Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) tại một số tỉnh Đông Nam Bộ

PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) đƣợc trồng rộng khắp ở các tỉnh trong cả nƣớc với nhiều vùng trồng tập trung, đem lại nguồn thu nhập cho ngƣời dân, góp phần ổn định tình hình kinh tế - xã hội. Sắn là cây lƣơng thực, đồng thời cung cấp nguyên liệu phục vụ cho công nghiệp chế biến, xuất khẩu và làm nguyên liệu sinh học. Sắn đã trở thành 1 trong 10 mặt hàng nông sản xuất khẩu quan trọng, có giá trị kinh tế cao của Việt Nam và là một trong những loại cây trồng đƣợc ƣu tiên phát triển trong tầm nhìn chiến lƣợc đến năm 2020 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Ở nƣớc ta trong những năm gần đây, trên cây sắn xuất hiện một loại bệnh mới đƣợc gọi là bệnh chổi phù thuỷ (hay bệnh chổi rồng) với biểu hiện triệu chứng đặc trƣng do bị nhiễm phytoplasma, nhƣ cây mọc nhiều chồi phụ ở ngọn và phần thân chính, lá biến vàng. Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn đƣợc ghi nhận xuất hiện rải rác từ năm 2005 trên giống sắn KM94 tại một số huyện của tỉnh Quảng Ngãi và đã trở thành dịch nghiêm trọng tại nhiều vùng trồng sắn thuộc một số tỉnh Đông Nam Bộ nhƣ Bà Rịa-Vũng Tàu và Đồng Nai. Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ, năng suất giảm 10 - 30%, hàm lƣợng tinh bột giảm 20 - 30% (Nguyên Khê, 2011). Ở các khu vực tiến hành trồng lại hay trồng mới thuộc các tỉnh Đông Nam Bộ, bệnh chổi phù thuỷ sắn vẫn xuất hiện, gây quan ngại cho nông dân và chính quyền địa phƣơng. Do nguyên nhân gây bệnh chƣa đƣợc xác định chính xác nên việc quản lý bệnh gặp nhiều lúng túng. Ở một số vùng trồng sắn, nông dân đã tiến hành thử nghiệm các loại thuốc trừ nấm để xử lý hom và phun cho cây sắn khi xuất hiện bệnh chổi phù thuỷ. Tuy nhiên, các biện pháp này đều không có hiệu quả phòng chống bệnh. Cây sắn bị nhiều bệnh gây hại khác nhau, trong đó có bệnh phytoplasma. Bệnh phytoplasma hại sắn đã đƣợc ghi nhận ở một số vùng trồng sắn trên thế giới nhƣ quần đảo Wallis-Futuna, Uganda, Cuba, một số nƣớc thuộc châu Mỹ và châu Á. Phytoplasma gây hại trên cây sắn xác định đƣợc liên quan đến bệnh biến vàng lá, bệnh chổi phù thuỷ và bệnh da cóc. Ở Brazil, tại một số vùng trồng sắn thuộc phía đông bắc nƣớc này, tỷ lệ cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ lên đến 85% và năng suất củ giảm đến 70% (Flôres et al., 2013), thậm chí năng suất củ giảm sút đến 90% cũng đã đƣợc ghi nhận (Lozano, 1992). Phytoplasma là một tác nhân đặc biệt gây bệnh trên cây trồng. Phytoplasma không thể nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng nhân tạo, tế bào thiếu lớp vách bên ngoài do bộ gen của chúng đã bị suy thoái mạnh. Con đƣờng lan truyền của phytoplasma ngoài tự nhiên là qua nhân giống vô tính và qua côn trùng môi giới. Do phytoplasma không nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng nhân tạo nên chẩn đoán và phân loại nhóm tác nhân gây bệnh này chủ yếu dựa trên phân tích một số vùng gen, quan trọng nhất là gen mã hóa 16S RNA ribosome (Bertaccini et al., 2014). Trên thế giới, phytoplasma gây bệnh trên hàng trăm loại cây trồng khác nhau và số lƣợng bệnh mới do phytoplasma gây ra tăng theo từng năm (Bertaccini et al., 2014). Ở Việt Nam, những nghiên cứu về bệnh phytoplasma trên cây trồng còn hạn chế. Các kết quả điều tra cơ bản trƣớc đây đều chƣa phát hiện ra bệnh phytoplasma ở Việt Nam. Gần đây, dựa trên đánh giá triệu chứng và chẩn đoán phân tử, nguyên nhân gây bệnh chồi cỏ mía và trắng lá mía đã đƣợc xác định là do phytoplasma gây ra (Hoat et al., 2012, 2013). Hai bệnh này đã gây thành dịch nghiêm trọng tại một số vùng trồng mía trọng điểm của Việt Nam. Phòng chống hiệu quả bệnh cây nói chung và bệnh chổi phù thuỷ hại sắn nói riêng phụ thuộc nhiều yếu tố, trong đó, đầu tiên là phải xác định chính xác tác nhân gây bệnh và các đặc điểm sinh học của bệnh. Do bệnh chổi phù thuỷ hại sắn là một bệnh mới ở Việt Nam nên cần phải thực hiện nghiên cứu về bệnh, đặc biệt tại các tỉnh trọng điểm có dịch ở Đông Nam Bộ. 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Chẩn đoán và phân loại đƣợc phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số tỉnh Đông Nam Bộ; đánh giá đƣợc một số đặc điểm sinh học chính nhƣ tính gây bệnh và khả năng lan truyền của chúng.

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN ĐỨC THÀNH

NGHIÊN C ỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN

(Manihot esculenta Crantz) T ẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP, NĂM 2016

2.2.5 Triệu chứng bệnh do phytoplasma gây ra 14

2.2.10 Biện pháp phòng chống 26 2.3 Một số nghiên cứu về bệnh phytoplasma hại sắn 27 2.4 Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại thực vật ở Việt Nam 32

3.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 36

3.2.1 Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 37 3.2.2 Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR 37 3.2.3 Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 38 3.2.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII

3.2.5 Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do

3.3.1 Phương pháp điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 39 3.3.2 Phương pháp phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử,

3.3.3 Phương pháp định danh phân tử và phân tích phả hệ 44 3.3.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII

3.3.5 Phương pháp xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ

4.1 Mô tả triệu chứng và điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ

4.1.2 Mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 53 4.2 Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR 54 4.2.1 Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử 54

4.2.2 Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm mô 57 4.2.3 Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR 59 4.3 Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 65 4.3.1 Kết quả định danh bằng giải trình tự sản phẩm PCR 65

4.3.3 Kết quả định danh bằng phân tích đồng nhất trình tự nucleotide 84 4.3.4 Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trên trình tự nucleotide 86 4.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII

4.4.1 Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 96 4.4.2 Đánh giá khả năng phát hiện phytoplasma của bộ mồi LAMP 101 4.5 Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do

4.5.1 Ảnh hưởng của đất và hom giống đến khả năng lan truyền của bệnh 104 4.5.2 Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua ghép cây 108 4.5.3 Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng 109 4.5.4 Khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn qua một số loài côn trùng 112

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

BIP Backward internal primer (Mồi ngược dòng bên trong)

BLAST Basic local alignment search tool

(Công cụ tìm kiếm chuỗi tương đồng cơ bản cục bộ)

bp Base pair (Cặp bazơ)

Ca Phytoplasma Candidatus Phytoplasma

CRD Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên) CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide

DAPI 4‟,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

FAO Food and agriculture organization

(Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên hiệp Quốc) FIP Forward internal primer (Mồi xuôi dòng bên trong)

IRPCM International research project for comparative mycoplasmology

(Dự án Nghiên cứu Quốc tế về Mycoplasma)

LAMP-PCR Loop mediated isothermal amplification - PCR

(Kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt)

RFLP Restriction fragment length polymorphism

(Đa hình chiều dài của đoạn cắt giới hạn) rRNA ribosomal ribonucleic acid

TAE Tris-acetate acid EDTA

TEM Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền qua) UPGMA Unweighted pair group method with arithmetic mean (Phương pháp

ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng)

4.14 Đại diện 28 nhóm phytoplasma dùng trong phân tích phả hệ 86 4.15 Đại diện các nhóm phụ nhóm 16SrI dùng trong phân tích phả hệ 89 4.16 Đại diện các nhóm phụ nhóm 16SrII dùng trong phân tích phả hệ 92 4.17 Các nhóm/nhóm phụ 16S RNA ribosome của phytoplasma hại sắn tại

4.18 Đặc điểm 8 trình tự phù hợp trên gen mã hóa 16S RNA ribosome để thiết

kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 99 4.19 Trình tự các mồi LAMP cải tiến đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 100 4.20 Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ DNA tổng số

4.23 Ảnh hưởng của đất trồng và hom giống đến khả năng lan truyền của bệnh

chổi phù thuỷ hại sắn (Đồng Nai, năm 2012) 105 4.24 Ảnh hưởng của nguồn vật liệu hom giống đến tỷ lệ bệnh chổi phù thuỷ

