Chiết xuất và phân lập các anthocyanin từ rubus idaeus với sự hỗ trợ của sóng siêu âm

ĐẶT VẤN ĐỀ Trở về với thiên nhiên đang là xu hướng chung của nhân loại trên nhiều lĩnh vực, trong đó có dược phẩm. Chính vì lẽ đó, nghiên cứu về cây thuốc và các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên đang là một trong những vấn đề được quan tâm hàng đầu của nhiều nhà khoa học trên thế giới.Trong đó, việc nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên có tác dụng chống oxy hóa ngày càng được quan tâm và có tiềm năng ứng dụng rất lớn. Theo đông y, phúc bồn tử ( Rubus idaeus L.) là một trong những vị thuốc có tác dụng chống oxy hóa rất tốt. Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy hợp chất anthocyanin trong phúc bồn tử giữ vai trò chính trong tác dụng chống oxy hóa. Anthocyanin trong quả phúc bồn tử có hàm lượng khá cao nên việc chiết xuất anthocyanin là hoàn toàn khả thi và có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tiễn. Tuy nhiên, việc chiết xuất bằng dung môi với những kĩ thuật cổ điển thường tốn nhiều thời gian và mang lại hiệu quả thấp. Hơn nữa, nhiệt độ chiết xuất trong một thời gian dài có thể gây ra sự thay đổi cấu trúc các anthocyanin và làm giảm đi hoạt tính chống oxy hoá của những dược chất này. Theo các nghiên cứu gần đây, phương pháp chiết xuất có sự hỗ trợ của sóng siêu âm với nhiều tính năng ưu việt đã được ứng dụng rộng rãi. Chính vì thế, trong phạm vi bài báo cáo này chúng tôi quyết định chọn đề tài: “ Chiết xuất và phân lập các anthocyanin từ Rubus idaeus với sự hỗ trợ của sóng siêu âm” với các mục tiêu: Chiết xuất và phân lập anthocyanin bằng phương pháp chiết siêu âm. Xác định các anthocyanin thu được bằng HPLCMS. So sánh kết quả thu được với phương pháp chiết xuất thông thường. Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái niệm về siêu âm:1 1.1.1. Định nghĩa siêu âm: Sóng âm thanh là những dao động cơ học trong một chất rắn, chất lỏng, chất khí. Siêu âm là sóng âm có tần số trên 20 KHz mà con người không thể nghe thấy.Âm thanh mà con người nghe được có tần số từ 1–16 KHz. Thiết bị tạo siêu âm (sừng siêu âm), thanh titan được ngâm vào trong dung dịch phản ứng để truyền động thông qua sự rung. 1.1.2. Lợi ích của siêu âm trong chiết xuất: Chiết xuất nhờ siêu âm là một cách hiệu quả để thu được một lượng đáng kể những chất cần phân tích từ nhiều loại mẫu khác nhau. Nhiệt độ và áp suất rất cao tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình hòa tan, khuếch tán, vận chuyển, thâm nhập xảy ra dễ dàng hơn. Các quá trình trên phụ thuộc vào năng lượng siêu âm và một chất nền rắn, kết hợp với năng lượng oxy hóa những gốc tự do (hydroxyl và hydrogen peroxide) tạo ra trong suốt quá trình phân tích sẽ mang lại năng suất chiết xuất cao. 1.2. Tổng quan về phúc bồn tử: 1.2.1 Phúc bồn tử: Tên khoa học: Rubus idaeus L. Tên khác: Mâm xôi đỏ. Họ: Hoa hồng ( Rosaceae). 1.2.1.1. Hình thái2: Cây nhỡ, thân bụi, cao khoảng 1.5 mét, lá kép có từ 3 đến 5 lá chét, lá chét giữa thường lớn hơn và có cuống dài hơn so với các lá chét còn lại. Cụm hoa hình chùm, nhiều nhị, nhiều lá noãn đỏ, khi chín tạo thành quả kép có mảu đỏ tươi, vị chua, ăn được. 1.3. Tổng quan về Anthocyanin:3 1.3.1. Tính chất Anthocyanin tồn tại đa số trong các thực vật bậc cao, được tìm thấy trong một số loại rau, hoa, quả, hạt có màu từ đỏ đến tím như: quả nho, quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, hoa hibicut, đậu đen, quả cà tím, gạo nếp than, gạo đỏ... CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 2.1 Chiết xuất Anthocyanin toàn phần từ quả phúc bồn tử: 2.1.1. Quy trình chiết xuất được hỗ trợ bởi sóng siêu âm 60 ± 0.5g mẫu quả ướp lạnh được làm nát thành những mảnh có kích thước 34 mm và cho vào bình 2 cổ có chứa sẵn dung môi chiết xuất HCl 1.5M : ethanol 95% (15:85) với hệ thống làm lạnh (dung tích bình được chọn dựa vào khả năng hòa tan của mẫu trong dung dịch chiết xuất). Bình được ngâm vào bể nước lạnh có kích thước 250 x 240 x 150mm trong buồng siêu âm với nguồn phát sóng siêu âm có công suất 650W, đường kính đầu phát siêu âm 8mm được đặt vào bể ở vị trí ½ chiều cao bể, tần số phát siêu âm 22kHz. Nhiệt độ được duy trì dưới 400C bằng cách thay thế nước trong bể bằng nước lạnh (150C). Bình được lấy ra và làm nguội đến nhiệt độ phòng bằng nước lạnh. Lọc qua giấy lọc Whatman No.1 dưới chân không và dung dịch được thu gom vào bình định mức. Phần còn lại được chiết xuất lần nữa với cùng điều kiện. Các anthocyanin qua 2 lần chiết xuất sẽ được dùng để phân tích. 2.1.3. Tinh khiết hóa các Anthocyanin9: Nhựa Amberlite CG50 (50g mỗi lần) được hydrate hóa bằng cách cho vào becher thêm ít nước và gạn, lặp lại vài lần. Nhựa sau khi trương nỡ được nạp vào cột kích thước 26 x 400 mm. 2.1.5. Kết quả chiết xuất: Tiến hành chiết xuất với những điều kiện tối ưu: Tỉ lệ dung môi và dược liệu: 4:1(mlg). Thời gian chiết xuất: 200s Năng lượng siêu âm: 400W Ta thu được 34,5 mg anthocyanidin từ 100g quả tươi. Khoảng 78.13% tổng số bột màu đỏ. Các anthocyanin được xác định bởi HPLCMS và kết quả là 12 loại anthocyanin đã được xác định, trong đó có 8 loại anthocyanidin đặc trưng.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trở về với thiên nhiên đang là xu hướng chung của nhân loại trên nhiều lĩnh vực,trong đó có dược phẩm Chính vì lẽ đó, nghiên cứu về cây thuốc và các hoạt chất cónguồn gốc thiên nhiên đang là một trong những vấn đề được quan tâm hàng đầu củanhiều nhà khoa học trên thế giới.Trong đó, việc nghiên cứu về các hợp chất thiênnhiên có tác dụng chống oxy hóa ngày càng được quan tâm và có tiềm năng ứngdụng rất lớn

