NGHIÊN CỨU VI RÚT GÂY BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) NUÔI TẠI KHU VỰC ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ GIẢI PHÁP HẠN CHẾ SỰ LÂY LAN

Do đó, nghiên cứu này của chúng tôi nhằm khảo sát có hay không sự hiện diện chủng mang di truyền khác nhau của chủng IHHNV, để qua đó nhằm góp phần làm rõ thêm những thông tin về chủng I

BỘ NÔNG NGHIỆP

VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC THUỘC CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU VI RÚT GÂY BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ

CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)

NUÔI TẠI KHU VỰC ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ GIẢI PHÁP

HẠN CHẾ SỰ LÂY LAN

MÃ SỐ ĐỀ TÀI:

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II

Chủ nhiệm đề tài/dự án: ThS Cao Thành Trung

BỘ NÔNG NGHIỆP

VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC THUỘC CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU VI RÚT GÂY BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ

CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)

NUÔI TẠI KHU VỰC ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ GIẢI PHÁP

MỞ ĐẦU

Ngành nuôi trồng thủy sản có vai trò hết sức quan trọng trong việc phát triển nền kinh tế của đất nước Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có điều kiện tự nhiên rất thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm thủy sản Vài năm trở lại đây, các tỉnh trong khu vực này phát triển khá nhanh nghề nuôi tôm thủy sản Tuy nhiên, ngoài những giá trị kinh tế mang lại ngành nuôi tôm còn phải đối mặt với nhiều thách thức và rủi ro như dịch bệnh do vi sinh vật gây ra như vi nấm, vi khuẩn và virus Đặc biệt phải kể đến các bệnh trên tôm do virus gây ra đang là một trở ngại lớn cho sự phát triển bền vững của ngành nuôi tôm trên thế giới cũng như Việt Nam nói riêng

Trong vài thập niên qua, bệnh do virus gây ra lúc đầu chỉ có 6 virus (năm 1989) được biết đến nhưng chỉ trong vài năm sau đó đã có hơn 20 virus (năm 1997) được phát hiện (Hernández-Rodríguez và ctv., 2001), trong đó có thể kể đến bệnh

đốm trắng do WSSV gây thiệt hại nặng nề đối với nghề nuôi tôm sú Penaeus

monodon thì virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô

(IHHNV) lại gây thiệt hại to lớn cho nghề nuôi tôm Penaeus (Litopenaeus)

stylirostris với tỉ lệ tử vong lên tới 90% (Lightner, 1983) Kể từ khi IHHNV được

phát hiện ở Hawaii vào năm 1981, virus này đã lan truyền nhanh chóng và đã được ghi nhận ở nhiều khu vực khác nhau Với nhiều mức độ thiệt hại do IHHNV gây ra

đã được báo cáo từ nhiều trang trại nuôi tôm ở nhiều khu vực trên thế giới Bằng chứng cho thấy mức độ thiệt hại do virus gây ra ước tính khoảng 8,5 tỷ USD thì riêng thiệt hại do IHHNV gây ra ước tính khoảng 0,5 – 1 tỷ USD (Lightner, 2005)

Trước những ảnh hưởng và thiệt hại do IHHNV gây ra trên các trang trại tôm,

nó đã được liệt vào danh mục vào những virus gây bệnh nguy hiểm trên tôm vào năm 2000 của Tổ chức Thú y Thế giới (Office Internationnal des Epizooties - OIE) (Lightner và ctv., 1997; OIE, 2009) Hơn nữa, Chương trình trang trại nuôi tôm nước mặn của Hoa Kỳ (UMSFP) cũng công bố IHHNV là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng ảnh hưởng đến giá trị kinh tế tôm thương phẩm và virus này được liệt vào danh mục bệnh của tổ chức này (Lotz và ctv., 1995) Sau khi

Shike và ctv, (2000) công bố những thông tin về trình tự bộ gen của IHHNV được phân lập ở Hawaii trên GenBank (AF218226) thì trình tự gen của một số chủng IHHNV cũng được công bố rộng rãi ở nhiều nước khác trên thế giới Qua những nghiên cứu về vật liệu di truyền của các chủng IHHNV phân lập từ nhiều vùng trên thế giới, các nhà khoa học cho rằng bộ gen của IHHNV khá ổn định (Tang và Lightner, 2002) Và nhiều phương pháp chẩn đoán đã được phát triển hỗ trợ phát hiện sớm sự hiện của virus IHHNV Trong đó, tập trung chủ yếu là các phương pháp phát hiện vật liệu di truyền của virus này Như phương pháp PCR, Real-time PCR, phương pháp lai tại chỗ, phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt LAMP đã được giới thiệu cho phép phát hiện IHHNV nhanh chóng và tiện lợi (Rai và ctv., 2012) Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây, cho thấy trình tự IHHNV có rất nhiều biến đổi khi nhiễm trên tôm sú (Tang và ctv 2006; Saksmerprome và ctv., 2011) Sự hiện diện của 2 type IHHNV A và B gắn vào bộ gen của tôm sú thì việc chẩn đoán IHHNV rất phức tạp bởi các biến thể di truyền của virus trong các khu vực địa lý khác nhau và sự tương đồng rất lớn về vật liệu di truyền giữa các type IHHNV Bên cạnh đó sự chèn trình tự IHHNV type lây nhiễm ngẫu nhiên vào bộ gen tôm sú thường xảy ra mà những cặp mồi do OIE và bộ kít thương mại có thể bắt cặp với trình tự chèn này như là trình tự đích Dẫn đến kết quả chẩn đoán dương tính giả khi

sử dụng những qui trình này (Saksmerprome và ctv., 2010; 2011)

Hiện nay, vẫn còn có nhiều nghiên cứu trái ngược nhau về sự tác động của virus lên sự tăng trưởng của tôm sú, một số nghiên cứu cho thấy, trên tôm sú nuôi ở

có hiện tượng dị dạng còi cọc, chậm lớn, phát triển có kích thước không đều khi nhiễm IHHNV (Primavera & Quinitio., 2000; Rai và ctv., 2009) Một số nghiên cứu khác cho rằng việc nhiễm IHHNV không có tác động lớn về sự phát triển của tôm nuôi, cũng như số lượng trứng được đẻ và tỷ lệ nở trứng từ tôm mẹ nhiễm hay không nhiễm cũng như sản lượng nuôi (Withyachumnarnkul và ctv., 2006; Flegel, 1997)

Sự lan truyền của virus này còn được nhiều nghiên cứu cho rằng chúng có thể lan truyền theo cả trục dọc lẫn trục ngang, do đó mức độ lây nhiễm của virus này

trở nên nhanh chóng Sự lan truyền theo trục dọc là khả năng truyền bệnh từ bố mẹ mang mầm bệnh và truyền cho thế hệ sau của chúng (Mottle và ctv., 2003), trong khi đó lan truyền theo trục ngang do tập tính ăn thịt lẫn nhau hay do nguồn nước bị nhiễm (Lightner và ctv., 1983a,b) Mặc dù, có nhiều nghiên cứu về sự lan truyền

theo trục dọc cũng như theo trục ngang của IHHNV ở các loài tôm he như P

stylirostris, P vannamei nhưng có rất ít nghiên cứu về sự lan truyền của IHHNV

trên tôm sú Penaeus monodon

Ở Việt Nam tôm nhiễm virus xảy ra hàng năm và IHHNV đã xuất hiện trên tôm nuôi Việt Nam, chủ yếu lây nhiễm trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng Khảo sát trên 307 mẫu tôm sú thu từ miền Trung, tây Nam Bộ và Đông Nam Bộ cho thấy có đến 52% mẫu nghiên cứu nhiễm các type IHHNV khác nhau (Hùng và ctv., 2009) Trong khi đó những hiểu biết về virus này trên tôm sú ở Việt Nam không nhiều do

có ít nghiên cứu về IHHNV mặc dù những hậu quả tiêu cực do loại vius này gây ra cho ngành công nghiệp nuôi tôm đã được cảnh báo trên toàn thế giới Chỉ có một vài tổ chức chỉ tập trung ứng dụng các qui trình chẩn đoán PCR đã được OIE công

bố để phát triển các kít thương mại để chẩn đoán virus Một nghiên cứu mới đây của Hùng và ctv (2009) cho thấy trình tự chủng IHHNV này có quan hệ rất gần với các chủng IHHNV ở Đài Loan (AY 355307) và Thái Lan Chưa có một nghiên cứu nào

về sự lây nhiễm IHHNV trên tôm sú bằng cách cho ăn hay sống chung với tôm bệnh, như lây nhiễm từ mẹ sang con, hay lây nhiễm giữa các cá thể tôm mang IHHNV và cá thể trong một quần đàn Cũng như đánh giá sự hiện diện của chúng trên tôm sú nuôi trong các mô hình ương nuôi khác nhau Do đó, nghiên cứu này của chúng tôi nhằm khảo sát có hay không sự hiện diện chủng mang di truyền khác nhau của chủng IHHNV, để qua đó nhằm góp phần làm rõ thêm những thông tin về chủng IHHNV nhiễm trên tôm sú ở Đồng Bằng Sông Cửu Long cũng như phát triển các công cụ chẩn đoán, đề xuất các giải pháp hạn chế sự lây lan và có biện pháp phòng trị trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh ở Đồng bằng Sông Cửu Long

2.1.1 Tình hình nuôi tôm

Trong những năm gần đây, ngành thủy sản với phát triển không ngừng đã và đang trở thành ngành kinh tế đóng vai trò quan trọng trong việc xuất khẩu Việt Nam với lợi thế bờ biển dài chạy dọc theo địa lý từ Bắc chí Nam nên có một tiềm năng to lớn cho sự phát triển của ngành thủy sản nước mặn và nước lợ Trong đó, nuôi tôm nước lợ chiếm một vị trí và vai trò quan trọng trong ngành thủy sản Ngoài những giá trị kinh tế mang lại trong việc xuất khẩu thu nguồn ngoại tệ lớn, ngành nuôi tôm ở nước ta còn góp phần vào việc giải quyết công ăn việc làm cho đông đảo người lao động Theo Tổng cục thống kê (2010) cho thấy vào năm 2000 cả nước chỉ

có khoảng hơn 324.000 ha diện tích nuôi tôm nhưng trong vòng khoảng 10 năm trở lại diện tích nuôi tôm đã tăng lên gần gấp đôi khoảng 629.000 ha vào năm 2008 và diện tích nuôi trồng có xu hướng mở rộng vào những năm sau đó (năm 2013 là 652.612 ha)

Ở Việt Nam, các giống tôm nuôi chủ yếu có nguồn gốc tự nhiên như tôm sú, tôm chì, tôm sắt, tôm nghệ và tôm thẻ được nhập vào nước ta ở thập niên gần đây

Tuy nhiên, hiện nay tôm sú (Penaeus monodon) vẫn là loài quan trọng được nông

dân lựa chọn nuôi nhiều tại Việt Nam từ nhiều năm qua Theo Tổng cục Thủy sản

Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông thôn (2011) thì đến năm 2011 cả nước thả nuôi được 656.425 ha tôm nước lợ thì trong đó diện tích nuôi tôm sú là 623.377 ha Trong nhiều năm tôm sú được xem là giống chính giúp đưa Việt Nam vào danh sách những nước cung cấp tôm quan trọng của thế giới Năm 2011, tôm sú vẫn giữ

vị trí chủ đạo trong cơ cấu xuất khẩu tôm Việt Nam với tổng giá trị xuất khẩu tôm trong năm 2011 đạt 2,396 tỷ USD thì trong đó xuất khẩu tôm sú đạt trên 1,43 tỷ USD, chiếm gần 60 % tổng giá trị