4.27 Kết quả bẫy đèn thu thập một số loài rầy trên vùng trồng sắn bị nhiễm

4.28 Xác định khả năng lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn của côn trùng

DANH MỤC HÌNH

2.1 Hình thái và kích thước phytoplasma trong tế bào ống rây của mạch

phloem được chụp dưới kính hiển vi điện tử 13 2.2 Minh họa sự phân bố của phytoplasma trong cơ thể côn trùng môi giới

2.3 Sơ đồ các mồi được sử dụng trong phản ứng LAMP-PCR 24

2.6 a) Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ ở vùng São Paulo, Brazil; b) cây sắn bị

2.8 Một số hình ảnh xác định phytoplasma bằng phương pháp hiển vi điện tử

3.1 Lược đồ cụm gen rDNA của phytoplasma, vị trí của các mồi và kích

4.1 Triệu chứng bệnh chổi phù thuỷ hại sắn trên đồng 52 4.2 Xác định phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử (đợt 1, năm 2011) 56 4.3 Xác định phyttoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử (đợt 2, năm 2011) 56

4.5 Minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR lồng dùng 2 cặp mồi

4.6 Minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR lồng dùng 2 cặp mồi

4.7 Phân tích sản phẩm PCR bằng kỹ thuật RFLP 75 4.8 Phân tích đa hình mô phỏng trình tự nucleotide bằng pDRAW32 81 4.9 Phân tích cụm dựa trên số liệu RFLP mô phỏng vùng gen mã hóa 16S

RNA ribosome của các mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam 82 4.10 Cây phả hệ xác định nhóm phytoplasma hại sắn được vẽ theo phương

4.11 Cây phả hệ xác định nhóm phụ của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI 91 4.12 Cây phả hệ xác định nhóm phụ của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrII 93

4.13 Minh họa một phần vùng gen 16S RNA ribosome chứa các trình tự

phytoplasma nhóm 16SrII với các nhóm còn lại 97 4.14 Vị trí các trình tự trên vùng gen mục tiêu và các mồi tương ứng trong kỹ

4.15 Tám đoạn trình tự được lựa chọn để thiết các mồi LAMP cải tiến đặc

4.16 Kết quả điện di sản phẩm LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ

4.17 Kết quả điện di sản phẩm LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ

4.18 Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma từ các loại mẫu sắn bị bệnh chổi

4.19 Ảnh thí nghiệm ảnh hưởng của đất trồng đến khả năng lan truyền của

bệnh chổi phù thuỷ sắn trong thí nghiệm nhà lưới (năm 2012) 106 4.20 Ảnh thí nghiệm xác định khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Nguyễn Đức Thành

Tên luận án: Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) tại

Phương pháp nghiên cứu

* Vật liệu: Hom sắn KM94, KM419 và SM937-26 đã bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ được

lấy từ ruộng sản xuất của hộ nông dân Hom sắn giống KM94 khoẻ

* Nội dung nghiên cứu:

- Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn

- Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR

- Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn

- Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn

- Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra

* Phương pháp nghiên cứu:

- Phát hiện phytoplasma trên sắn bằng kính hiển vi điện tử truyền qua trên máy JEOL 1010 và nhuộm với DAPI

- DNA tổng số được tách chiết bằng CTAB theo tài liệu mô tả của Doyle and Doyle (1990) Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp được thực hiện theo tài liệu của Deng

and Hiruki (1991), Lee et al (1994), Schneider et al (1995), Gundersen and Lee (1996)

- Tinh chiết sản phẩm PCR dùng QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

- Phân tích RFLP thực hiện mô phỏng bằng chương trình pDRAW32

- Sử dụng các phần mềm tin sinh học như ClustalW2, BioEdit 7.0 Cây phả hệ được xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining trong MEGA 5.0

- Số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp phân tích phương sai bằng chương trình IRRISTAT 4.0

THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Nguyen Duc Thanh

Thesis title: Study on phytoplasma disease on cassava (Manihot esculenta Crantz) in

Materials and Methods

* Materials: Cassava varieties KM94, KM419 and SM937-26

Hiruki (1991), Lee et al (1994), Schneider et al (1995), Gundersen and Lee (1996)

- PCR products from agarose gel were purified by QIAquick gel extraction kit (Qiagen) according to manufacturer‟s instructions

- Virtual-restriction fragment length polymorphism analysis of 16S rRNA gene was conducted by pDRAW32 program

- Phylogenetic trees were constructed by Neighbor-Joining method in MEGA 5.0 software

- Statistical analysis was conducted by IRRISTAT 4.0 software

Main findings and conclusions

- The study identified two different phytoplasma groups belonging to the 16SrI (subgroup B) and the 16SrII (subgroup A) from witches‟ broom cassava plants grown in south-eastern provinces of Vietnam

- The study designed loop mediated isothermal amplification (LAMP) primers based on the 16S ribosomal RNA gene LAMP-PCR using these primers demonstrated

to be efficient to detect the phytoplasma 16SrII group on cassava

- The study provided new scientific data on biological characteristics of phytoplasma disease on cassava This disease is mainly transmitted by cutting through vegetative propagation using diseased cassava plants

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) được trồng rộng khắp ở các tỉnh trong

cả nước với nhiều vùng trồng tập trung, đem lại nguồn thu nhập cho người dân, góp phần ổn định tình hình kinh tế - xã hội Sắn là cây lương thực, đồng thời cung cấp nguyên liệu phục vụ cho công nghiệp chế biến, xuất khẩu và làm nguyên liệu sinh học Sắn đã trở thành 1 trong 10 mặt hàng nông sản xuất khẩu quan trọng, có giá trị kinh tế cao của Việt Nam và là một trong những loại cây trồng được ưu tiên phát triển trong tầm nhìn chiến lược đến năm 2020 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

Ở nước ta trong những năm gần đây, trên cây sắn xuất hiện một loại bệnh mới được gọi là bệnh chổi phù thuỷ (hay bệnh chổi rồng) với biểu hiện triệu chứng đặc trưng do bị nhiễm phytoplasma, như cây mọc nhiều chồi phụ ở ngọn

và phần thân chính, lá biến vàng Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn được ghi nhận xuất hiện rải rác từ năm 2005 trên giống sắn KM94 tại một số huyện của tỉnh Quảng Ngãi và đã trở thành dịch nghiêm trọng tại nhiều vùng trồng sắn thuộc một số tỉnh Đông Nam Bộ như Bà Rịa-Vũng Tàu và Đồng Nai

Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ, năng suất giảm 10 - 30%, hàm lượng tinh bột giảm 20 - 30% (Nguyên Khê, 2011) Ở các khu vực tiến hành trồng lại hay trồng mới thuộc các tỉnh Đông Nam Bộ, bệnh chổi phù thuỷ sắn vẫn xuất hiện, gây quan ngại cho nông dân và chính quyền địa phương Do nguyên nhân gây bệnh chưa được xác định chính xác nên việc quản lý bệnh gặp nhiều lúng túng Ở một số vùng trồng sắn, nông dân đã tiến hành thử nghiệm các loại thuốc trừ nấm

để xử lý hom và phun cho cây sắn khi xuất hiện bệnh chổi phù thuỷ Tuy nhiên, các biện pháp này đều không có hiệu quả phòng chống bệnh

Cây sắn bị nhiều bệnh gây hại khác nhau, trong đó có bệnh phytoplasma Bệnh phytoplasma hại sắn đã được ghi nhận ở một số vùng trồng sắn trên thế giới như quần đảo Wallis-Futuna, Uganda, Cuba, một số nước thuộc châu Mỹ và châu Á Phytoplasma gây hại trên cây sắn xác định được liên quan đến bệnh biến vàng lá, bệnh chổi phù thuỷ và bệnh da cóc Ở Brazil, tại một số vùng trồng sắn thuộc phía đông bắc nước này, tỷ lệ cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ lên đến 85%

và năng suất củ giảm đến 70% (Flôres et al., 2013), thậm chí năng suất củ giảm

sút đến 90% cũng đã được ghi nhận (Lozano, 1992)

Phytoplasma là một tác nhân đặc biệt gây bệnh trên cây trồng Phytoplasma không thể nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo, tế bào thiếu lớp vách bên ngoài

do bộ gen của chúng đã bị suy thoái mạnh Con đường lan truyền của phytoplasma ngoài tự nhiên là qua nhân giống vô tính và qua côn trùng môi giới Do phytoplasma không nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo nên chẩn đoán và phân loại nhóm tác nhân gây bệnh này chủ yếu dựa trên phân tích một số vùng

gen, quan trọng nhất là gen mã hóa 16S RNA ribosome (Bertaccini et al., 2014)

Trên thế giới, phytoplasma gây bệnh trên hàng trăm loại cây trồng khác nhau và số lượng bệnh mới do phytoplasma gây ra tăng theo từng năm

