của sắc ký lỏng, là giải pháp cho các cấu tử không đáp ứng UV, huỳnh quang… Khoảng nhiệt độ làm việc từ nhiệt độ phòng đến khoảng 60 oC

Đáp ứng với khối lượng chất phân tích

e Đầu dò điện hoá

Phát hiện các chất phân tích dựa vào độ dẫn diện của pha động có mặt các chất phân tích ion hoặc dòng điện tạo thành do phản ứng oxy hoá khử ở điện thế xác định Không phù hợp cho chế độ gradient dung môi, có 2 loại:

- Đầu dò độ dẫn: thích hợp cho sắc ký ion trong đó chất phân tích là ion mang điện tích

- Đầu dò đo dòng: loại này rất nhạy, chọn lọc cao nhưng điện cực dễ bị nhiễm bẩn

1.1.5.7 Bộ phận ghi tín hiệu

Để ghi tín hiệu phát hiện do đầu dò truyền sang

 Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của pic, chiều cao

 Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất

cả các thông số, phổ đồ và các thông số của pic như tính đối xứng, hệ số phân giải trong quá trình phân tích đồng thời sử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD %,

1.1.5.8 Máy in

Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy

để hoàn thiện hồ sơ

1.1.6 Định tính và định lượng trong sắc ký lỏng

1.1.6.1 Định tính

Về căn bản quá trình định tính trong sắc ký lỏng dựa vào hai yếu tố:

 Thời gian lưu: đại lượng thời gian lưu là một tính chất, là một thông số đặc trưng của chất tan (chất phân tích) và được dùng để phân tích định tính các chất trong một hỗn hợp mẫu phân tích, do trong một hệ pha và trong các điều kiện tách HPLC đã chọn nhất định thì mỗi chất tan (chất phân tích) trong hỗn hợp mẫu sẽ có thời gian lưu khác nhau và cố định của nó

 Độ chọn lọc của đầu dò: hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao có nhiều loại đầu dò, trong đó có loại có độ chọn lọc cao nhưng cũng có loại có độ chọn lọc thấp Dựa trên tính chất này có thể xác định chính xác hơn những chất có cùng thời gian lưu

1.1.6.2 Định lượng

a Phương trình cơ bản để định lượng trong HPLC

Để định lượng một chất dựa vào hai phương trình cơ bản sau về mối quan hệ giữa độ lớn pic sắc ký (diện tích S, chiều cao H) và nồng độ Cx của chất phân tích:

 Hàm H = f(Cx), tức là H = k.Cb

 Hàm S = f(Cx), tức là S = k.Cb

Trong đó: H: chiều cao pic sắc ký của chất

S: diện tích pic sắc ký của chất

k: hằng số của điều kiện tách sắc ký

b: hằng số bản chất, nó nhận giá trị trong vùng 0 < b  1

b Các phương pháp định lượng

 Phương pháp đường chuẩn

Nguyên tắc định lượng trong HPLC:

 Chuẩn bị một dãy mẫu chuẩn của chất phân tích có nồng độ C0, C1, C2,

C3, C4, C5 và các mẫu phân tích Cx1, Cx2,… trong cùng điều kiện phù

 Dựng đường chuẩn theo quan hệ H - C hay S - C

 Từ các giá trị Hx hay Sx của mẫu phân tích áp vào đương chuẩn tương ứng sẽ xác định được nồng độ của chất trong các mẫu phân tích

 Phương pháp thêm chuẩn:

Nguyên tắc:

 Dùng ngay chính một dung dịch mẫu phân tích trong các mẫu phân tích làm nền để pha chế một dãy mẫu chuẩn của chất cần phân tích Tức là, trên cùng một dung dịch mẫu phân tích có nồng độ C0 đã chọn, lần lượt gia thêm một lượng chính xác nồng độ chất phân tích theo cấp số cộng

C trong vùng tuyến tính, ta sẽ có dãy chuẩn tương ứng với nồng độ C0 <

C1 < C2 < C3 < C4 < C5

 Chạy sắc ký tất cả các mẫu chuẩn và mẫu phân tích theo điều kiện đã chọn và ghi nhận sắc ký đồ

