ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN ĐỊNH DANH NẤM ĐƯỜNG SINH SẢN Ở PHỤ NỮ TRONG ĐỘ TUỔI SINH ĐẺ (18 - 49 TUỔI) ĐÃ CÓ CHỒNG TẠI THỊ XÃ QUẢNG YÊN TỈNH QUẢNG NINH (2013 - 2014)

Với tính cấp thiết của vấn đề và để xác định tỷ lệ thành phần loài nấm ĐSS, chúng tôi thực hiện nghiên cứu với mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen xác định tỷ lệ, t

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN ĐỊNH DANH NẤM ĐƯỜNG SINH SẢN Ở PHỤ NỮ TRONG ĐỘ TUỔI SINH ĐẺ (18 - 49 TUỔI) ĐÃ CÓ CHỒNG TẠI THỊ XÃ QUẢNG YÊN

TỈNH QUẢNG NINH (2013 - 2014)

Cao Bá Lợi*; Vũ Quyết Thắng* và CS

TÓM TẮT

398 phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ (18 - 49 tuổi) đã có chồng tại thị xã Quảng Yên, tỉnh Quảng Ninh được khám sản khoa và lấy mẫu xét nghiệm dịch âm đạo tìm ký sinh trùng Kết quả:

116 phụ nữ nhiễm Candida sp bằng phương pháp nuôi cấy trong môi trường Sabouraud,

sau đó, những phụ nữ này được xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR với gen mồi ITS1 và ITS4 và

sử dụng enzym phân cắt hạn chế Msp I để định danh loài nấm, kết quả: 95/106 (89,6%) mẫu

cho kết quả (+)

Lựa chọn 95 mẫu tiến hành thôi gel, 51 mẫu cho kết quả 2 băng, tiến hành thôi gel mỗi một băng ADN riêng rẽ và thu từng băng để giải trình tự Truy cập Ngân hàng Gen và phân tích

giám định loài 51 chuỗi gen cho thấy: 27 mẫu C glabrata, 15 mẫu C albicans, 6 mẫu C tropical,

2 mẫu C parapsilosis, 1 mẫu C krusei

* Từ khóa: Nấm đường sinh sản; PCR; Phụ nữ độ tuổi sinh đẻ; Quảng Ninh

Application of PCR and Electrophoresis Gel Sequencing for Quantification of Vaginal Candidiasis in 398 Married Women at Reproductive Age (18 - 49) in Quangyen, Quangninh (2013 - 2014)

Summary

The research was conducted in Quangyen, Quangninh provice on 398 married women at reproductive age (18 - 49) Obstetric examination was carried out, vaginal samples were examined

by Gram staining and cultured in Sabouraud medium for yeart gentital tract The result showed that 116 samples infected with Candida spp 106/116 samples were tested using PCR at Vietnam Institute of Biotechnology with ITS 1 - ITS4 target gene resulting in 95/106 (89.6%) positive samples

Selection of 51 samples in total of 95 positive samples were subjected to gel purifiel DNA from electrophoresis gel sequencing PCR product made 2 saparated bands, it was purified seperately

* Viện Sốt rột - Ký sinh trựng và Côn trùng TW

Người phản hồi (Corresponding): Cao Bá Lợi (saudaihocvsr2008@gmail.com)

Ngày nhận bài: 09/10/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/11/2014

Ngày bài báo được đăng: 26/11/2014

The order of the nucleotide sequence was handled by specialized software, with reference sequence in gene banks Results: 27 samples were as C glabrata, 15 samples purified as C albicans, 6 samples as C tropical, 2 samples known as C parapsilosis and and 1 samples as

C krusei

* Key words: Vaginal candidiasis; PCR; Women at reproductive age; Quangninh province

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tại Việt Nam, các bệnh nhiễm trùng

đường sinh sản (ĐSS) có xu hướng tăng

cao do nhiều nguyên nhân như: thói quen

sinh hoạt mất vệ sinh, nguồn nước bị ô

nhiễm, tệ mại dâm, tình trạng nạo phá

thai không kiểm soát… dẫn đến tình trạng

nhiễm trùng ĐSS, đặc biệt nhiễm nấm

Candida sp ĐSS Vũ Đức Bình và CS

(2013) nghiên cứu trên phụ nữ 18 - 49 đã

có chồng tại huyện Tam Nông, Phú Thọ

bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen

nấm ký sinh ĐSS thấy: tỷ lệ nhiễm

Candida sp ĐSS là 30,5%, trong đó,

Candida glabrata (C glabrata ) chiếm 43,5%,

Candida tropicalis (C tropicalis) 34,8%,

Candida albicans (C albicans) 14,6%,

Candida krusei (C krusei ) 4,3% và Candida

parapsilosis (C parapsilosis) 2,8% [1, 2]