(Bertaccini et al., 2014) Ở Việt Nam, những nghiên cứu về bệnh phytoplasma

trên cây trồng còn hạn chế Các kết quả điều tra cơ bản trước đây đều chưa phát hiện ra bệnh phytoplasma ở Việt Nam Gần đây, dựa trên đánh giá triệu chứng và chẩn đoán phân tử, nguyên nhân gây bệnh chồi cỏ mía và trắng lá mía đã được

xác định là do phytoplasma gây ra (Hoat et al., 2012, 2013) Hai bệnh này đã gây

thành dịch nghiêm trọng tại một số vùng trồng mía trọng điểm của Việt Nam Phòng chống hiệu quả bệnh cây nói chung và bệnh chổi phù thuỷ hại sắn nói riêng phụ thuộc nhiều yếu tố, trong đó, đầu tiên là phải xác định chính xác tác nhân gây bệnh và các đặc điểm sinh học của bệnh Do bệnh chổi phù thuỷ hại sắn

là một bệnh mới ở Việt Nam nên cần phải thực hiện nghiên cứu về bệnh, đặc biệt tại các tỉnh trọng điểm có dịch ở Đông Nam Bộ

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Chẩn đoán và phân loại được phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số tỉnh Đông Nam Bộ; đánh giá được một số đặc điểm sinh học chính như tính gây bệnh và khả năng lan truyền của chúng

1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Phytoplasma gây hại trên cây sắn, tập trung vào lĩnh vực chẩn đoán, phân loại và một số đặc điểm sinh học

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thủy hại sắn ở Đông Nam Bộ, xác định nguyên nhân phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn Nghiên cứu biện pháp chẩn đoán, xác định và phân loại phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn và khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn ở điều kiện chậu vại trong nhà lưới

1.3.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu

Điều tra trên đồng, thu thập mẫu được thực hiện tại một số tỉnh Đông Nam

Bộ gồm Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Tây Ninh và một số tỉnh khác, bao gồm Phú Thọ, Yên Bái, Quảng Ngãi, Kon Tum

Các nghiên cứu liên quan tới xác định đặc điểm sinh học được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc; nghiên cứu chẩn đoán, phân loại phytoplasma hại sắn được thực hiện tại Viện Bảo vệ thực vật và Trung tâm Nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới

Thời gian thực hiện các thí nghiệm trong đề tài từ năm 2011 đến năm 2014

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài đã xác định được bệnh chổi phù thủy hại sắn tại Việt Nam do phytoplasma gây ra Phytoplasma hại sắn tại Việt Nam thuộc 2 nhóm gồm 16SrI (nhóm phụ 16SrI-B) và 16SrII (nhóm phụ 16SrII-A) Riêng mẫu phytoplasma hại sắn YB-01 (KM360166) ở Yên Bái thuộc nhóm 16SrI nhưng nằm trong nhóm phụ hoàn toàn mới, chưa được công bố

Áp dụng thành công kỹ thuật nhuộm mô cây bằng DAPI để phát hiện phytoplasma hại sắn tại Việt Nam

Thiết kế thành công bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu để xác định phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn tại Đông Nam Bộ Đề xuất được quy trình chẩn đoán phytoplasma hại sắn cho một số tỉnh Đông Nam Bộ

Cung cấp dẫn liệu khoa học về một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra Xác định được con đường lan truyền chính của bệnh là qua nhân giống vô tính đã bị nhiễm bệnh

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Đã xác định được phytoplasma là nguyên nhân gây bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại Đông Nam Bộ, phân loại được phytoplasma hại sắn ở Việt Nam thuộc 2 nhóm 16SrI và 16SrII Đã ứng dụng thành công các kỹ thuật để chẩn đoán, phân loại phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn như kính hiển vi điện tử, kỹ thuật nhuộm mô cây bằng DAPI, kỹ thuật PCR lồng, kỹ thuật RFLP và kỹ thuật LAMP-PCR Xác định được con đường lan truyền của phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn tại Đông Nam Bộ là chủ yếu qua nhân giống vô tính

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Xác định được phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn, cũng như xác định được con đường lan truyền chủ yếu của phytoplasma hại sắn đã góp phần đưa ra biện pháp quản lý bệnh chổi phù thuỷ một cách có hiệu quả trong điều kiện sản xuất tại một số tỉnh Đông Nam Bộ Biện pháp quan trọng nhất để quản

lý bệnh là phát hiện bệnh sớm và sử dụng giống sạch bệnh

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 CÂY SẮN

2.1.1 Lược sử nguồn gốc và phân loại cây sắn

Cây sắn có nguồn gốc vùng nhiệt đới của châu Mỹ và được trồng cách đây 5.000 - 7.000 năm trước Công nguyên (Allem, 2002) Cây sắn được người Bồ Đào Nha đưa đến châu Phi vào khoảng giữa thế kỷ XVI, nhưng việc trồng và tiêu thụ sắn ở châu Phi mới thực sự phát triển từ cuối thế kỷ XIX (FAO, 2005)

Ở vùng Ấn Độ Dương, sắn được du nhập vào các đảo thuộc trong vùng này,

từ đó sắn được đưa sang Sri Lanka và một số nước phía Đông thuộc châu Phi Ở châu Á, sắn được du nhập vào từ vùng Ấn Độ Dương do người Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha đưa vào trồng Sự phát triển nghề trồng sắn ở châu Á chỉ trở lên quan trọng từ cuối thế kỷ XIX Ở châu Đại Dương, sắn được đem trồng ở Ốt-xtrây-li-a

từ thế kỷ XX Ở châu Âu hầu như không phát triển nghề trồng sắn (Howeler et

al., 2013)

Về phân loại, cây sắn có tên khoa học là Manihot esculenta Crantz, thuộc chi Manihot, họ Euphorbiaceae (Howeler et al., 2013)

2.1.2 Giá trị sử dụng và giá trị dinh dưỡng

Tuy có nhiều quan điểm khác nhau về giá trị sử dụng và giá trị dinh dưỡng, nhưng sắn vẫn là cây trồng được quan tâm phát triển

Sắn có nhiều công dụng trong chế biến công nghiệp, thức ăn gia súc và lương thực - thực phẩm Củ sắn chứa nhiều tinh bột nên thường được chế biến thành bột sắn khô Trong củ sắn tươi có chứa đến 80% hàm lượng carbonhydrate, canxi (50 mg/100 g), phốtpho (40 mg/100 g), vitamin (25 mg/100 g) và các chất dinh dưỡng khác Lá sắn là một nguồn cung cấp protein, có chứa nhiều axít amin cần thiết nhưng thiếu lysine, methionine và tryptophan (Ravindran, 1992) Ở nhiều nước, việc nghiên cứu, đánh giá sử dụng sắn như là một nguyên liệu nhiên

liệu sinh học ethanol đang được chú ý (Howeler et al., 2013)

2.1.3 Tình hình sản xuất sắn trên thế giới

Sắn được trồng ở nhiều nước có khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới Sắn là nguồn thực phẩm của hơn 800 triệu người, là một trong những cây lương thực

quan trọng và chiếm diện tích lớn nhất trong sản xuất nông nghiệp của loài người Ở nhiều nước có khí hậu nhiệt đới ẩm, sắn là cây lương thực có vị trí hàng

đầu (Howeler et al., 2013)

Theo số liệu thống kê của Tổ chức Nông Lương thế giới (Food and agriculture organization, FAO), diện tích, năng suất và sản lượng sắn của toàn thế giới trong giai đoạn 10 năm từ năm 1999 đến năm 2009 đều tăng, các chỉ số này vào năm 1999 lần lượt là 16,85 triệu ha; 10,09 tấn/ha và 170,01 triệu tấn, đến năm 2009 các chỉ số này lần lượt là 18,92 triệu ha; 12,36 tấn/ha và 233,80 triệu tấn (FAOSTAT, 2014) Vào năm 2009, diện tích trồng sắn của thế giới tập trung chủ yếu ở các nước châu Phi với 12,26 triệu ha và sản lượng đạt 11,89 triệu tấn Các chỉ số này ở châu Á lần lượt là 4,05 triệu ha và 8,16 triệu tấn; ở châu Mỹ Latinh là 2,59 triệu ha và 3,32 triệu tấn Các nước thuộc châu Đại Dương cũng có trồng sắn rãi rác nhưng không đáng kể Nigeria là nước có diện tích trồng sắn lớn nhất thế giới với hơn 3,12 triệu ha và sản lượng đạt 36,80 triệu tấn vào năm 2009 (FAOSTAT, 2014)

Năng suất sắn củ tươi bình quân của thế giới đạt 12,38 tấn/ha vào năm

2009 Ấn Độ là nước có năng suất sắn củ tươi đạt cao nhất thế giới (34,36 tấn/ha), kế tiếp là Thái Lan (22,68 tấn/ha) và Indonesia (18,74 tấn/ha) Thái Lan

là nước xuất khẩu sắn khô lớn nhất, chiếm 77% sản lượng xuất khẩu của thế giới trong năm 2005 Nước xuất khẩu sắn khô lớn thứ hai là Việt Nam (13,6%), tiếp theo là In-đô-nê-xi-a (5,8%) và Costa Rica (2,1%) (FAOSTAT, 2014)