Phần lớn diện tích nuôi tôm và sản lượng tôm tập trung từ Nam Bộ đặc biệt là một số tỉnh ở ĐBSCL có điều kiện tự nhiên rất thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm he Theo điều tra của Tổng cục Thủy sản Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông

thôn (2011), tổng diện tích thả nuôi tôm là 602.416 ha chiếm 91,8 % diện tích nuôi tôm của cả nước, trong đó có diện tích nuôi tôm sú đã lên tới 588.419 ha Các tỉnh

có diện tích nuôi tôm lớn như Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Kiên Giang…

Các bệnh do virus gây ra và dẫn đến nhiều thiệt hại nặng nề về kinh tế cho ngành nuôi tôm thâm canh phải kể đến như bệnh hoại tử gan tụy do Hepatopancreatic Parvovirus (HPV), bệnh còi do Monodon Baculovirus (MBV), bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV), bệnh đầu vàng do virus gây hội chứng đầu vàng (YHV - Yellow head virus), và trong những năm gần đây (từ 2011 đến nay) bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPNS - Acute Hepatopancreatic

Necrosis Syndrome) do Vibrio parahaemolyticus mang gen độc gây ra khiến tôm

chết hàng loạt ở những vùng nuôi tôm trong nước (ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và các tỉnh Miền Trung) Gần đây, ở Việt Nam còn xuất hiện thêm bệnh do virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV) tuy nhiên chưa ghi nhận được bất kỳ thiệt hại nào do virus này gây ra trên tôm nuôi Những dấu hiệu bệnh lâm sàng do virus này cho thấy không rõ ràng, bệnh không gây chết đối với tôm sú nuôi và những thông tin tìm hiểu và nghiên cứu về virus này ở Việt Nam hiện chưa có nhiều

2.2 Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (infectious hypothermal and hemotopoietic necrosis)

Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô có tác nhân gây bệnh là virus hypothermal and hemotopoietic necrosis (IHHNV) còn có tên khoa học là

PstDNV (Penaeus stylirostris densovirus), đây là một trong số bệnh nguy hiểm trên

tôm Litopenaeus stylirostris Bệnh IHHN lần đầu tiên được mô tả trên hệ thống nuôi siêu thâm canh tôm L stylirostris tại Hawaii năm 1981 (Lightner và ctv., 1983) Khi mắc bệnh này, tôm L stylirostris có tỷ lệ chết lên đến 90% Sau khi

được phát hiện ở Hawaii, bệnh IHHN tiếp tục được phát hiện phân bố rộng rãi ở Mỹ

và các vùng nuôi ven bờ biển Thái Bình Dương Ngay sau khi phát hiện IHHNV

trên tôm L stylirostris các nhà khoa học đã phát hiện virus này có mặt ở cả tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei cũng từ cùng khu vực phát hiện IHHNV trên tôm L

stylirostris ở khu vực này, và những tôm thẻ này là vật mang virus không biểu hiện

các bệnh tích (Lightner và ctv, 1983; Bell và Lightner, 1984) Các nghiên cứu sau này cho thấy IHHNV là nguyên nhân gây biến dạng lớp vỏ kitin của chủy, râu, vùng đốt ngực và vùng bụng ở tôm thẻ chân trắng và được gọi là hội chứng dị dạng còi cọc (Runt-deformity Syndrome, RDS) Tác động IHHNV lên tôm thẻ gây ảnh hưởng về giá trị thương mại do tôm chậm lớn, có kích thước nhỏ, biến dạng vỏ kitin mặc dù IHHNV không gây chết nghiêm trọng khi tôm nhiễm virus

Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan thành lập biểu mô là một trong những bệnh do virus gây nguy hiểm cho ngành nuôi tôm Virus này khi xâm nhiễm vào tôm sẽ gây hoại tử máu và nhiễm trùng dưới vỏ Tôm nuôi ở giai đoạn postlarvae và juvenile với mật độ cao rất dễ nhiễm virus này Tôm nhiễm virus này

có biểu hiện ít ăn, lừ đừ, nổi nước, xoay tròn và chết từ từ trong 2 – 3 tuần Các loài

tôm khác nhau khi nhiễm bệnh thì có dấu hiệu khác nhau Loài P monodon, những

con nhiễm IHHNV khi hấp hối có màu xanh lơ và hệ cơ vân ở phần bụng có thể bị

mờ đục, chậm lớn (Rai và ctv., 2009) Loài P vannamei, khi bị bệnh ở dạng mãn

tính và thể hiện một số đặc điểm như còi cọc, dị dạng, như chùy đầu sẽ bị uốn cong hoặc bị dị dạng, râu bị nhăn nhúm lại, vỏ kitin thì bị sùi Tôm kém ăn dẫn đến phân

đàn cao Loài P stylirostris, nếu bị nhiễm ở cấp tính có thể gây chết tôm ở giai đoạn

ấu niên, ấu trùng và hậu ấu trùng có thể đã nhiễm bệnh nhưng không phát bệnh, sau

35 ngày trở đi bệnh mới bộc phát Ở mức độ nặng thì tôm sẻ kém ăn, có sự thay đổi

về trạng thái và diện mạo, tôm bơi lội chậm chạp và chết sau vài giờ, xuất hiện các vùng trắng hay vàng sẫm ở lớp biểu bì kitin, đặc biệt là ở các khớp nối làm cơ thể tôm xuất hiện các vùng vằn vện (Lightner và Bell, 1984)

2.3 Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (infectious hypothermal and hemotopoietic necrosis virus – IHHNV)

2.3.1 Tên khoa học và phân loại

Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV) là

virus có kích thước nhỏ nhất được phát hiện lần đầu tiên trên tôm Penaeus

(Litopenaeus) stylirostris Do đó, IHHNV còn có tên khoa học là PstDNV (Penaeus stylirostris densovirus) (Shike và ctv., 2000) Virus này có kích thước từ 20 – 22

nm, có cấu trúc khối đa diện và không có vỏ ngoài Dựa trên kích thước và hình thái

học, hóa sinh IHHNV được xếp vào họ Parvoviridae và có thể là thành viên của chi

Brevidensovirus (Bonami, 1990)

2.3.2 Bộ gen và chức năng của các protein

Virus này mang vật liệu di truyền là DNA mạch đơn, kích thước khoảng 4,1

kb chứa 3 trình tự ORF (1, 2, 3) (Nunan và ctv 2000, Shike và ctv 2000) ở hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc bộ gen của chủng IHHNV phân lập ở Mỹ (AF273215,

Shike và ctv., 2000) Ba khung đọc mở (ORF trái, ORF giữa, ORF phải ) được chỉ

ra trong khung cùng với vị trí của chúng Vị trí cho (donor-D1) và nhận A1, A2 và A3) giả định được thể hiện hình tam giá P2, P11 và P61 là vị trí các vùng promotor (Bổ sung Dhar và ctv., 2010)

(Receptor-Trong bộ gen của IHHNV, ORF bên trái hay còn được gọi ORF1 có kích thước 2001 nucleotide (nt), chiếm 50% trình tự bộ gen và được dự đoán có thể mã

hóa cho một chuỗi peptide 666 amino acid với trọng lượng phân tử là 75.77 kDa,

trên cơ sở tương đồng trình tự với 2 virus Brevidensoviruses trên muỗi, trình tự

amino acid này được dự đoán là non-structural protein 1 (NS1) Trình tự acid amin được mã hóa bởi ORF1 chứa các motif đặc trưng cho IHHNV Bao gồm motif nhân

tố khởi đầu sao chép có tính bảo tồn cao (RCR – motifs) chứa motif I (ở vị trí a.a

258 đến a.a 266) và motif II (ở vị trí a.a 307 đến a.a 314) của protein khởi đầu sao chép và vùng NTP – binding và helicase (ATPase motifs) chung cho tất cả các parvoviruses (Rai và ctv., 2011; Shike và ctv., 2000) So sánh sự tương đồng trình

tự a.a giữa các chủng ở nhiều vùng trên thế giới cho thấy, mặc dù có sự khác biệt về trình tự, có nhiều sự thay đổi được tìm thấy ở trong 200 a.a đầu tiên nhưng các motif đặc trưng của IHHNV vẫn được bảo tồn (Shike và ctv., 2000; Tang và Lightner, 2003) Tương tự các parvovirus khác, ORF ở giữa (ORF2) bắt đầu từ nucleotide 56 tính theo chiều ngược và có đoạn chồng lấp trình tự với ORF1, có kích thước 1092 nt, có khả năng mã hóa cho vùng N – terminal của một chuỗi peptide mang 343 a.a và được gọi là protein không cấu trúc 2 (NS2) Cuối cùng, ORF bên phải (ORF3) cũng chồng lấp trình tự với ORF2 (56 nucleotide), có kích thước 990 nt và có thể mã hóa cho một chuỗi peptide chứa 329 a.a (Dhar và ctv., 2007; Nunan và ctv, 2000, Shike và ctv, 2000) Bằng phân tích SDS-PAGE có ít nhất bốn protein cấu trúc khác nhau được phát hiện từ thể virus IHHNV tinh sạch

và chúng có trọng lượng phân tử 74, 47, 39 và 37,5 kD (Bonami và ctv., 1990; Mari

và ctv., 1993) Trong đó protein có kích thước 47 kD đã được xác định là có nguồn gốc từ ORF3

2.3.3 Sự đa dạng di truyền của IHHVN

2.3.3.1 Phân loại kiểu gen

Cho đến nay, có rất nhiều bộ gen hoàn chỉnh của chủng IHHNV khác nhau đã được giải trình tự và mô tả chi tiết Bao gồm một số chủng như Hawaii ở Mỹ (trên Genbank có kí hiệu AF218266) có kích thước 3909 bp; Ấn Độ (GQ411199) có kích thước 3908 bp (Rai và ctv., 2011); Hàn Quốc (JN377975) có kích thước 3914 bp (Kim và ctv., 2011) và Trung Quốc (EF633688) có kích thước 3833 bp và cùng một

số chủng IHHNV có trên GenBank như từ Mexico (AF273215), Đài Loan (AY355307, AY355306 và AY355308); Thái Lan (AY362547 và AY102034); Việt Nam (JN616415); Ecuador (AY362548) và Úc (GQ475529) Qua những nghiên cứu trên vật liệu di truyền của các chủng IHHNV phân lập từ nhiều nơi trên thế giới cho thấy có ít nhất bốn kiểu gen (type) IHHNV bao gồm: kiểu gen 1 có nguồn gốc

từ Châu Mỹ, Đông Á (chủ yếu là Phillippines), kiểu gen 2 có nguồn gốc từ Đông Nam Á và hai kiểu gene này là kiểu gen lây nhiễm Những thí nghiệm lây nhiễm đã chứng minh kiểu gen 1 và 2 có khả năng lây nhiễm từ vật chủ này sang vật chủ

khác, đại diện là tôm thẻ chân trắng P vannamei và hoặc tôm sú P monodon

(Chayaburakul và ctv., 2005) Thông qua việc phân tích bằng PCR và trình tự DNA, IHHNV được phát hiện ở tôm sú từ vùng Đông Nam Á và 2 biến thể (đại diện là các chủng từ Thái Lan và Philippine) được nhận diện dựa trên phân tích cây di truyền (Tang và ctv., 2003)

Bên cạnh trình tự bộ gen IHHNV lây nhiễm, hai trình tự bộ gen IHHNV không lây nhiễm được chèn vào bộ gene của tôm (IHHNV type 3A/3B) gần đây đã được phát hiện trên tôm sú ở tự nhiên từ Đông Phi và Úc (Krabsetsve và ctv., 2004; Tang

và Lightner, 2006) Những trình tự tương đồng với virus này có mức độ tương đồng trình tự nucleotide khá cao (từ 86 – 92 %) với bộ gen virus IHHNV (Tang và ctv., 2007) Kiểu gen 3A có nguồn gốc từ Đông Phi (Madagascar), Ấn Độ và Úc (Genbank DQ228358) có chiều dài 4655 bp nucleotide (Tang và Lightner, 2006) Cuối cùng kiểu gen 3B với trình tự vật liệu di truyền dài 2935 nucleotide (kí hiệu trên Genbank AY123937) có nguồn gốc từ khu vực phía tây Ấn Độ - Thái Bình Dương (Indo-Pacific) bao gồm Mozambic, Mauritius và Tanzania (Tang và ctv., 2003) Các nghiên cứu cho thấy kiểu gen 3A và 3B chỉ tồn tại ở tôm sú và không có khả năng lây truyền (Tang và ctv., 2006) Tuy nhiên, các parvovirus khác được biết đến như nguyên nhân lây nhiễm tiềm tàng, đôi khi chúng liên quan đến sự chèn vào

bộ gene và có thể có hoạt tính trở lại dưới tác động của nhân tố môi trường hoặc sự xâm nhiễm cùng với các virus DNA không có họ hàng với chúng (Tattersall và ctv., 2005; Geoffroy và ctv., 2006)

tôm P monodon như là loài thủy sản nuôi trong thập niên 1970 của các trang trại

nuôi tôm (Lightner, 1996; Tang và ctv., 2003) Một vài nghiên cứu trước kia cho

thấy, IHHNV trên P stylirostris và P vannamei từ Tây bán cầu đã chứng minh bộ

gen IHHNV rất ổn định và sự phát triển giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ đã ổn định hơn (Tang và Lightner, 2002) Mặt khác, dựa trên phân tích sự đa dạng trình tự

bộ gen IHHNV mã hóa vùng protein không cấu trúc và vỏ capsid (trình tự nucleotide có kích thước 2,9 kb của IHHNV chứa đựng 3 ORF), cho thấy sự khác biệt trình tự thấp (ít hơn 0,5 % trình tự nucleotide khác biệt) được tìm thấy trong 14 chủng phân lập từ Hawaii và châu Mỹ từ năm 1982 đến 1997 Thậm chí không có

sự mất đi hay thêm vào trong vùng này của bộ gen virus Sự thay đổi của 30 nucleotide được ghi nhận thì chỉ có 15 nucleotide thay đổi dẫn đến sự thay đổi của các a.a (7 ở ORF1, 1 ở ORF2 và 7 ở ORF 3) nhưng không có sự liên hệ giữa sự thay đổi và động lực virus (Tang và Lightner, 2002) Tuy nhiên, trái ngược với báo cáo của Tang và Lighter (2002), một nghiên cứu gần đây cho thấy sự đa dạng di truyền của IHHNV còn cao hơn nữa và ước tính tỉ lệ thay đổi nucleotide ở những chủng IHHNV phân lập khoảng 1,39 ×10−4 thay đổi/vị trí/năm (Robles-Sikisaka và ctv., 2010) Bên cạnh đó, khi phân tích trinh tự gen ORF 3 mã hóa cho vỏ capsid của chủng IHHNV mới được phân lập ở Philippine cho thấy trình tự mới phân lập này

có thể là một chủng khác biệt với các chủng còn lại ở nước này (Caipang, và ctv., 2011)

Bên cạnh đó, chủng IHHNV từ Hawaii (AF218266) cũng được dùng để so sánh với các chủng khác được phân lập trên tôm sú từ các vùng khác nhau trên thế

giới Trình tự 2,9 kb được so sánh (chứa đựng khoảng 70 % toàn bộ bộ gen virus bao gồm cả chiều dài của ORF1 và ORF2) cho thấy chủng IHHNV phân lập từ Philippine khá giống với chủng ở Hawaii với sự khác biệt khoảng 0,2 % trong trình

tự nucleotide Chủng IHHNV ở Thái Lan cho thấy sự sai khác lớn hơn so với chủng Hawaii (ở mức 96 % sự tương đồng) Chủng phân lập từ Đài Loan rất giống (99,7

%) với chủng phân lập từ Thái Lan, sự khác biệt chỉ là 9 nucleotide Ngoài ra, DNA

ly trích từ tôm sú ở Đông Phi (Tanzania, Madagascar và Mauritius) cũng chứa trình

tự IHHNV và sự khác biệt với chủng từ Hawaii khoảng từ 8,2 % đến 14,1 % (Tang

và ctv., 2003) Nhìn chung, sự sai khác di truyền ở trong họ parvovirus chỉ lên đến 4

% (Erdman và ctv, 1996) Tuy nhiên, trình tự IHHNV được phân lập từ tôm sú có

sự sai khác cao hơn lên tới 14 % Điều này trái với những kết quả trước đó có ít hơn

0,5 % sự sai khác giữa các chủng IHHNV được phân lập trên tôm P stylirostris và

P vannamei ở Tây bán cầu (Tang và Lightner, 2002) Sự đa dạng di truyền cao của

IHHNV trên tôm sú cho thấy các đoạn trình tự ngẫu nhiên của virus được chèn vào

bộ gen của tôm Kết quả của nghiên cứu ở Thái Lan khi sử dụng 7 cặp mồi ngẫu nhiên để khuếch đại trình tự gen của IHHNV chỉ ra 20 trong tổng số 99 mẫu tôm (tỉ

lệ khoảng 20 %) có sự chèn vào một hoặc hai đoạn trình tự ngẫu nhiên

(Saksmerprome và ctv., 2011) Sự đa dạng di truyền ở P stylirostris và P vannamei

thấp hơn có thể được giải thích do đời sống ngắn nên ít có sự biển đổi di truyền, trái

lại tôm P monodon lại có khả năng mang virus trong suốt vòng đời của chúng Các

loài này bị nhiễm IHHNV sau khi IHHNV từ nguồn tôm sú nhiễm bệnh được xuất khẩu từ châu Á từ giữa và cuối những năm 1970

2.3.4 Sự lan truyền của IHHNV

Sự lan truyền của IHHNV diễn ra trong tự nhiên cả truyền dọc và truyền ngang đã được nghiên cứu và chứng minh khi nhiễm trên tôm he Một số cá thể

trong quần đàn L stylirostris và P vannamei sống sót qua các đợt dịch bệnh và

mang IHHNV trong suốt thời gian sống, chúng đã truyền IHHNV sang thế hệ con

và các quần đàn khác thông qua cả đường truyền ngang, lẫn truyền dọc (Bell và

Lightner, 1984; Lotz, 1997) IHHNV rất dễ gây bệnh cho tôm L Stylirostris, tôm

thẻ chân trắng L vannamei và postlarvae tôm càng xanh Macrobrachium

rosenbergii (Hsieh và ctv., 2006) Kết quả là tôm tăng trưởng bất thường trong suốt

quá trình phát triển (Kalagayan và ctv, 1991.; Lightner và ctv, 1992) Trong sản xuất tôm thẻ chân trắng, khi nhiễm virus này, tôm có sự chênh lệch về kích thước,

dị dạng còi cọc và thiệt hại về kinh tế khoảng 10-50% sản lượng so với tôm nuôi không nhiễm virus (Lightner và Redman, 1998) Hiện tại rất ít thông tin liên quan đến đáp ứng miễn dịch và sinh lý học của tôm khi nhiễm IHHNV, đặc biệt là liên quan đến sinh sản và phát triển của phôi Sự lây nhiễm IHHNV tùy thuộc chủng virus, tùy vào ký chủ lây nhiễm trong tự nhiên và phân bố theo vùng địa lý khác (từ châu Mỹ đến châu Á, Châu Úc và Châu Phi) Ký chủ của IHHNV hầu hết là các

loài họ tôm he, có thể bị nhiễm bởi IHHNV như tôm sú P monodon, tôm thẻ chân trắng P Vannamei, tôm xanh P Stylirostris, và một số loài tôm trong tự nhiên P

occidentalis, P semisulcatus, Litopenaeus Schmitti, Farfantepenaeus Californiensis, Marsupenaeus japonicus IHHNV nhiễm tự nhiên trên postlarvae

và cận trưởng thành trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) được ghi

nhận ở miền Nam Đài Loan, còn những loài tôm khác như Fenneropenaeus indicus,

Fenneropenaeus merguiensis, Farfantepenaeus aztecus, Farfantepenaeus duorarum

và Litopenaeus setiferus cũng được cho lây nhiễm trong phòng thí nghiệm (Rai và

ctv., 2012; Hsieh và ctv., 2006) Cho đến nay chưa có vật chủ trung gian truyền lây của IHHNV được biết đến

Thí nghiệm truyền dọc cũng đã được xác lập thông qua giám sát sự hiện diện IHHNV ở phôi và thế hệ ấu trùng trên tôm thẻ chân trắng khi cho thụ tinh trứng từ hai tôm thẻ chân trắng cái (một bị nhiễm IHHNV và một không nhiễm IHHNV) với tôm đực không mang IHHNV Kết quả phân tích PCR cho thấy khi tôm cái nhiễm IHHNV thì phôi và thế hệ con của chúng cũng nhiễm IHHNV, trường hợp tôm mẹ không mang IHHNV thì phôi và thế hệ con không mang virus IHHN (Motte và ctv., 2003) Một nghiên cứu khác về lây truyền dọc cho thấy, IHHNV nhiễm trên mô của

buồng trứng và trứng đã thụ tinh của tôm Fenneropenaeus chinesis thì các giai đoạn

con của chúng đều mang virus này (Zhang và Sun., 1997) Lây truyền dọc đã được xác định, vì virus đã được phát hiện trong các mô buồng trứng và nang buồng trứng

(Lotz, 1997) Truyền dọc có thể là một yếu tố rất quan trọng cho sự gia tăng của IHHNV phổ biến trong gia hóa tôm từ thế hệ này sang thế hệ khác Một vấn đề thực

tế, khi bố mẹ bị nhiễm virus sinh ra một số lượng lớn thế hệ con mang mầm bệnh và tiếp tục truyền cho các cá thể khác trong cùng một ao Vì phần lớn các tôm bị nhiễm bệnh tồn tại mà không có dấu hiệu lâm sàng, nhiều con tôm này sẽ được lựa chọn làm bố mẹ mang IHHNV và chúng có thể truyền virus cho thế hệ con sau này (Motte và ctv., 2003)

Thử nghiệm lây truyền ngang của IHHNV đã được thực hiện bằng cách tiêm virus, cho tôm ăn vật liệu mang virus, sống chung với tôm mang virus hoặc ngâm tôm khỏe trong nước có chứa virus (Bell và Lightner, 1984; Lotz, 1997) Kết quả lây nhiễm cho thấy, lây nhiễm tự nhiên từ tôm bệnh mang virus chết truyền cho tôm khỏe cao nhất Trong các trang trại, tôm bùng phát nhiễm virus có thể là kết quả của con đường truyền ngang thông qua tôm khỏe ăn những con tôm mang mầm bệnh chết

Để nghiên cứu sự lây nhiễm của virus trên tôm, có rất nhiều mô hình (phương pháp) lây nhiễm cho tôm trong phòng thí nghiệm như phương pháp tiêm vào cơ thể tôm, phương pháp cho tôm ăn nguồn nhiễm bệnh hay cho tôm tiếp xúc với nguồn nước nhiễm virus và phương pháp cho tôm sống chung với đối tượng nhiễm virus Phương pháp tiêm là phương pháp cho kết quả gây nhiễm nhanh và có độ tin cậy cao tuy nhiên phương pháp này thường gây sốc với tôm và con đường xâm nhập không giống với cách xâm nhiễm của virus trong tự nhiên Nên phương pháp này được chọn để chuẩn bị nguồn lây nhiễm (sống chung và làm nguồn thức ăn nhiễm bệnh) cho thí nghiệm lan truyền theo trục ngang và tiêm vào cá thể tôm mẹ trong thí nghiệm theo trục dọc Có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để cảm nhiễm nhiều loại virus cho tôm như WSSV (Vijayan và ctv., 2005), MrXV và XSV (Sudhakaran và ctv., 2007), IHHNV (Brock và ctv., 2007) Tùy thuộc vào kích thước mà liều lượng được tiêm cho tôm có thể được tính toán thông thường thể tích

từ 10 -100µl Phương pháp cho ăn mô tôm bệnh là phương pháp khá giống với cách thức xâm nhiễm của virus trong tự nhiên thông qua tập tính ăn thịt những cá thể yếu mang mầm bệnh hay xác bã mà cá thể tôm thải ra Phương pháp này được sử dụng

rất nhiều trong những nghiên cứu cảm nhiễm virus cho tôm như thí nghiệm lây

nhiễm WSSV cho tôm thông qua Polycharte Pereneis nuntia nhiễm virus (Vijayan

và ctv., 2005; Loarun và ctv., 2005), lây nhiễm MrNV và XSV cho tôm thông qua

Artemia (Sudhakaran và ctv., 2007) và lây nhiễm IHHNV cho tôm thẻ thông qua

nguồn thức ăn nhiễm virus (Bell và Lightner, 1984; Lotz và ctv., 1997; Tang và ctv., 2006; Coelho và ctv., 2009) Trong thí nghiệm lây nhiễm bằng cách thức cho

ăn, nguồn thức ăn được thu thập hay sàng lọc từ những cá thể cho kết quả dương tính với virus Sau đó chúng được xay nhuyễn và cân đo liều lượng cho ăn, thông thường các bể thí nghiệm sẽ được cho ăn với tỉ lệ từ 5 – 10 % trọng lượng tôm thí nghiệm Đối với các bể đối chứng tôm sẽ được cho ăn mô tôm khỏe hoặc thức ăn viên Do đó, phương pháp này thường được lựa chọn để nghiên cứu sự lan truyền của virus theo trục ngang Phương pháp sống chung (cohabitant) là phương pháp khắc phục được nhược điểm của phương pháp tiêm là làm cho tôm nhiễm bệnh giống với cách thức xâm nhiễm trong tự nhiên của virus Đây là phương pháp cho tôm khỏe mạnh sống chung với các cá thể tôm bệnh Các cá thể tôm bệnh được tạo

ra bằng phương pháp tiêm virus vào cơ thể tôm và được kiểm tra dương tính với virus bằng PCR Mô hình này cũng được sử dụng cho nhiều thí nghiệm cảm nhiễm WSSV (Corre và ctv., 2012) và IHHNV (Lightner và Bell, 1984)

2.3.5 Sự phân bố và lây nhiễm

IHHNV được báo cáo trên nhiều loài tôm và ở nhiều vùng trên thế giới bao gồm Nam Mỹ, Bắc Mỹ và Trung Mỹ; khu vực Caribe và vùng Indo – Thái Bình Dương Tuy nhiên, chưa có báo cáo nào ghi nhận sự hiện diện của virus này ở vùng duyên hải Đại Tây Dương Hiện nay, với tốc độ lan truyền nhanh chóng IHHNV được xem như tác nhân có tính phân phối toàn cầu (Lightner và ctv., 1996) Sự xâm

nhiễm trong tự nhiên đã được công bố ở các loài như P vanamei, P stylirostris, P

occidentalis, P monodon, P semisulcatus, P californiensis, P schmitti và P japonicas trên khắp thế giới (Flegel và ctv., 1997; Morales-Covarrubias, 1999) Sự

lây nhiễm trong thí nghiệm cũng được báo cáo ở P setiferus, P azteau và P

duoranrum Tuy nhiên P indicus và P merguiensis có lẽ không cảm nhiễm với sự

lây nhiễm của IHHNV (Lightner, 1996)

IHHNV lần đầu tiên được công bố trên tôm P stylirostris và P vanamei ở Hoa kỳ (Lightner và ctv., 1983) và sau đó là ở trên tôm P monodon từ Châu Á

Người ta cho rằng, nó được tìm thấy thông qua quá trình nhập khẩu tôm sú có nguồn gốc từ Philippine (Lightner và ctv., 1992; 1996; 1999) Ở Châu Mỹ, IHHNV còn được ghi nhận ở các trang trại nuôi tôm ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Trung Mỹ, vịnh Carribe và khu vực Indo – Thái Bình Dương Vịnh California ở Mexico virus này

được phát hiện ở các trang trại nuôi tôm xanh P stylirostris (Lightner, 1992) Sự

phân bố địa lý và giới tính của tôm là yếu tố ảnh hưởng đến mức độ nhiễm virus trong quần đàn Trong các vùng mà virus gây thành dịch trên các đàn tôm hoang dã, thì IHHNV đã được phát hiện trên các mẫu tôm tự nhiên ở các địa phương là từ 0 đến 100% Một vài số liệu đã được báo cáo về sự hiện diện IHHNV trong các đàn

tôm hoang dã lần lượt là 26% và 46% trong P stylirotris ở hạ lưu và thượng lưu của Vịnh California, 100% và 57% ở tôm cái và tôm đực trưởng thành của P stylirotris

ở vùng giữa của Vịnh California Trên tôm P vannamei thu thập được từ bờ biển

Thái Bình Dương của Panama là 28% khi kiểm tra bằng lai dot blot (Nunan và ctv., 2001) Mặt khác, những báo cáo gần đây cho thấy sự lưu hành của IHHNV trên tôm

P setiferus và P aztecus hoang dã ở Mexico là rất thấp khoảng 4,4 %

(Guzman-Saenz và ctv., 2009) Ở Nam Mỹ, những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được

tiến hành trên các mẫu xét nghiệm tôm hoang dã F subtilis thu thập từ cửa sông

Pacoti ở vùng biển miền Đông Bắc Brazil cho thấy chúng cảm nhiễm với IHHNV (Coelho và ctv., 2009) Sự lưu hành cao của IHHNV được báo cáo ở các trang trại tôm từ vùng Đông Bắc Brazil ở phạm vi từ 9,4 – 81 % (Braz và ctv., 2009) Sự lưu

hành thấp (1,1 – 1,3 %) được tìm thấy ở tôm P vanamei nuôi ở Venezuela và Peru

(0.31%) (Boada và ctv., 2008; Alfaro-Aguilera và ctv.,2010) Ngoài các loại họ tôm

he thì IHHNV hiện diện trên 3 loài giáp xác khác Artemesia longinaris,

Cyrtograpsus angulatus, và Palaemon macrodactylus ở Argentina với tỷ lệ nhiễm

56%, 67% và 40% (Martorelli và ctv., 2010)

Owen và ctv., (1992) đã báo cáo sự hiện của IHHNV trong tự nhiên ở Australia (Úc) thuộc vùng Ấn Độ - Thái Bình Dương Năm 2008, dạng lây nhiễm

của IHHNV được tìm thấy trên tôm P monodon nuôi ở Úc (Saksmerprome và ctv., 2010) Ngoài ra, IHHNV được phát hiện ở P stylirostris được nhập khẩu vào

Polynesia (thuộc địa Pháp) và Guam để nuôi trồng (Costa và ctv., 1998; Tang và ctv., 2002)

Ở Châu Á, virus này đã được tìm thấy ở kiện hàng tôm P vannamei nhập khẩu

từ tôm nuôi ở Đài Loan vào năm 1986 (Lightner và ctv., 1987) Sau đó, những báo

cáo về sự hiện diện của virus này trên tôm P monodon hoang dã và nuôi ở các nước

thuộc vùng Đông Á (Trung Quốc và Đài Loan), Đông Nam Á (Singapore, Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Philippin) và Ấn Độ (Flegel, 1997; Lightner và ctv., 1996; Tang và ctv., 2003; Rai và ctv., 2009) Những nghiên cứu gần đây cho thấy

sự hiện diện của IHHNV trên tôm P monodon hoang dã ở Brunei với sự lưu hành

thấp khoảng 14,1 % (Claydon và ctv., 2010) Một cuộc điểu tra ở Trung Quốc cho

thấy sự hiện diện của vius này ở cua biển hoang dã Hemigrapsus penicillatus ở

miền bắc Trung Quốc (Zhang và ctv., 1997) Hơn nữa, sự lưu hành của IHHNV ở tôm và cua thu thập từ các vùng nuôi trồng thủy sản lần lượt là 51,5 % và 8,3 % (Yang và ctv., 2007) Gần đây Virus IHHN cũng đã được nghi nhận trên tôm thẻ nuôi ở Hàn Quốc và trong nước (Kim và ctv., 2011) Ở nuôi trồng thủy sản nước ngọt, sự xâm nhiễm trong tự nhiên của IHHNV ở giai đoạn ấu trùng và cận trưởng

thành của Macrobrachium rosenbergii được công bố ở miền nam Đài Loan và

Malaysia (Hsieh và ctv., 2006) Một nghiên cứu ở Malaysia cho thấy sự hiện diện

của IHHNV ở tôm giống M rosenbergiii với sự lưu hành khoảng 20 %

(Hazreen-Nita và ctv., 2012)

2.4 Các nghiên cứu IHHNV trên tôm nuôi ở Việt Nam

Kể từ khi IHHNV được tổ chức thú y thế giới (OIE) xếp loại vào một trong những virus gây thiệt hại đến nghề nuôi tôm, đặc biệt là tôm xanh và tôm thẻ chân trắng, đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến loại virus này Tuy nhiên, trên tôm sú nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long nói riêng và ở Việt Nam nói chung, chỉ có ít

nghiên cứu liên quan đến việc phát hiện IHHNV nhiễm trên tôm sú và đặc tính di truyền cũng như phân bố của chúng Nghiên cứu về tần xuất hiện diện và sự lan truyền của IHHNV trên tôm sú nuôi rất hạn chế Chỉ có một vài nghiên cứu gần đây của nhóm nghiên cứu Hùng và ctv (2009) đánh giá về tần xuất xuất hiện IHHNV trên tôm sú ở một số lượng mẫu rất hạn hẹp, 307 mẫu (tỷ lệ nhiễm 160/307 ≈ 52,12%), cũng như phân tích trình tự bộ gen của virus (An và ctv., 2009) Các thông tin về sự hiện diện của IHHNV và tác động lên tôm sú nuôi tại Việt Nam vẫn chưa được làm rõ Hiện tại chỉ có 1 nghiên cứu giải trình tự bộ gen chủng IHHNV thu nhận từ mẫu tôm ở Bạc Liêu, kết quả cho thấy bộ gen IHHNV từ mẫu nghiên cứu này có kích thước 3815 bp, có độ tương đồng cao nhất 98% với chủng IHHNV phân lập ở Đài Loan, 97% với chủng IHHNV Thái Lan (An và ctv., 2009) Tuy nhiên, do sự du nhập tôm bố mẹ từ nhiều nguồn khác nhau nên rất có thể có sự đa dạng về di truyền của các chủng IHHNV truyền nhiễm hiện diện tại ĐBSCL Sự thiếu hụt các hiểu biết về IHHNV trong hệ thống nuôi tôm sú tại Việt Nam làm lúng túng trong việc chọn lựa phương pháp xét nghiệm để kiểm soát chất lượng tôm nuôi

2.5 Các kỹ thuật chẩn đoán bệnh IHHNV hiện nay

Khi tôm nhiễm bệnh, IHHNV được tìm thấy ở rất nhiều bộ phận như mang, biểu bì ruột trước, tuyến râu, dây thần kinh…(Lightner và ctv.,1983) Những bộ phận này thường được sử dụng để chẩn đoán bệnh

2.5.1 Dựa trên dấu hiệu lâm sàng

Tôm sú nhiễm IHHNV khi hấp hối có màu xanh lơ (hình 2.2) và hệ cơ vân ở phần bụng có thể bị mờ đục (Rai và ctv, 2009) Ngoài ra IHHNV hiện diện trên tôm

sú cũng gây ra hội chứng RDS làm biến dạng lớp vỏ kitin Chùy đầu sẽ bị uốn cong hoặc dị dạng, râu bị nhăn nhúm lại, vỏ kitin thì bị xùi, tôm kém ăn (Bell và Lightner., 1984; Kalagayan và ctv., 1991; Primavera và Quinitio., 2000) Tuy nhiên, dấu hiệu lâm sàng không phải luôn luôn rõ ràng, dễ nhầm lẫn với dấu hiệu các cơ quan gây ra bởi các bệnh khác như bệnh đốm trắng WSSV

Hình 2.2 Tôm sú (P monodon) 50 ngày tuổi bị nhiễm IHHNV với các kích thước

khác nhau (Rai và ctv., 2009) P monodon bị nhiễm IHHNV khi gần chết có màu xanh biếc, hệ cơ ở phần bụng có thể mờ đục

2.5.2 Phương pháp mô học

Đây là phương pháp sử dụng phổ biến nhất trong chẩn đoán bệnh thủy sản (Lightner và ctv., 1983; Bell và Lightner., 1984) Các tế bào bị bệnh xuất hiện ở mang, biểu bì, dưới vỏ, biểu mô phía trước, ruột sau, dây thần kinh, hạch thần kinh cũng như ở cơ quan tạo máu, tuyến anten, tuyến sinh dục, cơ quan bạch huyết và

mô liên kết Nội nhân bắt màu thuốc nhuộm Eosin (với thuốc nhuộm H&E), các thể vùi Cowdry type A (CAIs) hình 2.3 sẽ giúp cho việc dự chẩn nhiễm virus IHHNV Nhân của tế bào bệnh bị phồng to với thể vùi trung tâm bắt màu Eosin đôi khi bị tách ra từ chất nhiễm sắc có viền bằng một vòng không bắt màu, được lưu giữ bằng các chất cố định có chứa axit acetic Ngoài vấn đề thời gian kỹ thuật này thực tế không đủ nhạy để phát hiện giai đoạn sớm, thường chỉ cho kết quả chính xác khi tôm nhiễm bệnh nặng, cũng như dấu hiệu bệnh lý tế bào của một số bệnh giống nhau, dễ nhầm lẫn Kính hiển vi điện tử được áp dụng để chẩn đoán song rất đắt tiền

Hình 2.3 Một lát cắt mô học trên tôm sú nhiễm IHHNV nhuộm với H& E ở độ

phóng đại 1000X lần cho thấy các thể vùi nội nhân bắt màu Eosin (thể vùi Crowdry type A) đặc trưng cho nhiễm virus IHHNV (Rai và ctv., 2009)

2.5.3 Lai Dot Blot

Kỹ thuật dot blot đã được ứng dụng nghiên cứu IHHNV và chỉ ra sự hiện diện của IHHNV ở tôm cái và tôm đực là khác nhau (Morales−Covarrubia và ctv., 1999) ngoài ra lai dot blot còn dùng thử nghiệm độ nhạy và độ đặc hiệu với DNA IHHNV, kết quả cho thấy các đầu dò DNA có độ nhạy cao và độ đặc hiệu mạnh mẽ với DNA IHHNV không có DNA tôm, độ nhạy là 24.8 pg (Zhi−Qin Yue và ctv., 2006) Nhưng phương pháp này cũng có nhược điểm là phân tích, định lượng các phân tử lai kém chính xác, hiệu quả thấp, do một phần các nucleic acid được cố định trên giá thể bị che khuất, không tiếp xúc với các trình tự bổ sung

2.5.4 Real−time PCR

Phương pháp Real−time PCR là một trong những cải tiến mới nhất của kỹ thuật PCR Real-time PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA (hay RNA) được theo dõi trực tiếp trên máy luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt Do đó có thể phát hiện và định lượng được nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh quang (Tang và ctv., 2000) Kỹ thuật Real−time PCR được ứng dụng nghiên cứu IHHNV và biết được độ nhạy của phương pháp này dùng chẩn đoán DNA IHHNV trong mẫu là 0.15 pg (Khawsak và ctv., 2008) Bên cạnh

đó phương pháp này còn được dùng trong phát hiện IHHNV trên các cơ quan khác

nhau của tôm sú bố mẹ hoang dã, thế hệ con của chúng (Chayaburakul và ctv., 2005) Hiện đã có bộ kit Real-time PCR (IHHNV) (trung tâm công nghệ sinh học

Tp Hồ Chí Minh., 2008) Tuy nhiên kỹ thuật Real-time PCR đòi hỏi phòng thí nghiệm phải có trang thiết bị máy hiện đại, giá thành khá cao và người phân tích phải có kiến thức cơ bản về chúng

2.5.5 Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization)

Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử trong đó trình tự nucleic acid cần tìm (trình

tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô lai tại chỗ cho phép nghiên cứu nucleic acid mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra khỏi mô, tế bào Hiện nay phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) cũng được phát triển để chẩn đoán bệnh IHHNV (Mari và ctv., 1993; Jimenez và ctv., 1999), phát hiện IHHNV ngay trên mẫu mô mà không cần li trích DNA Kỹ thuật này được dùng để nghiên cứu sự thay đổi tế bào và mẫn cảm giữa hai loài tôm sú và tôm thẻ chân trắng khi nhiễm IHHNV (Chayaburakul và ctv., 2005) Mẫu dò đặc hiệu với virus IHHNV được đánh dấu và đem lai trực tiếp với DNA virus trên mô đích trong điều kiện nghiêm ngặt Phương pháp này nhạy và mang tính đặc hiệu cao nhưng lại cần thời gian dài để hoàn thành (2 – 3 ngày)

2.5.6 Phương pháp kháng thể đơn dòng

Phương pháp kháng thể đơn dòng cũng được xem như là 1 công cụ ứng dụng cho những nghiên cứu khác về IHHNV Kháng thể đơn dòng này có thể phát hiện IHHNV ở độ nhạy 0.1–0.5 x 10−3 μg/μl GP3 protein Đồng thời cũng thể hiện băng

đậm khi phát hiện vi khuẩn E Coli chứa protein tái tổ hợp GP3−pET15b ở vị trí 37

kDa với độ pha loãng 1:100 Hơn thế nữa, kháng thể với nồng độ 1:10 cũng cho phản ứng đặc hiệu khi bao xung quanh các thể vùi IHHNV ở nhiều bộ phận của tôm

bị nhiễm IHHNV như mang, dây thần kinh, cơ và tế bào biểu bì (Hằng và Flegel., 2008) Nhưng phương pháp này không đề cập đến chẩn đoán IHHNV lây nhiễm hay không lây nhiễm

2.5.7 Phương pháp khuyếch đại đẳng nhiệt LAMP (Loop−mediated isotheral amplification)

Phương pháp LAMP được Tsugunori Notomi và các cộng sự công bố năm

2000 (Notommi và ctv., 2000) Phương này cho phép phát hiện số lượng DNA mẫu ban đầu rất nhỏ chỉ vài bản mẫu cho tới 100 bản mẫu gốc Trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh trên tôm nuôi, phương pháp LAMP đã được phát triển để phát hiện cho nhiều tác nhân virus gây bệnh nguy hiểm trên cá và các thủy sản khác (Savan và ctv., 2005) Phương pháp LAMP cũng được công bố cho phép phát hiện IHHNV với giới hạn phát hiện là 5− 500 bản sao của bộ gen IHHNV bằng cách xác định sản phẩm theo phương pháp đo độ đục và quan sát sự đổi màu với thuốc nhuộm SYBR Green

I, kết quả so sánh còn cho thấy phương pháp LAMP cũng cho phép phát hiện IHHNV nhạy hơn 100 lần so với phương pháp PCR thông thường (Sun và ctv., 2006)

So với các phương khác truyền thống, LAMP được xem có nhiều điểm ưu việt như không cần thiết bị luân nhiệt và thời gian khuếch đại ngắn hơn (40−60 phút), ngoài ra, độ nhạy của phản ứng cũng tăng cao 10 − 100 lần so với phương pháp PCR truyền thống (Savan và ctv., 2005), do vậy việc áp dụng phương pháp này trở nên dễ dàng hơn cho nhiều phòng thí nghiệm không trang bị máy luân nhiệt mà thay vào đó chỉ cần bể ủ nhiệt (water bath) hoặc thiết bị nhiệt khô (heating block) Mặc

dù mới được giới thiệu nhưng số lượng công trình nghiên cứu sử dụng phương pháp LAMP như một công cụ chẩn đoán tăng lên đáng kể trong một vài năm gần đây đã cho thấy tính hấp dẫn của phương pháp này Nhưng nhìn chung thì LAMP vẫn còn

là một phương pháp mới và đang được nghiên cứu thêm

2.5.8 Phương pháp PCR

Phương pháp PCR được ứng dụng phát hiện IHHNV từ các động vật biển (Shi

và ctv., 2003) Hiện có nhiều quy trình PCR được công bố từ các nhóm nghiên cứu trên toàn thế giới như PCR phát hiện IHHNV (Nunan và ctv., 2000; Rai và ctv., 2009) Một số quy trình PCR còn cho phép phát hiện phân biệt IHHNV lây nhiễm

và không lây nhiễm (Tang và ctv., 2007; Saksmerprome và ctv., 2010) Đến nay, PCR vả realtime PCR được xem là một trong những phương pháp hiện đại, nhanh

chóng và cho kết quả chính xác nhất trong chẩn đoán IHHNV (Tang và Lightner., 2001; Dhar và ctv., 2001) Multiplex reverse transcription polymerase (mRT-PCR) cũng được phát triển để chẩn đoán đồng thời 6 loại virus khác nhau gây bệnh trên tôm bao gồm IHHNV với độ nhạy phát hiện IHHNV là 0.15pg trong phản ứng (Khawsak và ctv., 2008) Yang và ctv (2006) đã phát triển PCR một bước phát hiện đồng thời 2 virus WSSV và IHHNV nhiễm trên một mẫu tôm với độ đặc hiệu khá cao Gần đây, Chen và ctv (2012) cũng đã phát triển multiplex PCR phát hiện IHHNV và WSSV mới nhiễm trên tôm với độ nhạy cá 1x 103 copy DNA trong bản mẫu Khắc phục được những nhược điểm của các phương pháp nêu trên, phương pháp PCR cho kết quả nhanh (trong khoảng 4 giờ) và có độ tin cậy cao Kết quả thu được mang tính khách quan, trung thực khi người phân tích kết quả tốt Do những

ưu điểm trên chúng tôi đã chọn phương pháp PCR để thực hiện đề tài này

2.5.9 Các nghiên cứu PCR về chẩn đoán IHHNV lây nhiễm trên tôm nuôi

ở Việt Nam

Nhờ tiến bộ về công nghệ sinh, các phương pháp chẩn đoán tác nhân gây bệnh trên thủy sản ngày càng đa dạng và phong phú như: chẩn đoán dựa trên vật liệu di truyền hoặc phản ứng miễn dịch đặc hiệu với tác nhân gây bệnh Trong đó, PCR là phương pháp được đánh giá có hiệu quả và độ tin cậy cao Các đơn vị nghiên cứu trong nước (Viện công nghệ sinh học, trường Đại học và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản) đã phát triển áp dụng nhiều công cụ chẩn đoán giúp cho việc sàng lọc con giống sạch bệnh Hiện nay, một số nghiên cứu về IHHNV đã được đưa vào ứng dụng và thương mại như bộ Kit Mono PCR (IHHNV) hay bộ hóa chất cho phép phát hiện đồng thời ba virus WSSV, MBV, IHHNV (Trung tâm công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh., 2008) Tuy nhiên bộ hóa chất này không đề cập đến chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm hay không lây nhiễm Công ty Nam Khoa cũng đưa ra bộ hóa chất phát hiện đồng thời và phân biệt type IHHNV lây nhiễm và type A IHHNV không lây nhiễm dựa trên hai cặp mồi 309F/R và MG831F/R do OIE công bố Đại học Cần Thơ cộng tác với Thái Lan đã tạo được dòng kháng thể đơn dòng nhận diện protein 37 kDa của IHHNV (Hằng và Flegel.,

2008) nhưng cũng không đề cập đến chẩn đoán IHHNV lây nhiễm hay không lây nhiễm

Trong quần đàn tôm sú tự nhiên, sự xuất hiện hai dạng trình tự “related sequences IHHNV” (Type không lây nhiễm) gồm type 3A và type 3B chèn trong

bộ gen của tôm sú đã được công bố Hai trình tự của type 3A và type 3B được cho

là có nguồn gốc từ IHHNV và có độ tương đồng về trình tự cao với virus này, đồng thời, sự hiện diện của chúng trong bộ gen tôm cũng không gây ra triệu chứng bệnh hoặc truyền bệnh Do trình tự bộ gen IHHNV nhỏ và sự xuất hiện trình tự Type 3A

và Type 3B (khoảng 2,9 kb) trong bộ gen của tôm sú đã gây ra sự nhầm lẫn trong chẩn đoán sự lây nhiễm IHHNV ở nhiều phương pháp PCR Nghiên cứu một phần trình tự type 3A và type 3B trên các mẫu tôm thu được từ 5 tỉnh sẽ cho phép chọn lựa được phương pháp PCR thích hợp cho ứng dụng phát hiện sớm IHHNV tại Việt Nam

IHHNV được cho lây nhiễm ở tất cả các giai đoạn phát triển của tôm thẻ chân trắng và sự truyền lan được xác định diễn ra theo cả chiều ngang và chiều dọc Mặc

dù có nhiều báo cáo cho biết IHHNV có hiện diện trên tôm sú và gây một số biểu hiện chậm lớn và biến dạng nhưng chưa có thông tin về sự lây nhiễm IHHNV trên tôm sú ở các giai đoạn khác nhau trong vòng đời của loài này Nghiên cứu trong đề tài này sẽ thực hiện giám sát sự diện diện của IHHNV ở tất cả các giai đoạn trong vòng đời của tôm sú tại các trại sản xuất giống và trại nuôi, ở cả mô hình trại có mức độ an toàn sinh học cao và mức độ an toàn sinh học thấp Nghiên cứu cũng được thực hiện trên cả mô hình nuôi công nghiệp tại trại lớn, trại nhỏ và mô hình nuôi quảng canh để nắm được sự truyền nhiễm IHHNV trên các mức độ quản lý nuôi khác nhau Do nguồn giống tôm sú được sản xuất nhiều tại khu vực Miền Trung và chuyển vào các vùng nuôi ở ĐBSCL nên mẫu tôm bố mẹ và tôm giống trong nghiên cứu sẽ được thu tại các trại sản xuất ở Miền Trung và cả ĐBSCL Trong khi đó, mẫu tôm nuôi thương phẩm sẽ được thu và phân tích từ các ao nuôi ở các tỉnh ĐBSCL Kết hợp với thông tin điều tra và kết quả phân tích sự hiện diện IHHNV Type 1, 2 để bước đầu đánh giá mối quan hệ giữa việc nhiễm IHHNV và khả năng gây bệnh trên tôm sú nuôi

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Nghiên cứu đặc trưng di truyền của chủng IHHNV thu nhận ở

Việt Nam

1.1 Khảo sát thu mẫu

1.2 Phân lập, dòng hóa và giải trình tự bộ gen IHHNV type lây nhiễm

1.3 Phân lập, dòng hóa, giải trình tự và định danh IHHNV TypeA/B

1.4 Phân tích cấu trúc vật liệu di truyền các type IHHNV và mối quan hệ giữa chúng

Nội dung 2: Lựa chọn phương pháp tối ưu phát hiện IHHNV trên tôm sú nuôi

2.1 Nghiên cứu ứng dụng phương pháp PCR phát hiện IHHNV type lây nhiễm 2.2 Nghiên cứu ứng dụng phương pháp LAMP phát hiện IHHNV type lây nhiễm 2.3 So sánh và lựa chọn phương pháp tối ưu phát hiện IHHNV type lây nhiễm

Nội dung 3: Nghiên cứu xác định phương thức truyền lan theo trục dọc và trục ngang của IHHNV trên tôm sú trong phòng thí nghiệm

3.1 Phương thức truyền lan theo trục dọc

3.2 Phương thức truyền lan theo trục ngang cùng loài

3.3 Phương thức truyền lan theo trục ngang khác loài

Nội dung 4: Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện, truyền lan và các giải pháp hạn chế IHHNV trên tôm sú

1.1 Đánh giá sự hiện diện và truyền lan của IHHNV trên tôm sú

1.2 Các giải pháp hạn chế sự truyền lan của IHHNV trên tôm sú

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Thời gian nghiên cứu từ tháng 1/2011 tới cuối tháng 3/2014 tại Trung tâm Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ, Trung tâm giống Hải sản Nam Bộ và Khu thực nghiệm Gò Vấp thuộcViện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

1.2 Vật liệu

1.2.1 Mẫu tôm

Mẫu tôm sú nuôi thương phẩm, tôm sú giống, tôm ấu trùng, tôm sú bố mẹ và tôm thẻ chân trắng trong nghiên cứu được thu từ các ao nuôi ở ĐBSCL và Miền Trung từ năm 2011-2014 Mẫu tôm nhiễm IHHNV type lây nhiễm được cung cấp từ trường Đại học Arizona, Mỹ

1.2.2 Thu và bảo quản mẫu

Mẫu tôm postlarvae nguyên con, tôm nuôi thương phẩm, tôm bố mẹ gồm phần mang và chân bơi được cố định trong cồn và bảo quản ở 4°C hoặc −20°C & −80°C

1.2.3 Mồi sử dụng đã được thiết kế và công bố trên các tạp chí của thế giới

Để khuếch đại DNA của virus IHHNV type lây nhiễm và type A/B chúng tôi

sử dụng các mồi đã được công bố trên các công trình nghiên cứu của thế giới và thiết kế đã được trình bày trong bảng 6.1

Bảng 6.1 Mồi được thiết kế và công bố trên các tạp chí của thế giới

vnIHR

5’− AATTGCTTCGAGAACGCACG−3’

5’− GGACATGGTCCGTCTACTGC−3’

997

NỘI DUNG I: NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƯNG DI TRUYỀN CỦA CHỦNG IHHNV THU NHẬN Ở VIỆT NAM

Mục tiêu: Sự đa dạng di truyền các chủng IHHNV ở các vùng địa lý khác

nhau đã được nghi nhận trên tôm sú nuôi Ở Việt Nam, sự du nhập tôm bố mẹ từ nhiều nguồn khác nhau nên có thể có sự đa dạng về di truyền của các chủng IHHNV truyền nhiễm hiện diện tại ĐBSCL là rất cao Do vậy, việc thu mẫu ở các vùng khác nhau và giải trình tự IHHNV sẽ cho biết được cấu trúc vật liệu di truyền các chủng IHHNV tại Việt Nam và mối quan hệ di truyền với các chủng trên thế giới IHHNV Qua đó hiểu rõ hơn về đặc tính di truyền như đột biến dẫn đến ảnh hưởng độc lực của chủng IHHNV và sự tiến hóa trong di truyền của chủng IHHNV phân lập trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL để tìm ra những kỹ thuật chẩn đoán phù hợp nhằm phát hiện hiệu quả bệnh này là một yêu cầu cấp thiết trong nghiên cứu và phòng ngừa bệnh do IHHNV cho tôm nuôi cũng như cung cấp thông tin về đặc tính

di truyền của chúng cho nhà quản lý để kiểm soát sự lan rộng của IHHNV trên tôm nuôi ở Việt Nam

1 Khảo sát thu mẫu

Mẫu tôm sú nuôi thương phẩm (1-2 tháng sau khi thả nuôi) được thu trực tiếp ngẫu nhiên từ các ao nuôi tôm ở các tỉnh ĐBSCL như Bến Tre, Kiên Giang, Sóc Trăng, Tiền Giang và Bạc Liêu, tôm bố mẹ được thu từ các trại giống ở Vũng Tàu, ĐBSCL Tôm sú giống được thu từ những nông hộ bắt giống từ Miền Trung mang về nuôi ở ĐBSCL Các mẫu tôm sú được thu từ cuối tháng 12 năm 2010 đến tháng 8 năm 2013 Mẫu tôm mẹ được bảo quản âm sâu (-800C) để làm nguồn vật liệu ly trích virus Đối với mẫu post và tôm nuôi thương phẩm sau khi thu nhận sẽ được ghi lại thông tin lâm sàng và bảo quản trong cồn 95% để phân tích sự hiện diện IHHNV các type khác nhau

