Nghiên cứu khả năng kháng rầy nâu và đặc điểm nông sinh học của một số giống lúa tại Thừa Thiên Huế

MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Lúa là cây lương thực chính của hơn 50% dân số thế giới, đặc biệt đối với người dân Châu Á. Đối với Việt Nam, lúa gạo là nguồn lương thực chính, mỗi ngày một người tiêu thụ 465g gạo (đứng thứ 2 thế giới sau Myanmar (578g gạo/ngày), ngoài ra lúa gạo còn là nguồn xuất khẩu thu nhiều ngoại tệ [56]. Để đáp ứng nhu cầu lương thực ngày càng tăng nông dân sử dụng các giống lúa năng suất cao và tăng cường thâm canh trong sản xuất lúa. Đây chính là nguyên nhân phát sinh các loại côn trùng chích hút (rầy nâu, rầy lưng trắng, rầy cánh trắng), trong số đó rầy nâu (Nilarpavata lugens Stal) là tác nhân hại lúa nghiêm trọng đặc biệt ở các nước Châu Á, [45], [86]. Chúng hút nhựa ở bẹ lá làm cho lúa bị úa vàng, sinh trưởng kém hoặc gây hại gián tiếp bằng cách truyền virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, nếu mật độ rầy cao có thể làm chết cây lúa, gây hiện tượng cháy khô cả đám ruộng [5], [42]. Các biện pháp hiện dùng để đối phó với dịch rầy nâu là sử dụng thuốc diệt rầy, thâm canh và phân bón hợp lý. Tuy nhiên việc lạm dụng thuốc trừ sâu hóa học đã làm giảm quần thể côn trùng có ích trên đồng ruộng, gây mất cân bằng sinh thái và phát triển các biotype rầy nâu kháng thuốc. Do vậy, giải pháp cơ bản và lâu dài mà vẫn an toàn với môi trường và sức khỏe người dân là xác định và phổ biến các giống lúa kháng rầy nâu đến với người nông dân [55], [57], [76]. Hiện nay đa số giống lúa đang được trồng chủ yếu ở tỉnh Thừa Thiên Huế như HT1, Xi23, 13/2 đều nhiễm rầy nâu [13]. Do vậy, việc di nhập giống lúa kháng rầy nâu từ các vùng miền khác để trồng và đánh giá khả năng kháng rầy nâu và các đặc điểm nông sinh học tại Thừa Thiên Huế là việc thiết yếu nhằm tuyển chọn bổ sung nguồn giống lúa kháng rầy nâu, sinh trưởng phát triển tốt tại điều kiện sinh thái địa phương . Khả năng kháng rầy nâu của các giống lúa được đánh giá thông qua phản ứng với quần thể rầy nâu địa phương, đồng thời sử dụng kỹ thuật của sinh học phân tử trong việc xác định các gen kháng rầy cho kết quả chính xác và rút ngắn được thời gian thử nghiệm. Ngoài việc chọn lọc giống lúa có khả năng kháng rầy nâu và năng suất cao thì chất lượng gạo cũng là mục tiêu quan trọng cần được quan tâm hàng đầu trong công tác tuyển chọn. Những giống lúa có ưu thế về chất lượng gạo như hàm lượng tinh bột, amylose, độ trở hồ, độ bền gel…làm cho cơm có vị ngọt, ngon, mềm và dẻo đồng thời có hàm lượng các chất dinh dưỡng cao là những giống lúa cần được khai thác [9]. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng kháng rầy nâu và đặc điểm nông sinh học của một số giống lúa tại Thừa Thiên Huế”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Trên cơ sở đánh giá khả năng kháng rầy nâu của một số giống lúa, phân tích các đặc điểm nông sinh học (thời gian sinh trưởng, khả năng đẻ nhánh, diện tích lá, cường độ quang hợp, năng suất, chất lượng hạt gạo) của các giống lúa kháng rầy nâu, phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các giống kháng rầy nâu trồng tại Thừa Thiên Huế. Dựa trên kết quả nghiên cứu, chúng tôi tham mưu, đề xuất cho địa phương sử dụng các giống lúa phù hợp. 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh trưởng phát triển, nông sinh học và sinh học phân tử của một số giống lúa để sàng lọc khả năng kháng rầy nâu ở Thừa Thiên Huế sẽ cung cấp các bằng chứng khoa học cho công tác chọn tạo giống tại địa phương này trong tương lai. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Giới thiệu được giống lúa có năng suất cao, chất lượng gạo tốt và kháng rầy nâu tốt cho Thừa Thiên Huế và các địa phương có đặc điểm sinh thái tương tự. 4. PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu này được tiến hành tại Hợp tác xã phường An Đông, thành phố Huế trong các vụ Hè Thu và Đông Xuân; Phòng thí nghiệm Sinh lý-Sinh hóa-Vi sinh, Khoa Sinh, Đại học Khoa học, Đại học Huế; và Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Đại học Huế. - Nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm: xác định các đặc điểm nông sinh học và đánh giá khả năng kháng rầy nâu của các giống lúa có nguồn gốc từ địa phương khác trồng ở Thừa Thiên Huế.

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

PH ẠM THỊ THANH MAI

VÀ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ

Ế-2016

DANH M ỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Amp ampicilin

bp base pair

BEPT birefringence end point temperature

cds coding DNA sequence

DNA deoxyribonucleic acid

ĐBSH đồng bằng sông Hồng

ĐBSCL đồng bằng sông Cửu Long

EtBr ethidium bromide

FAO Food and Agriculture Organization

MAS marker-assisted selection

NB-LRR nucleotide binding - leucine rich repeat

NN&PTNT Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

NST nhiễm sắc thể

PCR polymerase chain reaction

RADP random amplified polymorphic DNA

RFLP restriction fragment length polymorphism

SM standard marker

SSR simple sequence repeat

STS sequence tagged sites

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

X-gal 5-bromo-4 chloro- 3 indolyl-beta-D-glactoside

M Ở ĐẦU

1 TÍNH C ẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Lúa là cây lương thực chính của hơn 50% dân số thế giới, đặc biệt đối với người dân Châu Á Đối với Việt Nam, lúa gạo là nguồn lương thực chính, mỗi ngày

một người tiêu thụ 465g gạo (đứng thứ 2 thế giới sau Myanmar (578g gạo/ngày), ngoài ra lúa gạo còn là nguồn xuất khẩu thu nhiều ngoại tệ [56]

Để đáp ứng nhu cầu lương thực ngày càng tăng nông dân sử dụng các giống lúa năng suất cao và tăng cường thâm canh trong sản xuất lúa Đây chính là nguyên nhân phát sinh các loại côn trùng chích hút (rầy nâu, rầy lưng trắng, rầy cánh trắng), trong số

đó rầy nâu (Nilarpavata lugens Stal) là tác nhân hại lúa nghiêm trọng đặc biệt ở các nước

Châu Á, [45], [86] Chúng hút nhựa ở bẹ lá làm cho lúa bị úa vàng, sinh trưởng kém

hoặc gây hại gián tiếp bằng cách truyền virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, nếu mật độ

rầy cao có thể làm chết cây lúa, gây hiện tượng cháy khô cả đám ruộng [5], [42]

Các biện pháp hiện dùng để đối phó với dịch rầy nâu là sử dụng thuốc diệt

rầy, thâm canh và phân bón hợp lý Tuy nhiên việc lạm dụng thuốc trừ sâu hóa học

đã làm giảm quần thể côn trùng có ích trên đồng ruộng, gây mất cân bằng sinh thái

và phát triển các biotype rầy nâu kháng thuốc Do vậy, giải pháp cơ bản và lâu dài

mà vẫn an toàn với môi trường và sức khỏe người dân là xác định và phổ biến các

giống lúa kháng rầy nâu đến với người nông dân [55], [57], [76]

Hiện nay đa số giống lúa đang được trồng chủ yếu ở tỉnh Thừa Thiên Huế như HT1, Xi23, 13/2 đều nhiễm rầy nâu [13] Do vậy, việc di nhập giống lúa kháng

rầy nâu từ các vùng miền khác để trồng và đánh giá khả năng kháng rầy nâu và các đặc điểm nông sinh học tại Thừa Thiên Huế là việc thiết yếu nhằm tuyển chọn bổ sung nguồn giống lúa kháng rầy nâu, sinh trưởng phát triển tốt tại điều kiện sinh thái địa phương

Khả năng kháng rầy nâu của các giống lúa được đánh giá thông qua phản ứng với quần thể rầy nâu địa phương, đồng thời sử dụng kỹ thuật của sinh học phân

tử trong việc xác định các gen kháng rầy cho kết quả chính xác và rút ngắn được

thời gian thử nghiệm Ngoài việc chọn lọc giống lúa có khả năng kháng rầy nâu và năng suất cao thì chất lượng gạo cũng là mục tiêu quan trọng cần được quan tâm hàng đầu trong công tác tuyển chọn Những giống lúa có ưu thế về chất lượng gạo

ngon, mềm và dẻo đồng thời có hàm lượng các chất dinh dưỡng cao là những giống lúa cần được khai thác [9]

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng kháng

r ầy nâu và đặc điểm nông sinh học của một số giống lúa tại Thừa Thiên Huế”

2 M ỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Trên cơ sở đánh giá khả năng kháng rầy nâu của một số giống lúa, phân tích các đặc điểm nông sinh học (thời gian sinh trưởng, khả năng đẻ nhánh, diện tích lá, cường độ quang hợp, năng suất, chất lượng hạt gạo) của các giống lúa kháng rầy nâu, phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các giống kháng rầy nâu trồng tại

Thừa Thiên Huế Dựa trên kết quả nghiên cứu, chúng tôi tham mưu, đề xuất cho địa phương sử dụng các giống lúa phù hợp

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh trưởng phát triển, nông sinh học và sinh học phân tử của một số giống lúa để sàng lọc khả năng kháng rầy nâu ở Thừa Thiên Huế sẽ cung cấp các bằng chứng khoa học cho công tác chọn tạo giống tại địa phương này trong tương lai

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Giới thiệu được giống lúa có năng suất cao, chất lượng gạo tốt và kháng rầy nâu tốt cho Thừa Thiên Huế và các địa phương có đặc điểm sinh thái tương tự

4 PH ẠM VI NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu này được tiến hành tại Hợp tác xã phường An Đông, thành phố

Huế trong các vụ Hè Thu và Đông Xuân; Phòng thí nghiệm Sinh lý-Sinh hóa-Vi sinh, Khoa Sinh, Đại học Khoa học, Đại học Huế; và Phòng thí nghiệm Công nghệ

tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Đại học Huế

- Nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm: xác định các đặc điểm nông sinh học và đánh giá khả năng kháng rầy nâu của các giống lúa có nguồn gốc từ địa phương khác trồng ở Thừa Thiên Huế

Chương 1

1.1 Gi ới thiệu về lúa gạo

1.1.1 Đặc điểm của cây lúa

Lúa là thực vật có nguồn gốc nhiệt đới, xuất phát từ khu vực Nam châu Á và châu Phi nhưng có thể thích nghi với các điều kiện khí hậu khác nhau và được trồng

ở nhiều vùng trên thế giới Về mặt phân loại thực vật, cây lúa thuộc họ Gramineae,

tộc Oryzeae, chi Oryza Chi Oryza có khoảng 20 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới ẩm của châu Phi, Nam và Đông Nam châu Á, Nam Trung Quốc, Nam và Trung Mỹ và một phần ở châu Úc Trong đó, chỉ có 2 loài là lúa trồng, còn lại là lúa hoang hằng năm và nhiều năm Loài lúa trồng quan trọng nhất, thích nghi rộng rãi và chiếm đại bộ phận diện tích lúa thế giới là Oryza sativa L Qua quá trình

chọn lọc tự nhiên và nhân tạo, hiện nay đã hình thành 2 loại lúa chính là nhóm lúa Indica và Japonia Hai nhóm lúa này khác nhau về một số đặc điểm hình thái, sinh

lý, đặc tính thích nghi với điều kiện thời tiết, đặc tính sinh hóa hạt gạo [11]

Lúa là loài thực vật hàng năm, thân thảo và có thể cao tới 1,0-1,8 m, đôi khi cao hơn Các bộ phận của một nhánh lúa bao gồm: rễ, thân, lá và có thể có hoặc không có bông Các lá mỏng, hẹp bản (2,0-2,5 cm) và dài 50-100 cm Các hoa nhỏ

thụ phấn nhờ gió, mọc thành các cụm hoa phân nhánh cong hay rủ xuống, dài khoảng 30-50 cm Hạt lúa là loại quả thóc (hạt nhỏ, cứng như các loại cây ngũ

cốc) dài 5-12 mm và dày 2-3 mm Sau khi xát bỏ lớp vỏ ngoài, thu được sản phẩm chính là gạo và các phụ phẩm là cám và trấu [11], [14]

1.1.2 Giá tr ị của lúa gạo

Lúa là cây lương thực chính của hơn 50% dân số thế giới và trên 90% dân số dân số châu Á Lúa gạo cung cấp gần một phần tư năng lượng trên thế giới Điều này càng khẳng định giá trị rất lớn của lúa gạo đối với con người [95]

* Giá tr ị dinh dưỡng

Gạo là nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng So với lúa mì, gạo có thành phần tinh

bột và protein hơi thấp hơn, nhưng năng lượng tạo ra cao hơn do chứa nhiều chất béo hơn Ngoài ra, nếu tính trên đơn vị 1 hecta, gạo cung cấp nhiều calo hơn lúa mì

do năng suất lúa cao hơn nhiều so với lúa mì Một người trung bình cần 3.200 calo

mỗi ngày thì một hecta lúa có thể nuôi 2.055 người/ngày hoặc 5,63 người/năm, trong khi lúa mì chỉ nuôi được 3,67 người /năm, bắp 5,3 người/năm Hơn nữa, trong

gạo lại có chứa nhiều acid amin quan trọng như: lysine, threonine, methionine, tryptophan [11], [95]