2.1.4 Tình hình sản xuất sắn tại Việt Nam

Theo số liệu của Tổng cục Thống kê (2015), diện tích cây sắn ở Việt Nam vào năm 1995 có khoảng 277,4 nghìn ha với sản lượng là 2211,5 nghìn tấn; các chỉ số này đến năm 2014 lần lượt là 551,9 nghìn ha và 10.255,3 nghìn tấn Năm

2011, diện tích trồng sắn là cao nhất (558,4 nghìn ha), với sản lượng cũng đạt cao nhất (9897,9 nghìn tấn) Diện tích và sản lượng sắn tăng lên do nhu cầu của một

số ngành thực phẩm và công nghiệp chế biến Các vùng gồm Trung du và miền núi phía Bắc, vùng Bắc Trung Bộ và Duyên hải miền Trung, vùng Đông Nam Bộ

là những vùng trồng sắn chủ lực và có sản lượng sắn đạt cao nhất của cả nước Vùng đồng bằng sông Hồng và vùng đồng bằng sông Cửu Long có diện tích trồng sắn và sản lượng sắn thấp hơn cả

2.2 PHYTOPLASMA HẠI THỰC VẬT

2.2.1 Lịch sử phát hiện phytoplasma

Năm 1967, phytoplasma gây hại thực vật lần đầu tiên được phát hiện ở Nhật Bản với hiện tượng cây trồng bị bệnh biến vàng Lúc đó, phytoplasma được phát hiện trong tế bào ống rây của mạch phloem cây bệnh có tên gọi là vi sinh

vật giống mycoplasma (mycoplasma like organisms, MLOs) (Doi et al., 1967)

Từ năm 1967 - 1993, tên gọi MLOs được sử dụng để nghiên cứu tác nhân của nhiều bệnh biến vàng cây trồng Đến năm 1994, tên gọi phytoplasma được công nhận, thay cho tên gọi MLOs tại Hội nghị các Tổ chức Quốc tế ngành

Mycoplasma học (Lee et al., 2000) Cho đến năm 2007, trên thế giới đã phát hiện

hơn 300 loại bệnh khác nhau do phytoplasma gây ra ở hàng trăm loài cây trồng

quan trọng khác nhau (Hoshi et al., 2007)

2.2.2 Phân loại phytoplasma

Việc nghiên cứu tìm hiểu về phytoplasma được bắt đầu vào những năm cuối thập niên 80 và đầu thập niên 90 của thế kỷ XX Đầu tiên các phân tích phả

hệ dựa trên các chuỗi gen mã hóa 16S RNA ribosome (16S ribosomal ribonucleic acid gene) và gen mã hóa protein ribosome (ribosomal protein gene) đã xác định

chính xác phytoplasma là thành viên của lớp dịch khuẩn bào (Mollicutes)

Hiện nay, về phân loại, tất cả phytoplasma được xếp vào chi „Candidatus Phytoplasma‟ („Ca Phytoplasma‟), bộ Acholeplasmatales, lớp Mollicutes, ngành

Firmucutes (IRPCM, 2004; Hogenhout et al., 2008) Dựa trên cơ sở so sánh

chuỗi gen mã hóa 16S RNA ribosome, các loài thuộc chi „Ca Phytoplasma‟

được xếp vào 33 nhóm phả hệ khác nhau (ký hiệu từ 16SrI đến 16SrXXXIII) với

hơn 116 nhóm phụ như trình bày ở bảng 2.1 (Lee et al., 1998; Lee et al., 2004; Arocha et al., 2005; Al-Saady et al., 2008; Bertaccini and Duduk, 2009; Bertaccini et al., 2014)

Theo Nhóm nghiên cứu phân loại phytoplasma của Dự án Nghiên cứu Quốc tế về Mycoplasma (International Research Project for Comparative Mycoplasmology, IRPCM), một loài phytoplasma được coi là một loài mới thuộc

„Ca Phytoplasma‟ khi so sánh dựa trên trình tự vùng gen mã hóa 16S

RNA ribosome (trình tự nucleotide  1,2 kb) có mức đồng nhất trình tự

nucleotide thấp hơn 97,5% so với các loài „Ca Phytoplasma‟ đã được công bố

trước đó (IRPCM, 2004)

Bảng 2.1 Phân loại phytoplasma dựa trên phân tích gen 16S RNA ribosome

I-A Aster yellows witches‟ broom (AYWB) NC_007716

I-R Strawberry phylloid fruit (StrawbPhF) AY102275

I-W Peach rosette-like disease (PRU0382) HQ450211

16SrII: Peanut witches‟ broom

16SrIII: X-disease

III-H Poinsettia branch-inducing (PoiBI) AF190223 III-I Virginia grapevine yellows (VGYIII) AF060875

III-Q Black raspberry witches‟ broom (BRWB7) AF302841

III-V Passion fruit phytoplasma (PassWB-Br4) GU292082 16SrIV: Coconut lethal yellows

IV-B Yucatan coconut lethal decline (LDY) U18753 IV-C Tanzanian coconut lethal decline (LDT) X80117 16SrV: Elm yellows

16SrVI: Clover proliferation

VI-E Centarurea solstitialis virescence (CSVI) AY270156 VI-F Catharanthus phyllody phytoplasma (CPS) EF186819 VI-H Portulaca little leaf phytoplasma (PLL-Ind) EF651786

16SrVII: Ash yellows

VII-C Argentinian alfalfa witches‟ broom (ArAWB) AY147038 16SrVIII: Loofah witches‟ broom

16SrIX: Pigeon pea witches‟ broom

IX-C Naxos periwinkle virescence (NAXOS) HQ589191

IX-F Almond and stone fruit witches‟ broom (N27-2) HQ407532 IX-G Almond and stone fruit witches‟ broom (A1-1) HQ407514 16SrX: Apple proliferation

X-B European stone fruit yellows (ESFY) AJ542544

16SrXI: Rice yellow dwarf

16SrXII: Stolbur

XII-B Australian grapevine yellows (AUSGY) L76865 XII-C Strawberry lethal yellows (StrawLY) AJ243045

XII-E Yellows diseased strawberry (StrawY) DQ086423

16SrXIII: Mexican periwinkle virescence

XIII-A Mexican periwinkle virescence (MPV) AF248960

16SrXIV: Bermudagrass white leaf

16SrXVI: Sugarcane yellow leaf syndrome

16SrXVII: Papaya bunchy top

16SrXVIII: American potato purple top wilt

16SrXIX: Chestnut witches‟ broom

16SrXX: Rhamnus witches‟ broom

16SrXXI: Pinus phytoplasmas

16SrXXII: -

XXII-A Lethal yellow disease Mozambique (LYDM) KF751387 XXII-B Cape St Paul wilt disease (CSPW) JQ868442 16SrXXIII: -

16SrXXIII-A Buckland valley grapevine yellows AY083605 16SrXXIV: -

16SXXIX: Cassia witches‟ broom

16SXXX: Salt cedar witches‟ broom

16SXXXI: Soybean stunt

16SXXXII: Malaysian periwinkle virescence and phyllody

16SXXXIII: Allocasuarina muelleriana phytoplasma

Nguồn: Lee et al (1998), Bertaccini et al (2014)

2.2.3 Tầm quan trọng của phytoplasma

Bệnh phytoplasma gây ra là một trong những yếu tố hạn chế đầu tiên cho sản xuất của nhiều cây trồng quan trọng trên toàn thế giới Phytoplasma gây ra rất nhiều bệnh trên cây lương thực, cây rau, cây ăn quả, cây hoa và cây bóng mát

với mức thiệt hại kinh tế là khác nhau (Al-Saady et al., 2008; Al-Subhi et al.,

2011) Ví dụ, phytoplasma thuộc nhóm gây bệnh biến vàng cây cúc tây (16SrI) làm giảm lợi nhuận kinh tế của nhiều loại cây trồng (cần tây, rau diếp xoăn, ) ở các nước thuộc bắc Mỹ và một số nước châu Âu, thiệt hại kinh do bệnh gây ra ở mức 10 - 25%, có khi đến tới 80 - 90% Bệnh phytoplasma gây hại trên cây đào (như bệnh biến vàng, bệnh X) làm giảm chất lượng quả, gây thất thu ở Hoa Kỳ

(Bertaccini and Duduk, 2009; Duduk et al., 2009)

Bệnh lùn cây lúa miến, bệnh lùn cây ngô ở châu Âu và châu Mỹ (Duduk and Bertaccini, 2006) Bệnh biến vàng, lùn cây lúa ở vùng trồng ở Đông Nam Á,

Ấn Độ có dạng do phytoplasma gây ra làm giảm sản lượng thóc (Jung et al., 2003; Valarmathi et al., 2013)

Bệnh trắng lá mía, bệnh chồi cỏ gây hại trên cây mía ở các nước châu Á làm giảm sản lượng mía, có lúc trở thành vấn đề nghiêm trọng tại một số nước

(Marcone, 2002; Rao et al., 2005; Ariyarathna et al., 2007) Bệnh chổi phù thuỷ,

bệnh biến vàng ở cây khoai lang, cây khoai tây làm giảm sản lượng khoai ở châu

Á, châu Âu (Munyaneza, 2010) Bệnh hóa gỗ quả táo tây gây thiệt hại khoảng 25

- 100 triệu Euro tại các nước Italia và Đức (Strauss, 2009)