Tại Quảng Ninh nói chung và thị xã

Quảng Yên nói riêng đến nay chưa có

công trình nghiên cứu nào đi sâu và đầy

đủ về tình trạng nhiễm nấm ĐSS ở phụ

nữ trong độ tuổi sinh đẻ, nhưng các yếu

tố nguy cơ nhiễm nấm ĐSS rất cao Với

tính cấp thiết của vấn đề và để xác định

tỷ lệ thành phần loài nấm ĐSS, chúng tôi

thực hiện nghiên cứu với mục tiêu: Ứng

dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen

xác định tỷ lệ, thành phần loài nấm ĐSS ở

phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ (18 - 49 tuổi)

đã có chồng tại thị xã Quảng Yên, tỉnh

Quảng Ninh

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: phụ nữ trong

độ tuổi sinh đẻ (18 - 49) đã có chồng, tình nguyện tham gia nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu:

+ Lấy mẫu bệnh phẩm tại thị xã Quảng Yên, tỉnh Quảng Ninh

+ Tiến hành kỹ thuật PCR giải trình tự gen nấm tại Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam

- Thời gian nghiên cứu từ 4 - 2014 đến

10 - 2014

2 Phương pháp nghiên cứu

- Cỡ mẫu nghiên cứu: cỡ mẫu điều

tra cắt ngang đánh giá tình trạng nhiễm nấm ĐSS là 384, trong thực tế chúng tôi

nghiên cứu 398 mẫu

Thực hiện kỹ thuật PCR giải trình tự gen 106/116 mẫu nấm

- Thu thập và bảo quản mẫu [3, 4]:

gồm các bệnh phẩm lấy từ dịch âm đạo tại cùng đồ sau, sau đó, nuôi cấy trong môi trường Sabouraud có kháng sinh

chloramphenicol, pH = 5,0

Các mẫu bệnh phẩm (+) với nấm

Candida spp mỗi mẫu cho vào túi riêng

biệt và chuyển về Phòng Miễn dịch học,

Viện Công nghệ Sinh học Bảo quản ở

ngăn mát (4 - 10 0 C) (tủ lạnh thường) đến

khi tiến hành tách ADN tổng số

* Tách chiết ADN tổng số [3, 4]:

Tiến hành tách ADN tổng số (ADN hỗn

hợp của tế bào nấm) theo quy trình sau:

- Dùng que cấy (loop) lấy đầy tế bào

nấm từ bề mặt ống nuôi cấy và chuyển

vào ống Eppendorf (dung tích 1,5 ml)

- Bổ sung 400 µl đệm TE (500 µl Tris-HCl

pH 6,8 1 M; 100 µl EDTA, pH8 0,5 M và

nước đến tổng số 50 ml) Ủ 80 0 C trong

20 phút để giết tế bào nấm, sau đó hạ nhiệt

độ xuống nhiệt độ phòng

- Bố sung 50 µl lysozyme nồng độ

10 mg/ml (35 mg lysozyme trong nước

đến tổng số 3,5 ml) lắc xoáy (vortex),

ủ 37 o C trong 1 giờ

- Bổ sung 5 µl proteinase K nồng độ

10 mg/l và 70 µl SDS 10% (1 g SDS trong

9 ml nước), lắc xoáy nhẹ và ủ ở 65 o C

trong 10 phút

- Bổ sung 100 µl NaCl 5 M, 100 µl CTAB/NaCl (4,1 g NaCl; 10 g CTAB; trong 100 ml nước), làm nóng đến 65 o

C, lắc xoáy đến khi toàn bộ dịch chuyển sang màu trắng sữa và ủ 65 o C trong 10 phút

- Bổ sung 450 µl hỗn hợp chloroform/ isoamyl alcohol 24:1 và lắc xoáy trong 10 giây Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút

- Chuyển dịch nổi sang ống Eppendorf mới, bổ sung 450 µl isopropanol, ủ trong

đá 10 phút

- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút; loại bỏ dịch nổi Bổ sung 500 µl ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút; loại bỏ dịch nổi và làm khô tủa Hòa tan tủa trong 50 µl dịch TE Bảo quản sản phẩm ở -20 o C

* Thiết kế mồi và thực hiện phản ứng PCR:

Để thực hiện xác định loài các mẫu nấm, cặp mồi chung cho các loài nấm ký hiệu ITS1/ITS4 [3, 4], thiết kế để thực hiện phản ứng PCR vùng ITS (internal

transcribed spacer)

Bảng 1: Trình tự nucleotid các chuỗi mồi thực hiện PCR trong xác định loài nấm Candida spp

nấm) vùng gen 18S rRNA-ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28S rRNA

Phản ứng PCR thực hiện với cặp mồi, bao gồm mồi xuôi ITS1 và mồi ngược ITS4

cho sản phẩm từ 500 - 900 bp, tùy từng loài Candida sp Thành phần phản ứng PCR

như sau:

* Thành phần phản ứng PCR: PCR master mix (Fermentas): 12,5 µl; ITS1F

(10 picomol/ul): 1 µl; ITS4R (10 picomol/ul): 1 µl; DMSO: 1,25 µl; ADN khuôn: 1 µl; nước: 8,25 µl

- Chu trình nhiệt thực hiện PCR như sau:

Bảng 2: Chu trình nhiệt thực hiện PCR

35

Sau khi thực hiện phản ứng, kết quả

PCR được kiểm tra bằng điện di sản

phẩm trên thạch agarose 1%, hiệu điện

thế U = 100 V trong 25 phút

* Giải trình tự và xử lý số liệu:

Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra được

tinh sạch bằng phương pháp thôi gel

(ADN elution) sử dụng bộ kít AccuPrep™

Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc)

Nếu mẫu có 2 băng ADN sản phẩm PCR,

tiến hành thôi gel mỗi băng ADN riêng rẽ

và thu từng băng để giải trình tự Sản

phẩm PCR sau khi tinh sạch được giải

trình tự trực tiếp, sử dụng mồi ITS1

Xử lý trình tự các chuỗi nucleotid bằng

phần mềm chuyên biệt, bao gồm SeqEd1.03,

AsemblyLIGNv1.9c và hệ chương trình

MacVector8.2 (Accelrys Inc) trên máy

tính Macintosh So sánh đối chiếu và

xử lý số liệu các chuỗi thu nhận và

Ngân hàng Gen (Genbank) bằng chương

trình GENEDOC2.7 So sánh trình tự

nucleotid vùng ITS của các chủng nấm

Candida spp v ề thành phần nucleotid, xác

định loài bằng cách truy cập Ngân hàng

Gen (BLAST: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

hệ nguồn gốc, sử dụng chương trình

MEGA5.0 phương pháp “kết nối liền kề”

NJ (Neighbor-JoiningNJ) với hệ số tin tưởng 1.000 bootstrap [4]

* Địa điểm thực hiện:

Tiến hành giải trình tự gen và xử lý số liệu tại Phòng Miễn dịch và Phòng Thí nghiệm Trọng điểm, Viện Công nghệ Sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ

BÀN LUẬN

1 Kết quả tách chiết ADN tổng số

từ các mẫu nấm nuôi cấy

Từ 106 mẫu nấm (phần lớn tập trung thuộc chi Candida spp.), sử dụng các loại dung môi, hóa chất pha chế theo mô tả trên Kiểm tra ngẫu nhiên ADN tổng số ở một số mẫu, kết quả cho thấy có hiển thị vệt sáng trên thạch agarose 1% nhuộm ethidium bromide, chứng tỏ trong mẫu tách chiết có ADN thu nhận từ hệ gen của mẫu nấm nuôi cấy Từ kết quả tách chiết,

sử dụng lần lượt ADN tổng số các mẫu

sử dụng làm khuôn để thực hiện PCR theo quy trình đã mô tả [3, 4] Kết quả như sau:

Bảng 3: Số lượng sản phẩm PCR ITS1 -

ITS4 trước và sau khi cắt bằng Msp I

Candida sp.

