Nghiên cứu phát hiện một số đột biến gen ty thể trên bệnh nhân cơ não người việt nam

Nghiên cứu phát hiện một số đột biến gen ty thể trên bệnh nhân cơ não người Việt Nam Trương Thị Huệ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Hóa sinh học; Mã số 62 4

Nghiên cứu phát hiện một số đột biến gen ty thể trên bệnh nhân cơ não người Việt Nam

Trương Thị Huệ

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Hóa sinh học; Mã số 62 42 30 15

Người hướng dẫn: PGS TS Phan Tuấn Nghĩa; PGS TS Nguyễn Thi ̣ Vân Anh

Năm bảo vệ: 2013

Abstract Thu thập mẫu bệnh phẩm và tách chiết DNA tổng số từ các bệnh nhân nghi

bị bệnh do rối loạn ty thể đến khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương Thiết kế mồi đặc hiệu và lựa chọn enzyme giới hạn phù hợp cho việc sàng lọc phát hiện đột biến gen ty thể bằng kỹ thuật PCR-RFLP Xây dựng cách thức phát hiện một số đột biến gen ty thể phổ biến và áp dụng cách thức thiết lập được để sàng lọc các đột biến này ở người Việt Nam, nghiên cứu đột biến gen ty thể ở mức độ gia đình Định lượng

số bản sao mang đột biến bằng phương pháp real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang cải tiến, tìm hiểu sự liên quan giữa mức độ không đồng nhất và tình trạng bệnh

lý của một loại đột biến gen ty thể

Keywords Hóa sinh học; Đột biến gen; Bệnh cơ não; Người Việt Nam

Content

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ty thể là bào quan có mă ̣t trong h ầu hết các tế bào nhân chu ẩn với chức năng chính là sản xuất năng lượng dưới dạng ATP cho tế bào Ty thể tạo ra năng lượng bằng cách oxy hóa các acid hữu cơ và acid béo thông qua quá trình phosphoryl hóa oxy hóa xảy ra bên trong ty thể ATP là nguồn năng lượng lớn được sử dụng cho tất cả các quá trình trao đổi chất cần thiết bên trong tế bào

Ty thể có hệ gen riêng, có cấu trúc sợi đôi, DNA mạch vòng với kích thước 16.569 bp, gồm 37 gen mã hóa cho 13 chuỗi polypeptide của chuỗi vận chuyển điện tử, 22 RNA vận chuyển (tRNA) và 2 RNA ribosome (rRNA) khác nhau liên quan đến hoạt động chức năng của ty thể So với DNA của nhân tế bào thì DNA của ty thể dễ bị tổn thương do ty thể là một môi trường giàu chất oxy phản ứng và do thiếu cơ chế sửa chữa hiệu quả dẫn đến nhiều đột biến xuất hiện trong hệ gen ty thể Năm 1988, Wallace và tập thể đã công bố đột biến điểm đầu tiên trên hệ gen ty thể người gây bệnh liên quan đến thần kinh thị giác di truyền theo Leber (Leber’s hereditary optic neuropathy - LHON) Sự mất đoạn mtDNA cũng được tìm thấy ở mô cơ của bệnh nhân liệt cơ mắt ngoài tiến triển mãn tính (chronic progressive external ophthalmoplegia - CPEO) và hội chứng Kearns-Sayre (KSS) cũng được phát hiện vào cùng năm 1988 Cho đến nay, hơn 300 đột biến khác nhau trong hệ gen ty thể người đã được xác định, trong đó có hơn 200 đột biến có khả năng gây bệnh và kèm theo nhiều hội chứng khác nhau

Gần như tất cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lượng ổn định do ty thể cung cấp,

do đó những sai hỏng trong DNA của ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống ảnh hưởng đến nhiều loại tế bào, nhiều loại mô và tổ chức Các bệnh do đột biến gen ty thể có thể khởi phát ở mọi lứa tuổi với diễn biến khác nhau Mức độ nghiêm trọng của bệnh ty thể tăng theo