Bệnh vàng lá nho, đu đủ, bệnh cây lê còi cọc, hoá xanh vỏ quả cam, chổi phù thuỷ táo ta, chổi phù thuỷ sơ-ri, chổi phù thuỷ chanh tây và nhiều cây ăn quả

khác làm giảm sản lượng, chất lượng quả ở nhiều vùng trên thế giới (Davis et al., 1998; Paltrinieri et al., 2006; Chen et al., 2009; Gajardo et al., 2009; Contaldo et

al., 2011; Gonzalez et al., 2011; Mardi et al., 2011)

Bệnh phytoplasma gây hại trên cây trồng thuộc cây họ đậu, cây họ vừng làm

giảm sản lượng ở nhiều vùng trên thế giới (Khan et al., 2007; Sertkaya et al., 2007; Teixeira et al., 2008; Akhtar et al., 2009; Win et al., 2010; Kumar et al., 2011)

Cũng có trường hợp đặc biệt, bệnh phytoplasma gây hại trên cây trồng lại

có lợi cho sự phát triển của cây, từ đó làm tăng giá trị của cây trồng, ví dụ như

bệnh phytoplasma gây lùn cây trạng nguyên (Bertaccini et al., 1996)

2.2.4 Đặc điểm hình thái phytoplasma

Do thiếu vách tế bào nên tế bào phytoplasma gây bệnh cây thông thường có hình dạng không cố định Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, phytoplasma có hình bầu dục, hình ovan, hình tròn, dạng hình sợi ngắn, đôi khi ở dạng không định hình; thông thường có kích thước đường kính nhỏ hơn 1 m (hình 2.1) Phytoplasma không có màng vững chắc như vi khuẩn nhưng cơ thể của phytoplasma được bao bọc bằng hai lớp màng, có tính đàn hồi (Bertaccini and Duduk, 2009)

Hình 2.1 Hình thái và kích thước phytoplasma trong tế bào ống rây

của mạch phloem được chụp dưới kính hiển vi điện tử

Nguồn: Marcone (2014)

2.2.5 Triệu chứng bệnh do phytoplasma gây ra

Phytoplasma xâm nhập vào bó mạch phloem và gây ra hiện tượng biến vàng ở cây bệnh Hầu hết, các cây bị nhiễm phytoplasma đều có lá màu nhạt, hàm lượng chlorophyl, carotenoid đều giảm (Bertamini and Nedunchezhian,

2001) Cây nhiễm phytoplasma thường biểu hiện dạng triệu chứng sau (Lee et

al., 2000; Christensen et al., 2005): (i) Lá biến màu, thường biến dạng lá màu

vàng hoặc đỏ; (ii) Hiện tượng diệp hóa: một phần hoa phát triển thành cấu trúc

lá; (iii) Hiện tượng lục hóa: hoa phát triển có màu xanh giống lá hoặc mất màu; (iv) Cây biến dạng, thấp lùn, còi cọc; (v) Đốt thân, ngọn cành, ngọn chính rụt ngắn lại; (vi) Biến dạng chổi phù thuỷ (hay chổi rồng): mọc nhiều chồi phụ ở cành, thân chính

2.2.6 Cơ chế gây bệnh của phytoplasma

Phytoplasma là ký sinh bắt buộc trong tế bào ống rây của mạch phloem cây

bệnh và trong cơ thể nhiều loài côn trùng (Bai et al., 2006) Vì ký sinh trong tế

bào ống rây của mạch phloem nên phytoplasma đã ức chế quá trình vận chuyển các sản phẩm đồng hóa, chủ yếu là carbonhydrate, từ mô sản xuất như lá trưởng thành, tới các mô tiêu thụ như rễ, củ và lá non Hậu quả là các mô sản xuất đã tích lũy lượng lớn bất thường các sản phẩm đồng hóa, còn các mô tiêu thụ lại bị thiếu hụt nghiêm trọng các chất này Việc cản trở quá trình vận chuyển các sản phẩm đồng hóa thông qua mạch phloem sẽ dẫn tới suy giảm một loạt các chức năng sinh lý của cây và do đó có thể gây ra triệu chứng Tuy nhiên, cơ chế chính xác của tác động này đến biểu hiện triệu chứng cây vẫn chưa được hiểu rõ (Marcone, 2014)

Trong những năm gần đây, dựa trên các nghiên cứu sinh học phân tử, cơ chế gây bệnh của phytoplasma trên thực vật đã dần được sáng tỏ Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, giống như virus, một số protein của phytoplasma đã can thiệp vào một loạt các đường hướng sinh học liên quan đến sinh trưởng, phát triển và biệt hóa mô của thực vật Một số protein gây bệnh của phytoplasma đã được nghiên cứu bao gồm:

(i) SAP11 SAP11 là một protein do „Ca Phytoplasma asteris‟ chủng

AY-WB tạo ra Cây Arabidopsis thaliana được chuyển gen SAP11 biểu hiện một loạt

các triệu chứng giống hệt như bị nhiễm phytoplasma AY-WB Protein SAP11 có dấu hiệu nhập nhân ở đầu amin cho phép nó liên kết với một α-importin - một protein có chức năng vận chuyển các protein từ tế bào chất vào trong nhân tế

bào Do đó, SAP11 có thể di chuyển vào trong nhân tế bào ký chủ Trong nhân, SAP11 tương tác với một số protein điều khiển phiên mã (transcription factors) như TEOSINTE BRANCHED 1, CYCLOYDEA và PROLIFERATING CELL FACTOR 1, 2 Cả 3 protein điều khiển phiên mã này chịu trách nhiệm điều khiển biểu hiện một loạt các gen liên quan đến phát triển thực vật Đặc biệt, protein SAP11 làm mất tính ổn định của protein điều khiển phiên mã CINCINNATA-chịu trách nhiệm điều khiển sự thành thục và già hóa của mô Protein SAP11 do phytoplasma tạo ra trong tế bào ống rây có thể di chuyển hệ thống trong cây tới các tế bào của mô tiêu thụ và xâm nhập vào nhân tế bào (Sugio and Hogenhout, 2012; Marcone, 2014)

(ii) SAP54 SAP54 cũng là một protein do „Ca Phytoplasma asteris‟ chủng

AY-WB tạo ra Cây A thaliana được chuyển gen SAP54 biểu hiện triệu chứng

diệp hóa điển hình giống như bị nhiễm phytoplasma Protein SAP54 tương tác với protein RADIATION SENSITIVE23 (RAD23) của tế bào ký chủ, dẫn tới phân hủy 2 protein điều khiển phiên mã là APETALA1 (AP1)/CAULIFLOWER

và LEAFY - là 2 protein đóng vai trò chủ chốt trong quá trình biệt hóa hoa của

cây (MacLean et al., 2011)

(iii) TENGU TENGU là một protein do „Ca Phytoplasma asteris‟ chủng

M tạo ra Cây A thaliana được chuyển gen mã hóa TENGU biểu hiện triệu

chứng chổi phù thuỷ và lùn cây điển hình giống như bị nhiễm phytoplasma TENGU là một protein được phytoplasma tiết vào tế bào mạch phloem và di chuyển hệ thống trong cây và xâm nhập được vào các tế bào khác, kể cả tế bào của mô tiêu thụ ở phần ngọn cây Khác với 2 protein ở trên, TENGU hoạt động trong tế bào chất chứ không phải trong nhân của tế bào đích Trong tế bào chất, TENGU ức chế sinh tổng hợp auxin Hậu quả là sự phát triển của chồi đỉnh bị ức chế dẫn tới kích thích phát triển của chồi bên tạo ra triệu chứng chổi phù thuỷ

(Hoshi et al., 2009; Sugio and Hogenhout, 2012; Sugawara et al., 2013)

2.2.7 Sự đa dạng của phytoplasma

Phytoplasma là tác nhân gây bệnh trên hàng trăm loại cây trồng khác nhau

và số lượng bệnh mới phát hiện được tăng theo từng năm Phytoplasma có khả năng gây bệnh cho một loại cây trồng do cùng một chủng, hoặc phytoplasma cũng có thể gây ra cùng một loại bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau Hơn nữa, côn trùng môi giới và cây trồng đều là những ký chủ tự nhiên của

phytoplasma (Lee et al., 2000; Bertaccini and Duduk, 2009; Sugio et al., 2011)

Sự thay đổi về mặt di truyền của một số nhóm phytoplasma thường liên quan đến vùng sinh thái, mặc dù đối với một số nhóm phụ lại liên quan đến phổ ký chủ cây trồng và côn trùng môi giới Côn trùng môi giới truyền phytoplasma gây bệnh chổi phù thuỷ trên cây hông, bệnh lùn cây ngô hoàn toàn khác so với các côn

trùng môi giới truyền một số bệnh khác trong cùng nhóm 16SrI (McCoy et al., 1989; Gundersen et al., 1996) Trong tự nhiên, tính đa dạng sinh học của các

nhóm phytoplasma liên quan chặt chẽ đến côn trùng môi giới, phổ ký chủ, hoặc

cả hai yếu tố này (Lee et al., 1998)