Theo đông y, phúc bồn tử ( Rubus idaeus L.) là một trong những vị thuốc có tác

dụng chống oxy hóa rất tốt Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy hợp chấtanthocyanin trong phúc bồn tử giữ vai trò chính trong tác dụng chống oxy hóa.Anthocyanin trong quả phúc bồn tử có hàm lượng khá cao nên việc chiết xuấtanthocyanin là hoàn toàn khả thi và có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tiễn.Tuy nhiên, việc chiết xuất bằng dung môi với những kĩ thuật cổ điển thường tốnnhiều thời gian và mang lại hiệu quả thấp Hơn nữa, nhiệt độ chiết xuất trong mộtthời gian dài có thể gây ra sự thay đổi cấu trúc các anthocyanin và làm giảm đi hoạttính chống oxy hoá của những dược chất này Theo các nghiên cứu gần đây, phươngpháp chiết xuất có sự hỗ trợ của sóng siêu âm với nhiều tính năng ưu việt đã đượcứng dụng rộng rãi Chính vì thế, trong phạm vi bài báo cáo này chúng tôi quyết định

chọn đề tài: “ Chiết xuất và phân lập các anthocyanin từ Rubus idaeus với sự hỗ trợ

của sóng siêu âm” với các mục tiêu:

- Chiết xuất và phân lập anthocyanin bằng phương pháp chiết siêu âm

- Xác định các anthocyanin thu được bằng HPLC-MS

- So sánh kết quả thu được với phương pháp chiết xuất thông thường

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Khái niệm về siêu âm:[1]

1.1.1 Định nghĩa siêu âm:

Sóng âm thanh là những dao động cơ học trong một chất rắn, chất lỏng, chấtkhí Siêu âm là sóng âm có tần số trên 20 KHz mà con người không thể nghethấy.Âm thanh mà con người nghe được có tần số từ 1–16 KHz

Thiết bị tạo siêu âm (sừng siêu âm), thanh titan được ngâm vào trong dung dịch phản ứng để truyền động thông qua sự rung.