2 Sàng lọc mẫu tôm nhiễm IHHNV type lây nhiễm và không lây nhiễm

Do IHHNV có type lây nhiễm và type A/B không lây nhiễm nên sàng lọc mẫu cần sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau đã được nghiên cứu, đặc hiệu cho mỗi type Dựa vào các điều kiện đã tối ưu và chu trình luân nhiệt của các cặp mồi đã

được công bố chúng tôi thiết lập lại phản ứng PCR với hóa chất hiện có tại phòng thí nghiệm

Sau khi sàng lọc các mẫu tôm có sự hiện diện type lây nhiễm và không lây nhiễm bằng các qui trình PCR phát hiện type lây nhiễm (OIE., 2009; Saksmerprome

và ctv., 2010) Các mẫu tôm này sẻ được tiếp tục sàng lọc type không lây nhiễm bằng các quy trình PCR chẩn đoán IHHNV type A/B của Tang và ctv (2007) với cặp mồi IHHNV ABF/R và MG831F/R, dựa theo công bố của tác giả chúng tôi sử dụng cặp mồi IHHNV ABF/R sàng lọc type A/B để thực hiện PCR với các điều kiện phản ứng của quy trình: tổng thể tích 50 µl hỗn hợp phản ứng PCR, thành phần cho mỗi phản ứng như sau: 10 µl Buffer Flexi 5X, 3 µl MgCl2 (25 mM), 1 µl dNTP (10 mM) (Promega, Mỹ), 0.5 µl MG831F (50 µM) và 0.5 µl MG831R (50 µM), 0.25 µl Go Taq Flexi polymerase 5 U/µl (Promega, Mỹ), thêm H20 khử ion cho đủ

48 µl, 2 µl mẫu DNA Chu kì luân nhiệt cho phản ứng như sau: 1 chu kì gồm: 94°C trong 5 phút; 30 chu kì gồm: 94°C trong 30 giây, 56°C trong 45 giây, 72°C trong 45 giây; 1 chu kì: 72°C trong 7 phút, 4°C cho đến khi sử dụng

Thành phần phản ứng của các quy trình chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm của OIE (2009) với cặp mồi IHHNV 77012F/77353R, IHHNV 309F/R và IHHNV 279F/940R cũng giống như thành phần phản ứng sàng lọc type A/B Phương pháp sàng lọc theo giả định để chọn mẫu giải trình tự theo bảng 6.2

Bảng 6.2 Giả định kết quả sàng lọc mẫu nhiễm IHHNV type A/B

Kết quả giả

định

IHHNV 77012F/773 53R

IHHNV 279F/940R

IHHNV 309F/R

MG831 F/R

IHHNV ABF/R

Chọn mẫu giải trình

phương pháp PCR với với cặp mồi IHHNV 279F/940R hoặc IHHNV 77012F/77353R và 309F/R đặc hiệu cho virus IHHN gây bệnh) Sau đó sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi IHHNV ABF/R để xác định sự hiện diện IHHNV type A/B trong những mẫu nghi nhiễm IHHNV type A/B đã chọn trên Ngược lại, các mẫu DNA thỏa điều kiện sàng lọc ở trên sẽ được nhân dòng và giải trình tự Những mẫu nhiễm IHHNV type lây nhiễm (xác nhận dương tính với với cặp mồi IHHNV 279F/940R hoặc IHHNV 77012F/77353R và 309F/R) sẽ được chọn đi giải trình tự gen cho IHHNV type lây nhiễm

3 Dòng hóa và giải trình tự

3.1 Đối với IHHNV type A/B

Khuếch đại đoạn DNA IHHNV type A/B có kích thước 1,2 kb trên mẫu tôm bằng phương pháp PCR với cặp mồi IHHNV ABF và IHHNV ABR (Tang và ctv.,

2007) với enzyme DNA polymerase Pfu (Invitrogen, Mỹ) Sau đó gắn đuôi poly A

vào sản phẩm khuếch đại sẽ được nối với vector pGEM T-easy Vector tái tổ hợp

pGEM T-easy-IHHNV type A/B được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli JM 109

Tế bào vi khuẩn mang gen tái tổ hợp được nhân sinh và tinh sạch sạch bằng Kit Wizard®Plus SV Miniprep DNA purification system (Promega, Mỹ) từ sinh khối nói trên Vector pGEM T-easy chứa đoạn sản phẩm khuếch đại sau đó sẽ được ly trích bằng bộ hóa chất SV Winzad miniprep (Promega, Mỹ) và giải trình tự trên cả

2 mạch bằng mồi trên vector pGEM T-easy (thực hiện giải trình tự tại Cty Nam Khoa)

3.2 Đối với IHHNV type lây nhiễm

Sau khi sàng lọc các mẫu tôm nhiễm IHHNV bằng các qui trình PCR chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm của OIE (2009) với cặp mồi IHHNV 77012F/77353R, IHHNV 309F/R cùng quy trình của Saksmerprome và ctv (2010) với cặp mồi IHHNV 279F/940R và khẳng định mẫu tôm không nhiễm virus IHHN type A/B bằng cặp mồi IHHNV ABF/R Tiến hành gửi mẫu cho công ty Nam Khoa giải trình

tự bằng các cặp mồi genome walking bảng 6.3 Phân tích giải trình tự các đoạn DNA của IHHNV đã tinh sạch trên máy 313xl Genetic Anzyzer với bộ kít

BigDye® Terminator V3.1 Cycle Sequencing Sau khi giải trình tự, dùng phần mềm BioEdit nối các trình tự này lại thành bộ gen hoàn chỉnh

Bảng 6.3 Trình tự từng cặp mồi để khuếch đại gen IHHNV type lây nhiễm để giải

trình tự do Công ty Nam Khoa cung cấp

Số thứ tự Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) Kích thước

3.2.1 Phân tích cấu trúc di truyền các type IHHNV

Trình tự DNA của đoạn gen IHHNV type A/B và bộ gen IHHNV type lây nhiễm thu nhận trên các tỉnh sẽ được phân tích trên nhiều phần mềm trên máy tính

và trang web, so sánh độ tương đồng nucleotide (nt), amino acid (a.a) của chủng thu nhận được từ các tỉnh ở Việt Nam với các chủng trên ngân hàng gen (Genbank) bằng chương trình Clustal W 2.1 của phần mềm DNASTAR Lasergene V7.1.0 và http://www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=clustalw2 Để khẳng định trình tự IHHNV type lây nhiễm thu nhận được sử dụng chương trình phân tích,

so sánh Basic local alignment search tool (BLAST) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Theo các nghiên cứu của Shike và ctv (2000) bộ gen của IHHNV gồm 3 vùng, các vùng này mã hóa cho các loại protein khác nhau (protein giả định 1 (NS1), protein giả định NS2 và protein vỏ) gồm vùng gen ORF1, ORF2 và ORF3 tìm kiếm khung đọc mở mã hóa protein (ORF) trên bộ gen virus IHHN thu nhận bằng chương trình (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) và Vector NTI 15.6 (Invitrogen, Mỹ)

Chương trình mã hóa cho trình tự DNA của bộ gen thành amino acid giả định ExPASy (http://us.expasy.org) và Vector NTI 15.6 được dùng để phân tích bộ gen

và dịch mã từ nucleotide thành amino acid trên các đoạn ORF của bộ gen IHHNV

- Xác định khung đọc mở: Sử dụng các phần mềm Vector NTI 15.6 để xác định các đoạn ORF và dịch mã giả định từ trình tự nucleotide sang trình tự amino acid

- Xác định promoter giả định đóng vai trò điều hòa phiên mã: Promoter là vùng gần vị trí bắt đầu phiên mã của bộ gen, có vai trò trong điều hòa, chúng thường nằm phía trước vùng trình tự có chức năng mã hóa Promoter có chiều dài khoảng 100-1000 nucleotide Vùng lỏi promoter thường có bán kính 35 nt tình theo chiều ngược hoặc chiều xuôi kể từ điểm bắt đầu phiên

mã +1 Lỏi của promoter như hộp TATA, yếu tố khởi đầu (Inr), và lỏi chiều xuôi –DPE Để xác định promoter, chương trình Neural Network Promoter Prediction (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)

- Phân tích chức năng các vùng của bộ gen: Sử dụng chương trình Vector NTI 15.6 để xác định các vùng chức năng như NTP, enzyme helicase của họ parvovirus

3.2.2 Phân tích mối quan hệ và cây tiến hóa di truyền

Việc so sánh trình tự virus thu nhận được ở Việt Nam và các nước khác nhằm để đánh giá mối quan hệ tiến hóa của IHHNV Khi hai trình tự gen hay trình

tự acid amino có độ tương đồng cao thì thường chúng có trình tự bảo tồn cao và có trình tự tổ tiên chung Ngoài ra khi so sánh nhiều trình tự để cung cấp các thông tin

về trình tự giống nhau trong tập hợp các trình tự đang so sánh

Xác định các mối quan hệ và tiến hóa di truyền giữa các chủng IHHNV thu nhận ở Việt Nam thu được trong nghiên cứu này được so sánh với các chủng IHHNV trong khu đã công bố trên ngân hàng gen thế giới bằng phần mềm MegAlig (DNASTAR Lasergene V7.1.0) So sánh trình tự 2,9 kb của bộ gen chủng IHHNV

thu nhận từ tôm sú (P monodon) với nhau, hoặc so sánh với các bộ gen IHHNV đã

công bố trên thế giới (Type không lây nhiễm Tanzania AY124937, Madagascar

type A DQ228358, Úc type A EU675312) Type lây nhiễm phân lập ở Thái Lan

2000 AY102034, Thái Lan 2003 AY263547, Đài Loan A AY355306, Đài Loan B AY355307, Đài Loan C AY355308, Ấn Độ GQ411199, Ecuador AY362548, Trung Quốc EF633688, Hawaii (Mỹ) AY218266, Úc (GQ475529) và Mexico AF273215 Các dữ liệu trình tự nucleotide của bộ gen IHHNV phân lập trên tôm sú ở ĐBSCL, Miền Trung và trình tự nucleotide bộ gen của IHHNV từ các nước khác sẽ được phân tích bằng phần mềm này Kết quả sẽ xác định được nguồn gốc của chủng IHHNV phân lập và chủng IHHNV trên thế giới Cây tiến hóa di truyền được xây dựng bởi các thuật toán neighbor-joining dựa trên tính toán giữa khoảng cách trình

tự nucleotide giữa đại diện IHHNV và giữa các nhóm bằng cách sử dụng phần mềm MegAlig Độ dài nhánh ngang là tỷ lệ thuận với khoảng cách di truyền, số hiển thị

là độ dài của nhánh chính xác hơn 70% ở độ tái lập lại 1000 Các chỉ số xác định có

độ tin cậy 95% trong cây di truyền

NỘI DUNG II: LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU PHÁT HIỆN IHHNV TRÊN TÔM SÚ NUÔI

Mục tiêu: Sự hiện diện của 2 type IHHNV A và B gắn vào bộ gen của tôm sú thì

việc lựa chọn quy trình PCR ứng dụng trên tôm sú phải được cân nhắc do có sự tương đồng rất lớn về vật liệu di truyền giữa các type IHHNV (trình tự 2.9 kb nucleotide của type A/B không lây nhiễm tương đồng 90−96% so với 4.1 kb của type IHHNV lây nhiễm) dẫn đến kết quả dương tính giả (Tang và ctv., 2006) Như vậy kết quả phân tích không thể phân biệt được mẫu mang vius IHHN có khả năng gây bệnh (type 1, type 2) hay mẫu mang IHHNV không gây bệnh (type A/ B) Điều này ảnh hưởng đến khâu chọn con giống ban đầu, giá trị thương phẩm của tôm nuôi Một nghiên cứu khác của các nhà khoa học Thái Lan trên tôm sú nuôi cho thấy, khi sử dụng qui trình IQ2000 (Đài Loan) và mồi 309F/R để khuếch đại gen IHHNV thì tỷ lệ dương tính giả chiếm tỷ lệ rất cao, vì có sự chèn ngẫu nhiên DNA của IHHNV vào bộ gen tôm mà vùng này là trình tự đích cho mồi của 2 qui trình trên bắt cặp Thêm vào đó, theo khuyến cáo của tổ chức thú y thế giới OIE (2009)

