NGHIÊN cứu TUYỂN CHỌN VI KHUẨN MALOLACTIC và ỨNG DỤNG TRONG sản XUẤT rượu VANG

Nhiều nước trên thế giới đã giải quyết được vấn đề này bằng những nghiên cứu hoàn thi n công ngh sản xuất rượu vang nho đi sâu àm rõ c c cơ chế như: s chuyển hóa c c thành phần trong nho

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về rượu vang 3

1.1.1 Vài nét về rượu vang 3

1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang 4

1.2 Vi khuẩn lactic 7

1.2.1 Phân loại và kiểu hình của các vi khuẩn lactic trong rượu vang 10

1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni 11

1.3 Quá trình lên men malolactic 12

1.3.1 Bản chất của quá trình lên men malolactic 12

1.3.2 Vai trò của quá trình lên men malolactic 14

1.3.3 Ảnh hưởng của quá trình lên men malolactic đến thành phần và chất lượng rượu vang 15

1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện quá trình lên men malolactic 18

1.4.1 Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic 18

1.4.2 Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hoá axít malic 19

1.4.3 Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza trong sản xuất vang 20

1.5 Các phương pháp lên men malolactic và khả năng ứng dụng để nâng cao chất lượng rượu vang 21

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Nguyên liệu, chủng vi sinh và hóa chất 25

2.1.1 Nguyên liệu 25

2.1.2 Vi sinh vật 25

2.1.3 Môi trường phân lập vi sinh vật 25

2.1.4 Hóa chất 26

2.1.5 Dụng cụ máy móc, thiết bị 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Phương pháp công nghệ 26

2.2.2 Phương pháp vi sinh vật 27

2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa 28

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rượu vang 31 3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn malolactic tại Ninh Thuận 31

3.1.2 Xác định khả năng lên men malolactic của các chủng vi khuẩn phân lập 33

3.1.3 Xác định khả năng chịu SO 2 của 02 chủng vi khuẩn malolactic phân lập được 36 3.2 Nghiên cứu quá trình lên men malolactic của Chủng NT9 và Chủng NT12 trên môi trường rượu vang non 37

3.3 Nghiên cứu khả năng tạo chất thơm của các chủng vi khuẩn malolactic 42 3.4 Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ưu quá trình lên men malolactic O.oeni NT12 44

3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất dinh dưỡng bổ sung đến quá trình lên men malolactic 44

3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men malolactic 47

3.4.3 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic đến chất lượng rượu vang 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân tích rượu vang đỏ trước và sau ên men ma o actic 15

Bảng 3.1 Đặc tính sinh ý của c c chủng vi khuẩn actic phân ập được 31

Bảng 3.2 Đặc tính trao đổi chất của c c chủng vi khuân actic phân ập được 34

Bảng 3.3Khả n ng ên men ma o actic của 8 chủng vi khuẩn phân ập được 35

Bảng 3.4 Hàm ượng axít ma ic và axít actic trước và sau ên men Ma o actic trên môi trường nước nho axít (AG) được su phit hóa với hàm ượng K2S2O5. bổ sung etano tới nồng độ 14%v/v 37

Bảng 3.5 Hàm ượng axít ma ic trước và sau qu tr nh ên men ma o actic của 2 chủng vi khuẩn ma o actic trên môi trường rượu vang non 38

Bảng 3.6 Hàm ượng axít actic trước và sau qu tr nh ên men ma o actic của 2 chủng vi khuẩn ma o actic trên môi trường rượu vang non 39

Bảng 3.7 Hàm ượng axít axetic trước và sau ên men ma o actic của 2 chủng vi khuẩn malolactic 40

Bảng 3.8 Hàm ượng diaxety trước và sau ên men ma o actic của 2 chủng vi khuẩn malolactic 41

Bảng 3.9 Một số chất bay hơi tạo thành sau qu tr nh ên men ma o actic của 02 chủng 43

Bảng 3.10 Thành phần dịch vang non sau khi ên men rượu 45

Bảng 3.11 Hàm ượng axít ma ic (g/ ) được phân giải trong qu tr nh tàng trữ có bổ sung dinh dưỡng kh c nhau theo thời gian 46

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nhi t độ đến s chuyển hóa axít ma o aic thành axít actic trong qu tr nh ên men ma o actic 48

Bảng 3.13 Thành phần của rượu vang sau khi kết thúc qu tr nh ên men ma o actic 49

Bảng 3.14 Thời gian ên men và hàm ượng axít malic, axít lactic sau qu tr nh ên men malolactic ở c c thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic kh c nhau 51

Bảng 3.15 Rượu etano được tạo thành và hàm ượng đường sót sau qu tr nh ên men malolactic 52

Bảng 3.16 S tạo thành 1 số chất bay hơi được tạo thành sau qu tr nh ên men malolactic 53

DANH MỤC CÁC HÌNH

H nh 1.1 H nh dạng chuỗi của chủng O.oeni 10

H nh 1.2 Qu tr nh trao đổi chất của c c vi khuẩn actic ên men dị h nh 13

H nh 1.3 Cơ chế của qu tr nh ên men ma o actic 133

H nh 1.4 C c yếu tố ảnh hưởng đến qu tr nh ên men ma o actic 17

H nh 2.1 Sơ đồ phân ập vi khuẩn ma o actic từ nguồn nguyên i u quả và nho 27 H nh 3.1 So s nh hàm ượng axít ma ic trước và sau qu tr nh ên men ma o actic của 2 chủng vi khuẩn ma o actic trên môi trường rượu vang non 38

H nh 3.2 So s nh hàm ượng axít actic trước và sau qu tr nh ên men ma o actic của 2 chủng vi khuẩn ma o actic trên môi trường rượu vang non 39

H nh 3.3 So s nh hàm ượng axít axetic trước và sau ên men ma o actic của 2 chủng vi khuẩn malolactic 41

H nh 3.4 So s nh hàm ượng diaxety trước và sau ên men ma o actic của 2 chủng vi khuẩn malolactic 42

H nh 3.5 So s nh hàm ượng axit axetic tạo thành sau qu tr nh ên men ma o actic của 2 chủng 43

H nh 3.6 Hàm ượng axít ma ic được phân giải trong qu tr nh tàng trữ có bổ sung dinh dưỡng kh c nhau theo thời gian 46

H nh 3.7 So s nh s tạo thành rượu etano sau qu tr nh ên men malolactic 52

H nh 3.8 So s nh s tạo thành 1 số chất bay hơi sau qu tr nh ên men ma o actic 53

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AG Acid Grape - Nước nho axít

CFU Colony forming unit - Đơn vị h nh thành khuẩn lạc HDL High density lipoprotein - Lipoprotein có tỷ trọng cao LAB Lactic acid bacteria - Vi khuẩn lactic

MRS De Man, Rogosa and Sharp - Môi trường MRS

NAD+ Nicotinamit Adenin Dinucleotide

NADH Nicotinamit Adenin Dinucleotide Hydrogen

EO Chế phẩm Essentia oenos

OD Optical density - Mật độ quang

MLF Melolactic fermentaeion - Lên men ma o actic

MỞ ĐẦU

Rượu vang à đồ uống có cồn được sản xuất từ qu tr nh ên men dịch quả nói chung mà phổ biến nhất à từ quả nho Do nho à oại quả có thành phần ho học thích hợp cho nấm men ph t triển và có hương thơm đ p ứng được những yêu cầu cho sản xuất rượu vang chất ượng cao Trải qua ịch sử h nh thành và ph t triển âu đời, rượu vang nho với nồng độ rượu vừa phải từ 10-14%v à đồ uống có ợi cho sức khỏe của con người với gi trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon rất được ưa chuộng ở khắp nơi trên thế giới Từ nhiều n m nay, rượu vang nho đã trở thành thức uống phổ biến ở nước ta Thị trường rượu vang trong nước rất ph t triển, tuy nhiên vẫn chưa đ p ứng được yêu cầu cả về chất và ượng Theo số i u của Tổng cục thống kê, kể từ n m 2010 đến nay, rượu vang nhập khẩu đã t ng khoảng 25%/ n m Trong đó, Ninh Thuận được biết đến à vùng trồng nho chính có sản ượng ớn nhất

cả nước, hi n trồng chủ yếu à giống nho Red Cardinal thường dùng để n tươi hơn

à để ên men rượu v cho màu sắc nhạt, không hấp dẫn Do vậy, chất ượng rượu vang Vi t Nam hi n nay chưa thật cao khi so s nh với rượu vang nhập khẩu do hương và vị sản phẩm chưa đạt tiêu chuẩn, màu sắc dễ bị nâu ho , sản phẩm bị ắng cặn…Với tiềm n ng về thị trường ớn như ở nước ta, vi c cải tiến công ngh để sản xuất rượu vang nho à vấn đề đang rất được quan tâm