độ tuổi và tỷ lệ DNA ty thể (mtDNA) đột biến có mặt trong các mô bị tác động Biểu hiện lâm sàng do các rối loạn ty thể thay đổi rất lớn, có thể liên quan đến nhiều cơ quan phức tạp hoặc đặc trưng cho từng mô Các triệu chứng lâm sàng hay thấy ở não, cơ, mắt và giác quan Các triệu chứng đó có thể kết hợp với nhau trong các hội chứng riêng biệt như hội chứng KSS, hội chứng não giật cơ kèm theo sợi cơ đỏ xé rách (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres – MERRF), hội chứng não giật cơ, tăng acid lactic máu và giả tai biến mạch (mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes – MELAS) hoặc viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh (hội chứng Leigh) Tuy nhiên các triệu chứng đó cũng có thể không nằm trong một bệnh cảnh cụ thể nào, một vài đột biến thể hiện kiểu hình tương tự nhau làm cho việc chẩn đoán bệnh dựa trên lâm sàng trở nên rất khó khăn Vì vậy bệnh do đột biến gen ty thể khó có được những chẩn đoán chính xác nếu chỉ dựa vào các triệu chứng lâm sàng và các chỉ tiêu cận lâm sàng Hiện nay, phân tích DNA là những phương pháp hiện đại nhất cho phép phát hiện nhanh và chính xác các đột biến gen gây bệnh Nghiên cứu các đột biến trong hệ gen ty thể cho phép phát hiện ra nguyên nhân của nhiều bệnh khác nhau

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh do đột biến gen ty thể Tuy nhiên, do tính phức tạp trong tác động lâm sàng, mô bệnh học, cơ chế phát sinh và

biểu hiện bệnh nên sự sai sót trong hệ gen ty thể ở nhiều bệnh nhân vẫn chưa được phát hiện

và không có phương pháp điều trị hiệu quả

Ở Việt Nam, bệnh do đột biến gen ty thể còn ít được nghiên cứu, cho đến nay chỉ mới

có một vài công trình mang tính chất khởi đầu trong phát hiện bệnh ty thể ở mức độ gen và protein Đặc biệt, chưa có công trình nào đi sâu nghiên cứu mức độ không đồng nhất (heteroplasmy) của đột biến gen ty thể cũng như sự liên quan giữa mức độ không đồng nhất

với triệu chứng lâm sàng của bệnh

Đề tài luận án của chúng tôi được đặt ra với mục tiêu áp dụng và thiết lập phương pháp phân tích chính xác và xác định mức độ không đồng nhất một số đột biến gen ty thể ở các bệnh nhân người Việt Nam nhằm góp phần vào công tác khám và điều trị các bệnh do rối loạn hệ gen ty thể

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Xây dựng được cách thức phát hiện một số đột biến gen ty thể phổ biến và sàng lọc các đột biến gen ty thể này ở bệnh nhân cơ não (encephalomyopathy)

- Thiết lập được phương pháp xác định mức độ không đồng nhất của một loại đột biến gen ty

thể (MELAS) để bước đầu tìm hiểu mối liên quan giữa mức độ không đồng nhất và tình trạng

bệnh lý

3 Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài

Đối tượng nghiên cứu của đề tài:

Các bệnh nhân nghi bị bệnh do rối loạn ty thể đến khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

- Thu thập mẫu bệnh phẩm và tách chiết DNA tổng số từ các bệnh nhân nghi bị bệnh

do rối loạn ty thể đến khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương

- Thiết kế mồi đặc hiệu và lựa chọn enzyme giới hạn phù hợp cho việc sàng lọc phát hiện đột biến gen ty thể bằng kỹ thuật PCR-RFLP

- Xây dựng cách thức phát hiện một số đột biến gen ty thể phổ biến và áp dụng cách thức thiết lập được để sàng lọc các đột biến này ở người Việt Nam, nghiên cứu đột biến gen ty thể ở mức độ gia đình