để khẳng định mẫu tôm nhiễm IHHNV type lây nhiễm thì ngoài sử dụng qui trình PCR có mồi 309F/R phát hiện virus cho kết quả dương tính còn phải sử dụng một quy trình PCR khác để khẳng định mẫu đó là dương tính virus IHHN thật Từ những lý do nêu trên, trong nghiên cứu này chúng tôi phát triển quy trình Multiplex PCR khuếch đoạn 2 vùng của một trình tự bộ gen IHHNV type lây nhiễm (chiếm 2/3 bộ gen) với cặp mồi vnIHF/vnIHR kết hợp mồi 309F/R để phát hiện virus thật IHHN nhiễm trên tôm nuôi Quy trình này được áp dụng để kiểm tra IHHNV ở tất

cả các giai đoạn tôm giống, tôm thương phẩm, tôm bố mẹ và tôm đông lạnh trên tôm sú và các loài tôm khác

1 Ly trích DNA virus từ tôm

1.1 Chuẩn bị mẫu

 Mẫu tôm giống: lấy toàn bộ phần đầu của tôm (có cả các cơ quan bên trong),

số lượng khoảng 100 − 150 con, tùy số lượng tôm trong đàn nhưng tổng trọng lượng không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0,1 gam, mẫu đã được cố định trong cồn 95o

 Mẫu tôm nuôi thương phẩm: lấy một phần nhỏ mang của 5 – 10 con nhưng tổng trọng lượng không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0.1 gam của mẫu tươi hoặc mẫu được cố định trong cồn 950

 Mẫu tôm mẹ: lấy mẫu tôm mẹ phức tạp hơn vì phải đảm bảo tôm vẫn còn sống

để tham gia sinh sản Do vậy, ưu tiên lấy mẫu chân bơi 2 hoặc một phần mang, mẫu được cố định trong cồn 950 Lượng mẫu lấy không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0.1 gam

1.2 Ly trích và tinh sạch DNA (Desoxyribonucleic Acid) virus

 Ly trích thô: Sử dụng 200 − 500 mg mô tôm nghiền trong 1 ml dung dịch NaOH − SDS (NaOH 0.025N, SDS 0.0125%) sau đó được đun sôi 10 phút và làm lạnh nhanh trong nước đá Sau khi ly tâm 13.000 vòng/10 phút, dịch nổi được sử dụng trực tiếp cho phản ứng PCR

 Ly trích tinh DNA của virus theo quy trình của Gudkovs (2008) có điều chỉnh:

sử dụng 200 − 500 mg mô tôm nghiền trong 500 µl dịch đệm ly trích DNA (50 mM Tris, pH8; 1 mM EDTA, pH8; 500 mM NaCl; 1% SDS), ủ trong nước đá 5 phút, sau đó đun ở 100°C trong 10 phút, lấy mẫu ra cho vào trong nước đá 5 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút Hút dịch nổi bên trên chứa DNA cho vào eppendorf 1.5 ml mới Sau đó tủa dịch nổi bằng 2 thể tích cồn tuyệt đối, ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút thu tủa DNA Loại bỏ dịch nổi, tủa DNA được làm khô ở 580C trong 10 phút, hòa tan cặn tủa DNA trong 200 µl nước khử ion và giữ ở

−20°C

2 Dòng hóa

Để thuận tiện cho việc nghiên cứu nhạy quy trình bằng cách tính số lượng bản copy mẫu trong 1 phản ứng, chúng tôi tiến hành dòng hóa đoạn DNA của IHHNV vào plasmid pGEM T-easy Mẫu DNA IHHNV được chọn để dòng hóa là mẫu đối chứng dương IHHNV được cung cấp từ trường Đại học Arizona Đoạn DNA của IHHNV có kích thước 2589 bp được khuếch đại với cặp mồi F1 5’−ACG AAC GAC CAC CCA TGG CA−3’ và 77353R 5′-TCG TAC TGG CTG TTC ATC-3′ (Trung và ctv., 2013; OIE., 2009) này dùng làm bản mẫu cho các qui trình PCR thiết kế và PCR của OIE đã công bố Qui trình PCR khuếch đại với 50 µM mỗi

mồi F1, 77353R và enzyme DNA polymerase Pfu rồi dòng hóa vào Vector pGEM T-easy và chuyển vào vi khuẩn E.coli JM109 (Promega, Mỹ) Plasmid pGEM T-

easy - IHHNV type lây nhiễm tiếp đó được tinh sạch từ vi khuẩn bằng Kit Wizard®Plus SV Miniprep DNA purification system (Promega, Mỹ,) sẽ được xác định nồng độ bằng phương pháp đo mật độ quang OD và số lượng bản sao (http://www.vsmmb.com/data/upload_file/File/PCR book 1) Đồng thời đoạn plasmid DNA IHHNV đại được sử dụng làm cho bản mẫu cho các cặp mồi khác và

để khảo sát giới hạn phát hiện virus trong các qui trình PCR

3 Phương pháp đo nồng độ DNA

Lấy 100 µl nước khử ion vô trùng vào cuvet 100 µl, đo đối chứng Hoà 10 µl dịch ADN cần đo vào 90 µl nước khử ion, trộn đều rồi bơm vào cuvet, đo ở bước sóng 260 nm, 280 nm Đọc độ hấp thụ trên máy đo quang phổ ở bước sóng 260 nm,

280 nm

4 Phương pháp tính số bản sao plasmid DNA

Với dung dịch plasmid DNA, chúng ta có thể tính được số bản sao plasmid DNA trong dung dịch có nồng độ (C ng) của plasmid DNA Cách tính như sau:

 1 mole của một cặp base trên đoạn DNA là có khối lượng 650 gr, do vậy plasmid dài L base (kể cả đoạn DNA chèn vào) sẽ có khối lượng (650 × L)

5 Phương pháp pha loãng nồng độ DNA

Dịch tách chiết DNA được pha loãng theo hệ số pha loãng bậc 10 Dùng micropipette hút 5 µl dịch tách chiết DNA cho vào 45 µl H20 khử ion, tiến hành trộn mẫu trên máy vortex ta sẽ được nồng độ pha loãng cao nhất, sau đó hút 5 µl mẫu từ ống eppendorf vừa vortex ở trên chuyển sang ống eppendorf thứ hai có chứa sẵn 45 µl nước khử ion, trộn đều Quá trình cứ lặp lại, sau cùng ta thu được một dãy

các nồng độ DNA theo chiều giảm dần đến eppendorf cuối sẽ có nồng độ DNA pha loãng thấp nhất

6 Phương pháp điện di trên gel agarose

Cân 1.5 g agrarose (Promega, Mỹ) cho vào chai thủy tinh, sau đó cho vào chai

100 ml dung dịch TBE 0.5 X Lắc chai cho agrarose hòa tan vào dung dịch TBE, sau đó đem đun trong microwave trong 3 phút ở 450 W (đun cho agrarose hòa tan hoàn toàn), agrarose sau khi đun xong để nguội khoảng 60oC rồi cho thêm 5 µl ethium bromide (nồng độ 10 mg/µl), trộn đều, đổ nhẹ dung dịch vào một đầu khay dung dịch sẽ tự trải đều khay Khoảng 30 phút sau gel đặc lại, lấy lược ra nhưng phải cẩn thận tránh bị bể gel Hút 2 µl dung dịch nạp mẫu 6X (40% glycerol, 0,25% bromophenol blue và 0,25% xylencyanol) nhỏ thành giọt ra giấy parafilm, sau đó hút 10 µl dung dịch sản phẩm khuếch đại trộn đều với dung dịch nạp mẫu và tiến hành nạp mẫu vào giếng của gel Sau khi nạp mẫu xong ta đậy nắp bể điện di lại và tiến hành chạy điện di ở 100V Thời gian điện di 30 phút Sau khi chạy điện di xong bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn gel và chụp hình trên bộ đọc gel Doc (Bio-Rad, Mỹ) Quan sát thấy DNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng

PHẦN 1: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN IHHNV TYPE LÂY NHIỄM

I PHÁT TRIỂN QUI TRÌNH MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN IHHNV TYPE LÂY NHIỄM

1.1 Thiết kế mồi cho phản ứng Multiplex PCR chẩn đoán IHHNV type lây

nhiễm

Hiện nay, có rất nhiều trình tự mồi của kỹ thuật PCR đã được công bố trên nhiều tạp chí và tạp chí hướng dẫn chẩn đoán virus gây bệnh trên động vật thủy sản (Rai., ctv 2012) Và nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy trên tôm sú nuôi có sự hiện diện của 2 type IHHNV A và B gắn vào bộ gen của tôm nuôi ở Thái Lan, Úc, Châu Phi và Ấn Độ Việc chẩn đoán IHHNV dựa trên vật liệu di truyền trở nên rất phức tạp bởi các biến thể di truyền của virus trong các khu vực địa lý khác nhau (Tang và ctv, 2006) Do đó việc lựa chọn quy trình PCR ứng dụng trên tôm sú phải được cân nhắc do có sự tương đồng rất lớn về vật liệu di truyền giữa các type IHHNV (trình

tự 2.9 kb nucleotide của type A/B không lây nhiễm tương đồng 90−96% so với 4.1

kb của type IHHNV lây nhiễm) (Saksmerprome và ctv., 2010) Một số phương pháp PCR có thể cho kết quả dương tính giả đối với virus truyền nhiễm IHHN type lây

nhiễm trên P monodon nếu mồi được thiết kế thuộc khu vực vật liệu di truyền

IHHNV của type A/B chèn vào hệ gen tôm (Tang và ctv., 2003; Krabsetsve và ctv., 2004; Tang và Lightner., 2006) Hiện nay cặp mồi khuếch đại IHHNV là 309F/R (Tang và ctv., 2007), 77012F/77353R (OIE., 2012) và Kít IQ 2000 (Inteligent, Đài Loan) phát hiện IHHNV type truyền nhiễm được đánh giá cao Tuy nhiên, gần đây theo nghiên cứu của Saksmerprome và ctv (2011) cho thấy có sự gắn chèn trình tự DNA ngẫu nhiên của IHHNV type lây nhiễm vào gen tôm sú Chính vì vậy, khi sử dụng các kỹ thuật PCR khuyến cáo hiện tại để phát hiện virus có thể cho kết quả dương tính giả

Theo khuyến cáo của tổ chức thú y thế giới OIE (2009) để khẳng định mẫu tôm nhiễm IHHNV type lây nhiễm thì ngoài sử dụng qui trình PCR mồi 309F/R phát hiện virus cho kết quả dương tính còn phải sử dụng một quy trình PCR khác để