2.2.8 Lan truyền của phytoplasma

2.2.8.1 Lan truyền của phytoplasma qua nhân giống vô tính

Phytoplasma là tác nhân gây bệnh nhiễm hệ thống, giới hạn trong mạch phloem, nên truyền qua nhân giống vô tính như ghép, củ giống, hom giống, thân ngầm là con đường lan truyền quan trọng, có thể được xem là quan trọng nhất đối với các loài cây được nhân giống vô tính Tuy nhiên, phytoplasma không truyền được qua tiếp xúc cơ học vì khi phytoplasma được đưa vào tế bào biểu bì hoặc nhu mô thì chúng cũng không có khả năng di chuyển xuống tế bào ống rây

của mạch phloem (Lee et al., 2000)

2.2.8.2 Lan truyền của phytoplasma qua tơ hồng

Tơ hồng (Cuscutas spp.) là loại thực vật không có diệp lục ký sinh trên thực

vật Khi sợi tơ hồng tiếp xúc với cây ký chủ, chúng hình thành đĩa áp (prehaustoria) gắn chặt bề mặt cây Tiếp theo, đĩa áp phát triển thành vòi hút (haustorium) và xâm nhập vào trong cây Sau khi xâm nhập vào trong cây, đỉnh vòi hút phát triển thành các sợi tìm kiếm (searching hyphae) để tiếp cận mạch xylem và mạch phloem của cây Sau khi tiếp xúc với mạch phloem của cây, sợi tìm kiếm dung hợp thành tế bào của chúng với thành tế bào mạch phloem và tạo thành một cầu nối thông suốt để tiếp nhận dinh dưỡng và nước của cây ký chủ

(Kaiser et al., 2015) Đặc điểm ký sinh này dẫn tới tơ hồng có thể truyền dễ dàng

phytoplasma và do đó thường được sử dụng như một loại vector hiệu quả để truyền phytoplasma sang cây thí nghiệm (Přibylová and Špak, 2013)

2.2.8.3 Lan truyền của phytoplasma qua hạt giống

Cấu tạo của hạt giống cho thấy mạch phloem của cây chỉ kéo dài tới vỏ hạt

mà không nối trực tiếp vào phôi của hạt (Finch-Savage, 2013) Do đặc điểm cấu

tạo của hạt như trên nên, về lý thuyết, phytoplasma không thể tiếp cận tới phôi của hạt Chính vì vậy, phytoplasma không được xem là tác nhân gây bệnh truyền

qua hạt (Lee et al., 2000) Một số nghiên cứu gần đây đã phát hiện thấy phytoplasma trên hạt và cả cây con cỏ 3 lá (Khan et al., 2002), cải dầu, cà chua, ngô (Calari et al., 2011), thậm chí cả ở phôi hạt cọ dầu (Nipah et al., 2007) Tuy

nhiên, các nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng, phytoplasma có thể phát hiện thấy ở

vỏ hạt nhưng không thể truyền sang cây con (Faghihi et al., 2011)

2.2.8.4 Lan truyền của phytoplasma qua côn trùng môi giới

Các nghiên cứu lan truyền đã chứng tỏ côn trùng chích hút là môi giới quan trọng nhất của các bệnh phytoplasma nhiễm trên cây trồng từ hạt

Tất cả côn trùng môi giới của phytoplasma đều thuộc bộ Hemiptera Các loài côn trùng thuộc bộ Hemiptera có hành vi chích hút khá đa dạng, có nhóm chích hút ở mạch phloem, có nhóm chích hút ở mạch xylem Do phytoplasma chỉ giới hạn ở mạch phloem nên chỉ nhóm côn trùng chích hút ở loại mô này mới có khả năng truyền chúng (Wilson and Weintraub, 2007) Hiện có ít nhất 102 loài côn trùng chích hút bộ Hemiptera đã được xác định là côn trùng môi giới của phytoplasma, phần lớn thuộc họ Rầy xanh (Cicadellidae) (bảng 2.2)

Côn trùng môi giới truyền phytoplasma theo kiểu bền vững tái sinh (propagative persistant) Quá trình chích nạp xảy ra ở mạch phloem của cây ký chủ Thời gian chích nạp (acquisition feeding time) có thể ngắn khoảng vài phút nhưng nhìn chung khoảng vài giờ và thời gian chích nạp càng dài thì khả năng nạp phytoplasma càng tăng

Bảng 2.2 Thành phần các nhóm côn trùng bộ Hemiptera là môi giới

Rầy đốm gân (Cixiidae) 7 Rầy nâu (Delphacidae) 4 Rầy cánh dài (Derbidae) 1

Ve sầu bướm (Flatidae) 1

Bọ xít lưới (Tingidae) 1 Nguồn: Weintraub and Beanland (2006), Weintraub (2007)

Hình 2.2 Minh họa sự phân bố của phytoplasma trong cơ thể côn trùng

môi giới lan truyền bệnh

Ghi chú: Não (Br); hạch thần kinh hỗn hợp (Cng); ống bơm nước bọt (Sp); vòi hút (St); Thực quản (Es); ruột trước (Amg); ruột giữa (Mmg); buồng lọc (Fc); ruột sau (Hg); ống Malpighi (Mt); chất Hemolymph (He); tuyến nước bọt (Sg); ống dẫn nước bọt (Sd); mạch xylem của cây (xylem); mạch phloem của cây

(Ph); thể phytoplasma được chỉ rõ bằng mũi tên

Nguồn: Hogenhout et al (2008)

Sau khi nạp phytoplasma, côn trùng cần thời gian tiềm ẩn (latent period = incubation period) trước khi có thể truyền phytoplasma Thời gian tiềm ẩn phụ thuộc nhiệt độ và thay đổi từ vài ngày tới thậm chí 80 ngày Trong thời gian tiềm

ẩn, phytoplasma di chuyển theo ruột trước tới ruột giữa - là vị trí chủ yếu để phytoplasma xâm nhập Ngoài cùng thành ruột giữa có một lớp tế bào biểu mô (epithelial cells) dạng cột được ngăn cách với ống ruột bởi 1 lớp màng đỉnh (apical membrane) Do cấu tạo của lớp tế bào biểu mô nên thành ruột giống như

có một lớp lông (microvilii), phytoplasma có thể xâm nhập vào lớp tế bào biểu

mô và tái sinh tại đây, sau đó vượt qua lớp màng thứ 2 là lớp màng đáy (basement membrane), xâm nhập sinh sản tại mô cơ ruột Tiếp theo, phytoplasma xâm nhập vào xoang cơ thể (hemocoel) Tại xoang cơ thể, phytoplasma có thể tiếp tục xâm nhiễm và sinh sản ở một loạt các cơ quan khác như ống Malpighi, thể béo, não hoặc cơ quan sinh sản Tiếp theo, phytoplasma xâm nhập và sinh sản tại màng đáy của tuyến nước bọt (salivary gland), tiếp tục di chuyển qua lớp màng đỉnh của tuyến nước bọt để vào ống dẫn của tuyến nước bọt và theo dòng nước bọt để xâm nhập vào cây khi côn trùng chích hút trên cây Như vậy, trong

cơ thể côn trùng, phytoplasma phải sinh sản ở nhiều loại mô và phải vượt qua một loạt các rào cản ở thành ruột và thành tuyến nước bọt (hình 2.2) (Weintraub

and Beanland, 2006; Hogenhout et al., 2008)

Tính đặc hiệu giữa phytoplasma và côn trùng môi giới khá phức tạp Một loài côn trùng môi giới có thể truyền một hoặc nhiều loài phytoplasma khác nhau, hoặc một loài phytoplasma có thể được truyền bởi một hoặc nhiều loài côn trùng khác nhau Phytoplasma gây bệnh biến vàng cây đu Mỹ (16SrV-A), bệnh trắng lá mía (16SrXI-B), bệnh chổi phù thuỷ khoai lang (16SrII-A) và bệnh chổi phù thuỷ mướp (16SrVIII-A) có thể chỉ được truyền bởi một hoặc vài loài côn trùng (Tsai, 1979) Trong khi đó, phytoplasma gây bệnh biến vàng cúc tây California (16SrI-B) được truyền bởi 24 loài rầy, còn phytoplasma gây bệnh X trên cây đào (16SrIII-A) được truyền bởi ít nhất 15 loài rầy (Toth, 1994) Một số chủng phytoplasma có thể được lan truyền bởi một loài côn trùng đa thực, từ loài thực vật này sang nhiều loài thực vật khác Ví dụ, phytoplasma gây bệnh biến vàng cúc tây bắc Mỹ (16SrI-A, 16SrI-B) chủ yếu được lan truyền bởi loài rầy

Macrosteles fascifrons sang 191 loài thực vật thuộc 42 họ khác nhau;

phytoplasma gây bệnh X miền đông (16SrIII-A) được lan truyền bởi một vài loài

rầy sang 59 loài thực vật thuộc hơn 10 họ thực vật khác nhau (Golino et al.,

1989; McCoy et al., 1989) Ngược lại, phytoplasma gây bệnh chết khơ cây đào được lan truyền bởi lồi cơn trùng đơn thực Cacopsylla pyricola cĩ phổ ký chủ hẹp hơn (Tedeschi et al., 2006)

Bản chất tính đặc hiệu giữa phytoplasma và cơn trùng mơi giới phần lớn chưa được hiểu rõ Như trình bày ở trên, phytoplasma, để cĩ thể truyền được qua một cơn trùng mơi giới buộc phải vượt qua một loạt các rào cản tế bào trong cơ thể cơn trùng Sự nhận biết và tương tác giữa các thụ thể của phytoplasma và của cơn trùng đĩng vai trị quan trọng trong quyết định tính đặc hiệu giữa chúng Một nghiên cứu trước đĩ đã phát hiện một protein xuyên màng cĩ hoạt tính kháng

nguyên (antigenic membrane protein) của „Ca Phytoplasma asteris‟, chủng OY,

cĩ khả năng tương tác đặc hiệu và hình thành một phức hợp với các vi sợi như actin và myosin của mơ cơ bao quanh ruột ở tất cả các lồi rầy là cơn trùng mơi

giới của phytoplasma này (Suzuki et al., 2006) Tương tự, gần đây hơn, protein Amp của „Ca P asteris‟, chủng CY, cũng được chứng minh tương tác và liên kết

đặc hiệu với actin và 2 tiểu phần α và β của enzym ATP synthase của lồi rầy

Euscelidius variegatus - là cơn trùng mơi giới của phytoplasma này Cần chú ý

rằng tiểu phần β của enzym ATP synthase cĩ mặt trên màng tế bào ruột giữa và

màng tế bào tuyến nước bọt của phytoplasma (Galetto et al., 2011)

2.2.9 Phương pháp chẩn đốn phytoplasma

Phytoplasma khơng thể nuơi cấy được trên mơi trường nhân tạo nên chẩn đốn loại tác nhân gây bệnh này khá phức tạp Bệnh phytoplasma tạo triệu chứng khá khác biệt so với các nhĩm tác nhân gây bệnh cây khác nên triệu chứng thường là căn cứ đầu tiên để chẩn đốn nhĩm bệnh này Tuy nhiên, nhiều nhĩm

vi sinh vật khác cũng cĩ thể tạo một trong các triệu chứng đặc trưng giống như nhiễm phytoplasma là triệu chứng chổi phù thuỷ Đã cĩ cơng bố cho thấy nhĩm nhện nhỏ (eriophyoid) cĩ thể cảm ứng tạo triệu chứng chổi phù thuỷ trên rất

nhiều loại cây (Lindquist et al., 1996) Một số lồi nấm, chẳng hạn nấm đảm

Moniliophthora perniciosa gây bệnh chổi phù thuỷ trên ca cao (Aime and

Phillips-Mora, 2005), nấm Aciculosporium take/Heteroepichloë sasae gây bệnh chổi phù thuỷ trên tre, nứa (Tanaka, 2010), nấm Fusarium mangiferae gây bệnh chổi phù thuỷ trên xồi (Crespo et al., 2012) Chính vì vậy, đối với bệnh

phytoplasma, ngồi triệu chứng, nhiều biện pháp chẩn đốn khác thường được sử dụng gồm 2 nhĩm chính là (i) chẩn đốn trực tiếp phytoplasma trong tế bào bằng hiện vi điện tử hoặc nhuộm mơ bằng thuốc nhuộm huỳnh quang; và (ii) chẩn

đoán gián tiếp bằng các phân tích phân tử như phản ứng trùng hợp chuỗi axít nucleic (polymerase chain reaction, PCR), giải trình tự

2.2.9.1 Nhuộm mô bằng thuốc nhuộm huỳnh quang

Phát hiện sự có mặt của phytoplasma trong tế bào ống rây của mạch phloem cây bệnh có thể được thực hiện bằng nhuộm mô cây với thuốc nhuộm huỳnh quang, phổ biến nhất là 4‟,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Cơ sở khoa học của phương pháp này là do thuốc nhuộm này có khả năng liên kết mạnh với vùng giàu AT của DNA Bộ gen của phytoplasma đã được chứng minh có hàm lượng

AT (72 - 79%) cao hơn nhiều so với CG (21 - 28%), và do đó rất nhạy với thuốc nhuộm DAPI Sau khi nhuộm với DAPI, mô được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang với tia cực tím (450 - 490 nm) được sử dụng làm nguồn kích hoạt

Do thuốc nhuộm DAPI sẽ phát huỳnh quang khi được kích hoạt nên tế bào phytoplasma có thể được quan sát thấy trong các tế bào bị nhiễm Do sự đơn giản

và khá chính xác nên nhuộm DAPI là một kỹ thuật chẩn đoán phytoplasma khá

phổ biến (Arismendi et al., 2010; Andrade and Arismendi, 2013)

2.2.9.2 ELISA

Phương pháp thử nghiệm miễn dịch liên kết men (enzyme linked immuno sorbent assay, ELISA) là kỹ thuật khá phổ biến trong chẩn đoán bệnh cây, đặc biệt đối với các bệnh virus Thành phần quan trọng nhất của phản ứng ELISA (và các kỹ thuật dựa trên miễn dịch học khác) là phải có một kháng thể đặc hiệu đối tượng cần chẩn đoán Do phytoplasma không thể nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo nên nguồn kháng nguyên là phytoplasma phải được chuẩn bị từ cây ký chủ nhiễm bệnh Việc tinh chiết phytoplasma từ cây rất khó, thường liên quan tới một bước ủ kháng thể được chuẩn bị từ protein của cây khỏe với dịch chiết của cây bệnh Bằng cách này, kháng thể đặc hiệu phytoplasma đã được tạo ra nhằm

chẩn đoán một số bệnh phytoplasma hại táo tây, cỏ linh lăng (Loi et al., 2002; Salehi et al., 2011)

2.2.9.3 Lai phân tử

Kỹ thuật lai DNA (southern hybridization) và phân tích đa hình của đoạn cắt giới hạn (restriction fragment length polymorphism, RFLP) sử dụng đoạn dò DNA có thể phân biệt được một số chủng phytoplasma Tuy nhiên, phương pháp

sử dụng đoạn dò DNA là quá trình bao gồm nhiều khâu phức tạp, người thực

hiện phải có trình độ và tay nghề cao (Martini et al., 2007)

2.2.9.4 PCR

Vì phytoplasma không thể nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo nên phương pháp phổ biến nhất hiện nay để phát hiện và xác định phytopasma là sử dụng phản ứng PCR kết hợp giải trình tự

Trong chẩn đoán bằng PCR, việc có được các cặp mồi đặc hiệu (mức chi và mức loài) là rất quan trọng Đối với phytoplasma, nhiều cặp mồi đã được thiết kế

và sử dụng rộng rãi, chủ yếu dựa trên vùng bảo thủ của gen rDNA mã hóa RNA ribosome Nghiên cứu đầu tiên ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán phytoplasma là vào năm 1992, khi Ahrens and Seemüller (1992) thiết kế một cặp mồi chung nhân một đoạn khoảng 558 bp của gen mã hóa 16S RNA ribosome và

dùng 2 enzym cắt giới hạn AluI và HincII phân tích sản phẩm PCR bằng kỹ thuật

đa hình các đoạn cắt giới hạn để phân biệt các loài phytoplasma khác nhau Cho đến nay, gen mục tiêu phổ biến nhất cho chẩn đoán và phân loại phytoplasma là gen 16S RNA ribosome và hàng chục cặp mồi chung hoặc mồi đặc hiệu nhóm đã được công bố dựa trên gen này (bảng 2.3)

Nhằm tăng tính đặc hiệu và độ nhạy để phát hiện phytoplasma, một kỹ thuật gọi là PCR lồng (nested PCR) đã được thử nghiệm Trong phản ứng PCR lồng, 2 cặp mồi phải được thiết kế gồm một cặp bên ngoài và một cặp bên trong của chuỗi đích Phản ứng PCR được lồng được thực hiện qua 2 vòng, trong đó sản phẩm PCR dùng cặp mồi bên ngoài được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR dùng cặp mồi bên trong (Gundersen and Lee, 1996)

Cho tới nay, 2 cặp mồi chung được sử dụng nhiều nhất để phát hiện phytoplasma bằng PCR lồng là P1/P7 hoặc R16mF2/R16mR1 (bước 1) và R16F2n/R16R2 (bước 2) PCR lồng sử dụng các cặp mồi trên đã chứng tỏ có khả năng phát hiện nhiều phytoplasma thuộc các nhóm khác nhau và được sử dụng bởi nhiều tác giả để phát hiện phytoplasma trên một loạt bệnh như bệnh vàng cây cúc tây, bệnh cây lê còi cọc… kể cả côn trùng môi giới (Deng and Hiruki, 1991;

Lee et al., 1994; Lorenz et al., 1995; Schneider et al., 1995; Gundersen and Lee, 1996; Khan et al., 2004; Duduk et al., 2013)