Bảng 4: Tổng hợp kết quả (+) với ITS1 và ITS4 PCR

89,6% phát hiện nấm (+) bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi chung ITS1 và ITS4 Có

sự khác biệt giữa tỷ lệ phát hiện nấm ở 3 xã Liên Vị, Hoàng Tân và Sông Khoai tương ứng 82,9% so với 93,6% và 91,7%, p < 0,05

2 Kết quả giải trình tự phân tích

chuỗi gen và giám định loài nấm gây

nhiễm

* Một số nhận xét chung:

Tất cả sản phẩm PCR thu được ở mỗi

nhóm, kể cả một số sản phẩm thu được

sau PCR lần 2, tinh sạch thu đơn băng

ADN bằng phương pháp thôi gel (ADN

elution) Trường hợp đơn băng thì cắt

riêng băng ADN đó, trong trường hợp đa

băng, cắt riêng từng băng một và thu

ADN tinh sạch vào từng ống để đưa đi

giải trình tự Sau khi giải trình tự, chuỗi

nucleotid được xử lý phân tích bằng phần

mềm chuyên biệt để có chuỗi cuối cùng

và tiến hành truy cập Ngân hàng Gen

sử dụng chương trình BLAST (BLAST:

sách mẫu, kết quả PCR, chuỗi gen giải

trình tự, kết quả truy cập Ngân hàng Gen

và xác định kết quả cuối cùng được thống

kê ở bảng 4

Có 106 mẫu được tách chiết ADN tổng

số, thực hiện PCR, kết quả 11 mẫu âm tính không cho sản phẩm Tổng số thu hoạch được 95 mẫu có sản phẩm PCR, trong đó, 4 mẫu cho sản phẩm kép, gồm

2 băng ADN (0.5 kb và 0.9 kb)

Hầu hết sản phẩm thæi gel các mẫu được giải trình tự trực tiếp Sau khi phân tích, thu được 51 chuỗi nucleotid đơn nhất

sử dụng để truy cập Ngân hàng Gen và phân tích giám định loài

Một số sản phẩm PCR khi giải trình tự cho 2 chuỗi nucleotid lồng nhau, không thể phân tích để thu chuỗi nucleotid riêng biệt Như vậy, tuy cùng kích thước, nhưng sản phẩm là ADN của 2 hoặc đa loài gây nhiễm Với trường hợp này, cần tách dòng phân biệt để thu từng clon riêng và giải trình tự

Kết quả truy cập Ngân hàng Gen chủ yếu là liệt kê xác định 5 loài trong số 51 mẫu truy cập, kết quả như sau:

- So sánh phân tích chuỗi gen ITS các mẫu thuộc loài Candida albicans

Calb-IST(5

Calb-IST(5

M1-H1- 030

M2- H2-003

M-H2- 052

M-H2- 055

M-H3-064

M-S-061

M-S-072

M-S-130

M-S-150

M-S-161

M-L-Đông-107 M-L-Hàn-074 M-L-Bầu-044 M-L- Đình-121 M-L-Quán-198 : : : : : : : : : : : : : : : : : GTGTTTTTCTTTGAAACAAACTTGCTTTGGCGGTCCCAGCCTGCCGCCAGAGGTCTAAACTTACAACCAATTTTTTA ……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

: 80 : 80 : 80 : 80 : 80 : 80 : 80 : 80 : 80 : 80 : 80 : 80 : 80 : 80 : 80 : 80 : 80 100 120 140 160 Calb-IST(5 Calb-IST(5 M1-H1- 030 M2- H2-003 M-H2- 052 M-H2- 055 M-H3-064 M-S-061

M-S-072

M-S-130

M-S-150

M-S-161

M-L-Đông-107 M-L-Hàn-074 M-L-Bầu-044 M-L- Đình-121 M-L-Quán-198 : : : : : : : : : : : : : : : : : TCAACTTGTCACACCAGATTATTACT-AATAGTCAAAACTTTCAACAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAAC ……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

: 159 : 159 : 159 : 159 : 159 : 159 : 159 : 159 : 159 : 159 : 159 : 159 : 159 : 159 : 159 : 159 : 159 180 200 220 240 Calb-IST(5

Calb-IST(5

M1-H1- 030

M2- H2-003 M-H2- 052

M-H2- 055

M-H3-064

M-S-061

M-S-072

M-S-130

M-S-150

M-S-161

M-L-Đông-107 M-L-Hàn-074 M-L-Bầu-044: M-L- Đình-121 M-L-Quán-198 : : : : : : : : : : : : : : : : : GCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGT ……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