Nhiều nước trên thế giới đã giải quyết được vấn đề này bằng những nghiên cứu hoàn thi n công ngh sản xuất rượu vang nho đi sâu àm rõ c c cơ chế như: s chuyển hóa c c thành phần trong nho thành c c chất thơm trong rượu vang, t c động của điều ki n môi trường đến s sinh trưởng và ph t triển của vi khuẩn

ma o actic trong qu tr nh ên men ma o actic[26, 27]…Qu tr nh ên men rượu vang à qu tr nh ên men th c hi n chủ yếu nhờ nấm men và một phần bởi vi khuẩn actic có mặt trên quả nho hoặc trên thiết bị àm rượu Nấm men sử dụng h enzym của m nh để chuyển hóa g ucoza và một số đường kh c thành rượu và c c sản phẩm phụ kh c (rượu bậc cao, este, c c axít hữu cơ ), trong khi đó vi khuẩn actic chuyển hóa axít ma ic thành axít actic và CO2 bằng qu tr nh ên men ma o actic Lên men

ma o actic đóng vai trò quan trọng trong sản xuất rượu vang đỏ và 1 số oại vang

trắng, đây à một qu tr nh không thể thiếu trong vi c àm biến đổi c c thành phần hóa học, mang ại cho rượu vang những hương vị đặc trưng Với điều ki n, công ngh sản xuất rượu vang của Vi t Nam hi n nay, vi c phân ập và tuyển chọn một

số chủng vi khuẩn actic để tối ưu hóa qu tr nh ên men ma o actic à rất cần thiết Điều này đã giúp c c nhà sản xuất rượu vang kiểm so t qu tr nh sản xuất rượu vang được tốt hơn, giảm rủi ro tạo ra c c sản phẩm hỏng hoặc có chất ượng không

ổn định, đồng thời àm đa dạng c c chủng oại rượu vang phục vụ cho nhu cầu người tiêu dùng Từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới cho công ngh sản xuất rượu vang nho chất ượng cao của Vi t Nam giải quyết những vấn đề th c tiễn của ngành

sản xuất rượu vang trong nước.V vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang”

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về rượu vang

1.1.1 Vài nét về rượu vang

Rượu vang à thức uống có cồn được sản xuất bằng phương ph p ên men không chưng cất từ dịch nho Nhờ t c nhân ên men ( ên men một giai đoạn) hoặc nhờ nấm men và vi khuẩn actic ( ên men hai gian đoạn) đã tạo cho rượu vang có hương vị đặc trưng, cũng như gi trị dinh dưỡng cao hơn hẳn c c oại rượu kh c

Thuật ngữ “Rượu vang”- tiếng a tinh à “vinum”, được bắt nguồn từ chữ “vinea”,

có nghĩa à cây nho Trước tiên vi c sản xuất rượu vang được tiến hành bằng c ch

ép ấy dịch quả nho, sau đó ên men hoàn toàn t nhiên trong c c hang đ Người La

Mã có công truyền b nghề trồng nho àm rượu sang Ph p Marsei es từ thế kỉ II, sau đó à vùng Champagne và Monse e Va ey vào khoảng thế kỉ IV Ph p bắt đầu xuất khẩu rượu vang sang Anh và Đức vào thế kỉ XII Vào n m 1857, ần đầu tiên trong ịch sử, Louis Pasteur công bố những nghiên cứu về qu tr nh ên men, x c định rõ vai trò quan trọng của nấm men trong qu tr nh ên men rượu và s biến đổi

ho sinh trong qu tr nh ên men của nấm men [8] Đến nay đã có hàng tr m oại rượu vang kh c nhau đ p ứng được nhu cầu đa dạng của người tiêu dùng Phân oại rượu vang được d a trên màu sắc: vang màu và vang trắng, trong c c oại vang màu

th rượu vang đỏ có gi trị cao nhất Ngày nay nguyên i u chế biến rượu vang được

mở rộng ra c c oại nguyên i u quả kh c nhau, phong phú về màu sắc và chất ượng

Trải qua nhiều thế kỷ, rượu vang đã khẳng định vai trò của nó với sức khỏe con người Louis Pasteur đã nhiều ần khẳng định: “Rượu vang à oại đồ uống rất

v sinh và rất có ợi cho sức khoẻ” Khoa học hi n nay đã ph t hi n trong rượu vang đỏ có chứa chất trans-resveratro à một chất chống oxi hóa, gặp trong vỏ của quả nho đỏ (vỏ mỗi quả chứa khoảng 2µg trans-resveratrol) C c po ypheno trong Chất này có t c dụng trung hòa c c t c nhân oxi hóa, chẳng hạn c c gốc t do được tạo thành trong qu tr nh trao đổi chất b nh thường của tế bào C c gốc t do này sẽ gây hư hại mô nếu không nhanh chóng được oại bỏ Chính t c dụng nói trên của

trans-resveratro đã góp phần àm giảm nguy cơ tử vong do b nh nhồi m u cơ tim ở người [30]

1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang [7, 8, 12]

Lên men à một qu tr nh trao đổi chất dưới t c dụng của c c enzyme tương ứng Tùy theo sản phẩm tích tụ sau qu tr nh ên men mà người ta chia c c kiểu ên men kh c nhau Có hai h nh thức ên men chính à ên men yếm khí và ên men hiếu khí Lên men rượu à qu tr nh ên men yếm khí với s có mặt của nấm men, chúng

sẽ chuyển hóa đường thành ethano và CO2 Th c chất đây à qu tr nh oxi ho - khử có mặt c c enzyme của nấm men N ng ượng sinh ra phục vụ cho hoạt động sống của nấm men hoặc bị tiêu hao dưới dạng nhi t [7] S thay đổi nhi t độ trong

qu tr nh ên men có thể dẫn tới sốc nhi t àm ảnh hưởng tới hoạt tính của nấm men

Do vậy giữ nhi t độ ổn định trong qu tr nh ên men à một yếu tố quan trọng giúp

qu tr nh ên men được hoàn thành Nấm men nhạy cảm nhất với nhi t độ trong giai đoạn đầu ph t triển và nhân ên và nó trở nên chống chịu tốt hơn trong giai đoạn sau Do vậy đối với ên men rượu vang th giai đoạn đầu của qu tr nh ên men nên duy tr ở nhi t độ 18-22oC và sau đấy cho phép t ng dần ên [7, 12] Nhi t độ ên men ban đầu qu cao có thể à nguyên nhân gây ra hi n tượng ở cuối qu tr nh ên men

Qu tr nh ên men rượu chia àm hai thời kỳ chính:

- Thời kỳ ph t triển sinh khối: giai đoạn này với s có mặt của oxy, tế bào nấm men ph t triển sinh khối

- Thời kỳ ên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này nấm men hấp thụ c c chất dinh dưỡng và sử dụng c c enzyme sẵn có của m nh th c hi n xúc

t c sinh học trong qu tr nh trao đổi chất để duy tr s sống, tạo thành rượu và CO2

Sản phẩm thu hồi của qu tr nh ên men rất phức tạp Ngoài ethano còn nhiều chất kh c như este, rượu bậc cao, c c axit hữu cơ, g ycero , dầu fuse Tỷ

c c sản phẩm phụ này phụ thuộc vào điều ki n của môi trường ên men

Trong qu tr nh này, nấm men chuyển hóa đường thành rượu và giải phóng

CO2 dưới t c dụng xúc t c của enzyme do nấm men tạo ra theo con đường Eno

-pyruvat [7]

Nho đỏ Nghiền/chà t ch cuống

Su fite hóa Ngâm

T ch dịch nho rỉ

T ch cặn

Hi u chỉnh thành phần

dich nho Lên men Lên ma o actic

Ủ rượu

Ổn định rượu Làm trong Rót sản phẩm

Sơ đồ: 1.1 Quy trình công nghệ sản xuất rƣợu vang đỏ trên thế giới.