 Xác định chiều cao H và diện tích S của chất phân tích trong mỗi mẫu

 Dựng đồ thị chuẩn theo hệ toạ độ H - C hay S - C, đây là đường chuẩn gốc

 Từ đường chuẩn gốc, thực hiện phép ngoại suy tuyến tính thì tìm được nồng độ Cx của chất phân tích đã chọn làm nền pha dãy chuẩn Sau đó, ngoại suy đường chuẩn gốc thành đường chuẩn phân tích để xác định nồng độ chất phân tích trong những mẫu khác

 Phương pháp một điểm chuẩn

Cách 1: khi có mẫu chuẩn, nếu mẫu chuẩn có nồng độ Cch và mẫu phân tích có nồng độ Cx, thì:

 Với mẫu phân tích: Hx = k.Cx

 Với mẫu chuẩn: Hch = k.Cch

độ Cx của chất cần phân tích

Cách 2: không có mẫu chuẩn, mẫu phân tích có nồng độ chưa biết Cx, lấy hai lượng mẫu như nhau, một mẫu giữ nguyên và một mẫu thêm lượng chính xác Cx của chất phân tích, ta có:

 Mẫu không thêm: Hx = k.Cx (a)

 Mẫu có thêm chất phân tích: Htch = k.(Cx + Cx) (b)

Chất chống oxy hoá là một loại chất giúp ngăn chặn và làm chậm quá trình oxy hoá của chất khác Oxy hoá là phản ứng của phân tử với oxy Các phản ứng oxy hoá

có thể tạo ra các gốc tự do và khởi động những phản ứng liên hoàn bắn phá tế bào Chất chống oxy hoá có thể khử các gốc tự do và ức chế được các phản ứng oxy hoá khác

Trong TACN, chất béo là thành phần không thể thiếu Chất béo là nguồn cung cấp năng lượng lớn, tham gia cấu tạo nên màng tế bào Trong thành phần của chất béo chứa nhiều acid béo không no nên dễ bị oxy hoá trong quá trình chế biến và bảo quản

Vì vậy, chất béo là nguyên nhân làm giảm chất lượng và làm hạn chế thời gian bảo quản thức ăn Khi bị oxy hoá, thức ăn sẽ có mùi ôi và mất đi các acid béo thiết yếu, các vitamin tan trong dầu như: A, D, E, carotenoid bị phân huỷ làm giá trị dinh dưỡng của thức ăn giảm Do đó, trong TACN cần thiết phải bổ sung chất chống oxy hoá để

ức chế các quá trình oxy hoá Các chất oxy hoá thêm vào sẽ giúp cho việc bảo quản gía trị dinh dưỡng, hương vị và kéo dài thời gian sử dụng của thức ăn Chất chống oxy hoá thêm vào phải đảm bảo dễ tiêu hoá, dễ hấp thu, không độc đối với vật nuôi và người tiêu dùng Các chất chống oxy hoá thường được dùng phổ biến là: BHT (Butylated hydroxyl toluene), BHA (Butylated hydroxyl anisole), ethoxyquin

1.3 TÌM HIỂU CHUNG VỀ ETHOXYQUIN

1.3.1 Công thức phân tử, công thức cấu tạo và một số tính chất của ethoxyquin[2]

 Tên thương mại: Santoquin, Santoflex, EQ

 Một số tính chất:

 Khối lượng phân tử: 217,31 g/mol

 Trạng thái: chất lỏng màu hơi nâu, nhớt

 Nhiệt độ sôi: 150 C ở 747 mmHg

 Độ tan ở 25 C: Nước 170 mg/l

Acetonitrile 462 g/l

n-octanol 452 g/l

1.3.2 Tác hại của ethoxyquin[13]

Ethoxyquin có độc tính trung bình, được dùng qua đường uống, qua da và qua đường hô hấp Nó không có tác dụng kích thích mắt và không làm rát da Các thử nghiệm trên động vật cho thấy nó kém nhạy cảm, đối với người tiếp xúc thường xuyên

dễ gây viêm da Các bộ phận chủ yếu bị ảnh hưởng bởi ethoxyquin trong động vật thí nghiệm là gan và thận Hiện nay chưa có bằng chứng cụ thể nào được ghi nhận trên thế giới về khả năng gây ung thư của ethoxyquin