: 239 : 239 : 239 : 239 : 239 : 239 : 239 : 239 : 239 : 239 : 239 : 239 : 239 : 239 : 239 : 239 : 239 260 280 300 320 Calb-IST(5 Calb-IST(5 M1-H1- 030 M2- H2-003 M-H2- 052

M-H2- 055 M-H3-064

M-S-061

M-S-072

M-S-130

M-S-150

M-S-161

M-L-Đông-107 M-L-Hàn-074 M-L-Bầu-044 M-L- Đình-121 M-L-Quán-198 : : : : : : : : : : : : : : : : : ATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGTTTCTCCCTCAAACCGCTGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGACTTGGGTTT ……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

……… ……… ………

: 319 : 319 : 319 : 319 : 319 : 319 : 319 : 319 : 319 : 319 : 319 : 319 : 319 : 319 : 319 : 319 : 319

340 360 380 400

Calb-IST(5

Calb-IST(5

M1-H1- 030

M2- H2-003

M-H2- 052

M-H2- 055

M-H3-064

M-S-061

M-S-072

M-S-130

M-S-150

M-S-161

M-L-Đông-107 M-L-Hàn-074 M-L-Bầu-044 M-L- Đình-121 M-L-Quán-198 : : : : : : : : : : : : : : : : : GCTTGAAAGACGGTAGTGGTAAGGCGGGATCGCTTTGACAATGGCTTAGGTCTAACCAAAAACATTGCTTGCGGCGGTAA ………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

: 399 : 399 : 399 : 399 : 399 : 399 : 399 : 399 : 399 : 399 : 399 : 399 : 399 : 399 : 399 : 399 : 399 Hình 1: So sánh trình tự nucleotid chuỗi gen ITS của 15 chủng C albicans từ

các mẫu nghiên cứu với 2 chủng C albicans của thế giới Các chuỗi nucleotid của 15 mẫu Candida sp nghiên cứu bao gồm H1-030, H2-003, H2-052, H2-055, H3-064, S-061, S-072, S-130, S-150, S-161, L-Đông-107, L-Hán-074, L-Bầu-044, L-Đình-121, L-Quán-198 được sắp xếp so sánh và phân tích thành phần nucleotid với 2 chuỗi C albicans thu thập từ Ngân hàng Gen là C albicans (Calb-ITS(571bp)ATCC-JX094781 từ ATCC; Calb-ITS(540bp)ICB954-BR-JX463266 tõ Brazil) Các chủng đã cho tỷ lệ đồng nhất đạt 99 - 100% Như vậy, ngoài truy cập Ngân hàng Gen, kết quả phân tích chuỗi gen khẳng định có 15 mẫu nấm gây nhiễm của Việt Nam được xác định là C albicans - So sánh phân tích chuỗi gen ITS của các mẫu thuộc loài Candida glabrata: 20 40 60 80 100 Cglab-ITS( Cglab-ITS (

M3-H1-052

M4-H1-053

M8-H2-008

M9-H2-019

M15-H2-062 M20-H3-070

M1-H3-016

M7-H3-046

M16-H3-069 M21-H3-082 M22-H3-083

M2-S-007

M10-S-096

M15-S-122 M16-S-124

M3-L-Đông171

M4-L-Đông195

M5-L-Hàn-073 M7-L-Hàn-086 M10-LBầu-072 M12-LĐình-114 M19-LQuán-003 M16-L-Bầu-54 M17-L-Quán18

: : : : : : : : : : : : : : : TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAT AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAC TTTCTCTGCTGCGAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATACTTTCTCTGCTGC GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC TGATTTGTCTGAGCTCGGAGAGAGACATCTCTGGGGAGGACCAGTGTAGACACTCAGGAGGCTCCTAA AATAT TTTCTCTGCTGT GAATGCTATTTCTCCTGCC : 104 : 104 : 104 : 104 : 104 : 104 : 104 : 104 : 104 : 104 : 104 : 104 : 104 : 104 : 104 : 104 420 440 460 Calb-IST(5 :

Calb-IST(5 :

M1-H1- 030 :

M2- H2-003 :

M-H2- 052 :

M-H2- 055 :

M-H3-064 :

M-S-061 :

M-S-072 :

M-S-130 :

M-S-150 :

M-S-161 :