Trong quả nho và nhiều oại quả kh c, hầu như chỉ có đường khử glucoza, fructoza V vậy nếu sử dụng dịch ên men hoàn toàn từ dịch ép quả th qu tr nh ên men rất thuận ợi Sản phẩm thu hồi của qu tr nh ên men rất phức tạp Ngoài etano , còn có nhiều c c hợp chất kh c như este, rượu bậc cao, c c axít hữu cơ, glyxerol

Este: C c este được cho à có ý nghĩa ớn nhất đối với s h nh thành hương

vị rượu vang [40] Mùi quả đặc trưng của vang chủ yếu nhờ vào một hỗn hợp của hexyl axetat, etyl caprilat Este có mặt nhiều nhất trong rượu vang à ety axetat Nó được h nh thành trong qu tr nh ên men và trong qu tr nh ưu giữ ở thùng gỗ sồi Ngưỡng cảm nhận của ety axetat à 160 mg/ [41] Trên ngưỡng này, nó ảnh hưởng xấu đến hương vị của rượu nhưng ở nồng độ thấp hơn th nó ại đóng góp tích c c vào gi trị cảm quan của vang

Rượu bậc cao: Rượu bậc cao được h nh thành trong qu tr nh ên men rượu

và đạt tới nồng độ từ 150-550 mg/ [41] Rượu bậc cao và c c este của nó đóng vai trò quan trọng đến vi c tạo hương cho rượu C c rượu bậc cao chủ yếu à c c isobuty và c c amy a coho Ở nồng độ thấp hơn 300 mg/ , nó tạo hương rất tốt cho rượu nhưng ở nồng độ cao hơn, hương của nó không chấp nhận được

C c axít hữu cơ: C c axít hữu cơ có t c dụng àm bền và nâng cao gi trị

cảm quan của rượu, đặc bi t à rượu vang trắng [31] Đặc tính bảo quản của nó cũng

àm t ng độ bền hóa ý và vi sinh vật của rượu vang C c axít hữu cơ chủ yếu được

h nh thành trong qu tr nh ên men à axít actic, axít sucxinic, axít axetic, ngoài ra còn có một ượng nhỏ axít butyric, axít formic và propionic, nhưng nhiều hơn cả

à axít actic và axít axetic C c axít hữu cơ có t c dụng àm giảm pH môi trường trong qu tr nh ên men Chúng ít ảnh hưởng đến thành phần hương của rượu trừ axít axetic tạo ra mùi dấm chua Không thể sản xuất ra rượu mà không có ít axít axetic nào Hàm ượng trung b nh của nó trong rượu vang bàn à nhỏ hơn 0,4g/

trong khi ngưỡng ph t hi n của nó à 3g/ Nhi t độ ên men ma o actic cao thúc đẩy

s tạo thành axít bay hơi nhiều hơn [27]

Ngoài ra, c c thành phần như a dehyt, g yxero được tạo ra bởi nấm men trong qu tr nh ên men đều có t c dụng tạo nên hương thơm đặc trưng của rượu vang Qu tr nh ên men rượu đã giải phóng 40 kca n ng ượng t do trên một phân

tử đường Qu tr nh ên men thường chứa khoảng 180g đường/ ít, do đó s giải phóng nhi t về í thuyết sẽ àm cho nhi t độ ên men t ng từ 20oC ên 45o

C [32]

Như vậy, ban đầu à qu tr nh ên men rượu được nấm men Saccharomyces cerevissiae đảm nhận Tiếp theo à hoạt động của c c vi khuẩn Leuconostoc oenos, Lactobacillus, Pediococcus chuyển ho đường sót trong rượu vang non và quan

trọng hơn cả à qu tr nh ên men axít malic thành axít 1 actic và axít xitric thành axít axetic, axetoin, diaxety , butađio 2-3, góp phần đ ng kể vào s h nh thành

hương vị đặc trưng của rượu vang, “Đây chính à qu tr nh ên men Ma o actic”

Trong công ngh sản xuất rượu vang, qu tr nh ên men ma o actic được tiến hành sau khi ên men chính, dịch ên men được gọi à “vang non” được tiến hành ắng gặn cặn và được chuyển sang bồn hay nồi ên men tiếp theo [4]

1.2 Vi khuẩn lactic

Vi khuẩn actic à một bộ phận của h vi sinh vật t nhiên trên quả nho, trong dịch đường và rượu vang Vi khuẩn actic à những tế bào Gram dương, dị dưỡng ho n ng hữu cơ, hoạt tính catalaza âm tính và axít lactic được xem à sản phẩm cuối cùng của qu tr nh trao đổi chất của chúng [4] Chính pH axít, hàm ượng êtano và c c thành phần kh c của rượu vang tạo ra p c chọn ọc đối với

c c vi khuẩn actic Chỉ có một số oài rất nhỏ có khả n ng t ph t triển trong c c oại dịch đường và rượu vang C c oài thường gặp trong sản xuất rượu vang chủ

yếu thuộc c c giống sau: Pediococcus, Leuconostoc, Oenococcus và Lactobacillus

S xuất hi n của c c oại vi khuẩn actic này trên bề mặt quả nho à rất nhỏ, khoảng

100 tế bào/g quả [43] Mật độ quần thể vi khuẩn actic phụ thuộc rất nhiều vào điều

ki n khí hậu trong những ngày cuối cùng của qu tr nh chín, độ chín và trạng th i

v sinh của quả nho C c quần thể vi sinh vật có mặt nhiều hơn trên vỏ quả nho chín

hoặc có t nh trạng v sinh kém Khi qu tr nh chín của quả nho kết thúc bởi một giai đoạn nóng và ít mưa kéo dài, th c c vi khuẩn actic sẽ xuất hi n nhiều hơn trên bề mặt quả nho Tuy nhiên, c c oài vi sinh vật ban đầu này xuất hi n rất ít trong rượu vang mà phần ớn à c c oại vi khuẩn nhiễm tạp từ c c dụng cụ àm rượu trong c c giai đoạn kh c nhau diễn ra trong qu tr nh bơm dịch nước nho vào thùng ên men Mặc dù người ta có thể bắt gặp trong c c oại rượu vang một số vi khuẩn t nhiên từ quả nho, nhưng chủ yếu vẫn à c c vi khuẩn có nguồn gốc từ c c thiết bị trong hầm rượu Tương t như vậy đối với trường hợp của nấm men Nấm men t nhiên trên

bề mặt quả t ph t triển sau c c thao t c công ngh kh c nhau diễn ra tiếp sau qu

tr nh thu h i và qu tr nh chuyển bơm dịch nước nho vào thùng ên men, cho tới tận khi dịch đường nước nho được cấy giống Tuy nhiên, cũng có thể à có s ph t triển của c c oại nấm men có nguồn gốc từ c c vật i u tiếp xúc với dịch nước nho Do vậy, sau giai đoạn thu hoạch nho, c c nấm men nhanh chóng ph t triển và chiếm ĩnh hầm rượu Trên th c tế, người ta vẫn chưa làm s ng tỏ được à con đường nào trong hai con đường gieo giống t nhiên này à có vai trò quan trọng hơn

Trong suốt qu tr nh sản xuất rượu vang, c c vi khuẩn actic ph t triển, không chỉ về số lượng mà còn có cả s thay đổi của c c oài Vi khuẩn phân ập

được trên vỏ quả nho trước khi thu hoạch thuộc chủ yếu à c c oài Lactobacillus plantarum, L hilgardii và L Casei Loài Oenococcus oeni trước đây được gọi à Leuconostoc oenos xuất hi n muộn hơn nhưng ại à quan trọng nhất, rất hiếm khi

chúng có mặt trên nho, quả nho và chỉ có số ượng rất ít Trong th c tế, oài này rất ít xuất hi n ở giai đoạn đầu của qu tr nh ên men C c oại tr c khuẩn và cầu

khuẩn xuất hi n trên quả nho thường xuyên hơn so với O.oeni Trong số tất cả c c oài này nói trên, oài cuối cùng O.oeni được coi là có khả n ng chống chịu cao nhất

đối với c c điều ki n môi trường bất ợi của rượu vang như pH thấp, hàm ượng cồn

và SO2 cao và do vậy chịu tr ch nhi m chính cho qu tr nh ên men ma o actic trong đa số c c trường hợp[4]

Số ượng tế bào vi khuẩn actic đạt 103 - 104 tế bào/ml sau qu tr nh ép nho [43] Dịch nước nho ngay sau khi được đưa đến thùng ên men có chứa một h vi

sinh vật rất đa dạng, phần ớn bao gồm c c oài Lactobacillus plantamm, L casei, L hilgardii, L brevis, Pediococcus dcimnosLis, p pentosaceus, Leuconostoc mensenteroides và Oenococcus oeni Tuy nhiên, trong t nh trạng v sinh kém hoặc

trong c c điều ki n vận chuyển hoặc mức độ sạch của c c thiết bị trons, hầm rượu không cao, số ượng tế bào vi khuẩn actic có thể ên tới 106 tế bào/ml Bên cạnh đó, trong giai đoạn đầu của qu tr nh ên men rượu, c c tế bào nấm men cũng có số ượng tương t Điều này rất có thể dẫn đến s nguy cơ cạnh tranh ph p triển giữa

vi khuẩn và nấm men Hơn nữa pH của dịch nước nho chín kỹ thường rất cao tạo điểu ki n thuận ợi cho c c vi khuẩn Đây à t c nhân quyết định chính tới số ượng của quần thể c c vi khuẩn và đối với s ph t triển của chúng trong giai đoạn đầu của qu tr nh ên men Trong qu tr nh sản xuất rượu vang, có ên men ma o actic, quần thể vi khuẩn t nhiên ph p triển trải qua rất nhiều pha kh c nhau Trong những ngày đầu tiên của qu tr nh ên men rượu, c c oại vi khuẩn và nấm men t ph t triển Nhưng c c nấm men thích nghi với dịch đường của nho nhiều hơn, t sinh sản rất nhanh đạt tới c c quần thể rất ớn Lafon- Lafourcade, 1983 đã bắt gặp, s ph t triển của c c vi khuẩn actic đồng thời với s ph t triển của c c nấm men trong giai đoạn đầu của qu tr nh ên men nhưng nó chỉ dừng ại ở giới hạn từ 104 đến 105 tế bào vi khuẩn actic/mL [43] S ph t triển này phụ thuộc vào c c điều ki n ho ý của môi trường và s ph t triển này còn cao hơn khi pH cao và hàm ượng SO2 thấp [29] S ph t triển của c c vi khuẩn ac ic trong giai đoạn đầu của qu tr nh ên men nrợu mang tính chuyển tiếp Trong giai đoạn hoạt động mạnh nhất của qu tr nh ên men rượu và tới tận khi hàm ượng đường đã bị cạn ki t, số ượng c c vi khuẩn giảm xuống nhanh chóng, chỉ còn 102 - 103 tế bào/ml và thậm chí còn thấp hơn do

s cạnh tranh với c c oại nấm men và c c điều ki n môi trường Trong qu tr nh

ên men rượu, s cạnh tranh của nhiều oài vi khuẩn kh c nhau diễn ra iên tục và tới cuối qu tr nh ên men rượu th chỉ có những oài chịu được với môi trường

êtano tốt hơn tồn tại được, đặc bi t à c c vi khuẩn O.oeni [35] Cuối qu tr nh ên

men rượu, sẽ còn khoảng 102 - 103 tế bào/mL vi khuẩn O.oeni Chính oài này sẽ t

sinh sản ngay sau đó và tạo ra h vi sinh vật chịu tr ch nhi m ên men ma o actic

Cũng có thể có c c đại di n của c c oài kh c còn sống sót với số ượng rất nhỏ sau

qu tr nh ên men, chúng có thể ph t triển nếu như rượu vang không được bảo v tốt và đây chính à nguyên nhân àm hỏng rượu vang Liên quan tới qu tr nh

chuyển ho axít ma ic, oài O.oeμni này được khởi động ngay sau khi số ượng qu n

thể đủ ớn để khởi động (thường à 106 tế bào/mL) S ph t triển này có thể kéo dài trong nhiều ngày hoặc nhiều tuần tuỳ theo c c trường hợp Lên men ma o actic có thể hoàn thành ở cuối pha tĩnh hoặc đầu pha suy vong Nhưng nếu có c c điều ki n

à thích hợp, ên men ma o actic có thể kết thúc ở cuối pha ph t triển Cuối cùng, khi kết thúc ên men ma o actic, cần phải Sulfit ho rượu vang để oại bỏ hoàn toàn

c c vi khuẩn còn sống [14]

1.2.1 Phân loại và kiểu hình của các vi khuẩn lactic trong rượu vang

C c vi khuẩn actic thuộc nhóm c c vi sinh vật Gram dương và do vậy được nhuộm mầu bằng phép thử Gram có iên quan tới cấu tạo của thành tế bào C c vi

khuẩn Leuconostoc và Oenococcus (h nh 1-2) có dạng h nh cầu Đó à c c tế bào

nhỏ (kích thước từ 0,5 - 1 μm) tròn hoặc hơi dài tạo ra c c cặp hoặc chuỗi

Hình 1.1 Tế bào dạng chuỗi của chủng O.oeni

Tuỳ vào s đa dạng của c c sản phẩm trao đổi chất của c c oại đường, c c

vi khuẩn actic được phân bi t thành 2 nhóm:

- Nhóm sinh axít actic (> 85%) từ g ucoza được gọi à ên men đồng h nh như

c c oài thuộc giống Pediococcus và oài Lactobaci us ma i C c vi khuẩn này phân

huỷ g ucoza thành pyruvat theo con đường đường phân truyền thống Pyruvat tiếp theo bị khử thành axít D và/hoặc L - actic phụ thuộc vào từng oài bởi c c enzim actate dehydrogenaza L và/hoặc D Qu tr nh này cho phép ôxy ho khử c c phân

tử NADH2+ thu được từ qu tr nh đường phân thành NAD+

- Nhóm mà bên cạnh axít actic, còn sản xuất axít axêtic, ethano và CO2, được gọi à ên men dị h nh Người ta phân bi t:

+ C c oài dị h nh nghiêm ngặt như c c oài thuộc giống Leuconostoc và một vài oài thuộc giống Lactobacillus (L brevis, L hilgardii ) Chúng không có enzim

a do aza của hai con đường (đường và pentoza -photphat) phân và do vậy không thể

ên men c c oại đường theo con đường ên men dị h nh của c c pentoza-photphat

+ C c oài ên men dị h nh tuỳ ti n như O.oeni, Lactobacillus casei và Lactobacillus plantarum có c c enzym của cả hai con đường (đường phân và

pentoza-photphat) và chúng thích nghi với một trong hai con đường này phụ thuộc vào điều ki n môi trường [14]

1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni

Mặc dù có rất nhiều oài vi khuẩn ma o actic sử dụng trong sản xuất rượu

vang nhưng O oeni vẫn à oài vi khuẩn được a chọn bởi đa số c c nhà sản xuất rượu vang O oeni có tên gọi trước đây à Leuconostoc oenos, à một oài hiếu khí

tùy ti n và có thể sinh trưởng trên môi trường có pH thấp (pH 4,2-4,8) được bổ sung nước cà chua hoặc nước nho [26] Ở c c vùng sản xuất rượu nho, nó có mặt trong dịch hèm cũng như trong rượu vang non Nguồn cacbon (có nguồn gốc từ c c oại đường), nitơ (từ c c axit amin t do hoặc c c chuỗi peptit ngắn), c c vitamin (axit nicotinic, thiamin và uraci ) à toàn bộ nhu cầu cho s sinh trưởng tối ưu của vi

khuẩn này O.oeni có khả n ng chuyển ho axít L-ma ic thành axít L- actic, ên

men fructoza, g ucoza và treha oza Qu tr nh ên men g ucoza tạo ra axít D-lactic, C02, axít axetic và etano Một số oài thuỷ phân arginin và một số kh c ên men axít xitric khi có mặt c c oại đường có thế ên men, nhưng c c tính chất này bị mất

đi sau một vài ần cấy iên tiếp [46]

Tế bào O oeni có h nh cầu và tồn tại ở dạng chuỗi khi sinh trưởng trên môi

trường rắn S sinh trưởng tương đối chậm và có thể mất từ 5-7 ngày để h nh thành

c c khuẩn ạc có thể quan s t được tại nhi t độ từ 20-30°C Mặc dù trước đây chúng

được xếp vào cùng nhóm với c c oài Lenconostoc, nhưng phân tích ADN đã chỉ ra chúng à một nhóm t ch bi t hoàn toàn với oài Leuconostoc [46]

O oeni được coi à ứng viên tốt nhất để tiến hành ên men ma o actic nhờ

s thích nghi của chúng với c c điều ki n khắc nghi t của môi trường, đặc bi t à

điều ki n axít và hàm ượng cồn cao trong rượu Rượu vang cấy c c chủng O oeni

đã tuyển chọn cho phép dễ dàng kiểm so t toàn bộ qu tr nh ên men malolactic

Ngoài ra, vi c a chọn một chủng o oeni có thể cho phép c c nhà sản xuất rượu

đảm bảo về c c tính chất được tạo ra trong sản phẩm cuối cùng Do vậy, rượu vang tạo ra đặc trưng Mặc dù, thường chỉ một chủng vi khuẩn được a chọn, nhưng trong một số trường hợp thỉ một hỗn hợp c c chủng có thể được sử dụng để cấy giống Điều này không chỉ tạo ra c c đặc tính được yêu thích hơn của rượu vang,

mà còn tạo ra khả n ng sống sót cao nhất của vi khuẩn nếu có một th c khuẩn thể trong rượu [26]

1.3 Quá trình lên men malolactic

1.3.1 Bản chất của quá trình lên men malolactic

Trong ên men rượu vang người ta gọi qu tr nh phân giải axit ma ic và

xitric dưới t c dụng của enzym ma o acticase của O oeni à qu tr nh ên men

actic, một qu tr nh quan trọng bậc nhất trong giai đoạn ên men phụ của rượu vang

và sâm panh [3, 42] Vi khuẩn lactic t nhiên uôn có mặt trên vỏ quả nho sau khi chín với số ượng từ 103 đến 104 CFU/m và đi vào vang non theo dịch nước quả Tuy nhiên, số ượng của chúng úc này cũng bị giảm đ ng kể do bị ức chế và tiêu

di t bởi S02 (khoảng 50 mg/m ) ở giai đoạn sunfit ho và nồng độ cồn cao (khoảng 14-15° cồn) sinh ra sau qu tr nh ên men rượu Do vậy, trong rượu vang non, c c oại tr c khuẩn và cầu khuẩn lactic bị tiêu di t gần như hoàn toàn và chỉ còn sót ại

số ượng ít ỏi c c tế bào vi khuẩn O oeni từ 102

-103 CFU/m Tuy nhiêu, đây chính

à t c nhân chính của một qu tr nh quan trọng nhất trong giai đoạn ên men phụ kéo dài đó à qu tr nh ên men ma o actic

Hình 1.2 Quá trình trao đổi chất của các vi khuẩn lactic lên men dị hình [32]

Đặc trưng cơ bản nhất của qu tr nh này à s chuyển ho hoàn toàn c c diaxít như malic và xitric có trong dịch quả và một phần sinh ra sau qu tr nh ên men chính (khoảng 10 g/1) thành c c monoaxít như lactic và axetic bởi c c vi

khuẩn O oeni [32] Axit ma ic và xitric chủ yếu vào dịch ên men từ quả và chỉ một

ượng ít được tạo ra từ qu tr nh ên men rượu Khi axit ma ic và xitric bị phân giải

sẽ àm vang chua dịu hơn và vị hài hoà hơn, một khi rượu vang không còn hai oại axit th ít có nguy cơ biến đổi độ chua và àm chất ượng vang ổn định hơn Sản phẩm của qu tr nh ên men ma o actic từ axit ma ic à axit actic và CO2, còn từ axit xitric à diaxety , axetoin, 2,3 - butadio đây à những tiền chất tạo nên h nh thơm đặc trưng cho vang, ngoài ra còn tạo thành axít axêtic

Cơ chế của qu tr nh ên men ma o actic được tr nh bày tóm tắt theo sơ đồ dưới đây:

Hình 1.3 Cơ chế của quá trình lên men malolactic

Lên men ma o actic à một chuỗi c c phản ứng ho học phức tạp được xúc

t c bởi một h enzim có trong vi khuẩn L.oenos Ban đầu à enzim malat

dehydrogenaza chuyển ho axít malic thành axít oxa oaxetic, tiếp theo à phản ứng decacboxy được xúc t c bởi enzim oxaloaxetat decacboxylaza để tạo thành axít pyruvic Sản phẩm trung gian này cuối cùng bị chuyển ho thành axít D hoặc L-lactic bởi enzim D hoặc L-lactic dehydrogenaza [12]

1.3.2 Vai trò của quá trình lên men malolactic

Những nghiên cứu gần đây cho thấy, rượu vang được trải qua ên men

ma o actic cho chất ượng cao hơn hẳn khi không trải qua giai đoạn này S biến đổi chất ượng của vang sau qu tr nh ên ma o actic đã được chỉ ra à v ba í do chủ yếu sau [3,4,42]

- Để giảm độ chua của vang do axit ma ic (diaxit) được chuyển thành axit actic (monoaxit), điều này àm giảm độ axit và t ng đọ pH nhờ đó mà vang thay v

vị chua gắt của axit ma ic sẽ trở nên dịu hơn và vị hài hòa hơn

- Làm t ng tính ổn định sinh học của rượu vang bởi v s ph t triển của vi khuẩn sẽ àm nghèo nguồn dinh dưỡng và oại khỏi môi trường hai axit hữu cơ quan trọng à axit ma ic và axít xitric Đảm bảo giảm tối thiểu qu tr nh ên men chậm của vi khuẩn lactic khi bảo quản vang trong chai và s ph t triển một c ch t ph t của c c vi sinh vật không mong muốn gây nên c c b nh cho vang

- Làm t ng tổ hợp thơm của vang v c c hợp chất diaxety , axetoin và butanediol tạo ra từ qu tr nh chuyển hóa axit xitric bởi vi khuẩn à c c hợp phần tạo nên hương thơm cho vang Những thành phần kh c ảnh hưởng đến hương vị cũng t ng như axit bay hơi, diety suxinat, một số este bay hơi, ety axetat, n-propanol, 2-butanol, n-hexano , ety actate và 2,3 butanedio Một số thành phần

2,3-kh c cũng t ng nhẹ như 3-methy-n-butal axetat, n-hexyl axetat, 2-phenyletyl-axetat

và 2-etyl-n-hexanoat [42,44]

1.3.3 Ảnh hưởng của quá trình lên men malolactic đến thành phần và chất lượng rượu vang

1.3.3.1 Sự giảm độ chua

Mỗi phân tử axit L-ma ic chuyển hóa tạo ra axit L- actic do s mất đi nhóm cacboxy và àm giảm tương ứng độ axit của rượu vang Độ giảm axít sau qu tr nh

ên men ma o actic rất kh c nhau phụ thuộc vào nồng độ axít ma ic Độ giảm này từ

2-3 g/l (H2SO4) Lên men 1 g axít ma ic trong 1 ít rượu vang non sẽ àm giảm axít tổng số xấp xỉ 0,4 g/1 Trong qu tr nh ên men ma o actic, hàm ượng axít bay hơi thường xuyên t ng ên, có thể một phần à do s ph hủy của axít xitric Vi khuẩn cũng sản xuất axít axetic từ s phân giải đường pentoza S phân hủy axít ma ic dường như à không đủ cung cấp n ng ượng cho hoạt động tế bào [28]

Bảng 1.1 Phân tích rượu vang đỏ trước và sau lên men malolactic

1.3.3.2 Những thay đổi về hương

C c nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng c c chủng vi khuẩn ma o actic kh c nhau

có thể t ng hoặc giảm cường độ của c c đặc tính hương và vị của rượu vang và những thay đổi này phụ thuộc vào chủng vi khuẩn Ngoài ra, hương rượu vang chịu

t c động của ên men ma o actic có thể à mùi bơ, mùi hạt dẻ, mùi nấm men, mùi gỗ

sồi, mùi mồ hôi và mùi đất Lên men ma o actic cũng t c động đến hương hoa và quả cũng như cảm gi c mềm mại của rượu vang [28,32] Cơ chế ảnh hưởng của vi khuẩn ma o actic đến hương rượu vang có thể à:

- Loại bỏ những hợp chất tạo hương có trong rượu vang non bởi s trao đổi chất và hấp thụ với thành tế bào

- Tạo ra c c họp chất tạo hương mới từ vi khuẩn nhờ qu tr nh trao đổi chất của đường, axít amin và c c cơ chất kh c

- S trao đổi chất và biến đổi c c sản phẩm thứ cấp từ nấm men và nho tới c c sản phẩm cuối cùng tạo ra t c động ớn hơn hoặc nhỏ hơn đối với gi trị cảm quan của rượu

C c chủng vi khuẩn ên men ma o actic có khả n ng tạo ra diaxety có mùi

bơ, mùi hạt dẻ Mặc dù hàm ượng thấp từ 1-4 mg/1 tạo ra hương bơ đặc trưng cho rượu vang nhưng hàm ượng vượt qu 5-7 mg/1 có thể ảnh hưởng bất ợi tới chất ượng rượu vang và gây hỏng rượu [17,39]

S tạo thành diaxety chịu ảnh hưởng bởi c c vi sinh vật, môi trường và c c yếu tố sản xuất Ngoài yếu tố chủng vi sinh vật, c c yếu tố sản xuất cũng có một t c động đ ng kể đến hàm ượng diaxety , bao gồm oại rượu, tương t c giữa cặn nấm men và vi khuấn, thời gian hoàn thành ên men ma o actic, s tiếp xúc giữa rượu vang và không khí, s bổ sung S02, hàm ượng axit xitric và đường, nhi t độ và pH Một số tiêu chí cho rằng để đạt được hàm ượng diaxety cao trong rượu vang bao gồm sử dụng một chủng vi sinh vật có khả n ng tạo ra hàm ượng diaxety cao, tỷ cấy giống vi khuẩn thấp, pH và nhi t độ thấp hơn [11,37]

Hương quả của rượu vang không nhất thiết bị giảm bởi qu tr nh ên men

ma o actic, thậm chí trong một số trường hợp nó có thế còn t ng ên do nó có thể tạo ra c c este như ety actat và isoamy axetat Điều thú vị à s t ng ên của hương quả nhờ qu tr nh ên men ma o actic iên quan tới s giảm đi của mùi rau

S giảm đi của mùi rau trong rượu vang Chardonnay sau qu tr nh ên men

ma o actic à oại bỏ mùi tỏi chín và mùi giống ure của 1-octano và -octene-3-ol [32]

1.3.3.3 Ảnh hưởng đến màu sắc của rượu vang đỏ

Lên men ma oactic rượu vang đỏ có thể àm giảm cường độ màu của rượu vang đỏ Ví dụ như s t ng ên của pH trong qu tr nh ên men ma o actic có thể t c động đến s cân bằng phụ thuộc pH của c c chất màu anthocyanin, dẫn tới mất đi màu đỏ S giảm màu sắc của rượu vang đỏ t ng ên iên tục bởi s kết tủa của c c phân tử anthocyanin được giải phóng với c c po ysaccharit Lên men ma o actic cũng àm t ng s kết tủa anthocyanin và tannin Phản ứng này àm ổn định màu của rượu

Tính chất cảm quan của rượu cũng được t ng ên nhiều Hương của rượu trở nên quyến rũ hơn Rượu trở nên mềm mại hơn do s khử gần như hoàn toàn axit

ma ic thành axít actic Kết thúc qu tr nh ên men ma o actic, hương và vị của rượu đầy đủ hơn nhưng ại thanh hơn [7]

1.3.3.4 Các chất ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic và quá trình lên menmalolactic

Thành phần rượu vang, phương ph p sản xuất và mối tương t c giữa vi khuẩn ma o actic và c c vi sinh vật kh c có thế ảnh hưởng tới s sống sót và sinh trưởng củavi khuấn ma o actic trong rượu vang và v vậy ảnh hưởng tới qu tr nh

ên menma o actic Tuy nhiên, c c điều ki n môi trường như pH, nhi t độ, độ cồn,

t nh trạng dinh dưỡng, và S02 cũng chiếm một vai trò đ ng kể (h nh 1.4)

Hình 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic [7]

Gi trị pH nhỏ nhất mà tại đó vi khuẩn sinh trưởng được trong rượu vang

pH

xấp xỉ 2,9-3,0 S sinh trưởng của vi khuẩn nhanh hơn và qu tr nh ên men

ma o actic hoàn thành sớm hơn khi pH t ng trên 3,0 Mặc dù pH 6,3 à tối ưu cho hoạt động của c c enzym ma o actic, nhưng s phân giải axit ma ic ại diễn ra nhanh nhất tại c c gi trị pH thấp hơn

Khả n ng chịu cồn à một đặc tính quan trọng của nhiều vi khuẩn malolactic Hầu hết c c chủng không có khả n ng ph t triển trong rượu vang có hàm ượng cồn ớn hơn 15% v/v nhưng một số ại quan s t thấy s sinh trưởng ở độ cồn 20% v/v

Nhi t độ sinh trưởng tối ưu đối với phòng thí nghi m vi khuẩn lactic à từ 25-27°C và tỷ phân giải ma atcao nhất tại nhi t độ gần đó Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn ma o actic và tốc độ ên men ma o actic bị ức chế tại nhi t độ thấp

SO2 có t c dụng ức chế vi khuẩn ma o actic, SO2 còn có t c dụng thúc đẩy

qu tr nh ắng trong dịch nho Theo Navarre (1994), đó à do s ức chế h vi sinh vật có trong nguyên i u của SO2 nên không xảy ra hi n tượng ên men t nhiên trong hỗn hợp nho sau qu tr nh nghiền xé Nhờ đó mà s kết ắng của c c cấu tử ơ ửng trong dịch nho sẽ diễn ra nhanh và hi u quả

S có mặt của th c khuẩn thể có thể cũng ức chế qu tr nh ên men malolactic trong rượu vang C c chủng th c khuẩn thể chống ại c c điều ki n bất

ợi và gây ph n hủy tế bào vi khuẩn ma o actic Chúng cũng có khả n ng ph vỡ động học quần thể của qu tr nh ên men ma o actic Mặc dù s có mặt của c c th c khuẩn thể có ảnh hưởng nghiêm trọng tới chất ượng của rượu vang, chúng có xu hướng bị ức chế trong suốt qu tr nh sinh trưởng của vi khuẩn ma o actic và ảnh hưởng của chúng à rất nhỏ nhờ c c điều ki n đảm bảo thuận ợi cho s sinh trưởng của c c vi khuẩn ma o actic [7]

1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện quá trình lên men malolactic

1.4.1 Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic

Với mục đích khắc phục một c ch hi u quả c c yếu tố bất lợi nói trên người ta

đã sử dụng chủng giống vi khuẩn thuần khiết có khả n ng ên men ma o actic mạnh trong qu tr nh sản suất rượu vang Để sử dụng c c chế phấm này một c ch hi u

quả, c c nhà sản xuất khuyến c o không nên cấy tr c tiếp chế phẩm vào vang non

mà trước tiên phải nhân giống bằng môi trường có bổ xung dịch nước quả và axít malic cho vi khuẩn từ từ lấy lại hoạt tính ên men ma o actic rồi sau đó mới cấy vào

rượu vang non, nhờ vậy tỷ l sống của vi khuẩn L.oenos úc này đạt trên 80% so với

khi cấy tr c tiếp chỉ đạt 20%

Sử dụng cố định tế bào cho quá trình lên men malolactic

Lên men ma o actic iên tục bằng phương ph p cố định tế bào vi khuẩn

L.casei trên ge po yacry amit ần đầu tiên được th c hi n vào n m 1985 bởi Davis

và cộng s Bên cạnh đó còn có nhiều nghiên cứu về ên men ma o actic bằng cố

định tế bào vi khuẩn L.oenos trong gel aginat ở 25°c trong 24 giờ Kết quả cho thấy,

trong phương ph p cố định tế bào hoạt tính ên men ma o actic được duy tr âu hơn

so với ên men thông thường, ngay cả trong điều ki n môi trường có độ axít cao và hàm ượng SO2 lớn[12]

Trong một nghiên cứu kh c, tế bào vi khuẩn Lactobacillussp 48 đã được cố

định trên ge k-carrageenan khi có hoặc không có mặt Pentagel (bentonit tinh khiết)

có t c d ng àm t ng kích thước lỗ của gel do vậy tạo điều ki n thuận lợi cho qu

tr nh chuyển khối của h thống cố định tế bào Trong qu tr nh này, tr c khuẩn

Lactobacilli có hoạt tính ên men axít malic, biến đổi pH môi trường, giảm độ chua,

tạo axít lactic tương đương với qu tr nh ên men ma o actic truyền thống [43]

Nếu như sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic để th c hi n qu tr nh ên men

ma o actic th thời gian ên men phụ có thể rút ngắn xuống còn vài th ng so với vài

n m khi ên men theo truyền thống Tuy nhiên, thời gian ên men phụ để cho qu

tr nh ên men ma o actic diễn ra tri t để chỉ mất có vài ngày, thậm chí à vài giờ khi tiên hành ên men bằng cố định tế bào Chính v vậy, ên men ma o actic bằng cố định tế bào à một giải ph p có nhiều triển vọng để nâng cao chất ượng của rượu vang

1.4.2 Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hoá axít malic

Cho tới nay, sử dụng chế phẩm enzim ma o actic có thể được coi à một giải

ph p ý tưởng nhất để chuyển ho axít malic Đã có rất nhiều chế phẩm enzim loại này được sản suất và thương mại ho , đặc bi t à 5 oại enzym sau: EC 1.1.1.40-

enzym malic phụ thuộc NADP, EC 1.1.1.37 - enzym malic dehydrogenaza phụ thuộc NAD, EC 1.1.1.27- enzyme phụ thuộc NAD, chuyến ho axít pyruvic thành axít lactic, EC 1.6.1.1- enzyme nicotiamit nucleotit transhydrogenaza, chuyển H từ NADPH sang NDA và enzim malolactic phụ thuộc NAD, chuyển ho tr c tiếp axít malic thành axít lactic

Hervé Vai ant và Pasca Formisyn, 1996, đã sử dụng phương ph p cố định

enzim malolactic tinh sạch từ chủng L.oenos 8406 trên màng Polysulfone nhằm

chuyển ho axít malic thành axít lactic Kết quả cho thấy nhờ có qu tr nh tinh sạch

mà hoạt l c của enzim ma o actic đã t ng 7,5 ần, tức à từ 1,7 đơn vị/mg ên 12,8 đơn vị/mg protein và khối ượng của enzim này à 131 kDa Trong điều ki n vang non có pH à 5.5 th sau 1 tuần có tới 70% ượng axít malic có trong vang bị chuyển

ho thành axít lactic và tỷ l này à 1:1

1.4.3 Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza trong sản xuất vang

Để th c hi n qu tr nh ên men ma o actic người ta còn đề cập tới một phương ph p hoàn toàn mới đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Đó chính à

sử dụng nấm men chuyển gien Người ta chuyển gien quyết định khả n ng ên men

malolactic của vi khuẩn Leuconostoc oenos vào tế bào nấm men Saccharomyces để

th c hi n đồng thời qu tr nh ên men rượu và qu tr nh ên men malolactic nhằm rút ngắn qui tr nh sản xuất rượu vang mà vẫn th c hi u đầy đủ c c qu tr nh ên men Để có thể nâng cao n ng suất và chất ượng rượu vang, thỏa mãn nhu cầu tiêu thụ vang ngày càng nhiêu của thị trường

Có thế nói xu hướng sử dụng chủng nấm men t i tổ hợp vừa có khả n ng

ên men rượu vừa có khả n ng ên men ma o actic đang thu hút được rất nhiều s quan tâm nghiên cứu của c c nhà khoa học hi n nay Đã có rất nhiều thành công

trong vi c đưa vào c c chủng nấm men rượu vang S.cerevissiae mang đoạn gen mã

ho cho enzim malolactat decacboxylaza Bằng c ch sử dụng c c mồi (primer) được sinh ra từ c c vùng bao thủ của c c đoạn protein của enzim malic, Céci e Labarre và

cộng s , 1996 đã nhận được một đoạn ADN có kích thước 324-bp của L.oenos Lo

84.13 bằng phương ph p PCR và sử nó àm mồi để phân ập bộ genom của chủng vi khuẩn này 2990 gen kh c nhau đã đ ợc x c định và 7 đoạn ADN trùng nhau đã được phân ập Trong số chúng, một gen có kích thước 3453 bp được x c định có hai đầu đọc mở bao gồm hai đoạn chứa 1623 và 942 nuc eotit tương ứng Protein được dịch mã từ đoạn gen đầu tiên có khối ượng 59118 Da rất giống với khối

ượng của enzim malolactic của vi khuẩn Lactobacillus lactỉs Đoạn gen này sau đó

đã được đưa vào vi khuẩn E.coli CBT313 và S.cerevisiae RH100 - 4 Bằng phương

ph p đ nh dấu người ta đã nhận thấy s biểu hi n của gen mã ho cho enzim malolactic nhờ vào c c phân tử protein được tổng hợp có khối ượng gần bằng 60 KDa có hoạt tính enzim ma o actic và khẳng định rằng hoạt tính ên men malolactic

đã được biểu hi n ở cả vi khuẩn E.coli CBT313 và S.cerevisiae RH100 - 4 t i tổ

hợp Thành công này cho phép nghĩ tới vi c ứng dụng c c chủng nấm men t i tổ hợp trong tương ai, khi chúng hội tụ đầy đủ c c tính chất cần có của một chủng nấm men công nghi p và đồng thời có hoạt tính ên men ma o actic mạnh [43]

1.5 Các phương pháp lên men malolactic và khả năng ứng dụng để nâng cao chất lượng rượu vang

Rượu vang mới chỉ xuất hi n ở nước ta c ch đây hơn 100 n m nhưng nó đã nhanh chóng trở thành thứ đồ uống không thể thiếu Tuy nhiên, mức tiêu thụ rượu vang b nh quân tính theo đầu người hi n nay ở nước ta còn thấp, chỉ à 3-5 ít/n m

Do gặp nhiều khó kh n về thiết bị và qui tr nh công ngh ạc hậu nên chất ượng vang Vi t nam chưa cao Để đ p ứng nhu cầu của thị trường, chúng ta đã thay đối qui tr nh công ngh , rút ngắn thời gian ên men và dịch siro quả trước khi ên men

bị đem thanh trùng nhằm tiêu di t vi sinh vật nhiễm tạp và cũng vô t nh tiêu di t

uôn quần thể vi khuẩn L.oenos quí gi có trong nguyên i u còn sót ại sau qu

tr nh xử ý Chính v vậy qu tr nh ên men ma o actic không được th c hi n, khiến cho vang có vị chua “cứng”, chất ượng không ổn định, nhanh đục và hay bị nhiễm tạp Chúng ta không sản xuất được rượu vang có chất ượng giống như rượu ngoại

và do vậy chịu nhiều thua thi t về gi cả, gi thành rượu nội chỉ bằng 5-10% so với rượu ngoại tương ứng và gây tiêu tốn ngoại t cho vi c nhập khuẩn rượu [7]

Sản xuất vang theo truyền thống th ên men ma o actic diễn ra t ph t trong suốt qu tr nh bảo quản vang non trong thời gian vài th ng hoặc nhiều n m Vi khuẩn có nguồn gốc trên vỏ quả nho hoặc ở thùng gỗ Tuy nhiên, trong công ngh sản xuất vang hi n đại với qu tr nh chế biến sạch hơn và thời gian bảo quản cần giảm tối thiểu th qu tr nh ên men như vậy qu chậm chạp và không đủ độ tin cậy Như vậy ên men ma o actic t nhiên có những ưu điểm à thuận ợi và rẻ tiền, nhưng nhược điểm cũng rất nhiều như à: khó khởi động, diễn ra rất chậm chạp và khó kiểm so t được c c chủng vi khuẩn tham gia vào qu tr nh dẫn đến vi c tạo c c sản phẩm phụ không mong muốn Để khắc phục, hi n nay người ta thường p dụng

phương ph p chủ động đưa vi khuẩn L.oenos thuần chủng vào môi trường để th c

hi n ên men ma o actic Vi c cấy vi khuẩn có thể diễn ra trong qu tr nh ên men rượu (đồng thời với nấm men) hoặc sau khi hoàn thành qu tr nh ên men rượu [3,18,38]

Để khắc phục hi n trạng th c tế này người ta đã sử dụng vi khuẩn thuần khiết để th c hi n qu tr nh ên men ma o actic Ưu điểm của c c chủng vi khuẩn này à có khả n ng thích nghi cao với môi trường rượu vang non có độ cồn cao (15% v/v), pH thấp (3,0) và có khả n ng ên men mạnh c c oại đường, đặc bi t à

ên men axít malic thành lactic và axít xitric thành axetic Có nhiều phương ph p sử

dụng vi khuẩn O.oeni thuần khiết để th c hi n qu tr nh ên men ma o actic nhưng

nh n chung d a vào hai phương ph p sau đây:

Lên men một giai đoạn ( ên men hỗn hợp): Lên men một giai đoạn có nghĩa à người ta cấy nấm men và vi khuẩn đồng thời trong qu tr nh ên men rượu Phương ph p này có những ưu điểm: vi khuẩn sẽ có điều ki n sinh trưởng tốt hơn trong môi trường có nồng độ cồn thấp và khi hàm ượng cồn t ng dần trong qu

tr nh ên men rượu th vi khuẩn sẽ được thích nghi dần với môi trường chứa rượu, chứ không bị sốc như khi đột ngột gặp môi trường có nồng độ cồn cao, hơn nữa khi

đó môi trường còn đang rất giàu chất dinh dưỡng nên thuận ợi cho s sinh trưởng

và ph t triển của vi khuẩn Nuôi cấy hỗn hợp còn tạo điều ki n cho s ên men

ma o actic xảy ra đồng thời với ên men rượu, nếu ên men ma o actic không xảy ra

tức thời th có thể à do tỉ vi khuẩn trong dịch ên men qu ít hoặc do hàm ượng

SO2 qu cao đã ức chế vi khuẩn [2]

Tuy nhiên, phương ph p này cũng có hạn chế: đó à à s cạnh tranh không ành mạnh chất dinh dưỡng và quan h đối kh ng giữa vi khuẩn và nấm men S chuyển hóa đường của vi khuẩn actic để sinh ra axit actic gây ảnh hưởng đến hi u suất qu tr nh ên men rượu của nấm men và chất ượng rượu vang Bên cạnh đó, khi vi khuẩn lactic ph t triển mạnh sinh ra qu nhiều axít lactic và axetic gây ra s mất cân bằng vị trong rượu vang àm mất gi trị cảm quan của sản phẩm Phương

ph p này chỉ th c hi n khi c c chủng vi sinh vật đã được l a chọn kĩ, không có tính đối kh ng và ượng tế bào cần có của mỗi chủng được x c định Do vậy, phương

ph p ên men hai giai đoạn đã được tiến hành[7]

Lên men hai giai đoạn iên tiếp là qu tr nh ên men rượu và ên men

ma o actic riêng bi t Sau khi ên men rượu bởi nấm men kết thúc, đưa vi khuẩn vào

th c hi n giai đoạn ên men phụ ( ên men ma o actic) Phương ph p này có ưu điểm sau: Cho phép điều chỉnh một c ch dễ dàng c c yếu tố môi trường thích hợp cho từng oài, điều này giúp thời gian ên men của mỗi giai đoạn có thể rút ngắn không ảnh hưởng đến hi u suất ên men rượu v nuôi cấy hai chủng riêng, cuối qu tr nh

ên men, do nồng độ đường còn rất thấp nên úc này vi khuẩn actic buộc phải sử dụng c c axit hữu cơ àm nguồn cơ chất chính để tồn tại pH dịch ên men úc này

đã giảm còn khoảng 3.5 – 4, đây à khoảng pH thích hợp cho vi c chuyển hóa axit malic nguy cơ đường bị chuyển hóa thành c c sản phẩm kh c như axit actic, axit axetic giảm[7]

Nhược điểm lớn nhất của phương ph p này à khi kết thúc ên men rượu nồng độ cồn trong môi trường cao khoảng 12 – 15%v/v, do đó khi cấy vi khuẩn vào môi trường do gặp nồng độ cồn cao đột ngột nên vi khuẩn sẽ bị sốc, số ượng giảm

đ ng kể nên sẽ àm chậm qu tr nh ên men ma o actic Do vậy mà phải chọn được

c c chủng vi khuẩn có khả n ng chịu được độ cồn cao và dùng phương ph p nuôi cấy trước, tức à nuôi vi khuẩn trong c c môi trường giàu dinh dưỡng có bổ sung cồn ở khoảng pH 4,5 trong 5 – 7 ngày để vi khuẩn thích ứng dần sau đó mới đưa

vào vang non, qua đó có thể khắc phục t nh trạng chết của vi khuẩn một c ch đ ng kể

Trong th c tế, không có một phương ph p nào chung cho vi c khởi động

qu tr nh ên men ma o actic, v vậy khi đưa một chủng vi khuẩn nào vào th c hi n

qu tr nh này cần thiết phải x c định thời điểm bổ sung thích hợp chủng giống này

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, chủng vi sinh và hóa chất

2.1.1 Nguyên liệu

- Syro nho nhập khẩu của Ý có nồng độ chất khô 65°Bx

- Chế phẩm Essentia oenos (EO) do công ty Gusmer Enterprises cung cấp: à chế phẩm chứa chất dinh dưỡng cần cho s sống sót của vi khuẩn ma o actic, bao gồm

c c vitamin, c c axit amin và muối kho ng

- Enzym Pectinex Ultra SP-L và Pectinex 3XL của hãng NoVo (Đan Mạch), mua tại Công ty EAC (Vi t Nam)

2.1.2 Vi sinh vật

- Chủng nấm men: Chủng nấm men S.cerevisiae SH09 phân ập tại Ninh Thuận

n m 2008

2.1.3 Môi trường phân lập vi sinh vật

Môi trường phân lập vi khuẩn lactic (MRS)

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn malolactic

Sử dụng môi trường MRS có bổ sung axít ma ic: môi trường MRS: 1 ít; axít

ma ic: 5g; pH 5 (điều chỉnh bằng KOH 10N) và thạch: 30g

Môi trường lên men malolactic nước nho axít AG (Acide Grape)

2.1.5 Dụng cụ máy móc, thiết bị

C c dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu, phân tích của Vi n Công nghi p th c phẩm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Quy trình lên men rượu vang

Sy rô nho được pha với tỷ 20%, sau đó bổ sung đường kính để đạt nồng độ chất khô 250 Bx Lên men bằng chủng nấm men S.cerevisiae SH09 Kết thúc qu

tr nh này, tiếp tục ên men dịch trong vòng 10 ngày ở nhi t độ 25°C, thu được rượu vang non Bổ sung vi khuẩn ma o actic (tỷ giống 106

tế bào/m ) để tiến hành ên men malolactic

Bổ sung vi khuẩn ma o actic (tỷ giống 106 tế bào/m ) để tiến hành ên men malolactic

Mẫu ĐC: Lên men ma o actic t ph t

Mẫu F: Lên men Ma o actic, cấy vi khuẩn actic ngay đầu qu tr nh ên men rượu Mầu M: Lên men ma o actic, cấy vi khuẩn actic khi qu tr nh ên men rượu được 48h

Mẫu E: Lên men ma o actic, cấy vi khuẩn actic khi qu tr nh ên men rượu vừa kết thúc

- Phương ph p x c định khả n ng ên men của chủng vi khuẩn malolactic

Lấy một đầu que cấy giống vi khuẩn ma o actic từ khuân ạc trên đĩa petri hoặc ống thạch nghiêng rồi cấy vào 10-50 m môi trường ên men ma o actic dịch vang non sau khi ên men rượu của bộ môn th c phẩm và dinh dưỡng Vi n Công nghi p

Th c phẩm cung cấp và ọc vô trùng bằng màng 0,45 micromet Lên men ở nhi t độ