1.1.2 Lợi ích của siêu âm trong chiết xuất:

Chiết xuất nhờ siêu âm là một cách hiệu quả để thu được một lượng đáng kểnhững chất cần phân tích từ nhiều loại mẫu khác nhau Nhiệt độ và áp suất rất caotạo điều kiện thuận lợi cho quá trình hòa tan, khuếch tán, vận chuyển, thâm nhậpxảy ra dễ dàng hơn Các quá trình trên phụ thuộc vào năng lượng siêu âm và mộtchất nền rắn, kết hợp với năng lượng oxy hóa những gốc tự do (hydroxyl vàhydrogen peroxide) tạo ra trong suốt quá trình phân tích sẽ mang lại năng suất chiếtxuất cao

Tác động cơ học của siêu âm làm cho dung môi thấm sâu hơn vào cấu trúc tếbào và cải thiện khả năng chuyển khối Siêu âm cũng có thể phá vỡ vách tế bào, tạođiều kiện cho hoạt chất được giải phóng Sự phá vỡ vách tế bào và khả năng chuyển

khối cao là hai yếu tố chính làm tăng hiệu quả chiết xuất khi sử dụng sóng siêu âm.Những hình ảnh hiển vi điện tử đã chứng minh tác động cơ học của siêu âm, chủyếu là sự phá vỡ vách tế bào và giải phóng hoạt chất.

Sóng siêu âm đã được sử dụng để chiết xuất nhiều nhóm hợp chất từ dượcliệu, ví dụ như tinh dầu, chất béo, và những chất bổ sung dinh dưỡng Mason vàcộng sự đã đưa ra một cái nhìn tổng quát về ứng dụng của siêu âm trong công nghệthực phẩm Còn Vinatoru lại phác họa tổng quan về việc sử dụng siêu âm để chiếtxuất những chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu

Chiết siêu âm được xem như là một phương pháp hiệu quả để chiết xuất

những chất có hoạt tính sinh học từ Solvia officinalis (Salisova và cộng sự, 1997) và hoa Hibiscus tiliaceus L (Melecchi và cộng sự, 2002), những chất chống oxi hóa từ Rosmarinus officinalis (Albu và cộng sự, 2004), steroid và triterpenoid từ Chresta spp (Schinor, Salvador, Turatti, Zucchi và Dias, 2004)

1.1.3 Cơ chế vật lí của siêu âm (Sonophysic):

Trong một chất lỏng, sự dãn nở của sóng âm tạo ra một áp suất âm Nếu sóngsiêu âm đủ mạnh, nó sẽ tạo ra những bong bóng bên trong chất lỏng Đó cũng là lúc

áp suất âm vượt quá sức căng cục bộ của chất lỏng, bình thường áp suất âm này phụthuộc vào bản chất và độ tinh khiết của chất lỏng Quá trình sủi bong bóng này chỉkéo dài trong vòng 400 s Hầu hết các chất lỏng đều bị nhiễm một lượng lớn nhữngphần tử nhỏ đủ để làm cho sự sủi bọt khởi đầu dễ dàng hơn ở một áp suất âm thấphơn

Khi sự sủi bong bóng xảy ra trong một chất lỏng gần với bề mặt của một chấtrắn thì động lực học của những bọt nước thay đổi một cách đột ngột Trong nhữngchất lỏng tinh khiết, bọt nước vẫn giữ được dạng hình cầu khi chúng xẹp lại, bề mặtcủa chúng vẫn không thay đổi Tuy nhiên, gần tới ranh giới chất rắn, chúng xẹp lạikhông đối xứng, tạo ra những tia chất lỏng bắn ra với tốc độ cao Năng lượng điệnthế của quá trình dãn nở bọt nước sẽ chuyển thành năng lượng động học trong mộttia chất lỏng, nó sẽ di chuyển suốt bên trong và xuyên qua thành đối diện của bọtnước Những tia chất lỏng bắn ra với tốc độ gần 400 km/giờ và va chạm mạnh với

bề mặt chất rắn Điều này có thể gây ra những tổn thương nghiêm trọng tại vùng vachạm và làm cho bề mặt tiếp xúc có khả năng phản ứng lại ở mức độ cao