M-L-Đông-107 : M-L-Hàn-074 :

M-L-Bầu-044 :

M-L- Đình-121 : M-L-Quán-198 : CGTCCAC CAC GTATATCTTCAAACTTT G AC C T C AAA TCAG GTAGGACTAC C C GCTGAACTTAAG : 463 ………:463

………:463

………:463

………:463

………:463

………:463

………:463

………:463

………:463

………:463

………:463

………:463

………:463

120 140 160 180 200 Cglab-ITS(

Cglab-ITS(

M3-H1-052

M4-H1-053

M8-H2-008

M9-H2-019

M15-H2-062

M20-H3-070

M1-H3-016

M6-H3-042

M16-H3-069

M21-H3-082

M22-H3-083

M2-S-007

M8-S-082

M10-S-096

M15-S-122

M16-S-124

M3-L-Đông171

M4-L-Đông195

M5-L-Hàn-073

M7-L-Hàn-086

M10-LBầu-072

M12-LĐình-114

M19-LQuán-003

M16-L-Bầu-54

M17-L-Quán18

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT TGCGCTTAAGTGCGCGGTTGGTGGGTGTTCTGCAGTGGGGGGAGGGAGCCGACAAAGACCTGGGAGTGTGCGTGGATCTCTCTATTCCAAAGGAGGTGTTTTAT

: 208 : 208 : 208 : 208 : 208 : 208 : 208 : 208 : 208 : 208 : 208 : 208 : 208 : 208 : 208 : 208

ITS(

Cglab-ITS(

M3-H1-052

M4-H1-053

M8-H2-008

M9-H2-019

M15-H2-062

M20-H3-070

M1-H3-016

M7-H3-046

M16-H3-069

M21-H3-082

M22-H3-083

M2-S-007

M10-S-096

M15-S-122

M16-S-124

M3-L-Đông171

M4-L-Đông195

M5-L-Hàn-073

M7-L-Hàn-086

M10-LBầu-072

M12-LĐình-114

M19-LQuán-003

M16-L-Bầu-54

M17-L-Quán18

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

: 311 : 311 : 311 : 311 : 311 : 311 : 311 : 312 : 311 : 311 : 311 : 311 : 311 : 311 : 311 : 311 : 311

ITS(

Cglab-ITS(

M3-H1-052

M4-H1-053

M8-H2-008

M9-H2-019

M15-H2-062

M20-H3-070

M1-H3-016

M7-H3-046

M16-H3-069

M18-H3-073

M21-H3-082

M22-H3-083

M2-S-007

M10-S-096

M15-S-122

M16-S-124

M3-L-Đông171

M4-L-Đông195

M5-L-Hàn-073

M7-L-Hàn-086

M10-LBầu-072

M12-LĐình-114

M19-LQuán-003

M16-L-Bầu-54

M17-L-Quán18

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

: 411 : 411 : 411 : 411 : 411 : 411 : 411 : 411 : 411 : 411 : 411 : 411 : 411 : 414 : 411 : 411 : 411

Cglab-ITS(

Cglab-ITS(

M3-H1-052

M4-H1-053

M8-H2-008

M9-H2-019

M15-H2-062

M20-H3-070

M1-H3-016

M7-H3-046

M16-H3-069

M21-H3-082

M22-H3-083

M2-S-007

M10-S-096

M15-S-122

M16-S-124

M3-L-Đông171

M4-L-Đông195

M5-L-Hàn-073

M7-L-Hàn-086

M10-LBầu-072

M12-LĐình-114

M19-LQuán-003

M16-L-Bầu-54

M17-L-Quán18

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

: 515 : 515 : 515 : 515 : 515 : 515 : 515 : 519 : 515 : 515 : 515 : 518 : 515 : 515 : 515

Cglab-ITS(

Cglab-ITS(

M3-H1-052

M4-H1-053

M8-H2-008

M9-H2-019

M15-H2-062

M20-H3-070

M1-H3-016

M7-H3-046

M16-H3-069

M21-H3-082

M22-H3-083

M2-S-007

M10-S-096

M15-S-122

M16-S-124

M3-L-Đông171

M4-L-Đông195

M5-L-Hàn-073

M7-L-Hàn-086

M10-LBầu-072

M12-LĐình-114

M19-LQuán-003

M16-L-Bầu-54

M17-L-Quán18

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

: 619 : 619 : 619 : 619 : 619 : 619 : 619 : 623 : 619 : 619 : 619 : 622 : 619 : 619 : 619