- Định lượng số bản sao mang đột biến bằng phương pháp real-time PCR sử dụng mẫu

dò huỳnh quang cải tiến, tìm hiểu sự liên quan giữa mức độ không đồng nhất và tình trạng bệnh lý của một loại đột biến gen ty thể

4 Địa điểm thực hiện đề tài

Các nghiên cứu của luận án được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

5 Đóng góp mới của đề tài

- Đã thiết lập được cách thức phát hiện 15 loại đột biến điểm trong hệ gen ty thể ở người Việt Nam bao gồm: các đột biến T3271C và T3291C (hội chứng MELAS); A8344G và T8356C (hội chứng MERRF); G11778A, G3460A và T14484C (hội chứng LHON); T8993G/C và T9176G (hội chứng Leigh), A1555G (hội chứng điếc) và các đột biến G4298A,

T10010C, T14727C, T14728C và T14709C (hội chứng cơ não nói chung)

- Thiết lập được phương pháp phát hiện và định lượng mức độ không đồng nhất của đột biến A3243G thuộc hội chứng MELAS và bước đầu cho thấy mối liên quan giữa mức độ không đồng nhất và tình trạng bệnh lý

- Là công trình đầu tiên phát hiện thấy đột biến mới T14727C trên gen MTTE mã hóa cho tRNA Glu ở bệnh nhân cơ não

6 Ứng dụng thực tiễn của đề tài

Cách thức phát hiện các đột biến gen ty thể đã được tạo ra trong nghiên cứu này có thể

dễ dàng phát triển thành các quy trình để áp dụng vào việc xét nghiệm bệnh do rối loạn ty thể

ở các bệnh viện

Reference

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I Tài liệu Tiếng Việt

1 Lê Đức Hinh, Lê Văn Thính, Nguyễn Vượng, Trần Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Bích

Nhi, Phan Văn Chi (2007), “Hội chứng MELAS”, Y học lâm sàng 18, tr 27-31

2 Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phạm Vân Anh, Phan Văn Chi (2006), “Phân tích hệ protein huyết thanh của bệnh nhân mang đột biến A3243G trong gen tRNALeu ty

thể”, Y học Việt Nam 4, tr 24-28

3 Trần Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Bích Nhi, Lê Đức Hinh, Phan Văn Chi (2007), “Báo cáo trường hợp: một bệnh nhân MELAS Việt Nam mang đột biến A3243G hệ gen tRNALeu ty thể”, Tạp chí Y học Việt Nam 1, tr 4-9

4 Trịnh Lê Phương, Chu Văn Mẫn, Phan Tuấn Nghĩa (2009), “Phát hiện đột biến gen

A3243G của hội chứng MELAS bằng phương pháp PCR-RFLP cải tiến”, Tạp chí Di truyền và ứng dụng 4, tr 6-9

5 Lê Thị Bích Thảo, Đỗ Quỳnh Hoa, Nguyễn Bích Nhi, Nông Văn Hải, Phan Văn Chi, Phạm Thị Vân Anh, Ninh Thị Ứng (2004), “Xác định đột biến A3243G trên gen tRNALeu ty thể từ các bệnh nhân mắc bệnh ty thể”, Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, tr 463-465

II Tài liệu Tiếng Anh

6 Aharoni S , Traves T.A., Melamed E., Cohen S., Silver E.L (2010), “MELAS syndrome associated with both A3243G-tRNALeu mutation and multiple mitochondrial