Trong hạt gạo, hàm lượng dinh dưỡng tập trung ở các lớp ngoài và giảm dần vào trung tâm Lớp vỏ ngoài của hạt gạo (cám) chiếm khoảng 10% trọng lượng khô

là thành phần rất bổ dưỡng của lúa, chứa nhiều protein, chất béo, khoáng chất và vitamin đặt biệt là các vitamin nhóm B Tấm gồm có mầm hạt lúa bị tách ra khi xay chà, cũng là thành phần rất bổ dưỡng, chứa nhiều protein, chất béo, đường, chất

khoáng và vitamin [11]

Ngoài việc được sử dụng làm lương thực, gạo còn dùng để chế biến nhiều

loại bánh, làm men rượu, cơm mẻ, làm rượu, cồn,… Các lớp vỏ ngoài của hạt gạo

do chứa nhiều protein, chất béo, chất khoáng, vitamin, nhất là vitamin nhóm B, nên được dùng làm bột dinh dưỡng trẻ em và điều trị người bị bệnh phù thũng Cám là thành phần cơ bản trong thức ăn gia súc, gia cầm và trích lấy dầu ăn…Trấu có công

dụng làm chất đốt, chất độn chuồng, ngoài ra còn dùng làm ván ép, vật liệu cách nhiệt, cách âm, chế tạo carbon và silic [11]

* Giá tr ị thương mại

Trên thị trường thế giới, giá gạo xuất khẩu tính trên đơn vị trọng lượng cao hơn rất nhiều so với các loại hạt cốc khác Nói chung, giá gạo xuất khẩu cao hơn

gạo lúa mì từ 2-3 lần và hơn bắp hạt từ 2-4 lần [11]

Những quốc gia có diện tích trồng lúa lớn hầu hết tập trung ở châu Á Trong đó, Ấn Độ là quốc gia dẫn đầu thế giới với 44,10 triệu ha (chiếm 27,86%), đứng thứ hai là Trung Quốc với 29,93 triệu ha, Indonesia: 12,88 triệu ha,

Bangladesh: 11,50 triệu ha…Việt Nam là nước có năng suất lúa cao đứng hàng

thứ 3 trong 10 nước trồng lúa chính, đạt 52,28 tạ/ha Từ những năm 1980, Thái Lan trở thành nước xuất khẩu gạo đứng hàng đầu thế giới, nhưng năng suất hiện nay chỉ đạt 28,7 tạ/ha, chủ yếu do Thái Lan chú trọng nhiều hơn đến canh tác các

giống lúa dài ngày, chất lượng cao [51]

Hiện nay, Việt Nam có sản lượng gạo xuất khẩu đứng thứ hai trên thế giới Năm 2010, lượng gạo xuất khẩu của Việt Nam là 6,886 triệu tấn với trị giá trên 3,24 tỉ USD (Tổng cục Thống kê, 2011) Giá xuất khẩu gạo của Việt Nam giữa năm 2011 đã dần được nâng lên gần tương đương giá gạo Thái Lan cùng thời điểm

và cấp loại gạo Điều này cho thấy, chất lượng gạo và quan hệ thị trường gạo của

Việt Nam đã có thế cạnh tranh ngang hàng với gạo Thái Lan trên thị trường thế

giới [10]

1.1.3 Tình hình s ản xuất lúa gạo ở Thừa Thiên Huế

Theo tài liệu của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn thì chiến lược phát triển nông nghiệp nông thôn Việt Nam giai đoạn 2011-2020 đối với ngành sản xuất

lương thực là “Phát triển sản xuất lúa gạo Việt Nam trở thành mặt hàng xuất khẩu

mũi nhọn có hiệu quả và đảm bảo an ninh lương thực” Trên cơ sở tính toán cân đối

giữa nhu cầu tương lai của đất nước và dự báo nhu cầu chung của thế giới nhằm đảm

bảo tuyệt đối an ninh lương thực quốc gia trong mọi tình huống, đảm bảo quyền lợi

hợp lý của người sản xuất và kinh doanh lúa gạo và xuất khẩu có lợi nhuận cao, đảm

bảo sản lượng lúa đến năm 2020 đạt hơn 41 triệu tấn lúa trên diện tích canh tác 3,7 triệu ha [3]

Hiện nay ở Thừa Thiên Huế thường trồng 2 vụ lúa chính là Hè Thu (bắt đầu từ tháng 5 và kết thúc vào đầu tháng 9) và Đông Xuân (bắt đầu từ giữa tháng 12 và thu

hoạch vào cuối tháng 4 năm sau) Khí hậu Thừa Thiên Huế hàng năm có hai mùa rõ rệt,

một mùa khô nóng, một mùa mưa ẩm lạnh cùng với nhiều trận lụt bão nên sản xuất lúa ở

Thừa Thiên Huế gặp rất nhiều khó khăn Tuy nhiên, lúa gạo vẫn chiếm vị trí quan trọng trong cơ cấu kinh tế của tỉnh, với sản lượng 246.100 tấn gạo mỗi năm Thừa Thiên Huế đứng thứ 39 trong tổng số 64 tỉnh thành trong cả nước về sản xuất lúa gạo [30]

Thừa Thiên Huế là tỉnh có một phần lớn diện tích đất được dành cho trồng lúa nhưng nhìn chung, diện tích đó có xu hướng ngày càng giảm Nguyên nhân chủ

yếu là người dân chuyển các diện tích sản xuất năng suất thấp sang nuôi trồng thủy

sản Trong vòng 10 năm (2000-2009), diện tích lúa toàn tỉnh đã giảm 1.303 ha từ 51.341 ha xuống còn 50.038 ha Về năng suất, nhờ áp dụng các biện pháp khoa học

kỹ thuật mới, nhất là ưu tiên sử dụng các giống lúa cấp một nên năng suất lúa ở

Thừa Thiên Huế tăng nhanh từ 3,83 tấn/ha (2000) lên 5,3 tấn/ha (2009) Cùng với năng suất, sản lượng lúa cũng tăng trong những năm qua đáp ứng nhu cầu sử dụng trong tỉnh và góp phần quan trọng vào xuất khẩu gạo nước ta [30]

1.2 Đặc điểm sinh lý của cây lúa

1.2 1 Các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây lúa

Thời gian sinh trưởng của cây lúa từ khi nảy mầm cho đến chín thay đổi từ 90-

180 ngày tùy theo giống và điều kiện ngoại cảnh Đa số tài liệu hiện nay đều chỉ ra

rằng cây lúa trải qua 2 thời kỳ sinh trưởng, phát triển chính là sinh trưởng dinh dưỡng và sinh trưởng sinh thực [11], [101]

Đời sống cây lúa bắt đầu từ lúc hạt nảy mầm cho đến khi lúa chín Hình 1.1 cho thấy thời gian sinh trưởng của cây lúa ở vùng nhiệt đới kéo dài khoảng 120 ngày, có thể chia làm 3 giai đoạn: giai đoạn tăng trưởng (sinh trưởng dinh dưỡng) chiếm 60 ngày, giai đoạn sinh sản (sinh dục) là 30 ngày và giai đoạn chín 30 ngày

Hình 1.1 Quá trình sinh trưởng của một số giống lúa 120 ngày

(Ngu ồn Yoshida, 1981)

Các giống lúa khác nhau gieo trồng theo mùa vụ và điều kiện ngoại cảnh khác nhau thì thời gian sinh trưởng khác nhau Nắm được quy luật thay đổi thời gian sinh trưởng của cây lúa là cơ sở chủ yếu để xác định thời vụ gieo cấy, cơ cấu

giống, luân canh tăng vụ ở các vùng trồng lúa khác nhau [62]

Thời kỳ sinh trưởng dinh dưỡng được tính từ lúc gieo đến lúc làm đòng, bao

gồm thời kỳ nảy mầm, mạ và làm đốt, làm đòng Trong thời kỳ này cây lúa chủ yếu hình thành và phát triển các cơ quan dinh dưỡng như ra lá, phát triển rễ, đẻ nhánh

Thời kỳ này có ảnh hưởng trực tiếp tới việc hình thành số bông

Thời kỳ sinh trưởng sinh thực là thời kỳ phân hóa, hình thành cơ quan sinh

sản từ lúc làm đòng cho đến khi thu hoạch, bao gồm các quá trình làm đòng, trổ bông và hình thành hạt Quá trình làm đốt (phát triển thân) tuy là sinh trưởng dinh dưỡng nhưng lại song song với quá trình phân hóa đòng nên nó cũng nằm trong quá trình sinh trưởng sinh thực Thời kỳ này quyết định việc hình thành số hạt trên bông, tỷ lệ hạt chắc và trọng lượng hạt Có thể xem thời kỳ từ trổ bông đến chín ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất thu hoạch [106]

Do vậy, việc theo dõi thời gian sinh trưởng và phát triển của cây lúa (từ khi gieo, đẻ nhánh, kết thúc đẻ nhánh, làm đòng, trỗ bông và chín) nhằm xác định đặc tính giống dài ngày hay ngắn ngày, qua đó điều tiết thời vụ gieo cấy phù hợp đối

với từng giống lúa Mặt khác xác định được thời gian sinh trưởng sẽ giúp chúng ta

có những chế độ chăm sóc như: tưới tiêu, bón phân, phòng trừ sâu bệnh một cách

hợp lý hơn nhằm đem lại năng suất tối ưu cho từng giống lúa

* Th ời kỳ nảy mầm

Đời sống cây lúa bắt đầu bằng quá trình nảy mầm Trong suốt quá trình ngâm

ủ, trong hạt lúa đã xảy ra các hoạt động hoạt hóa tinh bột, protein và các chất béo để

biến đổi thành những chất đơn giản cung cấp dinh dưỡng nuôi phôi, các tế bào phôi phân chia lớn lên thành mầm và rễ mầm, trục phôi trương to, đẩy mầm và rễ mầm ra

khỏi vỏ trấu, kết thúc giai đoạn nảy mầm Nếu thu hoạch lúa đảm bảo độ chín, bảo

quản tốt thì sức nảy mầm của hạt tốt hơn Hạt giống có vỏ trấu mỏng thường hút nước nhanh hơn giống vỏ dày, do đó thời gian nảy mầm thường ngắn hơn [11] Theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất lượng hạt giống lúa của Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn (2011) thì một trong những tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng

hạt giống là phải có tỷ lệ nảy mầm trên 80% [4]

* Th ời kỳ mạ

Đối với cây lúa gieo thẳng (sạ), sau thời kỳ nảy mầm là thời kỳ cây con rồi bước vào thời kỳ đẻ nhánh khi cây có khoảng 4-5 lá, còn ở lúa cấy phải trải qua thời

kỳ mạ Căn cứ vào đặc điểm sinh trưởng của cây mạ, có thể chia ra thành 2 thời kỳ

nhỏ: thời kỳ mạ non và thời kỳ mạ khỏe Thời kỳ này ngắn hay dài phụ thuộc vào

Khả năng đẻ nhánh là một chỉ tiêu sinh trưởng quyết định số lượng bông trên

một khóm lúa, nhưng số nhánh hữu hiệu của cây mới là yếu tố quyết định số bông trên cây Nhánh hình thành bông (nhánh hữu hiệu) thấp hơn so với số nhánh tối đa

và ổn định khoảng 10 ngày trước khi đạt được số nhánh tối đa Các nhánh ra sau đó thường sẽ tự rụi đi không thành bông được do chồi yếu không đủ khả năng cạnh tranh dinh dưỡng, ánh sáng với các chồi khác gọi là chồi vô hiệu [11]

Các nghiên cứu trước đây cho rằng giống có nhiều chồi rất cần thiết cho sản lượng tối đa trong quần thể dày hoặc trung bình Tuy nhiên, khả năng nhảy chồi trung bình cũng được xem là tốt đối với những giống lúa cho năng suất cao Ở lúa

cấy, khoảng 10- 30 chồi có thể được sinh ra trong điều kiện trồng hợp lý, nhưng chỉ 2- 5 chồi được hình thành trong lúa sạ thẳng [23]

* Th ời kì trổ bông, làm hạt

Đây là thời kỳ sinh trưởng phát triển cuối cùng của cây lúa, có liên quan quyết định trực tiếp đến quá trình tạo năng suất, trong đó quyết định trực tiếp đến quá trình tạo hạt chắc và trọng lượng hạt Đây cũng là thời kỳ mà điều kiện ngoại

cảnh tác động rõ rệt đến năng suất Thời kỳ trổ bông, làm hạt bao gồm các quá trình

trổ bông nở hoa, thụ phấn, thụ tinh hình thành hạt và chín Thời kỳ này bắt đầu từ khi các hoa đầu tiên của bông nhô ra khỏi đòng cho đến khi chúng được thụ phấn, phát triển hình thành phôi nhũ và bắt đầu tích lũy tinh bột [11], [21]

Chín sáp: ở thời kỳ này chất dịch trong hạt dần dần đặc lại, hạt cứng Màu xanh ở lưng hạt dần chuyển sang màu vàng, trọng lượng hạt tiếp tục tăng lên

Chín hoàn toàn: thời kỳ này hạt chắc cứng, vỏ trấu từ màu vàng chuyển sang vàng nhạt, trọng lượng hạt đạt tối đa Nói chung thời kỳ chín của hạt kéo dài từ 30-

40 ngày tùy theo giống và thời vụ Đây là thời kỳ quyết định trọng lượng hạt và quyết định trực tiếp đến quá trình tạo năng suất lúa [101]

1.2.2 Ho ạt động sinh lý của cây lúa

Ở cây trồng người ta phân biệt 2 khái niệm về năng suất, đó là năng suất sinh

được trên đơn vị diện tích trong một thời gian nhất định Năng suất kinh tế là năng

suất bộ phận kinh tế của cây trồng Đối với cây lúa, năng suất kinh tế là lượng thóc thu được trên đơn vị diện tích Nói cách khác năng suất kinh tế là một phần của năng

suất sinh vật theo công thức:

năng suất kinh tế = năng suất sinh học × hệ số kinh tế

Nghiên cứu đặc điểm sinh lý quá trình hình thành năng suất là nghiên cứu quá trình hình thành, tích lũy chất khô (carbohydrate) trong cây và trong hạt Năng suất sinh học của cây lúa phụ thuộc vào các yếu tố như cường độ quang hợp, thời gian quang hợp, diện tích lá Để nâng cao năng suất kinh tế của cây lúa thì ngoài các biện pháp nâng cao năng suất sinh học phải chọn giống lúa tốt có hệ số kinh tế cao, và

phải tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để huy động tối đa các chất hữu cơ về tích lũy