1.3.3 Một số ứng dụng chủ yếu của ethoxyquin[13,19]

Được phát hiện năm 1950, ethoxyquin được sử dụng như một chất chống oxy hoá chất béo, chất bảo quản trong thức ăn chăn nuôi Việc bổ sung chất chống oxy hoá ethoxyquin vào thức ăn chăn nuôi nhằm bảo vệ lipid và làm tăng tính ổn định các Vitamin tan trong dầu, đặc biệt là Vitamin A và Carotene để đảm bảo chất lượng của thức ăn chăn nuôi Ethoxyquin ngăn ngừa quá trình tự cháy của các thức ăn bảo quản trong kho do ức chế sự sản sinh nhiệt gây ra bởi quá trình oxy hoá lipid Ethoxyquin

có hoạt tính giúp các sản phẩm trái cây sau thu hoạch hạn chế quá trình mất mát hàm lượng carotenoid và Vitamin E

Ethoxyquin còn sử dụng với mục đích bảo quản màu trong sản xuất bột ớt, chất

ổn định chống phân huỷ trong sản xuất cao su, chống xuất hiện các đóm màu nâu của táo và lê sau thu hoạch

1.3.4 Tình hình nghiên cứu về Ethoxyquin

1.3.4.1 Tình hình sử dụng ethoxyquin trong thức ăn thuỷ sản [23]

Với giá thành rẻ, tác dụng chống oxy hoá cao, nên ethoxyquin được sử dụng rất rộng rãi trong sản xuất thức ăn thuỷ sản tại Việt Nam và nhiều nước khác trên thế giới Tuy nhiên, để đảm bảo sản phẩm nuôi trồng đáp ứng được yêu cầu của thị trường, cơ

Nghiên cứu trên 6 vùng nuôi tôm ở Bạc Liêu để theo dõi mức độ tồn lưu của ethoxyquin trên tôm nuôi thương phẩm Kết quả cho thấy, với các loại thức ăn chứa hàm lượng ethoxyquin thấp (27,02 – 29,53 ppb), dư lượng trong tôm thương phẩm là không có (dưới ngưỡng phát hiện của phương pháp và thiết bị) hoặc rất thấp Đối với các loại thức ăn có hàm lượng cao hơn, tuỳ thuộc vào hàm lượng ethoxyquin trong thức ăn, dư lượng ethoxyquin trong tôm thương phẩm có thể phát hiện ở mức độ khác nhau Tuy nhiên, dư lượng ethoxyquin trong tôm thương phẩm sẽ loại hoàn toàn trong thời gian 4-5 ngày sau khi ăn tuỳ theo hàm lượng có trong thức ăn thử nghiệm

Các nghiên cứu cũng cho thấy, sau thời gian ngưng sử dụng ethoxyquin khoảng

7 ngày thì thủy sản vẫn phát triển bình thường và không phát hiện dư lượng khi phân tích nếu sử dụng lượng ethoxyquin trong mức độ cho phép

1.3.4.2 Một số nghiên cứu về ethoxyquin [7]

Năm 1969, Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên Hiệp Quốc (FAO) và Tổ

chức Y tế Thế giới (WHO) đã cùng ban hành 2 bản báo cáo (số hiệu FAO/PL:

1969/M/17/1 và WHO/Food Add./70.38) về “Thẩm định dư lượng một số thuốc trừ sâu trong thực phẩm” Trong đó, tại Chương 159 nói về nghiên cứu ethoxyquin, nhiều thí nghiệm đã được phân tích rõ