DNA deletions”, J Neurol Sci 296, pp 101–103

7 Akagi M., Inui K., Tsukamoto H., Sakai N., Muramatsu T., Yamada M., Matsuzaki K., Goto Y., Nonaka I., Okada S (2002), “A point mutation of mitochondrial ATPase 6

gene in Leigh syndrome”, Neuromuscul Disord 12, pp 53-55

8 Alston C.L., Lowe J., Turnbull D.M., Maddison P., Taylor R.W (2010), “A novel mitochondrial tRNAGlu (MTTE) gene mutation causing chronic progressive external

ophthalmoplegia at low levels of heteroplasmy in muscle”, J Neurol Sci 98, pp

140-144

9 Anderson S., Bankier A.T., Barrell B.G., deBruijin M.H., Coulson A.R., Drouin J., Eperon I.C., Nierlich D.P., Rose B.A., Sanger F., Schreier P.H., Smith A.J.H., Staden R., Young I G (1981), “Sequence and organization of the human mitochondrial

genome”, Nature 290, pp 457-465

10 Andreu A.L., Bruno C., Dunne T.C., Tanjik K., Shanske S., Sue C.M., Krishna S., Hadjigeorgiou G.M., Shtilbans A., Bonilla E., DiMauro S (1999), “A nonsense mutation (G15059A) in the cytochrome b gene in a patient with exercise intolerance and

myoglobinuria”, Ann Neurol 45, pp 127-130

11 Andreu A.L., Hanna M.G., Reichmann H., Bruno C., Penn A.S., Tanji K Panllotti F., Iwata S., Bonilla E., Lach B., Morgan-Hughes J., Dimauro S (1999), “Exercise

intolerance due to mutations in the cytochrome b gene of mitochondrial DNA”, New Engl J Med 341, pp 1037-1044

12 Ayed I.B., Chamkha I., Mkaouar-Rebai E., Kammoun T., Mezghani N., Chabchoub I., Aloulou H., Hachicha M., Fakhfakh F (2011), “A Tunisian patient with Pearson syndrome harboring the 4.977 kb common deletion associated to two novel large-scale

mitochondrial deletions”, Biochem Biophys Res Commun 411, pp 381-386

13 Bai R.K., Wong L.J.C (2004), “Detection and quantification of heteroplasmic mutant mitochondrial DNA by real-time amplification refractory mutation system quantitative

PCR analysis: A single-step approach”, Clin Chem 50, pp 996–1001

14 Ballinger S.W., Schurr T.G., Torroni A., Gan Y.Y., Hodge J.A., Hassan K., Chen K.H., Wallace D.C (1992), “Southeast Asian mitochondrial DNA analysis reveals genetic

continuity of ancient Mogoloid migrations”, Genetics 130, pp 139-152

15 Baughman J.M., Mootha V.K (2006), “Buffering mitochondrial DNA variation”,

Nature Genet 38, pp 1232 – 1233

16 Berdanier C D (2005), Mitochondria in healthy and disease, CRC Press

17 Black G.C.M., Morten K., Laborde A., Poulton J (1996), “Leber's hereditary optic neuropathy: heteroplasmy is likely to be significant in the expression of LHON in families with the 3460 ND1 mutation”, Br J Ophthalmol

80, pp 915-917

18 Boulet L., Karpati G., Shoubridge E.A (1992), “Distribution and threshold expression

of the tRNALys mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and

ragged-red fibers (MERRF)”, Am J Hum Genet 51, pp 1187-1200

19 Budowle B., Chakraborty R., Giusti A.M., Eisenberg A.J., Allen R.C (1991), “Analysis

of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE”, Am J Hum Genet 48, pp 137-144

20 Calvaruso M.A., Willemsen M.A., Rodenburg R.J., Brand M.V.D., Smeitink J.A.M., Nijtmans L (2011), “New mitochondrial tRNAHIS

mutation in a family with lactic

acidosis and stroke-like episodes (MELAS)”, Mitochondrion 11, pp 778-782

21 Chinnery P.F., Brown D.T., Andrews R.M., Singh-Kler R., Riordan-Eva P., Lindley J., Applegarth D.A., Turnbull D.M., Howell N (2001), “The mitochondrial ND6 gene is a

hot spot for mutations that cause Leber’s hereditary optic neuropathy”, Brain 124, pp