Ảnh được chụp bởi máy quay vi phim cảm ứng laser tốc độ cao Sự

tạo-vỡ bọt gần bề mặt phân cách rắn lỏng, một vòi rất nhỏ được hình thành, bắn

vào bề mặt rắn với vận tốc xấp xỉ 400Km/giờ (111 m/s)

Sự sủi bọt nhờ sóng siêu âm này cho ta thấy mối liên quan độc nhất vô nhịgiữa năng lượng và vật chất Nhiệt độ và áp suất cao được tạo ra sẽ dẫn đến sự hìnhthành của những gốc tự do và nhiều hợp chất khác.Tầm quan trọng của quá trình sủibong bóng đối với hóa học siêu âm không phải là làm thế nào mà hình thành được

những bọt nước mà ở chỗ điều gì sẽ xảy ra khi những bọt nước này xẹp lại Chúng

có thể không hấp thu năng lượng từ sóng siêu âm nữa và sẽ nổ tung Sự nén ép đoạnnhiệt nhanh chóng của những chất khí và hơi bên trong những bọt nước tạo ra nhiệt

độ và áp suất cực lớn Kích thước của những bọt nước rất nhỏ, tương ứng với thểtích chất lỏng, vì vậy, nhiệt độ do nó sinh ra có thể biến mất một cách nhanh chóng

mà không cần có sự thay đổi đáng kể của điều kiện môi trường Sau khi những bọtnước xẹp lại, nhiệt độ hạ xuống với tốc độ khoảng 10 tỉ 0C/giây (nhanh hơn mộttriệu lần khi chúng ta nhúng một thanh sắt nóng đỏ vào trong nước)

Hot spot có nhiệt độ xấp xỉ 5000 o C, áp suất khoảng 1000atm, thời gian sống ngắn hơn 1microsecond, tốc độ gia nhiệt và làm lạnh 10 tỉ độ C/giây.

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu âm:

Sự phân phối sóng siêu âm trong máy chiết cũng là một thông số quan trọngđể thiết kế một máy chiết tốt Năng lượng siêu âm đạt tối đa ở gần bề mặt của đầudò Càng xa đầu dò, cường độ siêu âm giảm khá đột ngột Sự hiện diện của nhữngtiểu phân rắn càng làm giảm cường độ của siêu âm Vì vậy, để tránh việc cản trở

đường đi của sóng siêu âm hay sự hình thành những khối rắn, người ta thườngkhuấy hoặc lắc dung dịch.

Để đạt được hiệu quả chiết xuất cao, chúng ta cần chú ý đến những đặc điểmcủa dược liệu (độ ẩm, kích thước tiểu phân) và dung môi chiết xuất Thêm vào đó,

có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của sóng siêu âm như tần số, áp suất,nhiệt độ và thời gian chiết xuất

Tần số của sóng siêu âm ảnh hưởng lớn đến khối lượng dịch chiết, và nó phụthuộc vào bản chất của dược liệu Một sự thay đổi tần số nhỏ thôi cũng có thể làmtăng khối lượng dịch chiết khoảng 32% trong trường hợp chiết Pyrethrine từ hoaCúc với dung môi hexan rắn Tuy nhiên, khi chiết xuất dầu hạt cây Tùng Lam thìsiêu âm lại có ảnh hưởng kém

1.1.5 Ứng dụng của siêu âm trong phân tích:

Trong hóa học phân tích, sóng siêu âm được sử dụng như một công cụ giatốc cho quá trình phân tích Do đó, sóng siêu âm sẽ giúp ích rất nhiều trong việc xử

lý những mẫu rắn Chẳng hạn, nó sẽ tạo điều kiện dễ dàng và nhanh chóng trongviệc chiết xuất những hợp chấp hữu cơ và vô cơ, quá trình đồng nhất hóa, khí dunghóa…

Sóng siêu âm có thể làm tăng khối lượng chiết xuất Sharma và Gupta (2004)tìm ra rằng việc xử lí trước với sóng siêu âm đã mang lại khối lượng lớn những chấtdầu từ quả hạnh, quả mơ và cám gạo Sản lượng dầu chiết xuất từ hạt đậu tươngcũng tăng rõ rệt nếu sử dụng siêu âm (Li và cộng sự, 2004) Khi chiết saponin từnhân sâm bằng siêu âm, tổng lượng dịch chiết thu được tăng 15% và lượng saponinthu được tăng 30% (Hui và cộng sự, 1994)