ở cơ quan kinh tế (hạt thóc) như biện pháp tưới nước, bón phân, bố trí thời vụ hợp lý, phòng trừ sâu bệnh [26]

* Cường độ quang hợp và hiệu suất quang hợp

Quang hợp là quá trình cơ bản quyết định 90-95% năng suất cây trồng Do vậy tăng cường hoạt động quang hợp đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện năng suất cây trồng Theo Ishii và cộng sự (1977) thì cây lúa thuộc nhóm thực vật có chu trình quang hợp theo con đường C3, tuy nhiên nghiên cứu của Hegde và Joshi (1974) cho rằng

có cả hai chu trình quang hợp C3 và C4 trong cây lúa chịu hạn, [106]

+Cường độ quang hợp: được tính bằng lượng CO2 cây hấp thụ hoặc lượng

O2 cây thải ra hay lượng chất hữu cơ cây tích lũy được trên một đơn vị diện tích lá trong một đơn vị thời gian So với các loại cây C3khác, cây lúa có cường độ quang

hợp tương đối cao trên đơn vị diện tích lá: 10-20 mg CO2/dm2/1 giờ (tài liệu cũ), tài

liệu sau này thì khoảng 40-50 mg CO2/dm2/1 giờ [106] Cường độ quang hợp càng cao thì khả năng đồng hóa CO2 càng lớn, tuy nhiên đây là một chỉ tiêu phụ thuộc vào nhiều yếu tố như giống, giai đoạn sinh trưởng, điều kiện ngoại cảnh (cường độ ánh sáng, nhiệt độ, nồng độ CO2 ) Do vậy khi xác định cường độ quang hợp của cây lúa phải đặt trong một điều kiện cụ thể [26]

+ Hi ệu suất quang hợp: là lượng chất khô cây tích lũy được trên 1m2 lá trong

thời gian một ngày đêm Hệ số hiệu suất quang hợp tỷ lệ thuận với quá trình quang

hợp và tỷ lệ nghịch với quá trình hô hấp Hiệu suất quang hợp đánh giá khả năng tích lũy chất khô của quần thể cây trồng nên nó phản ánh năng suất cây trồng

Thường thì giai đoạn phát triển nào của cây có hoạt động quang hợp mạnh nhất thì

có hiệu suất quang hợp cao nhất [26]

* Hàm lượng diệp lục

Ở thực vật bậc cao, diệp lục là nhóm sắc tố chính tham gia vào quá trình quang hợp, bởi vì nó có khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng mặt trời, di trú tạm

thời năng lượng ánh sáng hấp thụ trên mức độ điện tử và biến năng lượng hấp thụ

ấy thành năng lượng hóa học, trong khi đó các loại sắc tố khác không thể thực hiện đầy đủ quá trình hấp thụ và biến đổi năng lượng ánh sáng như vậy được Trong đó

diệp lục a (C55H72O5N4Mg) và diệp lục b (C55H70O6N4Mg) là nhóm sắc tố chính tham gia vào quá trình quang hợp của cây trồng [26] Diệp lục a hấp thụ ánh sáng xanh-tím (blue-violet) và da cam-đỏ (orange-red) ở bước sóng 675 nm, trong khi đó

diệp lục b hấp thụ ánh sáng xanh (green) ở bước sóng 640 nm Trong điều kiện ánh sáng quang hợp thấp thì cây sản sinh ra nhiều diệp lục b hơn diệp lục a để tăng cường khả năng quang hợp của cây [68] Tỷ lệ diệp lục a/b được dùng như chỉ thị đánh giá sự hấp thu nitơ trong lá, vì tỷ lệ này liên quan trực tiếp với đến khả năng thu nhập ánh sáng của phức hợp diệp lục-protein (phần lớn là diệp lục b) trong hệ

thống quang hoá II [68, 103]

* Di ện tích lá

Lá chính là cơ quan quang hợp để tạo nên các chất hữu cơ tích lũy vào hạt

tạo nên năng suất kinh tế của cây lúa Có thể nói diện tích lá là một trong những yếu

tố quyết định năng suất của cây Để tăng năng suất cây lúa thì người ta tác động vào

2 yếu tố diện tích lá và thời gian quang hợp của lá Trong các biện pháp tăng diện tích lá và kéo dài thời gian quang hợp cần chú ý đến các yếu tố như giống, xen canh tăng vụ, mật độ cấy, phân bón đầy đủ và hợp lý, phòng trừ sâu bệnh hại lá [106]

* T ích lũy chất khô

Nhờ quá trình quang hợp nên lượng chất khô (carbohydrate) được hình thành trong cây và hạt lúa Các carbohydrate được tích lũy trong cây dưới 3 dạng: monosaccharide, oligosaccharide, polysaccaride Trong đó thì tinh bột thuộc nhóm polysaccharide được tích lũy nhiều trong hạt lúa Sự hình thành và tích lũy tinh bột trong cây có vai trò quan trọng và ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất

Trong cây lúa, tinh bột được hình thành ở lục lạp và có thể tích lũy trong bẹ lá, thân

và hạt Carbohydrate được tích lũy trong bẹ lá, thân cây sẽ được vận chuyển về hạt và tích lũy lại giúp cho hạt sinh trưởng được trong điều kiện thời tiết khác nhau và làm cho năng

trưởng của cây lúa, quá trình hình thành, tích lũy và vận chuyển các carbohydrate rất khác nhau Các carbohydrate bắt đầu tích lũy mạnh mẽ khoảng 2 tuần trước khi trổ bông và đạt

cực đại vào giai đoạn trổ bông sau đó giảm dần vào lúc chín rộ Ở giai đoạn chín hoàn toàn, quá trình tích lũy carbohydrate có thể tăng trở lại [106]

1.2.3 Các thành ph ần năng suất lúa

Morales (1986) cho rằng số hạt/bông và khối lượng 1.000 hạt là những yếu

tố quan trọng nhất trong việc gia tăng năng suất Trong khi đó, Moeljopawiro

(1989), Reuben và Katuli (1989) lại cho rằng số hạt/bông là yếu tố có ảnh hưởng

lớn nhất cấu thành năng suất Ibrahim và cộng sự (1990) cho rằng số nhánh/bông là

yếu tố cần quan tâm nhất khi chọn giống lúa Mehetre và cộng sự (1994) khẳng định số hạt chắc/bông là yếu tố năng suất cơ bản nhất (trích dẫn theo tài liệu của tác

giả Mzengeza, 2011) [79]

Phân tích cơ cấu năng suất lúa, người ta thấy năng suất được quyết định bởi

số bông/m2, số hạt/bông, tỷ lệ hạt chắc

Mỗi một giai đoạn phát triển của cây lúa đều liên quan mật thiết đến yếu tố

cấu thành năng suất Hầu như mỗi một yếu tố cấu thành năng suất lúa đều liên quan đến một giai đoạn phát triển cụ thể của cây lúa, mỗi một yếu tố đóng một vai trò khác nhau nhưng đều nằm trong một hệ quả liên hoàn tạo nên hiệu suất cao nhất mà trong đó các yếu tố đều có liên quan mật thiết với nhau Như vậy mỗi giai đoạn sinh trưởng, phát triển đều liên quan và tạo nên năng suất hạt sau này Vì vậy, chăm sóc,

quản lý tốt ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây lúa là điều hết sức cần thiết để nâng cao hiệu suất và năng suất cây lúa Muốn đạt năng suất cao cần phát huy đầy

đủ các yếu tố mà không ảnh hưởng lẫn nhau Trong một phạm vi nhất định thì tích

số của các yếu tố cấu thành năng suất đều đạt đến một mức độ cân bằng, chênh lệch nhau do quá trình tự điều tiết, nhưng nếu một yếu tố vượt quá phạm vi nhất định thì năng suất giảm Ví dụ như số bông tăng đến một phạm vi mà số hạt/bông và tỷ lệ

hạt chắc giảm ít thì năng suất đạt cao, nhưng nếu số bông tăng quá cao, số hạt/bông

và tỷ lệ hạt chắc giảm nhiều thì năng suất đạt thấp Số bông/m2 phụ thuộc nhiều vào

khả năng đẻ nhánh và mật độ gieo trồng [106]

1.2.4 Ảnh hưởng của một số điều kiện sinh thái đến sinh trưởng, phát triển của cây lúa

Sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa có liên quan mật thiết với điều kiện

thời tiết khí hậu Đó là các yếu tố về nhiệt độ, ẩm độ không khí, lượng mưa và ánh sáng Các yếu tố này thuận lợi thì sẽ là điều kiện cơ bản để nâng cao năng suất cây

trồng và ngược lại [101], [106]

* Nhiệt độ

Nhiệt độ có tác dụng quyết định đến tốc độ sinh trưởng của cây lúa Trong

phạm vi giới hạn (20-300C), nhiệt độ càng tăng cây lúa phát triển càng mạnh Nhiệt

độ trên 400C hoặc dưới 170C, cây lúa tăng trưởng chậm lại Dưới 130C cây lúa

ngừng sinh trưởng, nếu kéo dài cây lúa sẽ chết Phạm vi nhiệt độ mà cây lúa có thể

chịu đựng được và nhiệt độ tối hảo thay đổi tùy theo giống lúa, giai đọan sinh

trưởng, thời gian bị ảnh hưởng là tình trạng sinh lý của cây lúa Thời gian bị ảnh hưởng càng dài, cây lúa càng suy yếu thì khả năng chịu đựng càng kém Nhiệt độ

thấp làm giảm hoặc ngưng hẳn sự nẩy mầm của hạt, làm mạ chậm phát triển, cây

mạ ốm yếu, lùn lại, lá bị mất màu, trổ trễ, bông bị nghẹn, phần chót bông bị thoái hóa, sự thụ phấn bị đình trệ, khả năng bất thụ cao, hạt lép nhiều và chín kéo dài bất thường Ở nhiệt độ cao ngọn lá bị khô trắng, trên lá có những dãy và đốm bị mất màu, nở bụi kém, chiều cao giảm, số hạt trên bông giảm, bông lúa bị trắng, hạt thoái hóa nhiều, hạt bất thụ cao, hạt chắc giảm [106]

Thời kỳ phân hóa đòng: nếu thiếu ánh sáng thì bông lúa sẽ ngắn, ít hạt và hạt

nhỏ, hạt thoái hóa nhiều, dễ bị sâu bệnh phá hại

Thời kỳ lúa trổ: thiếu ánh sáng sự thụ phấn, thụ tinh bị trở ngại làm tăng số

hạt lép, giảm số hạt chắc và hạt phát triển không đầy đủ (hạt lửng), đồng thời cây có khuynh hướng vươn lóng dễ đổ ngã

Giai đoạn lúa chín: nếu ruộng lúa khô nước, nhiệt độ không khí cao, ánh sáng mạnh thì lúa chín nhanh và tập trung hơn; ngược lại thời gian chín sẽ kéo dài Thời kỳ cần năng lượng mặt trời cực trọng nhất đối với lúa là từ lúc phân hóa đòng đến khoảng 10 ngày truớc khi lúa chín, vì sự tích lũy tinh bột trong lá

và thân đã bắt đầu ngay từ khoảng 10 ngày trước khi trổ và được chuyển vị vào

hạt rất mạnh sau khi trổ [106]

* Lượng mưa

Lượng mưa là một trong những yếu tố khí hậu có tính chất quyết định đến việc hình thành các vùng trồng lúa và các vụ lúa trong năm Trong mùa mưa ẩm, lượng mưa cần thiết cho cây lúa trung bình là 6 – 7 mm/ngày và 8 – 9 mm/ngày trong mùa khô nếu không có nguồn nước khác bổ sung Nếu tính luôn lượng nước thấm rút và

bốc hơi thì trung bình 1 tháng cây lúa cần một lượng mưa khoảng 200 mm và suốt vụ lúa 5 tháng cần khoảng 1000 mm [106]

1.3 Đặc điểm hình thái, đặc tính hóa sinh của hạt gạo

1.3.1 Đặc điểm hình thái hạt gạo

Bằng cảm quan, chất lượng hạt gạo được đánh giá thông qua tỷ lệ dài/rộng và

độ bạc bụng Hình dạng hạt gạo phụ thuộc vào điều kiện khí hậu mà nơi nó phát triển như: hạt gạo Indica phát triển ở vùng có khí hậu nhiệt đới có hình dạng dài, thon, khô khi nấu, không dẻo chiếm 75% thị trường toàn cầu Trong khi đó, hạt gạo japonica

trường thế giới và gạo thơm như Jasmine của Thái Lan và Basmati của Ấn Độ và

Pakistan thon và dài hơn hạt Indica chiếm 12-13% thị trường thế giới [84]

Độ bạc bụng là phần đục của hạt gạo liên quan đến tính dễ gãy trong xay xát Tuy nhiên độ bạc bụng sẽ biến mất và không ảnh hưởng đến mùi, vị của cơm Bạc

bụng là do sự sắp xếp không chặt chẽ của những hạt tinh bột trong nội nhũ, tạo ra nhiều khoảng trống làm cho hạt gạo bị đục, điều này được cho là có thể do sự trục

trặc trong quá trình tạo hạt và phơi sấy Người ta phân biệt độ bạc bụng dựa vào vị trí của vết đục nằm về phía mầm hạt ở giữa hạt hay ở phía đối diện (lưng) mà chia ra:

bụng trắng (white belly), gan trắng (white center) hay lưng trắng (white back) [11]

Độ bạc bụng được chia ra các cấp từ 0 đến 9 dựa vào thể tích vết đục so với thể tích

của cả hạt gạo và tỷ lệ số hạt bị bạc bụng [61] Tỷ lệ bạc bụng cao (như gạo tẻ) sẽ làm tăng tỷ lệ gãy của hạt trong quá trình xay xát [18]