209-218

22 Chinnery P.F (2002), “Inheritance of mitochondrial disorders”, Mitochondrion 2, pp

149-155

23 Chinnery P.F (2006) “Mitochondrial DNA in Homo Sapiens”, Nucleic Acids Mol Biol 18, pp 3-11

24 Cao Y., Ma Y., Zhang Y., Li Y., Fang F., Wang S., Bu D., Xu Y., Pei P., Li L., Xiao Y., Wua H, Yang Y., Zou L., Qi Y (2010), “Detection of eight frequently encountered point mutations in mitochondria in Chinese patients suggestive of mitochondrial

encephalomyopathies”, Mitochondrion 10, pp 330–334

25 De Coo I.F., Renier W.O., Ruitenbeek W., Ter Laak H.J., Bakker M., Schagger H., Van Oost B.A., Smeets H.J (1999), “A 4-base pair deletion in the mitochondrial cytochrome

b gene associated with parkinsonism/Melas overlap syndrome”, Ann Neurol 45, pp

130-133

26 Deschauer M., Wieser T., Neudecker S., Lindner A., Zierz S (1999), “Mitochondrial A3243G mutation (MELAS mutation) associated with painful muscle stiffness”,

Neuromuscul Disord 9, pp 305-307

27 Du W., Li W., Chen G., Cao H., Tang H., Tang X., Jin Q., Sun Z., Zhao H., Zhou W.,

He S., Lva Y., Zhao J., Zhang X (2009), “Detection of known base substitution mutations in human mitochondrial DNA of MERRF and MELAS by biochip

technology”, Biosen Bioelectron 24, pp 2371-2376

28 Enns G.M., Bai R.K., Beck A.E., Wong L.J (2006), “Molecular–clinical correlations in

a family with variable tissue mitochondrial DNA T8993G mutant load”, Mol Genet Metab 88, pp 364–371

29 Fan H., Civalier C., Booker J.K., Gulley M.L., Prior T.W, Farber R.A (2006),

“Detection of common disease-causing mutations in mitochondrial DNA

(Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis with stroke-like episodes MTTL1 A3243G and myoclonic epilepsy associated with ragged-red fibers MTTK A8344G) by real-time polymerase chain reaction”, J Mol Diagn 8, pp 277-281

30 Fawcett D.W (1981), The Cell, W B Saunders Company, NewYork

31 Gal A., Komlosi K., Maasz A., Pentelenyi K., Remenyi V., Ovary C., Valikovics A., Dioszeghy P., Bereczki D., Melegh B., Molnár M.J (2010), “Analysis of mtDNA

A3243G mutation frequency in Hungary”, Cent Eur J Med 5, pp 322-328

32 Genasetti A., Valentino M.L., Carelli V., Vigetti D., Viola M., Karousou E.G., d’Eril G.V.M., De Luca G., Passi A., Pallotti F (2007), “Assessing heteroplasmic load in Leber’s hereditary optic neuropathy mutation G3460A/MT-ND1 with a real-time PCR

quantitative approach”, J Mol Diagn 9, pp 538-545

33 Glatz C., D’Aco K., Smith S., Sondheimer N (2011), “Mutation in the mitochondrial tRNAVal causes mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like

episodes”, Mitochondrion 11, pp 615–619

34 Goto Y., Nonaka I., Horai S (1990), “A mutation in the tRNALeu(UUR) gene

associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalomyopathies”, Nature

348, pp 651-653

35 Gropman A.L (2001), “Diagnosis and treatment of childhood mitochondrial diseases”,

Pediatr Neurol 1, pp 185-194

36 Gropman A.L (2004), “The neurological presentations of childhood and adult mitochondrial disease: established syndromes and phenotypic variations”,