Sóng siêu âm còn làm tăng động học chiết xuất, nghĩa là quá trình chiết xuất

sẽ diễn ra nhanh hơn, và thậm chí còn cải thiện chất lượng dịch chiết Cravotto vàcộng sự (2004) đã chỉ ra rằng việc chiết xuất dầu từ cám gạo được thực hiện mộtcách hiệu quả trong vòng 30 phút dưới cường độ cao sóng siêu âm với dung môi làhexan hoặc dung dịch kiềm Tốc độ chiết xuất Carvone và Limonene bằng siêu âm

nhanh gấp 1,3 đến 2 lần so với những phương pháp cổ điển phụ thuộc nhiệt độ(Chemat và cộng sự, 2004) Hơn nữa, khối lượng và chất lượng của Carvone khichiết bằng siêu âm cũng tốt hơn Sóng siêu âm còn được áp dụng trong kỹ thuậtSoxhlet để chiết xuất chất béo từ những hạt có dầu như hướng dương, cải dầu vàđậu tương, thời gian chiết xuất giảm ít nhất một nửa so với các phương pháp cổ điển

mà thành phần dịch chiết thì không đổi (Luque-Garcia và Luque de Castro, 2004)

Wu và cộng sự (2001) đã chiết xuất Saponin từ nhân sâm bằng siêu âm, thời gianchiết xuất tăng gấp 3 lần so với phương pháp Soxhlet cổ điển

1.1.6 Nhược điểm, ưu điểm của chiết siêu âm:

Ưu điểm:

 Đơn giản, rẻ tiền và hiệu quả cao hơn những phương pháp cổ điển

 So với những kỹ thuật khác như chiết vi sóng thì chiết siêu âm rẻ tiền hơn vàvận hành dễ dàng hơn

 Lợi ích chính của việc sử dụng siêu âm trong chiết lỏng-rắn là sự tăng khốilượng dịch chiết và rút ngắn thời gian chiết

 Hơn nữa, chiết siêu âm cũng giống như chiết bằng Soxhlet, có thể dùng bất

kì dung môi nào để chiết xuất những hợp chất thiên nhiên đa dạng

 Giảm được nhiệt độ và áp suất khi chiết Chẳng hạn khi chiết xuất Pyrethrinetừ hoa Cúc bằng hexan rắn mà không sử dụng siêu âm, khối lượng dịch chiết

sẽ tăng theo nhiệt độ chiết xuất và khối lượng tối đa thu được ở 66oC Trongkhi sử dụng sóng siêu âm, ảnh hưởng của nhiệt độ trong khoảng 40 – 60oCtrên khối lượng dịch chiết là không đáng kể Vì vậy, chiết siêu âm thích hợpvới những chất không chịu được nhiệt độ cao khi chiết bằng Soxhlet Tuynhiên, bởi vì sóng siêu âm cũng có thể sinh ra nhiệt, nên chúng ta phải chú ýđiều chỉnh nhiệt độ chiết xuất cho phù hợp Thời gian chiết xuất cũng nênđược xem xét cẩn thận, nếu vượt quá giới hạn cho phép có thể sẽ làm hỏngchất lượng của dịch chiết

1.1.7 So sánh với các phương pháp khác:

Trong nhiều trường hợp, chiết xuất nhờ siêu âm là một lựa chọn hiệu quả, rẻtiền, nhanh chóng hơn những kỹ thật chiết xuất cổ điển, và trong một vài trườnghợp, nó còn hơn cả các phương pháp khác như vi sóng hay dùng CO2 siêu tới hạn.Tuy nhiên siêu âm vẫn có những nhược điểm riêng của nó cần được cân nhắc trướckhi sử dụng

1.1.7.1 Chiết siêu âm và vi sóng:

Ưu điểm của chiết siêu âm so với vi sóng:

 Đôi khi nhanh hơn

 Chiết siêu âm an toàn hơn chiết vi sóng nếu ta có sử dụng acid vì nó khôngđòi hỏi nhiệt độ hay áp suất cao

 Quá trình vận hành đơn giản hơn

Nhược điểm của chiết siêu âm so với vi sóng:

 Sự thoái hóa bề mặt của đầu dò theo thời gian sẽ ảnh hưởng đến hiệu suấtchiết

 Kích thước hạt là nhân tố quyết định trong chiết siêu âm

1.7.1.2 Chiết siêu âm và chất lỏng siêu tới hạn:

Ưu điểm của siêu âm so với so với chất lỏng siêu tới hạn:

 Dụng cụ đơn giản hơn vì vậy chi phí tiêu hao sẽ thấp hơn.