Theo đó, các nghiên cứu trên chuột và chó cho thấy có xuất hiện tác dụng độc hại trên gan và thận ở nồng độ ethoxyquin trong thức ăn từ 250 ppm trở lên đối với chuột,

và từ 10 mg/kg đối với chó Ở nồng độ thấp (khoảng 50 ppm), ethoxyquin nhanh

chóng bị chuột, chó và gà bài tiết Ethoxyquin dễ chuyển hoá thành chất hoà tan và nếu quá trình bài thiết xảy ra thuận lợi, ít có khả năng ethoxyquin lưu lại trong cơ thể

1.3.4.3 Qui định mức dư lượng tối đa của ethoxyquin [10, 20]

Hiện nay, tuỳ theo mục đích sử dụng và nhu cầu của từng khu vực mà giới hạn cho phép của ethoxyquin trong các loại thức ăn chăn nuôi hay thực phẩm sẽ khác nhau

Bảng 1.1 Qui định giới hạn cho phép của ethoxyquin trong thức ăn chăn nuôi,

thực phẩm

Tên khu vực hay

quốc gia Thức ăn chăn nuôi, thực phẩm Giới hạn cho phép

Mỹ Thức ăn chăn nuôi 150 ppm

 Cân phân tích 4 số OHAUS

 Máy li tâm Mikro 220R

 Đầu tip Micropipete 20 – 200 µl màu vàng

 Đầu tip Micropipete 100 – 1000 µl màu xanh

 Đầu tip Micropipete 1 – 5 ml màu trắng

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp thu mẫu

Mẫu phân tích là thức ăn chăn nuôi do phòng thí nghiệm hóa Trung tâm Phân

tích dịch vụ thí nghiệm Vinacert Cần Thơ cung cấp

Bảng 2.1 Số lượng các mẫu thức ăn chăn nuôi được phân tích

Loại thức ăn chăn nuôi Số lượng Ngày thu

Thức ăn cho tôm 23 03/01/2016

 Dung dịch chuẩn trung gian

Chuẩn trung gian 100 ppm: Lấy 100 µl chuẩn C0 (1000 ppm) cho vào vial, định mức thành 1 ml bằng H2O : ACN (1:1)

 Dung dịch chuẩn làm việc

Sơ đồ 2 Sơ đồ tóm tắt quy trình trích ly mẫu

Mẫu xay nhuyễn đã đồng nhất

Lọc lấy dung dịch cho qua ống nhựa chứa hỗn hợp

0,4 g MgSO4 khan + 0,4 g NaCl

Vortex khoảng 60 giây, lắc trong 30 phút với tốc độ 300 rpm, ly tâm ở 25 C

với tốc độ 5500 rpm trong 5 phút

Cân khoảng 2,0 g mẫu cho vào ống ly tâm 50 ml và ngâm trong 10 ml ACN

Vortex và ly tâm ở 25 C với tốc độ 5500 rpm trong 5 phút

Hút 1 ml dung dịch mẫu và lọc bằng côn lọc 0,45 µm cho vào vial

Hút 2 ml dung dịch mẫu cho vào ống nhựa chứa 0,1 g MgSO4

Vortex và ly tâm ở 25 C với tốc độ 5500 rpm trong 5 phút

Phân tích bằng máy HPLC – DAD tại bước sóng 360 nm

c Chuẩn bị mẫu kiểm soát:

Mẫu trắng: Là mẫu kiểm soát chất lượng có cùng nền mẫu và đã trải qua quy trình chuẩn bị mẫu (n = 6) như mẫu thử nghiệm và kết quả không chứa chất cần phân tích ở đây là ethoxyquin

Mẫu chứng nhận (CRM): Là mẫu đã được biết trước hàm lượng, được chứng nhận bởi một tổ chức có kèm theo chứng nhận bằng quy trình có thể truy xuất nguồn gốc và kèm theo độ không đảm bảo đo

Mẫu thêm chuẩn: Mẫu được chuẩn bị bằng cách thêm một lượng chính xác ethoxyquin và được phân tích giống như mẫu thử nghiệm