Mitochondrion 4, pp 503–520

37 Guan M.X (2011), “Mitochondrial 12S rRNA mutations associated with

aminoglycoside ototoxicity”, Mitochondrion 11, pp 237–245

38 Gvozdjáková A (2008), Mitochondrial medicine, Springer Science + Business Media

B.V

39 Handoko H Y., Lum J K., Rismalia G., Kartapradja H., Sofro A S M., Marzuki S (2001),

“Length variations in the COII-tRNALys intergenic region of mitochondrial DNA in

Indonesian populations”, Hum Biol 73, pp 205-223

40 Holt I.J (2003), Genetics of mitochondrial disease, Oxford University Press Inc.,

NewYork

41 Horvath R., Kemp J.P., Tuppen H.A.L., Hudson G., Oldfors A., Marie S.K.N., Moslemi A.R., Servidei S., Holme E., Shanske S., Kollberg G., Jayakar P., Pyle A., Marks H.M., Holinski-Feder E., Scavina M., Walter M.C., Coku J., Gunther-Scholz A., Smith P.M., McFarland R., Chrzanowska-Lightowlers Z.M.A., Lightowlers R.N., Hirano M., Lochmuller H., Taylor R.W., Chinnery P.F., Tulinius M., DiMauro S (2009),

“Molecular basis of infantile reversible Cyt c oxidase deficiency myopathy”, Brain 132,

pp 3165–3174

42 Houten B.V., Woshner V., Santos J.H (2006), “Role of mitochondrial DNA in toxic

responses to oxidative stress”, DNA Repair 5, pp 145–152

43 Ida H., Rennert O.M., Iwasawa K., Kobayashi M., Eto Y (1999), “Clinical and genetic

studies of Japanese homozygotes for the Gaucher disease L444P mutation”, Hum Genet 105, pp 120-126

44 Ivanova R., Astrinidis A., Lepage V., Djoulah S., Wijnen E., Vu-Trieu A., Hors J., Charron D (1999), “Mitochondrial DNA polymorphism in the Vietnamese population”,

Eur J Immunogenet 26, pp 417- 422

45 Jacobi F.K., Meyer J., Pusch C.M., Wissinger B (2001), “Quantitation of heteroplasmy

in mitochondrial DNA mutations by primer extension using VentR ®(exo-) DNA

polymerase and RFLP analysis”, Mut Res 478, pp 141–151

46 Keightley J.A., Anitori R., Burton M.D., Quan F., Buist N.R., Kennaway N.G (2000),

“Mitochondrial encephalomyopathy and complex III deficiency associated with a

stop-codon mutation in the cytochrome b gene”, Am J Hum Genet 67, pp 1400-1410

47 Kim D.S., Jung D.S., Park K.H., Kim I.J., Kim C.M., Lee W.H., Rho S.K (2002),

“Histochemical and molecular genetic study of MELAS and MERRF in Korean

patients”, J Korean Med Sci 17, pp 103-112

48 Kirby D.M., Milovac T., Thorburn D.R (1998), “A failse -positive diagnosis for the common MELAS (A3243G) mutation caused a novel variant (A3426G) in the ND1

gene mitochondria DNA”, Mol Diagn 3, pp 211-216

49 Kolesnikova O.A., Entelis N.S., Mireau H., Fox T.D., Martin R.P., Tarassov I.A

(2000), “Suppression of mutations in mitochondrial DNA by tRNAs imported from the

cytoplasm”, Science 289, pp 1931-1933

50 Legros F., Chatzoglou E., Frachon P., Ogier De Baulny H., Laforet P., Jardel C., Godinot C., Lombes A (2001), “Functional characterization of novel mutations in the

human cytochrome b gene”, Eur J Hum Genet 9, pp 510-518

51 Letertre C., Perelle S., Dilasser F., Arar K., Fach P (2003), “Evaluation of the

performance of LNA and MGB probes in 5’ nuclease PCR assays” Mol Cell Probes 17,

pp 307-311

52 Liu V.W.S., Shi H.H., Cheung A.N.Y., Chiu P.M., Leung T.W., Nagley P., Wong L.C., Ngan H.Y.S (2001), “High incidence of somatic mitochondrial DNA mutations in

human ovarian carcinomas”, Cancer Res 61, pp 5998-6001

53 Liu C.S., Cheng W.L., Chen Y.Y., Ma Y.S., Pang C.Y., Wei Y.H (2005), “High

prevalence of the COII/tRNALys intergenic 9-bp deletion in mitochondrial DNA of

Taiwanese patients with MELAS or MERRF syndrome”, Ann N.Y Acad Sci 1042,

pp 82-87

54 Loeb L.A., Wallace D.C., Martin G.M (2005), “The mitochondrial theory of aging and

its relationship to reactive oxygen species damage and somatic mtDNA mutations”, Nat Acad Sci 102, pp 18769-18770