 Có thể áp dụng đối với nhiều hợp chất, kể cả phân cực và không phân cực, vìvậy có thể sử dụng bất kì dung môi nào Trái lại, CO2 siêu tới hạn chỉ dùngđể chiết xuất những hợp chất không phân cực

Nhược điểm của siêu âm so với chất lỏng siêu tới hạn:

 Trong vài trường hợp, chiết bằng CO2 siêu tới hạn sẽ đơn giản và nhanh hơn

 Không giống những dung môi chiết siêu âm (cyclohexane, tetrahydrofuran,hỗn hợp dichloromethane và acetone), CO2 siêu tới hạn không gây ô nhiễmmôi trường

 Chiết siêu tới hạn thường rõ ràng, chính xác hơn có lẽ là do nó sử dụng mộtbể chứa thay vì một đầu dò như chiết siêu âm

1.7.1.3 Chiết siêu âm và Soxhlet:

Ưu điểm của siêu âm so với chiết bằng Soxhlet:

 Sự sủi bong bóng làm gia tăng sự phân cực của hệ thống, bao gồm dung môi,chất phân tích và chất nền, điều này sẽ làm tăng hiệu quả chiết xuất

 Có thể thêm một chất hỗ trợ để tăng hơn nữa độ phân cực của pha lỏng

 Thích hợp với chất không chịu nhiệt, những chất này sẽ bị biến đổi nếu chiếtbằng Soxhlet

 Thời gian chiết xuất ngắn hơn

Nhược điểm của siêu âm so với chiết bằng Soxhlet:

 Dung môi không thể được làm mới trong suốt quá trình chiết xuất, vì vậyhiệu lực của nó là một hàm số phụ thuộc vào hệ số phân ly

 Thời gian lọc và rửa dịch chiết kéo dài, vì vậy sẽ tốn nhiều dung môi, làmmất một lượng dịch chiết hoặc dịch chiết có thể bị nhiễm bẩn Trong khichiết bằng Soxhlet chỉ tốn một lượng nhỏ dung môi

1.1.8 Trang thiết bị:

Có hai thiết bị cơ bản dùng trong phương pháp siêu âm là bể nước và đầu dò.Mặc dù bể nước đã được sử dụng rộng rãi hơn nhưng chúng vẫn có hai bất lợi chủyếu có thể làm giảm độ lặp lại và độ sao chép của thí nghiệm

Thứ nhất là sự giảm năng lượng theo thời gian, vì vậy năng lượng cung cấpcho bể nước sẽ lãng phí Đầu dò siêu âm có một điểm thuận lợi hơn bể nước là nótập trung năng lượng trên một vùng cố định, vì vậy mà quá trình sủi bong bóng diễn

ra hiệu quả hơn

Thứ hai là sự phân phối năng lượng siêu âm không đồng đều, chỉ có mộtphần nhỏ thể tích chất lỏng tiếp xúc trực tiếp với nguồn năng lượng siêu âm mớixảy ra sự sủi bong bóng

1.1.9 Chiết siêu âm cải tiến:

Người ta cải tiến khả năng xử lí mẫu bằng cách chiết siêu âm liên tục Ưuđiểm chính của quá trình chiết này là ít tốn mẫu và thuốc thử, đó là những hóa chấtcần cho sự hòa tan và liên quan đến tốc độ chiết xuất

Sự hữu ích của chiết siêu âm liên tục đã được chứng minh bằng việc chiếtchất sắt trong nguyên liệu thực vật…Sự hình thành phức hợp giữa sắt và 1,10-phenanthroline đã mang lại những kết quả phù hợp với phương pháp cổ điển sửdụng phổ hấp thu nguyên tử sau khi xử lí bằng acid nóng Thời gian chiết siêu âmliên tục chỉ có 5 phút so với 40 phút của phương pháp cổ điển mà kết quả vẫn tương

tự

Có 2 hệ thống chiết siêu âm liên tục:

 Hệ thống kín: dung môi có thể tích nhất định chảy liên tục qua mẫu rắn.