1.3.2 Đặc tính hóa sinh hạt gạo

Chất lượng hạt gạo là một chỉ tiêu quan trọng liên quan đến thị hiếu của người tiêu dùng hiện nay Trong điều kiện kinh tế ngày càng được cải thiện, đời

sống của người dân ngày càng được nâng cao, thì xu hướng “Ăn ngon” càng được chú trọng, do vậy bên cạnh yếu tố năng suất thì yếu tố liên quan đến chất lượng gạo như hàm lượng amylose, độ trở hồ, độ bền thể gel, hàm lượng protein, vitamin, khoáng vi lượng ngày càng được quan tâm [9], [29], [91] Chất lượng hạt gạo được đánh giá thông qua một số chỉ tiêu như hình dạng hạt gạo, hàm lượng chất dinh dưỡng có trong hạt gạo, độ mềm dẻo của hạt gạo khi nấu thành cơm [18], [48]

Trong hạt gạo, hàm lượng dinh dưỡng tập trung ở các lớp ngoài và giảm dần vào trung tâm Lớp vỏ ngoài của hạt gạo (cám) chiếm khoảng 10% trọng lượng khô

là thành phần rất bổ dưỡng của lúa, chứa nhiều protein, chất béo, khoáng chất và vitaminSo với lúa mì, gạo có thành phần tinh bột và protein hơi thấp hơn, nhưng năng lượng tạo ra cao hơn do chứa nhiều chất béo hơn (Bảng 1.1) Ngoài ra, nếu tính trên đơn vị 1 hecta, gạo cung cấp nhiều calo hơn lúa mì do năng suất lúa cao hơn nhiều so với lúa mì Một người trung bình cần 3.200 calo mỗi ngày thì một hecta lúa có thể nuôi 2.055 người/ngày hoặc 5,63 người/năm, trong khi lúa mì chỉ nuôi được 3,67 người /năm, bắp 5,3 người/năm Hơn nữa, trong gạo lại có chứa nhiều acid amin, thiết yếu như: lysine, threonine, methionine, tryptophan… hơn hẳn

lúa mì [11], [95]

B ảng 1.1 Thành phần hóa học của lúa gạo so với một số loại cây lương thực khác

(% khối lượng khô)Cây lương thực Tinh bột Protein Lipid Chất xơ Tro

có hàm lượng protein càng cao càng có giá trị dinh dưỡng Giống lúa và môi trường

ở vùng nhiệt đới trong giai đoạn chín, đặc biệt là giai đoạn từ 14-21 ngày sau khi

trổ, có ảnh hưởng rất lớn tới tính chất của tinh bột và hàm lượng protein, vì các hạt tinh bột bắt đầu xuất hiện 4 ngày sau khi trổ, protein khoảng 7 ngày sau khi trổ và

thời kỳ tích lũy tinh bột và protein thật sự trong hạt lúa rất ngắn Độ chín của hạt cũng có ảnh hưởng đến phẩm chất hạt, hạt chín sớm hoặc độ chín không đồng đều

sẽ làm giảm phẩm chất hạt [11]

Protein dự trữ trong hạt có thể chia thành 4 nhóm dựa vào tính chất tan của chúng, những protein chính tìm thấy ở lúa là glutein (hay còn gọi là glutelin), glubolin, prolamin, albumin Theo những nghiên cứu trước đây, glutein chiếm khoảng 80% protein tổng số của hạt, 20% còn lại gồm prolamin, albumin, globulin [96]

Việc gia tăng hàm lượng protein và thành phần amino acid cân đối trong hạt

có vai trò quan trọng về mặt dinh dưỡng cho người dân ở các nước nghèo Theo nghiên cứu của Stoh và cộng sự (2010), protein trong gạo chiếm từ 20-40% tổng số protein trong bữa ăn hằng ngày của người dân các nước châu Á và là nguồn protein

truyền tính trạng liên quan đến hàm lượng protein trong hạt rất phức tạp và bị ảnh hưởng mạnh mẽ của môi trường, giống có hàm lượng protein cao thường là giống

ngắn ngày và trọng lượng hạt nhẹ [92]

* Hàm lượng amylose

Amylose là thành phần tinh bột không phân nhánh trong hạt gạo, là yếu tố ảnh hưởng đến sự mềm cơm hoặc ngược lại Hàm lượng amylose trong hạt gạo dao động từ 1-35% (phổ biến nhất từ 15-33%), được chia thành các nhóm: 0-2%: rất

thấp, 2-20%: thấp, 20-25%: trung bình và trên 25%: cao Hàm lượng amylose trong

hạt gạo từ 20-25% thường cho cơm ngon, mềm và dẻo Những giống có hàm lượng amylose lớn hơn 25% cho cơm khô, cứng và rời rạc

Hàm lượng amylose trong hạt thay đổi tùy theo từng loại giống, các giống lúa thuộc nhóm Japonica thường biến động từ 10-20%, trong khi đó giống Indica thường biến động từ 20-30% Những giống có hàm lượng amylose trung bình

thường được ưa chuộng hơn [11], [33], [80]

Độ nở, khả năng hấp thụ nước, và tính kháng đối với sự phân hủy của gạo trong khi nấu có liên quan trực tiếp đến tỷ lệ amylose/amylopectin của tinh bột Tính mềm và dẻo của cơm có tương quan nghịch với hàm lượng amylose Các

giống lúa có hàm lượng amylose tương đương, có thể có sự khác biệt về độ bền gel

và nhiệt độ hóa hồ (độ trở hồ) [11]

Hàm lượng amylose do một gen điều khiển kèm theo một gen phụ có tính

chất cải tiến Hàm lượng amylose cao có tính trội không hoàn toàn so với hàm lượng amylose thấp Nghiên cứu của Resurreccion và cs (1977) cho thấy nhiệt độ không khí trong thời kỳ phát triển của hạt ảnh hưởng đến tốc độ tích lũy tinh bột và đặc tính của hạt tinh bột Nhiệt độ càng cao có thể làm giảm hàm lượng amylose nhưng lại làm tăng nhiệt độ hóa hồ hay độ trở hồ của các hạt tinh bột Nhiệt độ thấp không ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột tích lũy cuối cùng nhưng lại làm tăng hàm lượng amylose [33], [97], [99]

* Độ trở hồ

Độ trở hồ hay còn gọi là nhiệt độ hóa hồ (BEPT-birefringence end point temperature) là thời gian cần thiết để nấu gạo thành cơm Nhiệt độ hóa hồ là nhiệt

độ mà ở đó 90% hạt tinh bột bị hóa hồ hoặc phồng lên trong nước nóng không thể

trở lại dạng cũ được Nhiệt độ hoá hồ được chia thành các cấp như: 55-69,5oC: thấp, 70-74oC: trung bình và 74,5-79oC: cao [11]

* Độ bền gel

Độ bền gel (còn được gọi là độ trải gel) là giá trị đo lường đặc tính chảy của

hồ Đây là một thông số liên quan đến xu hướng cứng cơm khi nguội, là yếu tố quyết định đến phẩm chất cơm Thường có sự liên hệ trực tiếp giữa độ bền gel và

hàm lượng amylose, nhưng trong những giống có cùng hàm lượng amylose, giống

có độ bền gel lớn thường được ưa chuộng hơn vì mềm cơm, hạt gạo óng ánh hơn [104]

Cũng như hàm lượng amylose và độ trở hồ, độ bền gel cũng chịu ảnh hưởng

của môi trường trong quá trình hình thành hạt gạo Thường độ bền gel mềm hay tinh bột gạo kéo dài ra nếu nhiệt độ cao trong thời gian hạt gạo tích lũy và chín hạt Đây cũng là một yếu tố chính đánh giá chất lượng xay chà hạt gạo, vì chất cám dính vào hạt gạo cũng làm độ bền gel mềm hơn [11], [17]

Lúa trồng ở các vùng nhiệt độ khác nhau có độ bền gel, hàm lượng amylose,

độ trở hồ và độ bền thể gel của hạt gạo khác nhau Lúa Indica có hàm lượng tinh bột

biến động nhiều hơn loại lúa Japonica Lúa Japonica có hàm lượng amylose thấp và

hầu hết chúng đều có BEPT thấp và độ bền gel mềm [52]

1.4 R ầy nâu gây hại và khả năng kháng rầy nâu của cây lúa

1.4.1 Gi ới thiệu về rầy nâu

Rầy nâu (Nilarpavata lugens S.), thuộc họ Delphacidae, bộ Homoptera Rầy

nâu phân bố ở nhiều nước Châu Á, Châu Úc và quần đảo Thái Bình Dương, nhưng chúng không được tìm thấy ở Châu Mỹ và Châu Phi [45]

Rầy nâu chích hút trực tiếp chất dinh dưỡng từ cây đang phát triển, làm giảm năng suất, nếu mật độ rầy cao có thể làm chết cây lúa, gây hiện tượng cháy khô cả đám ruộng [47] Chen và cộng sự (1979) chỉ ra rằng rằng cây lúa có phản ứng khác nhau đối với các thời điểm gây hại khác nhau của rầy nâu, thông thường nếu rầy nâu chích hút vào giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng thì khả năng bị mất năng suất cao hơn là chích hút ở giai đoạn lúa bắt đầu chín [47]

Ngoài ra, rầy nâu cũng có thể gây hại gián tiếp cho cây lúa bằng cách truyền virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá [5], [42] Hai loại virus này phân bố rộng ở Nam Á và Đông Nam Á trong đó có Việt Nam [81]

Rầy nâu thường tập trung thành từng đám ở giữa thân và phần gốc lúa (cách

mặt nước ruộng 20 cm), chúng chích hút nhựa cây làm thức ăn Rầy nâu sinh sản và phát triển rất nhanh Mỗi lứa, rầy cái đẻ hàng trăm trứng trong bẹ lá Rầy con phải

trải qua 5 lần lột xác để trở thành rầy trưởng thành Vòng đời trung bình của rầy nâu khoảng 25-28 ngày, ở nhiệt độ 25-30oC Nếu gặp điều kiện thuận lợi, thức ăn đầy

đủ thì từ lúc trứng nở đến khi trưởng thành chỉ mất khoảng 15-20 ngày Ở Việt Nam trong một vụ lúa có thể xuất hiện 3 lứa rầy Ở các nước khác thường sử dụng các

giống lúa có thời gian sinh trưởng dài nên số lứa rầy xuất hiện cũng nhiều hơn, có

thể lên đến 8 lứa rầy trong một vụ lúa [50]

Rầy trưởng thành cánh ngắn có thời gian đẻ trứng sớm hơn, số lượng trứng nhiều hơn rầy trưởng thành cánh dài Rầy cái dài 4,5-5,0 mm có màu nâu vàng, rầy đực dài 3,6-4,0 mm có màu nâu tối [50]

Điều kiện khí hậu ấm nóng, ẩm độ cao, mưa nắng xen kẻ thích hợp cho rầy nâu phát triển Ở miền Nam rầy có thể gây hại liên tục các vụ lúa, còn ở phía Bắc thường gây hại vào tháng 5 (vụ xuân) và cuối tháng 9 đầu tháng 10 (vụ mùa)

1.4.2 Biotype r ầy nâu

Các biotype rầy nâu được xác định chủ yếu dựa vào phản ứng khác nhau của

thành các biotype khác nhau Việc sử dụng các giống lúa đơn gen liên tục trong nhiều năm làm cho biotype của rầy nâu phát triển, chúng có thể thích ứng và gây

hại được trên các giống lúa đó Sự gây hại và độc tính của rầy nâu ở các vùng địa

lý, khí hậu khác nhau cũng thay đổi, các nhà côn trùng học và chọn giống lúa nhận

thấy có một số giống có khả năng kháng rầy nâu ở vùng này nhưng có thể trở thành

giống nhiễm ở vùng địa lý khác [87] Hiện nay có 4 biotype: biotype 1 phân bố rộng

ở vùng Đông Á và Đông Nam Á, biotype 2 có nguồn gốc ở Philippin phát sinh sau khi sử dụng rộng rãi các giống có gen bph1, biotype 3 phát sinh từ các phòng thí

nghiệm ở Nhật Bản và Philippin, biotype 4 chỉ thấy ở vùng Nam Á [12], [38], [66]

Theo Saxena và Barrion (1983), các biotype rầy nâu được xác định chủ yếu

dựa vào phản ứng khác nhau của cây lúa đối với rầy cũng như phản ứng đối phó lại

của rầy Ngoài ra, hình thái của rầy nâu như vòi hút, chân, râu, các bộ phận khác

của cơ thể cũng là yếu tố để phân thành các biotype khác nhau Việc sử dụng các

giống lúa đơn gen liên tục trong nhiều năm làm cho biotype của rầy nâu phát triển, chúng có thể thích ứng và gây hại được trên các giống lúa đó [87]

Sự gây hại và độc tính của rầy nâu ở các vùng địa lý, khí hậu khác nhau cũng thay đổi, các nhà côn trùng học và chọn giống lúa nhận thấy có một số

giống có khả năng kháng rầy nâu ở vùng này nhưng có thể trở thành giống

nhiễm ở vùng địa lý khác [87]

Ở nước ta do cách biệt về địa lý đã ngăn chặn sự lây lan của các quần thể rầy nâu giữa 2 miền Nam-Bắc, do đó đã hình thành nên các quần thể rầy nâu ở miền Nam và miền Bắc với độc tính khác nhau như rầy nâu Tiền Giang có độc tính cao hơn rầy nâu Hà Nội [12] Rầy nâu ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chủ yếu

là biotype 2, nhưng khả năng thích ứng gia tăng và đang chuyển biến thành biotype

mới [20] Trong khi đó quần thể rầy nâu ở tỉnh Thừa Thiên Huế thuộc biotype 1 và biotype 2 [13].Chính vì sự thay đổi biotype rầy nâu như vậy nên việc sử dụng giống lúa kháng rầy đa gen thật sự có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn giống

kháng hiện nay

1.4.3 Cơ chế kháng rầy nâu của cây lúa

Tính kháng là một phản ứng tự vệ của cây chống lại sự tấn công của côn trùng và mầm bệnh Hiểu rõ cơ chế kháng rầy sẽ là tiền đề quan trọng cho những

biện pháp nhằm hạn chế thiệt hại do rầy nâu gây ra Những nghiên cứu dựa vào các

kỹ thuật phân tử gần đây cho thấy có sự thay đổi về mặt di truyền, sinh lý và hóa sinh của cây lúa khi có sự tấn công của rầy nâu [37], [59], [100], song cơ chế kháng

rầy nâu vẫn chưa được xác định rõ [43], [82].Khi bị rầy tấn công có hàm lượng lớn các chất schaftoside, isoschaftoside và apigenin-C-glycosides được tích luỹ cao hơn