Chuẩn bị mẫu QC: Nếu PTN có mẫu CRM thì thực hiện trên mẫu CRM, nếu không thì sử dụng mẫu thêm chuẩn Cân 2,0 g mẫu, tiêm vào 25 ppm ethoxyquin (thêm 50 µl chuẩn gốc 1000 ppm) và được xử lý theo quy trình như mẫu thử nghiệm

2.2.2.4 Điều kiện chạy máy HPLC

X: nồng độ (ppm) có được từ diện tích pic mẫu với phương trình đường chuẩn

V: thể tích pha loãng (ml)

m: khối lượng mẫu ban đầu (g)

2.2.2.6 Các biện pháp đảm bảo chất lượng kết quả thử nghiệm

a Sử dụng mẫu thêm chuẩn

Nếu số lượng mẫu  10 mẫu, cứ 10 mẫu thì thực hiện 1 mẫu QC

Nếu số lượng mẫu nhỏ hơn 10 thì vẫn đảm bảo có 1 mẫu QC

b Mẫu QC kiểm tra đường chuẩn

Chạy lại một trong những điểm chuẩn của đường chuẩn, lựa chọn điểm chuẩn có nồng độ gần với nồng độ chất phân tích trong mẫu

Cứ 10 lần chạy mẫu, chạy lại mẫu QC 1 lần

Độ chính xác của mẫu QC kiểm tra nằm trong khoảng giới hạn từ 90 – 110 % so với kết quả của lần chạy trước Nếu kết quả vượt ngoài giới hạn cho phép thì phải dừng lại đường chuẩn và chạy lại mẫu phân tích

c Thử nghiệm lặp lại

Đối với mẫu phát hiện trên MLOD, tiến hành thử nghiệm lặp lại 2 lần trên cùng mẫu thử nghiệm

2.2.2.7 Phương pháp đánh giá[2, 4, 5]

a Khảo sát khoảng tuyến tính của ethoxyquin trong xây dựng đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (ở đây là diện tích pic) với nồng độ chất phân tích

Để khảo sát khoảng tuyến tính, ta thực hiện:

- Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn (tối thiểu 6 nồng độ)

- Xác định giá trị đo được y theo nồng độ x (lặp lại 2 lần lấy giá trị trung bình) Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đường biểu diễn là phương trình:

y = ax + b Trong đó: a: giá trị độ dốc slope

b: giá trị hệ số chặn intercept

SD =

n - 1



SDRSD = ×100

xSD: độ lệch chuẩn

n: số lần thí nghiệm

i

x : Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ i (hiệu suất thu hồi hoặc hàm lượng)

x : Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm

Bảng 2.2 Độ lặp lại chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)

c Khảo sát hiệu suất thu hồi

Hiệu suất thu hồi là đại lượng đánh giá độ đúng, độ chính xác của quy trình chuẩn bị mẫu

Tính hiệu suất thu hồi theo công thức sau đây:

c

C - CR% = ×100

CTrong đó:

R%: Hiệu suất thu hồi (%)

C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Bảng 2.3 Độ thu hồi chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theoAOAC) Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%)

Tiến hành thực hiện trên 20 mẫu trắng đã được thêm chuẩn ethoxyquin vào mẫu sao cho hàm lượng khá nhỏ Phân tích các mẫu giống như mẫu thử để tính độ lệch chuẩn của mẫu (SD)

LOD = x + 3SDLOD = x + 10SD

i i=1(x - x)

x̅: Kết quả trung bình của n lần

Dựa trên tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)

Thực hiện phân tích trên mẫu trắng, mẫu thêm chuẩn, mẫu chuẩn và mẫu thử ít nhất 6 lần theo quy trình phân tích của mẫu thử Xác định tỉ lệ tín hiệu chia cho nhiễu S/N

Giá trị LOD chấp nhận tại nồng độ thỏa mãn được yêu cầu: 3  S/N 10 hoặc chấp nhận tại nồng độ mong muốn với S/N > 3 Khi đó, giới hạn phát hiện của phương pháp LOD được tính theo công thức: