Bộ câu hỏi Đề thi đáp án thi học sinh giỏi thành phố môn Sinh học lớp 12

29. Nguyên tắc cơ bản của việc phân tích đối ngẫu, sắc ký lỏng cao áp. 1. Phân tích đối ngẫu (Heteroduplex Analysis) 2 sản phẩm khuyếch đại PCR được trộn với nhau với một lượng tương đương, biến tính ở 95°C và sau đó làm lạnh Trong suốt quá trình làm lạnh, những chuỗi đơn được gắn lại để hình thành những DNA đối ngẫu ........ 30. Các kiểu biến động DNA mà có thể thăm dò được bằng chỉ thị sequencing, EST và SNP.  DNA sequencing cho phép thăm dò các biến động ở mức độ nucleotide  ESTs là công cụ có hiệu lực để thăm dò sự đa hình trong những vùng coding; Phương pháp này có hiệu quả cực kỳ cao trong việc tìm ra gene mới. Chúng có thể được dùng để xác định phiên bản gene, là công cụ để khám phá gene và xác định trình tự gene ...... 2. Biến động di truyền là gì? Biến động di truyền được xác định như thế nào? Biến động di truyền là những sự biến đổi ngẫu nhiên vô hướng về tần số allele và các kiểu gen trong tất cả các quần thể, nhưng đặc biệt là ở các quần thể nhỏ và không cần có sự chọn lọc tự nhiên. Biến động di truyền xảy ra thuần túy ngẫu nhiên, mang tính xác suất và tỷ lệ nghịch với kích thước quần thể. Trong một quần thể lớn, thông thường biến động di truyền chỉ gây ra một sự thay đổi ngẫu nhiên nhỏ. Nhưng trong các quần thể nhỏ, nó có thể gây ra những sự biến động lớn về tần số allele qua các thế hệ khác nhau. Chính hiện tượng này là nguyên nhân tạo nên sự khác biệt đa dạng về mặt di truyền ở các quần thể nhỏ và dần dần dẫn tới sự cách ly sinh sản trong quá trình tiến hóa của loài. Và sự biến động di truyền có thể là nguyên nhân làm cho mức dị hợp tử thấp quan sát được ở một số loài có nguy cơ bị diệt vong Biến động di truyền được xác định như thế nào? Để xác định được biến động di truyền trong quần thể, các thí nghiệm cần bố trí hợp lý về vị trí và số lượng cá thể thu thập. Phương pháp nghiên cứu có thể áp dụng là thăm dò mức độ biến động, đa hình mức độ DNA như các kỹ thuật RAPDs (đánh giá tính đa hình của các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên), RFLPs (đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzyme hạn chế), AFLP (RFLP + PCR nhằm tăng độ nhạy truy tìm dấu vết biến đổi DNA), Microsatellite (kỹ thuật giúp phát hiện các đột biến, biến đổi bên trong các đoạn DNA siêu vệ tinh). Hoặc áp dụng kỹ thuật isozymes giúp phát hiện biến đổi trong các locus mã hóa cho 1 loại enzyme bất kỳ, tính toán thống kê, khoảng cách di truyền, để thiết lập bản đồ di truyền, đánh giá biến động di truyền trong quần thể. 3. Các kiểu chỉ thị di truyền? Ưu điểm và nhược điểm chính của các kiểu chỉ thị này? 3.1. Những đặc điểm hình thái Về mặt truyền thống, sự đa dạng bên trong hoặc giữa các quần thể được xác định bằng sự đánh giá sự khác biệt về mặt hình thái. Sự đánh giá này có ưu điểm là có sẵn, không đòi hỏi những dụng cụ phức tạp và là phương pháp xác định trực tiếp dựa vào kiểu hình. Tuy nhiên việc xác định hình thái cần phải có các chuyên gia về loài, chúng lại ảnh hưởng bởi những thay đổi của các điều kiện môi trường, và có thể biến động qua các giai đoạn khác nhau và số lượng của chúng cũng bị giơíi hạn. 3.2. Chỉ thị sinh hoá (protein) Để khắc phục những giới hạn của phương pháp phân tích hình thái, một số chỉ thị khác vừa mới được phát triển dựa vào cả 2 mức độ, mức đọ protein (kiểu hình) và mức độ DNA (kiểu gene). Chỉ thị protein thường được gọi là ‘chỉ thị” sinh hoá, và chúng thường được xếp sai vào nhóm của các “chỉ thị phân tử”. Chỉ thị protein (những protein dự trữ trong hạt và isozymes) được tạo ra thông qua quá trình điện di, nhờ vào đặc tính di chuyển của protein và enzymes và được biểu lộ bằng thuốc nhuộm đặc biệt đối với protein được phân tích. Việc thăm dò sự đa hình, những khác biệt có thể thăm dò được ở chỉ thị đưa ra xảy ra bên trong các cá thể, trong những chỉ thị prtein là một kỹ thuật mà chia sẽ một vài ưu điểm của việc sử dụng chỉ thị hình thái. Tuy nhiên, chỉ thị protein là cũng bị giới hạn do bị ảnh hưởng bởi những điều kiện môi trường và những thay đổi trong những giai đoạn phát triển khác nhau. Mặc dù vậy isozyme là một phương pháp hổ trợ thô cho sự phận tích những biến động hình thái đơn giản. 3.3. Chỉ thị phân tử Sự đa hình có thể được thăm dò bên trong DNA của nhân hoặc của các bào quan, mà được tìm thấy có ở trong ti thể và lạp thể. Chỉ thị phân tử nói đến chính phân tử DNA và vì vậy mà được coi như là một phương pháp đo lường các biến dị một cách khách quan. Chúng không phụ thuộc vào những ảnh hưởng của môi trường, việc đánh giá có thể được thực hiện ở bất kỳ thời điểm nào trong quá trình phát triển của thực vật và hơn tất cả đó là chũng có tiềm năng cho một sự tồn tại không giới hạn về mặt số lượng, bao phủ toàn bộ bộ gen. Ưu điểm – Không phụ thuộc vào những ảnh hưởng của môi trường – Khả năng không bị giới hạn về số lượng – Đánh giá khách quan các biến dị Nhược điểm chính là cần những phương tiện kỹ thuật tương đối phức tạp

Trường THPT chuyên Nguyễn Huệ

Bộ môn Sinh học

Bộ câu hỏi ôn thi học sinh giỏi thành phố môn Sinh học.

(Lưu hành nội bộ)

CHỈ THỊ PHÂN TỬ

1 Đa dạng di truyền là gì?

Đa dạng di truyền ý nói đến sự biến động của những gene bên trong loài, đó là những biến dị cóthể thừa kế bên trong hoặc giữa những quần thể của các cá thể Kết quả là tất cả những biến dị ở lạibên trong chuỗi 4 base pairs mà bao gồm phân tử DNA và như vậy tạo thành code di truyền Nhữngkiểu đa dạng di truyền khác cũng có thể được xác định ở tất cả các mức độ của cơ thể trong nhân,bao gồm lượng DNA trên tế bào, số lượng chromosome và cấu trúc DNA

Các thế hệ của biến dị di truyền mới xảy ra liên tục trong những cá thể thông qua những độtbiến nhiễm sắc thể và đột biến gene, mà trong các cá thể sinh sản hữu tính được nhân giống thôngqua sự tái tổ hợp Biến dị di truyền cũng bị ảnh hưởng bởi sự chọn lọc Kết quả của những hiệntượng này là những thay đổi trong gene và allele mà liên quan đến sự tiến hoá quần thể Những trạngthái tương tự có thể xảy ra thông qua chọn lọc nhân tạo như là việc nuôi dưỡng rèn luyện

2 Biến động di truyền là gì? Biến động di truyền được xác định như thế nào?

Biến động di truyền là những sự biến đổi ngẫu nhiên vô hướng về tần số allele và các kiểu gentrong tất cả các quần thể, nhưng đặc biệt là ở các quần thể nhỏ và không cần có sự chọn lọc tự nhiên.Biến động di truyền xảy ra thuần túy ngẫu nhiên, mang tính xác suất và tỷ lệ nghịch với kíchthước quần thể Trong một quần thể lớn, thông thường biến động di truyền chỉ gây ra một sự thay đổingẫu nhiên nhỏ Nhưng trong các quần thể nhỏ, nó có thể gây ra những sự biến động lớn về tần sốallele qua các thế hệ khác nhau Chính hiện tượng này là nguyên nhân tạo nên sự khác biệt đa dạng

về mặt di truyền ở các quần thể nhỏ và dần dần dẫn tới sự cách ly sinh sản trong quá trình tiến hóacủa loài Và sự biến động di truyền có thể là nguyên nhân làm cho mức dị hợp tử thấp quan sát được

ở một số loài có nguy cơ bị diệt vong

Biến động di truyền được xác định như thế nào?

Để xác định được biến động di truyền trong quần thể, các thí nghiệm cần bố trí hợp lý về vị trí

và số lượng cá thể thu thập

Phương pháp nghiên cứu có thể áp dụng là thăm dò mức độ biến động, đa hình mức độ DNAnhư các kỹ thuật RAPDs (đánh giá tính đa hình của các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên),RFLPs (đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzyme hạn chế), AFLP(RFLP + PCR nhằm tăng độ nhạy truy tìm dấu vết biến đổi DNA), Microsatellite (kỹ thuật giúp pháthiện các đột biến, biến đổi bên trong các đoạn DNA siêu vệ tinh) Hoặc áp dụng kỹ thuật isozymesgiúp phát hiện biến đổi trong các locus mã hóa cho 1 loại enzyme bất kỳ, tính toán thống kê, khoảngcách di truyền, để thiết lập bản đồ di truyền, đánh giá biến động di truyền trong quần thể

3 Các kiểu chỉ thị di truyền? Ưu điểm và nhược điểm chính của các kiểu chỉ thị này?

3.1 Những đặc điểm hình thái

Về mặt truyền thống, sự đa dạng bên trong hoặc giữa các quần thể được xác định bằng sự đánhgiá sự khác biệt về mặt hình thái Sự đánh giá này có ưu điểm là có sẵn, không đòi hỏi những dụng

cụ phức tạp và là phương pháp xác định trực tiếp dựa vào kiểu hình Tuy nhiên việc xác định hìnhthái cần phải có các chuyên gia về loài, chúng lại ảnh hưởng bởi những thay đổi của các điều kiệnmôi trường, và có thể biến động qua các giai đoạn khác nhau và số lượng của chúng cũng bị giơíihạn

3.2 Chỉ thị sinh hoá (protein)

Để khắc phục những giới hạn của phương pháp phân tích hình thái, một số chỉ thị khác vừa mớiđược phát triển dựa vào cả 2 mức độ, mức đọ protein (kiểu hình) và mức độ DNA (kiểu gene) Chỉthị protein thường được gọi là ‘chỉ thị” sinh hoá, và chúng thường được xếp sai vào nhóm của các

“chỉ thị phân tử”

Chỉ thị protein (những protein dự trữ trong hạt và isozymes) được tạo ra thông qua quá trìnhđiện di, nhờ vào đặc tính di chuyển của protein và enzymes và được biểu lộ bằng thuốc nhuộm đặcbiệt đối với protein được phân tích

Việc thăm dò sự đa hình, những khác biệt có thể thăm dò được ở chỉ thị đưa ra xảy ra bên trongcác cá thể, trong những chỉ thị prtein là một kỹ thuật mà chia sẽ một vài ưu điểm của việc sử dụngchỉ thị hình thái Tuy nhiên, chỉ thị protein là cũng bị giới hạn do bị ảnh hưởng bởi những điều kiệnmôi trường và những thay đổi trong những giai đoạn phát triển khác nhau Mặc dù vậy isozyme làmột phương pháp hổ trợ thô cho sự phận tích những biến động hình thái đơn giản

3.3 Chỉ thị phân tử

Sự đa hình có thể được thăm dò bên trong DNA của nhân hoặc của các bào quan, mà được tìmthấy có ở trong ti thể và lạp thể Chỉ thị phân tử nói đến chính phân tử DNA và vì vậy mà được coinhư là một phương pháp đo lường các biến dị một cách khách quan Chúng không phụ thuộc vàonhững ảnh hưởng của môi trường, việc đánh giá có thể được thực hiện ở bất kỳ thời điểm nào trongquá trình phát triển của thực vật và hơn tất cả đó là chũng có tiềm năng cho một sự tồn tại không giớihạn về mặt số lượng, bao phủ toàn bộ bộ gen

Ưu điểm

–Không phụ thuộc vào những ảnh hưởng của môi trường

–Khả năng không bị giới hạn về số lượng

–Đánh giá khách quan các biến dị

Nhược điểm chính là cần những phương tiện kỹ thuật tương đối phức tạp

4 Tiêu chuẩn của một chỉ thị phân tử là gì?

- Đa hình cao: nó biến động bên trong các cá thể Mức độ đa hình được thăm dò phụ thuộc vào

kỹ thuật dùng để đánh giá nó

- Có thể lặp lại được: Có thể tạo ra chỉ thị này ở bất kỳ phòng thí nghiệm nào, có nghĩa là nó có

thể dùng để đánh giá trong nhiều phòng thí nghiệm khác nhau

- Đồng ưu thế (đồng trội): Phụ thuộc vào kiểu áp dụng, kỹ thuật được chọn lọc phải có thể thăm

dò các dạng khác nhau của marker, phân biệt giữa đồng hợp tử, dị hợp tử (đồng kế thừa) Một cá thể

dị hợp cho thấy đồng thời kiểu gene kết hợp của hai bố mẹ đồng hợp tử

- Được phân bố một cách đều đặn qua toàn bộ bộ gene Sự bao phủ trên toàn bộ gene càng dày

đặc và càng rãi rác thì việc đánh giá sự đa hình càng tốt hơn

- Sự biểu lộ rõ, nghĩa là có thể thăm dò sự khác biệt giữa các cá thể có quan hệ họ hàng gần gũi.

- Không phụ thuộc vào những ảnh hưởng môi trường Tính chính xác của một kiểu gene của

một marker nên không phụ thuộc vào môi trường mà cơ thể đó sống hay giai đoạn phát triển của nó

- Tính trung tính Allele hiện diện ở vị trí marker là không phụ thuộc hay không có ảnh hưởng

bởi áp lực chọn lọc tác động lên cá thể Đây chỉ là một giả thiết vì chưa có dữ liệu nào có sẵn để xácminh hoạc phản kháng đặc tính này

- Không đắt Dễ, nhanh và rẽ trong việc thăm dò qua nhiều cá thể Nếu có thể, những phương

tiên nên có khả năng sử dụng đa mục đích trong thí nghiệm

5 Protein ? Enzyme?

1 Protein:

- Protein là hợp chất hữu cơ có ý nghĩa quan trọng bậc nhất trong cơ thể sống Về mặt số lượng,

nó chiếm không dưới 50% trọng lượng khô của tế bào Về thành phần cấu trúc, protein được tạothành chủ yếu từ các amino acid qua liên kết peptide Cho đến nay người ta đã thu được nhiềuloại protein ở dạng sạch cao có thể kết tinh được và đã xác định được thành phần các nguyên tốhoá học, thông thường trong cấu trúc của chúng  gồm bốn nguyên tố chính là C H O N với tỷ lệ C

 50%, H  7%, O  23% và N  16%

- Protein tham gia mọi hoạt động sống trong cơ thể sinh vật, từ việc tham gia xây dưng tế bào,

mô, đến tham gia hoạt động xúc tác và nhiều chức năng khác

- Cùng với acid nucleic, protein là cơ sở vật chất của sự sống

2 Enzyme:

Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hoá học, là chất xúc tácsinh học có ý nghĩa đặc biệt quan trọng

6 Cấu trúc của protein liên quan đến chức năng của chúng?

- Có khoảng 20 loại a.a, chúng liên kết với nhau = lk peptide

- Lk peptide là sự kết hợp giữa nhóm amine của 1 a.a với nhóm cacboxyl của a.a

kế tiếp (H2N-CH(R)-COOH) Peptide là phức hợp gồm 2 ->c30a.a nếu dài hơn gọi là olypeptide

- Bản chất gốc R khác nhau sẽ tạo nên những nhóm P, a.a khác nhau Căn cứ vào đó ta chia a.athành 4 nhóm

+Nhóm kiềm, nhóm acid, nhóm trung tính kị nước ko mang điện tíc, nhóm trung tính ưa nướcmang tính phân cực

- Nhóm NH2 và COOH: Là 2 nhóm rất q.trọng vì chúng phân li trong nước làm cho các acidamin trở thành ion trái dấu NH3+ và COO-

- Tất cả các chuỗi polypeptide đều có 2 amino acid ở 2 đầu tận cùng, 1 đính vào nhóm amin, cònđầu kia đính nhóm COOH tự do và đc tổng hợp từ trái sang phải, bắt đầu từ acid amin chứa đầuamin (N )và kết thúc là acid amin chứa đầu cacboxyl (C)

- Các P khác nhau có trình tự và thành phần các amino acid khác nhau, trình tự và thành phần cácacid amin quyết định tính chất và chất lượng Protein

- Trong cơ thể, protein đảm nhận nhiều chức năng quan trọng như cấu trúc, vận chuyển, dự trữ,xúc tác, điều hòa trao đổi chất, miễn dịch…

* Tính chất của P phụ thuộc vào: trình tự, số acid amin và số chuỗi polypeptide phản ánh mức độphức tạp và chức năng của P Cấu trúc không gian do mức độ cuộn xoắn các chuỗi polypeptide

* Cấu trúc P

- Cấu trúc b1 Là trình tự sắp xếp của các a.a trong chuỗi polypeptidetừ 20 loại acid amin khácnhau Các a.a đều có 3 nhóm gốc giống nhau là amin(-NH2), cacboxyl (COOH) và hydro(-H) còngốc R thì khác nhau do đó quy định Tính chất khác biệt giữa các a.a

->Cấu trúc b1 quy định tính đặc thù và cấu hình không gian của pt P Nếu chuỗi polypeptide bịmất, thêm or thay đổi trình tự dù chỉ 1 a.a cũng có thể dẫn đến sự thay đổi tính đặc thù và tínhchất của phân tử protein

- Cấu trúc b2: Là sự uốn các phần của từng chuỗi polypeptide thành Cấu trúc đều đặn trongkhông gian theo kiểu dạng xoắn α hay phiến gấp nếp β Lk H đóng vai trò tạo nên Cấu trúc b2 -> Ảnh hg đến hoạt tính và chức năng của P Là dạng trung gian chuyển tiếp để pt P hình thànhnên Cấu trúc b3 phức tạp hơn

-Cấu trúc b3: Đc hình thành do các chuỗi polypeptide cuộn xoắn hay gấp khúc tạo nên pt có cấuhình không gian 3 chiều, cấu hình không gian của P Cấu trúc không gian đc tạo nên bởi các lkyếu như lk ion, lk kỵ nc hoặc lk disulphite giữa 2 a.a chứa S

-> Cấu hình không gian quy định hoạt tính chức năng của P

-Cấu trúc b4: đc hình thành do 2 or nhiều chuỗi polypeptide thành phần tg tác với nhau tạo nên ->Ảnh hưởng đến chức năng của P

6 Nêu các yếu tố ảnh hưởng đến PCR? Nó ảnh hưởng như thế nào?

 Trình tự của primer:

Trình tự primer có khoảng 50% GC để tăng khả năng gắn mồi Tránh GC ở đầu 3’ của primer

vì nó có thể làm tăng cơ hội tạo hiện tượng primer-dimers Tránh chọn các vùng có trình tự tươngđồng để hạn chế primer gắn với nhau

 Nhiệt độ của quá trình ủ:

Nhiệt độ ủ thích hợp là nhiệt độ mà ở đó 1/2 primer sẽ gắn với DNA khuôn mẫu Số base củaprimer càng ít thì nhiệt độ ủ càng thấp và ngược lại

T¬a = 4(G+C) + 2(A+T) - 5oC

 Enzyme Taq pol

Nếu nồng độ E quá cao có thể xuất hiện các sản phẩm PCR không đặc hiệu và làm sai kết quả.Nếu nồng độ quá thấp sẽ không đủ lượng E để xúc tác tạo sản phẩm mong muốn

 Đệm ổn định hoạt động của Taq pol.

 Nồng độ các primer

Sử dụng nồng độ primer cao không cần thiết và thường tạo ra bất lợi vì quá thừa primer sẽ cóhiện tượng primer-dimers và hiện tượng gắn primer nhầm vị trí trên khuôn mẫu

 Nồng độ DNA khuôn mẫu

Nếu các chất trong thành phần phản ứng có nồng độ cao trong khi DNA khuôn có nồng độ thấpthì giai đoạn sàng lọc của PCR sẻ trở nên khó khăn vì tần suất DNA và primer gặp nhau giảm rõ rệt

 Tỷ lệ giữa primer và DNA khuôn

Nếu tỉ lệ quá cao sẽ gây hiện tượng primer-dimers, nếu tỷ lệ này quá thấp thì sản phẩm k nhiều

 Khởi động nóng PCR

Làm tăng khả năng bắt cặp của primer và DNA khuôn, giúp thu đc sp sạch hơn

7 Cơ sở của phản ứng chuỗi polymerase (PCR)?

PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinhhọc hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến

vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southernblot

PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại invitro các nucleic acid đặc trưng PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần cácđoạn DNA có chiều dài từ 200-3000 bp Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận diệnnhờ cặp primer đặc trưng (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide

8 Các kiểu DNA?

- Tổ chức trình tự DNA: DNA của các sinh vật nhân thật có thể được chia thành những kiểukhác nhau và những nhóm khác nhau:

–Gene code protein phiên bản đơn

–Sự hiện diện DNA trong đa phiên bản

+Những trình tự với những chức năng được biết:

–Coding

+Những trình tự với chức năng không được biết:

–Lặp lại (tản mạn hay theo thứ tự)

–Transposons (gene nhảy)

–DNA spacer (vùng đệm)

Nhiều đoạn lặp lại được tìm thấy trong DNA spacer Chúng bao gồm cùng một trình tự đượctìm thấy ở nhiều vị trí, đặc biệt là ở centromere và ở telomere Những lặp lại thay đổi về kích cỡ, sốlượng và sự phân bố trên toàn bộ gene, làm cho chúng có thể được dùng làm những chỉ thị phân tử

- Các loại DNA:

Xét về cấu trúc:

B-DNA

 Cuộn xoắn tạo thành NST

 Xoắn phải đối song song, 10 cặp base mỗi vòng xoắn; mã hóa cho các protein trong tếbào; tiến hành sao chép, phiên mã dịch mã, trong đó sao chép là bước đầu tiên và cầnthiết cho quá trình phân bào

A-DNA

 Cũng là chuỗi xoắn phải nhưng có nhiều cặp base trong 1 vòng xoắn hơn B-DNA (11)

 Ít được tìm thấy, hầu như chỉ được tổng hợp trong phòng thí nghiệm

Z-DNA

 Xoắn trái, hình dạng zíc-zắc

 Có 12 cặp base mỗi vòng xoắn nên mang nhiều gen hơn

 Đóng vai trò trong quá trình phiên mã RNA, tạo mRNA từ chuỗi DNA

cDNA (complementary or clonal DNA) là dạng DNA dùng tạo nên thư viện thông tin di truyền

Là một sợ DNA bổ sung với mạch DNA gốc, ứng dụng trong các thí nghiệm kiểm tra tính đặchiệu thuốc…

DNA bào quan (Cytoplasmatic DNA)

–Chloroplast DNA (cpDNA)

–Mitochondrial DNA (mtDNA)

Một lượng nhỏ DNA được tìm thấy trong cytoplasm bên ngoài nhân- trong lạp thể (chloroplastDNA ký hiệu là cpDNA) và ti thể (mitochondrial DNA kí hiệu là mtDNA) Lạp thể và ti thể có sợisắc thể riêng của nó cùng với một vài phiên bản Những gene này cũng qui định cho sự dịch mã vàsao mã riêng các cấu thành của các bào quan, và đóng vai trò chuyên biệt cao trong biểu hiện kiểuhình của cơ thể

Điểm đặc trưng của cytoplasmatic DNA:

–Tính kế thừa DNA bào quan là thường (nhưng không luôn luôn) di truyền thông qua mẹ, mộtmẫu hình của sự thừa kế qua mẹ

–Sự khác biệt trong tốc độ tiến hoá (trật tự của gene thông qua trình tự các nucleotide)

–Tích luỹ chậm các đột biến

Nguyên nhân tại sao sự tích luỹ các đột biến là chậm là chưa được giải thích rõ ràng, nhưng có

lẽ đó là kết qủa của sự hiện diện của cả việc sửa chữa có hiệu quả cao các thiệt hại trên DNA hay cảmột hệ thống tái tạo DNA lỗi tự do

9 Những nét chính của DNA tế bào chất (cytoplasmic DNA)?

Tế bào chất không chỉ là môi trường hoạt động của hệ gen trong nhân mà trong đó còn cónhững bào quan cũng chứa những gen gọi là gen ngoài nhân hay gen ngoài nhiễm sắc thể

Gen ngoài nhiễm sắc thể có trong lạp thể, ti thể, các plasmit ở vi khuẩn là những bào quan cókhả năng tự nhân đôi Bản chất của gen ngoài nhân cũng là DNA

Lượng DNA trong tế bào chất ít hơn nhiều so với lượng DNA trong nhân, hàm lượng không ổnđịnh, phụ thuộc vào trạng thái hoạt động sinh lý của tế bào.DNA ngoài NST có cấu trúc xoắn kép,trần, dạng vòng Ví dụ, DNA của lạp thể ở tế bào thực vật có dạng vòng giống DNA của một số vikhuẩn và virut DNA plasmit ở vi khuẩn là những phân tử nhỏ dạng vòng, chứa các gen kháng thuốc,bền vững với các ion kim loại và có vai trò quan trọng trong kĩ thuật di truyền.

Bộ mã di truyền cũng có nhiều điểm khác với bộ mã di truyền trong nhân, gen ngoài NST cũng

có khả năng tự nhân đôi, nhưng sự nhân đôi không thật sự chính xác như gen nhân

Các đặc điểm cơ bản của di truyền tế bào chất

- Lai thuận lai nghịch kết quả biểu hiện kiểu hình ở đời con thay đổi

- Di truyền qua tế bào chất vai trò chủ yếu thuộc về tế bào chất của tế bào sinh dục cái

- Các tính trạng di truyền qua tế bào chất được truyền theo dòng mẹ (nhưng không nhất thiếtmọi đặc điểm di truyền theo mẹ đều liên quan tới các gen trong tế bào chất vì còn những nguyênnhân khác)

- Các tính trạng di truyền qua tế bào chất không tuân theo các định luật của thuyết di truyền quanhiễm sắc thể vì khi phân bào thì tế bào chất không được chia đều cho 2 tế bào con một cách chínhxác như các nhiễm sắc thể

- Tóm lại, trong sự di truyền, nhân có vai trò chính nhưng tế bào chất cũng có vai trò nhất định.Trong tế bào có 2 hệ thống di truyền: di truyền qua nhiễm sắc thể và di truyền ngoài nhiễm sắc thểtác động qua lại lẫn nhau đảm bảo cho sự tồn tại sinh trưởng, phát triển của cơ thể

10 Enzyme cắt hạn chế là gì?

Trong tự nhiên, các enzyme hạn chế hiện diện trong hầu hết các tế bào vi khuẩn để ngăn cảnDNA ngoại lai tiếp quản bộ máy tổng hợp protein của tế bào DNA của chính chúng sẽ được bảo vệkhỏi tác dụng của enzyme hạn chế do sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa(methylation) các nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không nhận biết bởi các enzyme hạnchế Enzyme hạn chế có khả năng nhận biết những đoạn DNA có trình tự nucleotide xác định, bámvào đoạn DNA đó và cắt cả hai sợi của DNA vào giữa nucleotide đối xứng nhau tại điểm cắt

Các enzyme hạn chế có ba loại (type): I, II và III Các enzyme được dùng phổ biến hiện naythuộc type II, có cơ chế tác động đơn giản nhất Đây là các nuclease cắt ở một vị trí đặc hiệu nằm bêntrong sợi DNA (chứ không phân hủy DNA từ hai đầu), nên được gọi là endonuclease Tên gọi đầy đủcủa chúng là các restriction endonuclease type II, hay được gọi đơn giản là enzyme hạn chế(restriction enzyme, RE).Mỗi enzyme cắt hạn chế cắt phân tử DNA thành những đoạn xác định bằngcách hoạt động tại các trình tự đặc trưng Các enzyme hạn chế cắt các phân tử DNA sợi đôi theo haicách khác nhau:

+Cắt trên một đường thẳng đối xứng để tạo ra các phân tử đầu bằng

+Cắt trên những vị trí nằm đối xứng quanh một đường thẳng đối xứng để tạo ra những phân tửđầu so le (đầu kết dính).

Bởi vì các đặc tính của chúng mà tất cả những kiểu enzyme này trở thành cốt yếu cho kỹ thuậtDNA tái tổ hợp Enzyme hạn chế có bán sẵn trên thị trường và thường được cung cấp với thông tin

11 Thế nào là đa hình trong chuỗi DNA?

Vô số những khác biệt lớn và nhỏ trong chuỗi nucleotide giữa các cá thể được gọi là đa hìnhDNA Hai loại cơ bản khác nhau của tính đa hình đã được khai thác rộng rãi cho DNA gồm: lặp đilặp lại song song và đa hình độ dài đoạn hạn chế

Nhiều sự kiện có thể gia tăng các biến dị trong chuỗi DNA Những biến dị như thế thườngđược mô tả như những thể đa hình Sự đa hình có thể hiểu như những khác biệt trong kiểu gene-như được chứng tỏ trong sự đa dạng của đặc điểm của band khi được thăm dò với một qui trìnhthích hợp,-và có thể đa dạng kiểu hình

Một số trường hợp có thể tạo ra sự đa hình:

- Đột biến điểm (point mutations): Đột biến điểm xảy ra khi một base trong chuỗi DNAđược thay thế bởi một base khác Chiều dài của chuỗi DNA là không thay đổi

- Chèn đoạn hoặc mất đoạn (insertions & deletions): Chèn đoạn hoặc mất đoạn là sự thêmvào hoặc biến mất một vài base trong trình tự DNA Độ dài của phân tử DNA vì thế mà thay đổi

- Sắp xếp lại (rearrangements): Sự thay đổi trong trình tự DNA có thể xảy ra thông qua sựsắp xếp lại vì thế các đoạn bị đảo lộn Trong trường hợp như thế, độ dài phân tử có thể thay đổihoặc không Sự thay đổi như thế có thể xem như là một sự đa hình

12 Phân biệt allozyme và isozyme?

Isoenzym là những dạng khác nhau của một enzyme có cùng hoạt tính cơ chất đặc hiệu nhưnglại khác nhau về phương diện di truyền tức là khác nhau về cấu trúc bậc một và do các locus genekhác nhau mã hóa trình tự Còn allozyme lại là các dạng khác nhau của một isoenzym do chỉ mộtlocus gene xác định

13 Những bước tiến hành chính của kỹ thuật izozyme?

Gồm 4 bước:

 xử lý nguyên liệu:

 nghiền nát mẫu bằng chày

 lọc lấy dịch chiết

 load mẫu vào gel

 điện di trên gel tinh bột hay acrylamine:

 thêm dung dịch đệm

 gắn dòng điện vào hệ thống, chạy trong 1h

 nhuộm mô hóa học:

 cắt lớp gel theo cùng chiều và chuyển lên các khay nhuộm

 nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm tùy mỗi loại enzyme

 phân tích kết quả điện di

14 Những điểm chính cần quan tâm để dịch mã mẫu hình các band.

Những vấn đề chính là:

- Cấu trúc bậc 4 của enzymes (kể cả monomeric, dimeric…)

- Cây nghiên cứu là đồng hợp tử hay dị hợp tử ở tại mỗi locus của gene

- Số loci của gene

- Số allele trên một locus

- Có bao nhiêu gene được di truyền lại?

+ Allozymes được điều khiển bởi những allele đồng trội có nghĩa là đồng hợp tử, có thể đượcphân biệt với dị hợp tử

+ Đối với các enzyme monomeric (bao gồm 1 polypeptide đơn), những cây đồng hợp tử đối với

1 locus sẽ cho 1 band, trong khi cá thể dị hợp tử sẽ tạo ra 2 bands

+ Đối với các enzyme dimeric (bao gồm 2 polypeptide), cây đồng hợp tử đối với 1 locus sẽ cho

ra 1 band, trong khi cây dị hợp sẽ cho 3 bands do sự liên kết ngẫu nhiên giữa các polypeptides

+ Những enzymes multimeric cũng tồn tại, nơi mà những polypeptides được đặc trưng bởinhững loci khác nhau Những thông tin về cấu trúc enzyme (isozymic heteromers) có thể làm phứctạp thêm mẫu hình của các band

+ Những sự phức tạp này và tầm quan trọng của việc dịch đúng mẫu hình các bands càng làmcho việc phân tích di truyền có kết quả đúng như mong đợi

15 Ưu điểm và nhược điểm của chỉ thị di truyền izozyme trong nghiên cứu đa dạng.

Ưu điểm:

- Là phương pháp thô và có thể lặp lại được

- Đồng trội nên thích hợp cho việc đánh giá trên một khoảng rộng để đo di truyền quần thể vàcho việc lập bản đồ gene

- Có khoảng 90 enzymes được dùng đối với thực vật với vị trí isozymes được lập bản đồ trongnhiều trường hợp

Nhược điểm:

- Có tương đối ít các phép phân tích là có sẵn để thăm dò enzymes Giới hạn chính của phântích isozymes là có ít marker được cung cấp vì số lượng phép phân tích sinh hoá có sẵn để thăm dòchúng là quá nhỏ Kết quả là tỉ lệ phần trăm những thông tin đưa ra là không đủ cho những nghiêncứu đa dạng di truyền

- Phân tích dựa vào kiểu hình Vì vậy có thể bị ảnh hưởng bới điều kiện môi trường do đó sẽ cónhững biểu hiện làm sai lệch kết quả Bởi vì những biểu hiện khác nhau của gene có thể xảy ra ởnhững giai đoạn phát triển khác nhau, hoặc trong những mô khác nhau, cùng một nguyên liệu phảiđược dùng cho tất cả các thí nghiệm

16 Những nét chính của kỹ thuật RADP?

Bước 1: Tách chiết DNA:

DNA được tách chiết có chất lượng tốt (tương đối sạch và không bị gãy nhiều) Thông thườngquy trình ly trích DNA ở thực vật gồm 3 giai đoạn:

• Giai đoạn 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân

Tế bào lá được nghiền với dịch trích EB (extraction buffer) để phá vỡ màng tế bào, giải phóngcác thành phần có trong tế bào ra ngoài môi trường dịch trích

• Giai đoạn 2: Làm biến tính protein, loại bỏ protein và các thành phần hữu cơ khác(polysaccharides, polyphenols, lipids,…)

• Giai đoạn 3: Tủa DNA bằng isopropanol hay ethanol 100 %, thường tủa bằng isopropanollạnh trước, sau đó tiếp tục tủa bằng ethanol 100 % kết hợp với muối

Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA:

 DNA bị phân hủy hoặc bị gãy

 Có RNA trong mẫu DNA

 Có polysaccharide trong mẫu DNA •

 Có polyphenol trong mẫu DNA

Bước 2:Thực hiện phản ứng PCR:

Phản ứng PCR được thực hiện với các primer ngắn, thiết lập điều kiện phản ứng nghiêm ngặt

để hạn chế tạo ra những sản phẩm không chính xác

 Hỗn hợp các chất cho phản ứng PCR

 Primer (10 base) được bán sẵn ở nhiều công ty

 MgCl2 (thêm) để gia tăng số lượng bands được khuyếch đại trong một phản ứng Tuy nhiêncần phải tính toán để tìm ra nồng độ thích hợp, tránh việc khuyếch đại những đoạn gene không đặchiệu

 Chu kỳ gắn kết primer được thực hiện ở nhiệt độ thấp (32 - 40°C)

Bước 3: Điện di phát hiện:

Kết quả PCR – RAPD được điện di trên gel agarose

Bước 4: Dùng kết quả điện di mã hoá và chạy trên chương trình NTSYS để phân tích đa dạng

di truyền giữa các chủng giống

Kết quả : Có được bảng hệ số đồng dạng di truyền và sơ đồ cây thông từ đó có thể biết đượcmức độ gần gũi giữa các loài

 Những nét chính

 Dùng một primer ngẫu nhiên ngắn (10 bases)

 Khuyếch đại một đoạn DNA chưa biết

 Các bước trong phòng thí nghiệm

 Phân lập DNA

 Phản ứng PCR với 1 primer

 Tách các phân đoạn DNA bằng điện di trên gel

 Quan sát các phân đoạn bằng nhuộm ethidium bromide

17 Nguyên nhân sự đa hình phân tử DNA mà có thể thăm dò bởi kỹ thuật RADP?

 Sự đa hình DNA trong các cá thể có thể là do:

 Lỗi trong quá trình ghép đôi ở các điểm gắn mồi

 Sự xuất hiện điểm primer mới

 Độ dài đoạn khuyếch đại giữa các điểm primer

18 Tiêu chuẩn để chọn lựa band RADP để phân tích đa dạng di truyền?

 Do bản chất của các chỉ thị RAPD, chỉ có sự hiện diện hay vắng mặt các bands riêngbiệt có thể được đánh giá Tiêu chuẩn để chọn lựa các bands:

 Khả năng lặp lại (reproducibility): cần để lặp lại các thí nghiệm

 Độ dày

 Kích cỡ

 Sự chia cách có thể quan sát được trong một quần thể lập bản đồ