ở giống kháng so với giống không, có lẽ các chất này gây tăng tỷ lệ chết của rầy nâu [93] Một nghiên cứu khác được thực hiện trên hai nhóm lúa kháng rầy và không kháng rầy đã phát hiện thấy hàm lượng đường dự trữ trong các giống lúa kháng rầy

giảm mạnh khi bị rầy nâu tấn công [74] Bing và cộng sự (2007) đã sử dụng phương pháp sắc ký cột tách được flavonoid 5,7,4′-trihydroxy-3′,5′-dimethoxyflavone

(tricin) từ giống lúa IR36 (chứa gen kháng rầy bph2) Các thí nghiệm sau đó của các

tác giả cho thấy trictin có tác dụng làm tăng tỷ lệ chết ở rầy non, giảm số lượng rầy trưởng thành, giảm khả năng đẻ trứng của rầy cái [39]

Nghiên cứu của Hao và cộng sự (2008) trên hai giống B5 (kháng) và giống TN1 (nhiễm) cho thấy, hàm lượng enzyme callose synthase (enzyme tổng hợp

callose) tăng lên khi cây lúa bị rầy tấn công Các phân tích khác cũng cho thấy, trên cây lúa có gen kháng thì rầy nâu phải tốn nhiều thời gian để hút và lượng nhựa hút được cũng ít hơn so với cây nhiễm rầy do quá trình chích hút thường xuyên bị gián đoạn Điều này đã được chứng minh thông qua theo dõi lượng [14C] sucrose trong cây Cây sau khi bị nhiễm rầy nâu thì tăng giải mã các gen tổng hợp callose và gây ra

lắng đọng callose trong ống dẫn tại vị trí chích hút của rầy nâu Ở cây kháng, sự lắng đọng callose được duy trì, trong khi đó ở cây nhiễm rầy nâu thì các gen mã hóa enzyme β-1,3-glucanase được hoạt hóa dẫn đến thông ống dẫn tại vị trí callose ngưng

tụ ban đầu Do enzyme β-1,3-glucanase được tạo ra có tác dụng thủy phân callose Ở cây lúa nhiễm rầy, quá trình hút liên tục của rầy nâu dẫn đến giảm rõ rệt hàm lượng sucrose trong cây đồng thời kích hoạt gen Ramy3D gây thủy phân tinh bột, cuối cùng làm cạn kiệt lượng carbohydrate của cây Sự lắng đọng callose ở ống dẫn được xem

là cơ chế bảo vệ quan trọng để hạn chế các tổn hại do rầy nâu gây ra [53]

Zhang và cộng sự (2004) đã phát hiện biểu hiện của 58 gen khác nhau, các gen này tham gia vào con đường trao đổi jasmonic acid độc lập và liên kết với các con đường trao đổi chất của các tác nhân vô sinh (abiotic) như: tín hiệu (signaling pathway), phản ứng tổn thương, cảm ứng chịu hạn và các quá trình trao đổi của hormon tín hiệu thực vật khi lúa bị gây nhiễm rầy nâu [107]

Wang và cộng sự (2008), trong thí nghiệm thăm dò sự khác nhau về di truyền

giữa các giống kháng và nhiễm rầy nâu, giống nhiễm rầy MH63 có sự suy giảm 3 thông

số cơ bản đại diện cho sự sinh trưởng của cây lúa (diện tích lá, chiều cao và khối lượng khô), đồng thời khả năng quang hợp của cây nhiễm rầy cũng bị giảm Còn ở giống kháng B5, khi bị rầy nâu tấn công thì có giảm nhẹ hàm lượng đường sucrose và protein, nhưng khả năng sinh trưởng thì vẫn bình thường Sử dụng microarray cDNA, đã phát

hiện sự biểu hiện của 160 gen lạ do sự tác động của rầy nâu Một trong những gen tổng

hợp jasmonic acid cũng xuất hiện khi rầy nâu tấn công cây lúa và giúp tăng cường khả năng kháng rầy trong các dòng lúa chuyển gen [98]

Theo nghiên cứu của Du và cộng sự (2009) trên giống lúa có mang gen kháng rầy nâu bph (brown planthopper) cho thấy gen bph14 mã hóa protein C

(coiled-coil), NB (nucleotide binding), và LRR (leucine rich repeat) So sánh chuỗi trình tự cho thấy gen này mang vùng domain của LRR có chức năng ghi nhận sự xâm nhập của rầy nâu và kích hoạt phản ứng tự vệ Gen bph14 ưu tiên thể hiện ở

vùng bó mạch dẫn truyền, nơi rầy nâu chích hút cây lúa Thể hiện gen bph14 làm

kích hoạt lộ trình truyền tín hiệu của salicylic acid và làm tích lũy callose ở mạch rây, sản xuất chất ức chế trypsin sau khi bị rầy nâu tấn công, nhờ đó, nó làm giảm đáng kể sự chích hút của rầy, rầy tăng trưởng kém, và giảm tuổi thọ [49] Các nghiên cứu khác cho thấy hàm lượng diệp lục, lượng nước trong cây, hàm lượng protein và đường giảm xuống, nhưng nitơ tự do và quá trình tổng hợp amino acid

lại tăng lên khi cây bị rầy tấn công [43], [107] Phân tích proteomic trên giống lúa

mang gen bph15, kết quả cho thấy cơ chế tổng hợp callose và glycine có liên quan đến tính kháng rầy [100]

1.4.4 Gen kháng r ầy nâu ở cây lúa

Gen kháng rầy nâu đã được Pathak và cộng sự phát hiện đầu tiên vào năm

1967 tại Viện Lúa Quốc tế (International Rice Research Institute-IRRI) [69] Cho đến nay đã có ít nhất 24 gen kháng rầy nâu được xác định Những gen này có nguồn

gốc từ giống lúa trồng hoặc hoang dại [41], [66], [89].Trong số các gen đã được xác

định gen bph1 và bph2 được xác định từ năm 1970 [36] Giống lúa kháng rầy nâu

đầu tiên mang gen bhp1 được trồng đại trà ở nhiều quốc gia là IR26 Tuy nhiên, sau

6 năm trồng đại trà giống IR26 trở nên mẫn cảm với rầy nâu do sự xuất hiện của

quần thể rầy nâu biotype 2 Các nghiên cứu tiếp theo đã xác định được gen bph2 và

giống lúa mang gen kháng rầy nâu bph2 được trồng rộng rãi ở Philippin, Indonesia

và Việt Nam Các giống kháng rầy nâu mang gen bph2 giữ được tính kháng ổn định

hơn 10 năm, cho tới năm 1991 Sau đó thì xuất hiện một loại biotype rầy nâu mới,

biotype 3, đã phá vỡ tính kháng của gen bph2 [69] Gen bph3 được xác định là có nguồn gốc từ giống chuẩn Rathu Heenati và gen này phân ly độc lập với gen bhp1

Gen lặn bph4 có nguồn gốc từ giống chuẩn Babawee và phân ly độc lập với gen

bph2 Giống lúa IR56 và IR60 được chọn tạo và trồng đại trà ở Philippin vào năm

1982 có mang gen bph3 Gi ống IR66 mang gen bph4 bắt đầu trồng năm 1987 Các

giống IR68, IR70, IR72, IR74 mang gen bph3 được trồng vào năm 1988 có khả

năng kháng rầy nâu biotype 3 [66]

Gần đây, nhờ áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử đã giúp các nhà khoa học

lập được bản đồ gen kháng rầy nâu Trong số 21 gen kháng rầy nâu, có 18 gen đã xác định được vị trí trên 6 nhiễm sắc thể (NST) khác nhau của cây lúa Một nhóm

các gen như: bph1, bph2, bph9, bph10, bph18, and bph21 nằm trên cánh dài của

NST số 12, gen bph12, bph15, bph17, bph20 đều nằm trên cánh ngắn của NST số 4, gen bph11, bph14 n ằm trên cánh dài của NST số 3, gen Bph13, bph19 nằm trên

cánh ngắn của NST số 3 (Hình 1.2) [41], [66], [88], [102] Sáu gen (Bph11, bph11,

Bph12, bph12, bph13 and bph13-t) có nguồn gốc từ các giống lúa hoang dại Bên

cạnh những gen chính được xác định định vị trên 3 NST trên thì xác định các locus điều khiển tính trạng bằng bảng đồ gen (QTLs) kết hợp với kháng rầy nâu đã phát

hiện gen kháng rầy nâu nằm trên 8 NST khác nhau Hầu hết các giống lúa trồng có nguồn gốc từ IRRI có chứa 1 hoặc 2 gen kháng rầy nâu, trong đó giống lúa IR64 được xác định có chứa nhiều gen kháng rầy nâu mạnh [58]

Hình 1.2 V ị trí của các gen kháng rầy nâu trên bộ NST của cây lúa

(Ngu ồn Jena, 2010)

Bên cạnh việc xác định vị trí của các gen kháng rầy nâu khác nhau trên qua bảng

đồ gen thì việc xác định từng gen cũng đã được tiến hành bằng các kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau Sharma và cộng sự (2004) đã thiết kế các chỉ thị STS (sequence

tagged sites) dựa trên chỉ thị AFLP (amplified fragment length polymorphism) nhằm

xác định gen Bph1 và bph2 [90], [89] Kim và cộng sự (2005) đã sử dụng OPE18 được chuyển đổi thành chỉ thị STS BpE18-3 liên kết với gen kháng rầy nâu

RAPD-Bph1 nằm trên NST số 12, khoảng cách di truyền là 3.9 cM [67]

Jairin và cộng sự (2007a, 2007b) đã sử dụng các dòng con lai của 3 cặp bố mẹ: PTB33 × RD6, Rathu Heenati × KDML105 và IR71033-121-15 × KDML105, để nghiên cứu xác định gen kháng rầy nâu Nhóm tác giả đã phát hiện được gen Bph3

theo trên cánh ngắn của NST số 6, gen Bph3 liên kết chặt với 2 chỉ thị SSR là RM586

và RM589 với khoảng cách di truyền lần lượt là 1,4 và 0,9 cM Nhóm tác giả tiếp tục nghiên cứu và xác định được gen bph4 có gần vị trí trên cùng NST với gen Bph3,

giữa 2 marker RM586 và RM589 [63], [64]

Du và cộng sự (2009) đã sử dụng kỹ thuật “map-based cloning” phân lập

được được gen bph14 kháng rầy nâu Độ dài đầy đủ của gen này là 9921 bp gồm 1

intron và 2 exon, độ dài của vùng cds (coding DNA sequence) là 3972 bp mã hóa

1323 amino acid, protein do gen bph14 mã hóa thuộc nhóm protein NB-LRR

(Nucleotide Binding - Leucine Rich Repeat), đây là loại protein được mã hóa bởi

ột số gen kháng với một số loại sâu bệnh ở thực vật Gen bph14 tạo dòng thành

khác Đồng thời kết quả của việc giải trình tự gen bph14 cũng rất hữu ích cho việc

nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng rầy nâu ở cây lúa [49]

Qiu và cộng sự (2012) nghiên cứu về hai giống lúa có mang gen kháng rầy nâu Q660 và Q327, là nguồn nguyên liệu cho lai tạo phát triển các giống lúa kháng

rầy nâu [83] Myint và cộng sự (2012) đã xác định được 2 gen kháng rầy nâu bph25 và

bph26 trong gi ống lúa ADR52 được trồng ở Ấn Độ [78] Hai gen kháng rầy nâu bph27

và bph27(t) cho thấy 2 gen này định vị trên nhiễm sắc thể số 4 [54], [60] Một số công trình nghiên cứu khác về các gen kháng rầy nâu đã được công bố gần đây như gen bph7,

bph28(t), Qbph3, Qbph4 [58], [102], [105]

1.5 Nghiên c ứu về cây lúa kháng rầy nâu ở Việt Nam

1.5.1 Tình hình gây h ại của rầy nâu đối với sản xuất lúa ở nước ta

Các tỉnh có diện tích nhiễm rầy nâu nhiều như Bạc Liêu, Kiên Giang, Vĩnh Long, Đồng Nai, Sóc Trăng, Tiền Giang, Đồng Tháp Tổng diện tích lúa bị nhiễm

bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá là 4,5 ha, với tỷ lệ bệnh từ 3-10% Bệnh xuất hiện ở tỉnh

An Giang trong vụ lúa Hè Thu 2011 ở các tỉnh phía Nam, rầy nâu chủ yếu gây hại ở giai đoạn đẻ nhánh và làm đòng [1]

Ở Thừa Thiên Huế, năm 2009 có 7.773 ha (giảm 1.083 ha so với năm trước)

bị nhiễm rầy, trong đó nhiễm nặng 740 ha (tăng 565 ha so với năm trước) Rầy chủ

yếu gây hại vào giai đoạn lúa đòng trỗ vụ Đông Xuân và trên lúa đẻ nhánh vụ Hè Thu, cá biệt có một số diện tích mật độ cao trên 5.000 con/m2, gây ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây lúa (vàng lá, cháy chòm) Năm 2010, rầy các loại phát sinh trên diện rộng, mật độ thấp Diện tích nhiễm 2014 ha (giảm 5.759 ha so

với năm trước), trong đó diện tích nhiễm nặng chỉ có 24 ha (giảm 716 ha so với năm trước) Chủ yếu gây hại vào giai đoạn trỗ-chín, cục bộ một số diện tích có mật

độ cao 5.000-10.000 con/m2, gây ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của cây lúa ở Vinh Hà, Vinh Thái-Phú Vang; Hương Phong-Hương Trà trong vụ Đông Xuân Nguyên nhân là do lúa chín sắp thu hoạch, bà con tháo cạn nước để ruộng khô và không phun trừ, rầy gặp điều kiện nóng ẩm gia tăng mật số nhanh, gây cháy

cục bộ [25] Năm 2011, rầy các loại phát sinh trên diện rộng, mật độ thấp Diện tích nhiễm 1.692,9 ha (giảm 321,1 ha so với năm trước), trong đó diện tích nặng 75,5 ha (tăng 51,5 ha so với năm trước) gây hại giai đoạn lúa đòng trỗ tập trung chủ yếu vụ Đông Xuân, cục bộ có một số diện tích mật độ rầy cao trên 10.000 con/m2 gây cháy chòm ảnh hưởng đến năng suất (Quảng Lợi, Quảng Thái, Quảng Thành-Quảng Điền; Thủy Phù 2, Thủy Tân - Hương Thủy…) Nguyên nhân do điều kiện thời tiết

cuối tháng 4, đầu tháng 5 có những đợt nắng nóng xen kẽ có mưa dông tạo điều

kiện nóng ẩm thuận lợi cho rầy phát sinh phát triển gây hại [25]

1.5.2 Tình hình nghiên c ứu về cây lúa kháng rầy nâu

Từ năm 1968, Việt Nam đã hợp tác với IRRI trong việc cải thiện các giống lúa trồng, và đã có hàng chục giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt và kháng được sâu bệnh, đặc biệt là kháng rầy nâu được đưa vào sử dụng Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long (CLRRI) đã có những nghiên cứu cho thấy rằng độc tính của quần thể rầy nâu có chiều hướng gia tăng trên giống chỉ thị ASD7 (bph2),

Rathu heenati (bph3) và gi ống chuẩn kháng (bph2 và bph3) Đại học Cần Thơ

(CTU) đã chọn lọc được các giống có khả năng kháng rầy nâu, vàng lùn, lùn xoắn

lá cao như: MTL 145, MTL 250, MTL 384, MTL 466, MTL 499, MTL 500, hiện được trồng trên nhiều tỉnh như: Vĩnh Long, An Giang, Tiền Giang, Hậu Giang, Cần Thơ Các giống lúa MTL500, MTL645 (CTU), OM4900, OM6162 (CLRRI) trong

bộ giống triển vọng trồng phổ biến chống chịu được rầy nâu, bệnh vàng lùn, thích nghi tốt và có năng suất cao Các giống MTL645, MTL649 (CTU) và OM10043 (CLRRI) trong bộ giống mang gen kháng rầy thể hiện thích nghi tốt, có năng suất cao.Mỗi năm CLRRI sản xuất được khoảng 10-20 giống lúa có khả năng kháng rầy nâu và các giống lúa này chủ yếu được trồng thử nghiệm hoặc trồng đại trà ở các vùng lúa thuộc khu vực ĐBSCL, còn ở khu vực miền Trung việc các giống lúa kháng rầy vẫn chưa được quan tâm nhiều [9], [28]

Lang và cộng sự (1999) thực hiện lai tạo giữa giống hoang dại Oryza

autraliensis (có kh ả năng kháng rầy nâu biotype 1, 2, 3) và giống lúa trồng Oryza

sativa (IR31917-45-3-2 nhi ễm rầy nâu) tạo được cây lai có chứa gen Bph10 với

khoảng cách di truyền 1,7 cM trên NST 12 [70]

Lang và cộng sự (2004) đã nghiên cứu gen kháng rầy nâu trên hai loài lúa hoang tại Việt Nam (Oryza rufipogon và Oryza officinalis) nhằm đánh giá mức độ

đa dạng di truyền trên quần thể làm nguồn vật liệu ban đầu phục vụ cho công tác tạo

giống kháng rầy nâu, kháng sâu bệnh Kết quả cho thấy, quần thể lúa Oryza

officinalis cho kh ả năng kháng rầy nâu hơn nhóm Oryza rufipogon ở cả hai giai

đoạn mạ và đẻ nhánh [61]

Lưu Thị Ngọc Huyền và cộng sự (2003) xác định được gen bph4 và bph6 bằng

kỹ thuật SSR trên cây lai ở thế hệ F2 và F3 có nguồn gốc từ các giống DG5 (chứa gen

bph4) và GC9 (ch ứa gen Bph6) Kết quả cho thấy, gen bph4 nằm trên NST 4 [15]

Ứng dụng marker phân tử trong phân tích DNA để xác định gen kháng rầy nâu cũng mang lại một số kết quả Vi và cộng sự (2011) đã sàng lọc được 10 giống

lúa có mang gen Bph10 [31].Tú và cộng (2011) sàng lọc được 29 giống lúa có khả năng kháng rầy nâu biotype 2, 3 từ ngân hàng gen cây lúa của Viện Nghiên cứu và Phát triển Đồng bằng Sông Cửu Long[27]

Chương 2

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu

2.1.1 Các gi ống lúa

Tên gọi, nguồn cung cấp và điểm kháng rầy của các giống lúa sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1

B ảng 2.1 Các giống lúa nghiên cứu

Kí hiệu Tên giống Nguồn cung cấp Điểm kháng rầy

Chú thích: - chưa xác định điểm kháng rầy

A: Trung tâm Giống cây trồng Thừa Thiên Huế

B: Trung tâm Tài nguyên Th ực vật, Viện Khoa học Nông nghiệp, Hà Nội

Đ/c: Giống đối chứng

2.1.2 R ầy nâu

Quần thể rầy nâu được thu thập trên các ruộng lúa ở Tứ Hạ và An Đông; Hương Long và Hương Sơ; Hương Xuân và Hương Chữ, huyện Hương Trà, thành phố Huế

2.2 N ội dung nghiên cứu

- Các đặc điểm nông sinh học (thời gian sinh trưởng, khả năng đẻ nhánh, chiều cao cây, diện tích lá, hàm lượng diệp lục, cường độ quang hợp, các chỉ tiêu năng suất) của các giống lúa nghiên cứu trong hai vụ Hè Thu và Đông Xuân tại hợp tác xã An Đông, thành phố Huế

- Các đặc điểm chất lượng hạt gạo (hàm lượng tinh bột, protein, amylose, độ

trải gel, độ trở hồ, hình dạng hạt, độ bạc bụng) của các giống lúa nghiên cứu trong hai vụ Hè Thu và Đông Xuân tại hợp tác xã An Đông, thành phố Huế

- Đánh giá tính kháng rầy nâu của các giống lúa nghiên cứu (trong nhà lưới

và ngoài đồng ruộng) trong hai vụ Hè Thu và Đông Xuân tại hợp tác xã An Đông, thành phố Huế

- Xác định gen kháng rầy nâu có trong các giống lúa nghiên cứu bằng kỹ thuật sinh học phân tử

2.3 Ph ương pháp nghiên cứu

2.3.1 B ố trí thí nghiệm

Thí nghiệm gồm 5 công thức, mỗi giống là một công thức thí nghiệm và được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ với 3 lần nhắc lại, mỗi ô thí nghiệm có diện tích 10 m2 (5 m x 2 m), khoảng cách giữa các ô là 30 cm [16]

+ Liều lượng phân bón: ngoài lượng phân hữu cơ bón trước khi cày bừa lần

cuối, còn bón phân vô cơ trong suốt quá trình sinh trưởng phát triển của cây lúa, thông thường bón cho một sào (500 m2) khoảng 16 kg Urê, 25 kg Lân, 10 kg Kali

+ Các ruộng lúa đồng đại trà đều được bà con nông dân phun thuốc diệt trừ sâu hại, còn tại các lúa thí nghiệm của chúng tôi thì không phun thuốc

2.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nông sinh học

Các chỉ tiêu nông sinh học như: tỷ lệ nảy mầm, thời gian sinh trưởng, khả năng đẻ nhánh, diện tích lá, chiều cao cây cuối cùng, chiều dài bông được xác định

và đánh giá dựa theo “Quy phạm khảo nghiệm giống quốc gia 10 TCN 558-2002”

và "Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá cây lúa" của IRRI năm 2002 [2], [61]

Các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa được trình bày ở bảng 2.2

B ảng 2.2 Các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa

Tiến hành lấy mẫu hạt bằng cách trải hạt trên giấy thành hình vuông, rạch 2 đường chữ thập chia hình vuông thành 4 phần bằng nhau, rạch thêm các đường chéo chia thành các phần nhỏ hơn bằng nhau, sau đó lấy một số hạt ở các phần tam giác đối nhau đem gieo Tỷ lệ nảy mầm được xác định như sau:

Tỷ lệ nảy mầm (%) =

Trong đó: A là số hạt nảy mầm bình thường

B là số hạt còn lại

* Xác định diện tích lá đòng

Đo chính xác chiều dài lá từ gốc đến đầu lá và chiều rộng qua nơi rộng nhất

của lá vào giai đoạn sinh trưởng 6 của cây (Bảng 2.2) Tiến hành đo diện tích lá đòng ở mỗi giống

B A A

Diện tích lá được tính theo công thức:

Di ện tích lá (cm 2 ) = Chi ều dài lá × Chiều rộng lá × 0,8

* Xác định chiều cao cây

Chiều cao cây được tính từ mặt đất đến đỉnh bông vào giai đoạn sinh trưởng 7-9 (Bảng 2.2) IRRI đưa ra ba mức độ đánh giá chiều cao cây:

Bán lùn (nhỏ hơn 110 cm ở vùng trũng và 90 cm ở vùng cao)

Trung bình (110 - 130 cm ở vùng trũng, 90 - 125 cm ở vùng cao)

Cao (cao hơn 130 cm ở vùng trũng và 125 cm ở vùng cao)

* Xác định thời gian đẻ nhánh và số nhánh cuối cùng

Thời gian đẻ nhánh của lúa được theo dõi từ khi lúa đẻ nhánh cho đến khi số nhánh không tăng nữa mà có xu hướng giảm xuống, đặc biệt là vào giai đoạn sinh trưởng 5 (Bảng 2.2) IRRI đánh giá mức độ đẻ nhánh dựa vào số nhánh cuối cùng:

* Xác định thời gian trổ bông và thời gian sinh trưởng

Thời gian trổ bông của mỗi giống được tính từ khi bông đầu tiên trổ cho đến khi trổ rộ (trỗ 75%) kể từ ngày gieo Độ dài giai đoạn trổ được đánh giá ở các mức:

Mức 1: Tập trung (không quá 3 ngày); Mức 5: Trung bình (4-7 ngày); Mức 9: Không tập trung (hơn 7 ngày)

Thời gian sinh trưởng của mỗi giống được tính từ ngày gieo đến khi hạt chín (85% số hạt trên các bông đã chín)

* Xác định chiều dài bông

Chiều dài bông được đo từ cổ bông đến đỉnh bông vào giai đoạn sinh trưởng

8 (Bảng 2.2)

* T ỷ lệ hạt chắc

Độ thụ phấn (tỷ lệ hạt chắc) là tỷ lệ phần trăm hạt chắc trên tổng số hạt của bông Theo IRRI, độ thụ phấn được đánh giá ở các mức: hữu thụ cao (trên 90%), hữu thụ (75-89%), hữu thụ bộ phận (50-74%) và bất thụ cao (dưới 50%)

* Các y ếu tố cấu thành năng suất

Trên mỗi giống, gặt ngẫu nhiên 5 điểm, diện tích mỗi điểm: 0,5 m × 0,5 m (bỏ các hàng bìa), sau đó tiến hành:

- Đếm tổng số bông có trên 5 điểm đó

- Chọn ngẫu nhiên 10 bông, tách toàn bộ hạt ra khỏi bông, xác định số hạt

chắc và hạt lép trên mỗi bông

- Phơi khô, đếm 1000 hạt và đem cân để xác định khối lượng

Năng suất lý thuyết (NSLT) của các giống được xác định như sau [21]

Năng suất lý thuyết (tạ/ha) =

Trong đó: P1.000: là khối lượng 1.000 hạt được tính bằng gam

- Năng suất thực thu: cân khối lượng thực thu sau khi phơi khô của 3 lần

nhắc lại, quạt sạch đem cân lấy trung bình, đơn vị kg/m2, quy ra năng suất tạ/ha

* Xác định hàm lượng diệp lục và cường độ quang hợp

+ Xác định hàm lượng diệp lục

Hàm lượng diệp lục được xác định theo phương pháp của Arnon, 1949 [35],

lấy 0.5 g lá (giai đoạn lúa đẻ nhánh) nghiền trong cối chày sứ lạnh, bổ sung lượng

nhỏ CaCO3để trung hòa dịch acid dịch bào, thêm vào 5 ml acetone 80%, lọc qua máy hút chân không Lấy 0.05 ml dịch chiết, thêm vào 0.95 ml acetone và đo hấp thụ quang của dịch chiết (OD) bằng máy UV Ultrospec 2000 (Amersham

Pharmacia) ở các bước sóng 663 nm và 645 nm

Hàm lượng diệp lục được tính theo công thức sau:

C(a+b) (µg/ml) = 20.2 x A645 + 8.02 x A663

Cường độ quang hợp được xác định theo sự tích lũy carbon hữu cơ trong lá

và hàm lượng carbon này được xác định theo phương pháp của Tiurin [8] Thu mẫu

P

V C

×

× 000 1

s ố bông/m 2 × s ố hạt chắc/bông × P1.000

10 4

lá lúa đại diện ở giai đoạn đẻ nhánh Dùng khoan lá (đường kính 0,3 cm) khoan lá thành các mảnh đều nhau Cho 2-4 mảnh lá vào mỗi bình tam giác chứa 10 ml

K2Cr2O70,4 N Đậy bình tam giác bằng phễu con và đặt lên nồi cách cát có nhiệt độ

ổn định Để sôi thật nhẹ khoảng 5 phút ở nhiệt độ khoảng 140-180oC Sau khi để nguội, dùng 10-20 ml nước cất tia vào phễu và cổ bình để rửa sạch K2Cr2O7 Thêm vào mỗi bình 2-3 giọt H3PO4, 1-2 giọt diphenylamin, lắc tròn đều và chuẩn độ bằng dung dịch muối Morh 0,2 N cho đến khi dung dịch trong bình chuyển từ màu nâu

nhạt sang màu xanh lơ sáng Bình kiểm tra làm tương tự như trên nhưng không có

mẫu lá Hàm lượng CO2được tính theo công thức:

m: hàm lượng CO2 tính bằng mg chứa trong 1dm2 lá

a: số ml muối Morh 0,2 N dùng để chuẩn độ 10 ml K2Cr2O7 0,4 N ở bình

kiểm tra

b: số ml muối Morh 0,2 N dùng để chuẩn độ 10 ml K2Cr2O7 0,4 N ở bình thí nghiệm

0,6: lượng CO2 tương ứng với 1 ml muối Morh 0,2 N

K: hệ số điều chỉnh của muối Morh (K = 1)

S: diện tích tổng số mẫu lá dùng thí nghiệm (đã đổi ra dm2)

2.3.3 Phương pháp đánh giá chất lượng gạo

* Xác định hàm lượng protein

Tách chiết protein tổng số từ hạt lúa theo phương pháp của Hirata [96]: cân

10 mg hạt nghiền trong 300 µl đệm đồng nhất mẫu chứa Tris/HCl 60 mM; SDS 0,2 M; Urea 7 M và β-mercaptoethanol 0,2% ; pH 8,0 Sau đó hỗn hợp được ly tâm 15.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC Dịch chiết protein sau khi ly tâm được sử dụng

để xác định hàm lượng protein tổng số và điện di protein

Hàm lượng protein tổng số được xác định theo phương pháp Bradford [40], lấy

20 µl dịch nổi bổ sung thêm 980 µl thuốc nhuộm, trộn đều rồi đem đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 595 nm Mẫu trắng là đệm Hirata

Dựng đường chuẩn theo kit của hãng BioRad với các thang nồng độ 0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,34 mg/ml

Phương trình đường chuẩn có dạng: y = 3,258x (r = 0,987).

* Xác định hàm lượng tinh bột

Xác định hàm lượng glucose theo phương pháp của Lindsay (1973) [72], từ hàm lượng glucose tính hàm lượng tinh bột

Mẫu hạt sau khi sấy khô được nghiền mịn bằng chày và cối sứ Cân 50 mg

mẫu cho vào ống nghiệm Thêm 10 ml nước cất, lắc mạnh và để trong 45 phút để hòa tan các loại đường Loại bỏ đường tan trong mẫu bằng ly tâm 10.000 rpm và

loại bỏ dịch nổi Rửa kết tủa bằng nước cất (3 lần) Thủy phân tinh bột thành

S

6 , 0 b)

(a

protein bằng (CH3COO)2Pb Loại bỏ (CH3COO)2Pb bằng Na2HPO4 Định mức

dung dịch lên 20 ml

Dựng đường chuẩn glucose: lấy 1 ml dịch đường + 1 ml DNS 1% Đun sôi

hỗn hợp trong 15 phút Đo mật độ quang ở bước sóng 570 nm

Phương trình đường chuẩn có dạng: y = 0,83x (r = 0,998)

Tính toán hàm lượng tinh bột theo công thức:

Hàm lượng tinh bột (%) =

Trong đó: 50 là lượng mẫu đưa vào

0.9 là hệ số chuyển đổi giữa tinh bột và glucose

20 là lượng thể tích dung dịch cuối cùng

* Xác định hàm lượng lipid

Hàm lượng lipid được xác định bằng phương pháp Soxhlet Chuẩn bị túi

bằng giấy lọc để đựng nguyên liệu, túi được sấy khô đến khối lượng không đổi và

cân trên cân phân tích Nguyên liệu được nghiền nhỏ, sấy khô đến khối lượng

không đổi, cân 1g cho vào túi giấy, gấp kín mép túi, đặt vào trụ chiết Lắp trụ chiết

vào bình cầu, cho dung môi ether vào trụ chiết đến ngập nguyên liệu Lắp ống làm

lạnh, ngâm nguyên liệu trong dung môi vài giờ Đặt máy Soxhlet vào nồi cách thủy

(nhiệt độ không quá 50oC đối với ether) sao cho số lần dung môi từ trụ chiết xuống

bình cầu khoảng 10-15 lần/1 giờ Thử lipid đã hết thì quá trình chiết kết thúc Lấy

túi nguyên liệu ra khỏi bình chiết, cho bay hơi hết dung môi, sấy khô đến trọng

lượng không đổi, cân phân tích [22]

Hàm lượng lipid trong 100 g mẫu nguyên liệu được tính như sau:

Trong đó: a: khối lượng túi mẫu nguyên liệu trước khi chiết

b: khối lượng túi mẫu nguyên liệu sau khi chiết c: lượng nguyên liệu lấy để phân tích

* Xác định hàm lượng amylose

Hàm lượng amylose được xác định theo phương pháp của Sadavisam và

Manikam (1992) [85] Hạt lúa được bóc vỏ và nghiền mịn trong cối sứ Cân 10 mg

mẫu cho vào ống nhiệm 50 ml, bổ sung thêm 4 ml dimethylsulfoxide 90% Trộn đều

rồi ủ ở 85oC trong 15 phút để hòa tan hết amylose, để nguội ở nhiệt độ phòng Chỉnh

thể tích đến 12,5 ml bằng nước cất 2 lần Hút 1 ml chuyển qua bình tam giác 250 ml

Bổ sung thêm 40 ml nước cất 2 lần và lắc đều bằng tay Sau đó bổ sung tiếp 5 ml

dung dịch KI+I2 (KI 0,0065M / I2 0,0025M) Lắc đều bằng tay, phát triển màu trong

15 phút ở nhiệt độ phòng Hút 1 ml đem đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm Mẫu

trắng được tiến hành song song nhưng không có hòa tan mẫu

Xây dựng đường chuẩn amylose: được tiến hành như trên với các thang nồng

độ 10%; 20%; 40%; 60%; 80%; 100%

Phương trình đường chuẩn có dạng: y = 46,3x (r = 0,977)

* Xác định độ bền gel

Độ bền gel được xác định theo phương pháp của Cagampang (1973) [44]

Hạt lúa được bóc vỏ, sau đó được nghiền mịn thành bột trong cối sứ Cân 100 mg

bột cho vào ống nghiệm có kích thước 150 × 13 mm Bổ sung 0,2 ml ethanol 95%

có chứa 0,025% thymol blue, trộn đều mẫu Bổ sung thêm 2 ml 0,2N KOH, trộn đều mẫu Ống nghiệm chứa mẫu được đun sôi trong 8 phút sau đó để nguội 5 phút ở nhiệt độ phòng, rồi làm lạnh trong nước đá 20 phút Đặt ống nghiệm nằm ngang trên mặt bàn cho gel chảy đều Để gel đông sau 60 phút, tiến hành đo Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Chất lượng gạo được đánh giá dựa vào độ trải của gel theo IRRI:

Độ trở hồ được xác định theo phương pháp của Little và cộng sự (1958) [73]

Hạt lúa được bóc vỏ, sau đó cho vào mỗi đĩa petri nhựa 10 hạt Bổ sung 10 ml KOH 1,7%, rồi dàn đều các hạt lúa trên bề mặt đĩa Ủ ở nhiệt độ phòng trong 23 giờ Phân tích mẫu bằng mắt thường Độ trải của hồ gồm 7 cấp tương ứng với đặc điểm của

+Xác định độ bạc bụng

Độ bạc bụng được quan sát bằng mắt thường Mức độ bạc bụng của hạt gạo được chia như sau: Cấp 0: không bạc bụng; Cấp 1: vùng bạc bụng ít hơn 10% ở trong hạt gạo; Cấp 5: diện tích bạc bụng trung bình 11-20%; Cấp 9: diện tích bạc

bụng hơn 20% [61]

B ảng 2.4 Phân loại chiều dài và hình dạng hạt gạo

Kích thước Chiều dài (cm) Cấp độ Hình dạng Tỉ lệ dài/rộng Cấp độ Rất dài

Dài

Trung bình

Ngắn

>7,5 6,61-7,5 5,51-6,60 5,50

>3,0 2,1-3,0 1,1-2,0

2.3.4 Phương pháp đánh giá tính kháng rầy nâu

* Thu th ập rầy nâu

Rầy nâu được thu thập từ ruộng lúa hợp tác xã An Đông-Huế và các vùng phụ

cận bằng dụng cụ hút rầy Sau đó nuôi rầy trong các lồng với thức ăn là giống lúa Hương thơm 1 qua 3-5 thế hệ để tạo quần thể ổn định [13]

* Đánh giá trong nhà lưới

Tính kháng của các giống lúa nghiên cứu được đánh giá theo từng giống riêng lẻ trong ống nghiệm (không có sự lựa chọn thức ăn/non-choice test) và chung cho tất cả các giống trong khay mạ (có sự lựa chọn thức ăn/choice test) theo phương phápcủa Tanaka năm 2000 [94]:

- Phương pháp trong ống nghiệm: gieo các giống lúa trên khay, khi cây mạ được 2 lá (khoảng 7 ngày tuổi) nhổ cây mạ ra khỏi khay, dùng giấy thấm nước quấn dưới gốc Sau đó, đặt riêng lẽ cây mạ vào ống nghiệm (3 × 20 cm), để qua 1 đêm Dùng ống hút thả 3 rầy non tuổi 2 vào một ống nghiệm Đầu ống nghiệm được bọc

bằng vải mỏng Thí nghiệm được nhắc lại 30 lần

- Phương pháp hộp mạ: gieo tất cả các giống lúa cần đánh giá vào chung một khay lớn (60 cm × 40 cm × 5 cm) Mỗi giống được gieo 10 cây thành một hàng theo chiều rộng của khay Đặt khay vào lồng nuôi rầy, giữ nước đủ ẩm cho cây lúa Bảy ngày sau khi gieo, thả rầy nâu tuổi 2 (3 con/cây) vào trong khay

Kết quả đánh giá chỉ tiêu cấp gây hại và mức độ kháng của các giống lúa đối

với quần thể rầy nâu ở Thừa Thiên Huế căn cứ vào bảng phân cấp hại theo triệu

chứng và phân cấp mức độ kháng ở bảng 2.3 theo IRRI, 2002 [61] Giống chuẩn nhiễm sử dụng trong thí nghiệm này là giống Taichung Native 1 (TN1) do Khoa Nông học, trường Đại học Nông lâm, Đại học Huế cung cấp

B ảng 2.5 Bảng phân cấp hại, triệu chứng của cây mạ và mức độ kháng

r ầy nâu trong nhà lưới

Cấp hại Tỷ lệ chết và triệu chứng cây mạ Cấp hại Mức độ kháng

0 ≥ 70% rầy chết, cây mạ khỏe Cấp 0 – cấp 3 Kháng

1 ≤ 70% rầy chết, cây mạ khỏe Cấp 3,1 – cấp 4,5 Kháng vừa

3 Cây mạ bị biến vàng (≤ 50%) Cấp 4,6 – cấp 5,5 Nhiễm vừa

5 Hầu hết cây bị biến vàng (> 50%) Cấp 5,6 – cấp 7,0 Nhiễm

* Đánh giá ngoài đồng ruộng

Theo quyết định 82 của Bộ NN&PTNT năm 2006 quy định về mức nhiễm

của rầy nâu như sau: mức nhiễm nhẹ từ 750-1.500 con/m2, nhiễm trung bình từ 1.500-3.000 con/m2, nhiễm nặng là > 3.000 con/m2

Đánh giá tình hình rầy nâu trên ruộng thí nghiệm: Tiến hành đánh giá

định kỳ khoảng 7 ngày/lần

Trên mỗi giống, điều tra 5 điểm (0,2m2/điểm) ngẫu nhiên

M ật độ con/m 2 =

Ghi nhận sự xuất hiện của rầy nâu vào 3 giai đoạn (đẻ nhánh, làm đòng,

trổ) và đánh giá rầy ngoài đồng ruộng, mật độ rầy ít nhất phải đạt như sau thì mới đánh giá được cấp hại của rầy nâu: 10 con/bụi ở giai đoạn lúa đẻ nhánh; 25 con/bụi

ở giai đoạn làm đòng; 100 con/bụi ở giai đoạn trổ và phơi màu [61]

2.3.5 Phương pháp sinh học phân tử

* Các c ặp mồi khuếch đại các chỉ thị phân tử

Khuếch đại chỉ thị liên kết với gen bph1 sử dụng cặp mồi BpE18-3 (R/F), sản

phẩm PCR gen giống kháng có băng kích thước 523 bp (Kim và cộng sự, 2005) [67];

khuếch đại chỉ thị liên kết với gen bph3 sử dụng cặp mồi RM589 (R/F) sản phẩm PCR

gen giống kháng có băng kích thước 187 bp (Jairin và cộng sự, 2007) [64]; khuếch đại

chỉ thị liên kết với gen bph4 sử dụng cặp mồi RM586 (R/F) sản phẩm PCR gen giống

kháng có băng kích thước 276 bp (Jairin và cộng sự, 2007) [65] Khuếch đại chỉ thị RG457L/L liên kết với gen bph10 sử dụng cặp mồi RG457L/L (R/F) (Lang và cộng sự,

1999) [70]

* Ph ản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme HinfI

Thành phần phản ứng cắt bao gồm: 3,2 µl nước cất; 1,5 µl buffer (10X); 0,3

µl enzyme HinfI (10 U/µl); 10 µl sản phẩm PCR Hỗn hợp trên được ủ ở 37oC trong 1,5 giờ; sau đó ủ 4oC qua đêm Điện di sản phẩm cắt trên agarose gel 1,5% ở 80V trong đệm 1×TAE Sản phẩm PCR của giống nhiễm rầy nâu có 2 băng (200 và 500 bp) Sản phẩm PCR giống kháng có 3 băng (300, 250 và 200 bp)

* Thi ết kế mồi cho gen bph14

Dựa trên trình tự vùng cds gen kháng rầy nâu bph14 (Accession:

FJ941067.1) [49], chúng tôi sử dụng chương trình DNASIS (Hitachi Software Engineering Co., Ltd) để thiết kế 4 cặp mồi, được ký hiệu là: M1-F và R, M2-F và

R, M3-F và R, M4-F và R nhằm khuếch đại 4 đoạn overlapping (M1, M2, M3, M4)

trên toàn bộ chiều dài vùng cds gen kháng rầy nâu bph14 (Bảng 2.6)

Bảng 2.6 Trình tự các cặp mồi và kích thước đoạn DNA được khuếch đại

Mồi Trình tự xuôi Trình tự ngược Kích thước

T ổng số đơn vị diện tích (m 2 )

T ổng số rầy nâu điều tra

M1 ATGGCGGAGCTAATGGCCACCA AGAGTTCTTTATATCATGGAACTCA 1491 M2 GATCATGAGATTGACGTGGAAA AAGTCACTTAGCTTTGGTG 1541 M3 AGTCGATGGAACTCCAAGGG GATGAGTATGCTTGAGGCCC 1025 M4 AATCTTGCTTAGGAGAGCTCGC CTACTTCAAGCACATCAGC 919

Vị trí của các cặp mồi trên gen bph14 (có kích thước 9576 bp) được trình bày

ở hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ vị trí các cặp mồi trên gen bph14

* Ph ản ứng PCR

PCR được thực hiện trong tổng số 50 µL dung dịch phản ứng gồm 250 ng -

300 ng DNA tổng số, 10 pmol mỗi loại mồi, 2 × Master mix (GoTaq® Green Master Mix 2×, Promega) Phản ứng khuếch đại DNA được tiến hành trong máy luân nhiệt (iCyler, BioRad) theo quy trình sau: 95oC-5 phút; 30 chu kỳ: 95oC-1 phút, 55oC đến

60oC-1 phút và 72oC-1 phút; 72oC-10 phút Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện

di trên agarose gel 1,5% ở 80V trong đệm 1 × TAE Nhuộm agarose gel 15 phút

trong dung dịch ethidium bromide (EtBr; 0,5 µg/ml) và quan sát hình ảnh điện di

dưới ánh sáng tử ngoại bằng hệ thống Gel Documentation (BioRad)

* T ạo dòng đoạn DNA và phân tích trình tự

+ Quá trình t ạo dòng

Sản phẩm PCR được sử dụng để gắn vào vector pTZ57R/T Thành phần

phản ứng gắn bao gồm: sản phẩm PCR (khoảng 100 ng), 5 × Ligation buffer, 5 U T4 DNA ligase và 55 ng vector pTZ57R/T; bổ sung nước đến thể tích cuối cùng là

10 µL Phản ứng gắn được ủ qua đêm ở 14oC Hỗn hợp phản ứng gắn của các sản

phẩm PCR và pTZ57R/T vector được biến nạp vào tế bào khả biến E coli chủng

DH5α (Invitrogen) bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây và làm lạnh

nhanh trong đá 3 phút Sau đó tế bào E coli được nuôi trên đĩa petri chứa môi

trường chọn lọc LB + 1,5% agar + 50 µg/ml amp + 40 µL IPTG 0,1M + 40 µL gal (20 mg/ml) ở 37oC qua đêm Chọn khuẩn lạc đơn màu trắng để sản xuất sinh

X-khối trên môi trường LB lỏng + amp (50 µg/ml) ở 37oC, lắc 200 vòng/phút trong

khoảng 15 giờ

Tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp với các sản phẩm PCR dùng để phân tích

trình tự nucleotide bằng AccuPrep Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer) Để kiểm

tra sự hiện diện của sản phẩm PCR trong vector chúng tôi đã cắt vector bằng

enzyme cắt hạn chế EcoRI Thành phần phản ứng cắt trong 10 μL dung dịch bao gồm 3 μL DNA plasmid tái tổ hợp, 1 μL 10 × EcoRI buffer, và 5 U EcoRI Phản

ứng được thực hiện ở 37oC trong 2 giờ Kết quả phản ứng được kiểm tra bằng điện

di agarose gel 0,8% ở 100 V trong đệm 1 × TAE

+ Phân tích trình t ự

Trình tự các đoạn DNA tái tổ hợp được phân tích bằng phương pháp dioxy trên máy Instrument Model/Name: 3730xl do công ty Bioneer, Korea thực hiện

2.3.6 X ử lý thống kê

Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần (n≥30) Số liệu thực nghiệm được tính giá

trị trung bình và phân tích ANOVA (một yếu tố và hai yếu tố), phân tích mô hình tuyến tính nhiều biến bằng phần mềm R

C hương 3

3.1 Đặc điểm nông sinh học của các giống lúa

Các giống lúa sử dụng trong nghiên cứu này do Trung tâm Tài nguyên thực

vật, Viện Khoa học Nông nghiệp, Việt Nam cung cấp và được trồng thử nghiệm tại

hợp tác xã An Đông-Thừa Thiên Huế trong hai năm, mỗi năm hai vụ Hè Thu và

Đông Xuân

Hình 3.1 Các gi ống lúa thí nghiệm tại hợp tác xã An Đông-Thừa Thiên Huế

3.1.1 Th ời gian sinh trưởng và phát triển

Bảng 3.1 trình bày các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của các giống lúa Giai đoạn đẻ nhánh bắt đầu khi cây lúa đạt 5-6 lá Các giống khác nhau có thời gian

đẻ nhánh không giống nhau ở cùng 1 vụ gieo trồng và cùng 1 giống cũng có thời gian đẻ nhánh khác nhau tuỳ theo mùa vụ gieo trồng Vụ Hè Thu, thời gian từ khi gieo đến khi đẻ nhánh của các giống lúa Khang Dân (KD), IRRI 352 (L1), BG 367-

2 (L3), Sài Đường Kiến An (L25) và Lốc Nước (L27) từ 37 đến 40 ngày Vụ Đông Xuân, thời gian đẻ nhánh của tất cả các giống lúa từ 27-42 ngày, trong đó giống IRRI 352 có thời gian đẻ nhánh sớm nhất so với các giống lúa còn lại Thời gian đẻ nhánh của giống Khang Dân là 38,7 ngày trong vụ Hè Thu và 41,3 ngày trong vụ Đông Xuân, trong khi đó giống IRRI 352 là 39,7 ngày trong vụ Hè Thu và 27,0 ngày trong vụ Đông Xuân Điều này có thể là do khác nhau điều kiện thời tiết giữa các vụ mùa dẫn đến sự thay đổi quá trình sinh trưởng và phát triển (thời gian đẻ nhánh) của giống lúa giữa hai vụ mùa Vụ Đông Xuân (từ tháng 1 đến tháng 5), thời gian này có nhiều đợt không khí lạnh tăng cường, gây ra rét, rét đậm kéo dài 24-25 ngày, nhiệt độ có lúc xuống thấp 12-130C, có 4 ngày rét hại (Hình 3.2) Tuy nhiên, đối với giống IRRI 352 thì thời gian đẻ nhánh vụ Đông Xuân lại sớm hơn so với vụ

Hè Thu gần 13 ngày, theo lý lịch giống thì IRRI 352 là giống lúa chịu rét kém ở giai đoạn mạ (Phụ lục 1), vụ Đông Xuân cũng chính là thời điểm có các đợt lạnh kéo dài

thậm chí có các ngày rét hại ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây mạ

Thời gian làm đòng của các giống lúa khác nhau thì khác nhau và trong cùng

một giống cũng khác nhau tuỳ theo mùa vụ gieo trồng (Bảng 3.1) Hầu hết các

giống lúa trồng trong vụ Hè Thu có thời gian làm đòng từ 65,3-75,3 ngày sau gieo

sạ, trong số các giống thì giống Lốc Nước có thời gian làm đòng dài nhất là 73,3 ngày sau gieo Trong khi đó, vụ Đông Xuân các giống lúa có thời gian làm đòng từ 71,7-86,3 ngày sau gieo Các giống BG 367-2, Sài Đường Kiến An và Lốc Nước có

thời gian làm đòng sau khi gieo trong vụ Đông Xuân dài hơn vụ Hè Thu Nhìn chung, thời gian làm đòng của các giống lúa trồng trong vụ Đông Xuân dài hơn so

với vụ Hè Thu (Bảng 3.1) Vụ Đông Xuân có nhiệt độ môi trường thường thấp hơn

so với vụ Hè Thu, sự sinh trưởng và phát triển của cây bị kéo dài khi bị ảnh hưởng

bởi nhiệt độ thấp [106]

Quan sát thời gian bông trổ rộ ở các giống lúa chúng tôi thấy thời gian bông rộ dao động từ 74,3-85,3 ngày trong vụ Hè Thu, số liệu ghi nhận được giữa các giống có

thời gian trổ bông sai khác nhau có ý nghĩa thống kê Ở vụ Đông Xuân thời gian bông

rộ từ 94-111,7 ngày, các giống lúa khác nhau có thời gian trổ bông khác nhau Khi so sánh thời gian trổ rộ cùng giống ở hai vụ Hè Thu và Đông Xuân cho thấy không chỉ có

sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.1) Thời kỳ trổ bông, làm hạt là thời kỳ phát triển cuối cùng của cây lúa, đây là giai đoạn có liên quan trực tiếp đến quá trình tạo năng suất, cụ thể là quyết định tỷ lệ hạt chắc và trọng lượng hạt Thời kỳ trổ bông, làm

hạt bao gồm các quá trình trổ bông, nở hoa, thụ phấn, thụ tinh, hình thành hạt và chín Cũng như các thời kì sinh trưởng phát triển khác của cây lúa, thời kì trổ bông chịu ảnh hưởng rất lớn của yếu tố thời tiết khí hậu, ngoài yếu tố nhiệt độ thấp làm kéo dài thời gian trổ bông thì thời gian chiếu sáng trong ngày của vụ Đông Xuân thấp hơn vụ Hè Thu cũng dẫn đến kéo dài thời kì này [75], [106]

Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi về thời gian từ khi gieo tới khi lúa chín của các giống nghiên cứu trong vụ Hè Thu dao động trong khoảng 94 đến

97 ngày, ở vụ Đông Xuân từ 126-137 ngày, dài hơn so với Hè Thu khoảng 30-40 ngày Giống Khang Dân là giống nhập nội được công nhận giống theo Quyết định

số 1659 QĐ/BNN-KHCN ngày 13/5/1999, theo lý lịch giống Khang Dân có thời gian sinh trưởng ngắn, vụ Hè Thu là 95 ngày, ở vụ Đông Xuân kéo dài hơn vụ Hè Thu khoảng 25-30 ngày, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy yếu tố thời

tiết khí hậu đã kéo dài thời gian sinh trưởng của giống Khang Dân so với vụ Hè Thu Các giống lúa IRRI 352, BG 367-2, Sài Đường Kiến An và Lốc Nước trồng tại

Thừa Thiên Huế có sự sai khác so với thông tin lý lịch giống về thời gian sinh trưởng (105-119 ngày), điều này cho thấy ngoài yếu tố vụ mùa ảnh hưởng đến thời gian sinh trưởng thì điều kiện địa lý cũng có tác động đến sự thay đổi của thời gian sinh trưởng phát triển cây lúa

Theo Yoshida (1981) các giống lúa có thời gian sinh trưởng và năng suất thay đổi theo mùa, mùa lạnh thời gian sinh trưởng của cây lúa sẽ kéo dài hơn [106] Theo một số kết quả chọn lọc giống lúa ở nước ta như giốngVNĐ95-20, OM576, OM997, IR64 là những giống có thời gian sinh trưởng từ 95-110 ngày được đánh giá là thích hợp với nhiều vùng sản xuất lúa ở Việt Nam, thời gian sinh trưởng quá dài hoặc quá ngắn đều không cho năng suất cao [7], [32]

Kết quả phân tích ANOVA-hai yếu tố cho thấy rằng thời gian sinh trưởng và phát triển của các giống lúa như trình bày ở trên bị ảnh hưởng rõ rệt bởi yếu tố di truyền của từng giống và từng mùa vụ gieo trồng, đồng thời sự tương tác giữa 2 yếu

tố giống và mùa vụ gieo trồng cũng ảnh hưởng rõ rệt đến nhánh con và thời gian trổ bông Điều này cho thấy rằng đặc tính di truyền của các giống và thời tiết của các mùa vụ có thể liên quan đến năng suất thu hoạch (Bảng 3.5)

B ảng 3.1 Thời gian sinh trưởng của các giống lúa

Chú thích: Chữ cái in hoa chỉ sự sai khác giữa các giống, chữ cái thường chỉ sự sai khác giữa các mùa (P<0,05)

Giống

HT ĐX HT ĐX HT ĐX HT ĐX

KD 38,7ABa±1,2 41,3Ab±1,2 68,3Aa±0,6 80,7Ab±0,6 77,3Aa±0,6 111,7Ab±2,9 96,3Aa±0,6 137,0Ab±1,7 L1 39,7Aa±0,6 27,0Cb±1,0 67,7ABa±0,6 71,7Bb±1,5 78,7Aa±1,5 104,7Bb±0,6 96,3Aa±0,6 137,3Ab±1,2 L3 37,7AB±0,6 36,3B±1,5 65,3Ba±0,6 79,3Ab±0,6 74,3Ba±0,6 105,3Bb±1,2 94,7Ba±0,6 135,3ABb±0,6 L25 37,3B±0,6 39,7AB±1,5 67,7ABa±1,2 86,3Cb±1,2 77,3Aa±0,6 103,3Bb±1,5 96,3Aa±0,6 132,3Bb±2,5 L27 39,0AB±1,0 41,3A±1,2 73,3Ca±1,5 84,3Cb±0,6 85,3Ca±0,6 94,0Cb±1,7 96,7Aa±0,6 126,0Cb±1,0