Việc điều khiển dung môi có thể không đổi trong suốt quá trình chiết xuấthoặc được thay đổi sau những khoảng thời gian nhất định bằng cách lập trìnhsẵn Với cách này, dung môi sẽ đi tới đi lui qua mẫu, vì vậy sẽ tránh được sựkết hợp lại thành khối rắn chắc của mẫu và sự gia tăng áp suất bên trong

máy Hệ thống này còn có ưu điểm là dịch chiết ít bị pha loãng Trong mộthệ thống kín, một van có thể chệch hướng với dịch chiết để tập hợp dịchchiết vào trong một lọ nhỏ bằng thủy tinh hoặc chuyển nó đến một ống gópđể tiếp tục phân tích (ví dụ như cô, phát hiện bằng detector…) Điều này làmcho hệ thống vận hành hoàn toàn tự động.

 Hệ thống mở: dung môi tinh khiết chảy liên tục qua mẫu, vì vậy trạng thái

cân bằng chuyển khối được thay thế bởi quá trình hòa tan những chất phântích vào pha lỏng Quá trình này có nhược điểm là làm loãng dịch chiết Việckết hợp dụng cụ chiết với những bước phân tích khác ví dụ như chiết pha rắnvẫn chưa được thực hiện mặc dù sự kết hợp này có thể làm giảm sự phaloãng dịch chiết

Hình 1 Hai hệ thống chiết siêu âm liên tục.

LC, leaching carrier; PP, bơm nhu động; UP, đầu dò siêu âm; EC, bình chiết; WB, bồn nước; W, chất thải; SV, van chọn lọc; EX, dịch chiết;

E, dung môi rửa giải; IV, van tiêm; SPC, cột pha rắn; DR, derivatization reagent; RC reaction coil; D, detector

1.2 Tổng quan về phúc bồn tử:

1.2.1 Phúc bồn tử:

- Tên khoa học: Rubus idaeus L

- Tên khác: Mâm xôi đỏ

- Họ: Hoa hồng ( Rosaceae)

1.2.1.1 Hình thái[2]:

Cây nhỡ, thân bụi, cao khoảng 1.5 mét, lá kép có từ 3 đến 5 lá chét, lá chét giữa thường lớn hơn và có cuống dài hơn so với các lá chét còn lại Cụm hoa hình chùm, nhiều nhị, nhiều lá noãn đỏ, khi chín tạo thành quả kép có mảu

đỏ tươi, vị chua, ăn được

1.2.1.2 Phân bố sinh thái:

Rubus idaeus phân bố rộng khắp ở các khu rừng Châu Âu Hiện nay được trồng nhiều ở một số tỉnh Trung Quốc

Ở Việt Nam, có một số loài như Rubus alceaefolius, Rubus cochinchinenis mọc hoang ở các vùng rừng núi phía Bắc

1.2.1.3 Bộ phận dùng: quả, thu hái khoảng từ tháng 7 đến tháng 9.

Thuộc nhóm euflavonoid, có cấu trúc 2 phenylbenzopyrilium.

Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong các dung môi phân cực

Trong cây hầu hết anthocyanin ở dạng glycosid nằm trong dịch tế bào, dễ bị thuỷ phân cho ra phần aglycon khi đun với dung dịch HCl 20% ( được gọi là

anthocyanidin)

Màu sắc của anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào pH môi trường Cấu trúc của anthocyanidin là 1 cation, trong dung dịch acid có pH 1-4 tạo muối có màu đỏ Trong môi trường kiềm pH > 6 là anion cũng tạo được muối với các chất kiềm có màu xanh

Dung dịch anthoccyanidin mất màu bởi bisulfit kiềm và dễ bị oxy hoá

1.3.2 Công dụng

- Chống oxy hoá: Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng anthocyanin có khả năng chống oxy hoá cao Theo Joseph et al[4] anthocyanin được chiết xuất từ các loại trái cây có hiệu quả trong việc làm chậm sự lão hoá và làm giảm sự suy thoái của các tế bào thần kinh

- Ngoài ra, do có màu sắc tự nhiên và các tác dụng trong y học nên các anthocyanin còn được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chế biến thực phẩm.