55 Lorenzoni P.J., Scola R.H., Kay C.S.K., Arndt R.C., Freund A.A., Bruck I., Santos

M.L.S.F., Lineu C., Werneck L.C (2009), “MELAS-Clinical features, muscle biopsy

and molecular genetics”, Arq Neuropsiquiatr 67, pp 668-676

56 Lu C.Y., Tso D.J, Yang T., Jong Y.J., Wei Y.H (2002), “Detection of DNA mutations

associated with mitochondrial diseases by Agilent 2100 bioanalyzer”, Clin Chimica Acta 318, pp 97-105

57 Lu J., Wang D., Li R., Li W., Ji J., Zhao J., Ye W., Yang L., Qian Y., Zhu Y., Guan M.X (2006), “Maternally transmitted diabetes mellitus associated with the mitochondrial tRNALeu(UUR) A3243G mutation in a four-generation Han Chinese

family”, Biochem Biophys Res Commun 348, pp 115–119

58 Ma Y., Fang F., Yang Y., Zou L., Zhang Y., Wang S., Xu Y., Pei P., Qi Y., (2009),

“The study of mitochondrial A3243G mutation in different samples”, Mitochondrion 9,

pp 139-143

59 Ma Y , Fang F., Cao Y., Yang Y., Zou L., Zhang Y., Wang S., Zhu S., Xu Y., Pei P.,

Qi Y (2010), “Clinical features of mitochondrial DNA m.3243A>G mutation in 47

Chinese families”, J Neurol Sci 291, pp 17–21

60 Mancuso M., Ferraris S., Nishigaki Y., Azan G., Mauro A., Sammarco P., Krishna S., Tay S.K.H., Bonilla E., Romansky S.G., Hirano M., DiMauro S (2005), “Congenital or

late-onset myopathy in patients with the T14709C mtDNA mutation”, J Neurol Sci

228, pp 93-97

61 Martin-Kleiner I., Gabrilovac J., Bradvica M., Vidovi T., Cerovski B., Fumic K., Borani

M (2006), “Leber’s hereditary optic neuroretinopathy (LHON) associated with

mitochondrial DNA point mutation G11778A in two Croatian families”, Coll Antropol

30, pp.171–174

62 Mashima Y., Saga M., Hiida Y., Oguchi Y., Wakakura M., Kudoh J., Shimizu N

(1995), “Quantitative determination of heteroplasmy in Leber's hereditary optic neuropathy by single-strand conformation polymorphism”, Invest Ophthalmol Vis Sci 36, pp 1714-1720

63 Masoro E.J., Austad S.N (2006), Handbook of the biology of aging, 6th Edition, Academic Press, USA

64 McFarland R., Schaefer A.M., Gardner J.L., Lynn S., Hayes C.M., Barron M.J., Walker M., Chinnery P.F., Taylor R.W., Turnbull D.M (2004), “Familial myopathy: new

insights into the T14709C mitochondrial tRNA mutation”, Ann Neurol 55 (4), pp

478-484

65 Mezghania N., Mkaouar-Rebaia E., Mnif M., Charfi N., Rekik N., Youssef S., Abid M., Fakhfakha F (2010), “The heteroplasmic m.14709TNC mutation in the tRNAGlu

gene in two Tunisian families with mitochondrial diabetes”, J Diab Compl 24, pp

270-277

66 Miller F.J., Losenfeldt F.L., Zhang C., Linnane A.W., Nagley P (2003), “Precise

determination of mitochondrial DNA copy number in human skeletal and cardiac

muscle by a PCR-based assay”, Nucleic Acids Res 31, pp 1-7