Phương pháp phân tích đa hình thực hiện mô phỏng trên gel ảo cũng được

sử dụng rộng rãi nhằm đánh giá mức độ tương đồng giữa các cặp trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome của phytoplasma gây bệnh cây thuộc

các nhóm khác nhau (Wei et al., 2007; Zhao et al., 2009)

Bảng 2.3 Một số mồi PCR phát hiện phytoplasma đã được công bố

P1 Mồi chung AAGAATTTGATCCTGGCTCAGGATT Deng and Hiruki, 1991 P7 Mồi chung CGTCCTTCATCGGCTCTT Schneider et al., 1995

P3 Mồi chung GGATGGATCACCTCCTT Schneider et al., 1995

P4 Mồi chung GAAGTCTGCAACTCGACTTC Schneider et al., 1995

P5 Mồi chung CGGCAATGGAGGAAACT Schneider et al., 1995

R16F2n Mồi chung GAAACGACTGCTAAGACTGG Gundersen and Lee, 1996 R16R2 Mồi chung TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG Gundersen and Lee, 1996 R16mF2 Mồi chung CATGCAAGTCGAACGGA Gundersen and Lee, 1996 R16mR2 Mồi chung CTTAACCCCAATCATCGA Gundersen and Lee, 1996 fU5 Mồi chung CGGCAATGGAGGAAACT Lorenz et al., 1995

rU3 Mồi chung TTCAGCTACTCTTTGTAACA Lorenz et al., 1995

SN910601 Mồi chung GTTTGATCCTGGCTCAGGATT Namba et al., 1993

SN910502 Mồi chung AACCCCGAGAACGTATTCACC Namba et al., 1993

R16(III)F2 Đặc hiệu nhóm III AAGAGTGGAAAAACTCCC Lee et al., 1994

R16(III)R1 Đặc hiệu nhóm III TTCGAACTGAGATTGA Lee et al., 1994

R16(V)F1 Đặc hiệu nhóm V TTAAAAGACCTTCTTCGG Lee et al., 1994

R16(V)R1 Đặc hiệu nhóm V TTCAATCCGTACTGAGACTACC Lee et al., 1994

R16(X)F1 Đặc hiệu nhóm X GACCCGCAAGTATGCTGAGAGATG Lee et al., 1994

R16(X)R1 Đặc hiệu nhóm X CAATCCGAACTGAGAGTCT Lee et al., 1994

fO1 Đặc hiệu nhóm X CGGAAACTTTTAGTTTCAGT Lorenz et al., 1995

rO1 Đặc hiệu nhóm X AAGTGCCCAACTAAATGAT Lorenz et al., 1995

Nguồn: Deng and Hiruki (1991), Namba et al (1993), Lee et al (1994), Schneider et al

(1995), Lorenz et al (1995), Gundersen and Lee (1996),

2.2.9.5 LAMP-PCR

Phương pháp nhân gen đẳng nhiệt (loop mediated isothermal amplification, LAMP-PCR) là phương pháp nhân bản DNA nhanh, được công bố lần đầu bởi

(Notomi et al., 2000) Kỹ thuật LAMP-PCR điển hình sử dụng sử dụng 4 mồi

khác nhau, được thiết kế dựa trên 6 trình tự của vùng gen đích Hai mồi bên

ngoài, thường được ký hiệu là F3 (mồi xuôi dòng: forward) và B3 (mồi ngược dòng: backward) Hai mồi bên trong được thiết kế rất đặc biệt, thường được ký hiệu là FIP (mồi xuôi dòng bên trong: forward internal primer) và BIP (mồi ngược dòng bên trong: backward internal primer) (hình 2.3)

Hình 2.3 Sơ đồ các mồi được sử dụng trong phản ứng LAMP-PCR

Trình tự 6 vùng thiết kế mồi được ký hiệu từ đầu 5‟ là F3, F2, F1c, B1c, B2 và B3 Bốn mồi bao gồm 2 mồi bên ngoài là F3 và B3 (lần lượt tương ứng với trình tự vùng F3 và B3), 2 mồi bên trong là FIP (tương

ứng với trình tự vùng F2 và F1c) và BIP (tương ứng trình tự vùng B2 và B1c)

Nguồn: Obura et al (2011)

Phản ứng LAMP-PCR được hoàn thành chỉ trong một bước bằng cách ủ

khuôn DNA, các cặp mồi, enzym Bst DNA polymerase (có hoạt tính thay thế

mạch) và đệm ở nhiệt độ cố định (khoảng 60 - 65oC) Phản ứng LAMP-PCR bao gồm 2 giai đoạn chính: (i) Tạo khuôn có cấu trúc thòng lọng 2 đầu: đầu tiên, mồi FIP sẽ tổng hợp sợi đầu tiên trên khuôn DNA sợi kép; tiếp theo mồi F3 sẽ tiếp tục hoạt động trên khuôn sợi kép mới hình thành và đẩy ra một sợi đơn chứa 1 đầu là mồi FIP Trên khuôn sợi đơn này, mồi BIP sẽ tổng hợp sợi mới để hình thành sợi kép, và trên khuôn sợi kép này, mồi B3 sẽ hoạt động, tổng hợp sợi kép mới và đẩy ra một sợi đơn có trình tự 2 đầu là mồi FIP và BIP

Do cấu tạo đặc biệt của mồi FIP và BIP, 2 đầu của sợi đơn sẽ tự bắt cặp (F1/F1c, B1/B1c) để tạo ra cấu trúc thòng lọng (hình 2.4A); (ii) Tạo sản phẩm

LAMP cuối cùng: trên khuôn được tạo ra ở bước trên, 2 mồi FIP và BIP sẽ

tham gia tổng hợp DNA và tạo ra một hỗn hợp các sản phẩm tổng hợp cuối cùng có kích thước khác nhau (hình 2.4.B) Phương pháp này cho hiệu quả nhân gen cao với lượng DNA được khuếch đại đến 109 - 1010 lần trong thời gian

từ 15 - 60 phút (Tomita et al., 2008)

Hình 2.4 Sơ đồ nguyên lý phản ứng LAMP-PCR

Nguồn: Tomita et al (2008)

Do tính đặc hiệu và độ nhạy rất cao đồng thời không quá đắt nên kỹ thuật LAMP đã được phát triển rất mạnh trong những năm gần đây, chủ yếu cho mục

đích chẩn đoán nhiều bệnh trên người, động vật cũng như thực vật (Parida et al., 2008; Mori and Notomi, 2009; Gandelman et al., 2011; Dhama et al., 2014; Saharan et al., 2014; Kinoshita et al., 2015; Niessen, 2015; Okuda et al., 2015; Palacio-Bielsa et al., 2015)

Tương tự, kỹ thuật LAMP-PCR cũng được phát triển và ứng dụng trong

chẩn đoán phytoplasma gây bệnh cây (Bekele et al., 2011; Obura et al., 2011; Yankey et al., 2011; Sugawara et al., 2012; Kogovšek et al., 2015)

2.2.10 Biện pháp phòng chống

Phương pháp truyền thống sử dụng thuốc hóa học để phòng trừ côn trùng

môi giới được xem là chưa đủ để quản lý bệnh do phytoplasma gây ra (Wally et

al., 2004; Weintraub and Beanland, 2006) Sử dụng lưới chống côn trùng bao

phủ toàn bộ cây là biện pháp hữu hiệu nhất Tuy nhiên, biện pháp này không khả

thi đối với những phạm vi rộng lớn (Walsh et al., 2006; Weintraub, 2007)

Bressan and Purcell (2005) tiến hành phun hoạt chất kích kháng thực vật

(tên gọi là benzothiadiazole) lên cây Arabidopsis thaliana trước khi nhiễm bệnh

X đã làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh Nghiên cứu của Weintraub (2007) cho biết, phòng chống côn trùng môi giới bằng việc sử dụng hợp chất carbohydrate có khả năng kết hợp với lectin thực vật và có thể hạn chế sự chích hút của côn trùng môi giới vào mô thực vật Các chất kháng sinh, các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc hữu cơ và vô cơ được sử dụng để phòng chống bệnh phytoplasma hại cây trồng

Tuy nhiên, biện pháp này mới chỉ áp dụng trong điều kiện in vitro trong phòng thí nghiệm và chậu vại (Hayat et al., 2010)

Trong những năm gần đây, sử dụng nấm ký sinh vùng rễ (arbuscular mycorrhiza, AM) nhằm tăng cường khả năng sức đề kháng của cây với bệnh phytoplasma cũng đã được áp dụng trên nhiều loại cây trồng Ví dụ, sử dụng loài

nấm Glomus intraradices, nấm Epicoccum nigrum có tác dụng tăng khả năng

chống chịu đối với bệnh vàng lá cà chua do phytoplasma thuộc nhóm 16SrXII

gây ra (Lingua et al., 2002), bệnh vàng lá cây dừa cạn do „Ca Phytoplasma asteris‟ thuộc nhóm 16SrI gây ra (Kaminska et al., 2010), và bệnh chết lụi cây lê

do „Ca Phytoplasma mali‟ gây ra (Musetti et al., 2011)