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM2.1 Chiết xuất Anthocyanin toàn phần từ quả phúc bồn tử:

2.1.1 Quy trình chiết xuất được hỗ trợ bởi sóng siêu âm

- 60 ± 0.5g mẫu quả ướp lạnh được làm nát thành những mảnh có kích thước 3-4

mm và cho vào bình 2 cổ có chứa sẵn dung môi chiết xuất HCl 1.5M : ethanol 95%(15:85) với hệ thống làm lạnh (dung tích bình được chọn dựa vào khả năng hòa tancủa mẫu trong dung dịch chiết xuất)

- Bình được ngâm vào bể nước lạnh có kích thước 250 x 240 x 150mm trong buồngsiêu âm với nguồn phát sóng siêu âm có công suất 650W, đường kính đầu phát siêu

âm 8mm được đặt vào bể ở vị trí ½ chiều cao bể, tần số phát siêu âm 22kHz Nhiệt

độ được duy trì dưới 400C bằng cách thay thế nước trong bể bằng nước lạnh (150C)

- Bình được lấy ra và làm nguội đến nhiệt độ phòng bằng nước lạnh Lọc qua giấylọc Whatman No.1 dưới chân không và dung dịch được thu gom vào bình địnhmức Phần còn lại được chiết xuất lần nữa với cùng điều kiện Các anthocyanin qua

2 lần chiết xuất sẽ được dùng để phân tích

2.1.2 Quy trình chiết xuất truyền thống[8]:

- 60 ± 0.5 g mẫu quả được ướp lạnh được làm nát thành những mảnh có kích thước3-4mm, hòa tan và điều chỉnh với 240ml HCl 1.5M : ethanol 95% (15:85) và đáybình được làm lạnh

- Nhiệt độ chiết xuất được thiết đặt ở 71 ± 10C

- Quá trình chiết xuất được lấy ra sau 12, 20, 30, 60 phút tương ứng Cácanthocyanin chiết xuất được làm lạnh đến nhiệt độ phòng, lọc qua giấy lọcWhatman No.1 dưới chân không và cho vào bình định mức

- Phần còn lại được chiết tiếp với cùng điều kiện và toàn bộ được dùng để xác địnhanthocyanin

2.1.3 Tinh khiết hóa các Anthocyanin[9]:

- Nhựa Amberlite CG-50 (50g mỗi lần) được hydrate hóa bằng cách cho vào becherthêm ít nước và gạn, lặp lại vài lần Nhựa sau khi trương nỡ được nạp vào cột kíchthước 26 x 400 mm

- Bơm xấp xỉ 15ml dịch chiết xuất vào đầu cột, đợi cho đến khi nhựa chuyển sangmàu đỏ do hấp thu các anthocyanin.

- Đường, acid và hợp chất khác được loại ra khỏi cột bằng cách rửa cột với 100mlnước

- Chất màu được tách ra bằng cách rửa cột với ethanol có chứa HCl 0.01% (khoảng50ml) cho đến khi nhựa trở lại màu sắc ban đầu Dịch ethanol acid cho vào máy côquay ở 450C dưới chân không đến khi ethanol bay hơi, phần còn lại sẽ hòa tan vớiacid HCl 0.5% Dung dịch được bảo quản ở 200C để phân tích

2.1.4 Tối ưu hóa điều kiện chiết siêu âm và chiết xuất các anthocyanin từ phúc bồn tử bằng CCRD (a Central Composite Rotate Design)

Quá trình chiết xuất các anthocyanin có thể bị ảnh hưởng bởi 3 yếu tố: thể tích củadung môi thêm vào có thể bay hơi dẫn đến không tương tác hoàn toàn với mẫu; thờigian siêu âm cũng như năng lượng đặt vào sẽ tác động đến việc tạo ra các vi bọttrong lòng chất lỏng, điều đó sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất Kết quả điều tra

sơ bộ điều kiện chiết xuất siêu âm đã xác định rằng lượng anthocyanin toàn phần

chiết xuất từ phúc bồn tử phụ thuộc rất lớn vào tỉ lệ dung môi:mẫu, thời gian chiết

xuất, và năng lượng siêu âm, do đó một thiết kế mô hình phức hợp xoay quanh điểmtrung tâm (CCRD) để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất siêu âm và kiểm tra nhanh ảnhhưởng của 3 biến số trên chiết xuất anthocyanin toàn phần từ phúc bồn tử Một sơ

đồ hoàn chỉnh liên quan đến 20 điểm thử nghiệm thu được của các điểm chínhđược mô tả ở bảng 1

Các mô hình hồi qui đã được dự đoán (1) như sau

Ở đó, có thể thay đổi mã +1, 0 và -1, minh họa trong bảng 1, khi sử dụng nên thaythế giá trị mã trên

Việc phân tích phương sai cho các mô hình này đã được đưa ra trong bảng 2