ITS(

Cglab-ITS(

M3-H1-052

M4-H1-053

M8-H2-008

M9-H2-019

M15-H2-062

M20-H3-070

M1-H3-016

M7-H3-046

M16-H3-069

M21-H3-082

M22-H3-083

M2-S-007

M10-S-096

M15-S-122

M16-S-124

M3-L-Đông171

M4-L-Đông195

M5-L-Hàn-073

M7-L-Hàn-086

M10-LBầu-072

M12-LĐình-114

M19-LQuán-003

M16-L-Bầu-54

M17-L-Quán18

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG TATCAGTATGTGGGACACGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGGGGTTAATACTGTATTAGGTTTTACCAACTCGGTGTTG

: 723 : 723 : 723 : 723 : 723 : 723 : 727 : 723 : 723 : 723 : 723 : 726 : 723 : 723 : 723

Cglab-ITS(

Cglab-ITS(

M3-H1-052

M4-H1-053

M8-H2-008

M9-H2-019

M15-H2-062

M20-H3-070

M1-H3-016

M7-H3-046

M16-H3-069

M21-H3-082

M22-H3-083

M2-S-007

M10-S-096

M15-S-122

M16-S-124

M3-L-Đông171

M4-L-Đông195

M5-L-Hàn-073

M7-L-Hàn-086

M10-LBầu-072

M12-LĐình-114

M19-LQuán-003

M16-L-Bầu-54

M17-L-Quán18

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

Hình 2: So sánh trình tự nucleotid chuỗi gen ITS của 27 chủng C glabrata (Việt Nam)

với 2 chủng C glabrata của thế giới

Các chủng cho tỷ lệ đồng nhất đạt cao (98 - 100%) Xác định các chuỗi nucleotid của

27 mẫu Candida sp ở Việt Nam là C glabrata, được sắp xếp so sánh và phân tích thành phần nucleotid với 2 chuỗi C glabrata thu thập từ Ngân hàng Gen là C glabrata

(Cglab-ITS(886bp)-KW-FN652301 từ Cô-oét và Cglab-ITS (905bp)-GR-KC253980 từ

Hy Lạp) Ngoài những sai khác mang tính chất đơn lẻ từng nucleotid, 2 chủng của mẫu nghiên cứu (các chủng H3-083 và L-Hàn-073) có sai khác đặc biệt đến 3 nucleotid (TTA) và đột biến điểm thêm vào 1 nucleotid G hoặc T tại vị trí giải trình tự gen

Như vậy, ngoài truy cập Ngân hàng Gen, kết quả phân tích chuỗi gen đã khẳng định

27 mẫu nấm gây nhiễm nghiên cứu được xác định là C glabrata

- So sánh phân tích chuỗi gen ITS của các mẫu thuộc loài Candida tropicalis:

Ctrop-CN(5 :

Ctrop-PK(5 :

M11-H2-030 :

M12-H3-061 :

M9 - S-084 :

M12- S-103 :

M21- S-157 :

TGCTTA A TTGCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCTTTGGTGGCGGGAGCAATCCTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACCAAACTTTTTAT

- GCTTA - TTGCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCTTTGGTGGCGGGAGCAATCCTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACCAAACTTTTTAT

TGCTTA – TTGCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCTTTGGTGGCGGGAGCAATCCTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACCAAACTTTTTAT

TGCTTA – TTGCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCTTTGGTGGCGGGAGCAATCCTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACCAAACTTTTTAT

TGCTTA – TTGCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCTTTGGTGGCGGGAGCAATCCTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACCAAACTTTTTAT

TGCTTA – TTGCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCTTTGGTGGCGGGAGCAATCCTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACCAAACTTTTTAT

TGCTTA – TTGCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCTTTGGTGGCGGGAGCAATCCTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACCAAACTTTTTAT

TGCTTA – TTGCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCTTTGGTGGCGGGAGCAATCCTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACCAAACTTTTTAT

TGCTTA – TTGCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCTTTGGTGGCGGGAGCAATCCTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACCAAACTTTTTAT

TGCTTA – TTGCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCTTTGGTGGCGGGAGCAATCCTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACCAAACTTTTTAT

TGCTTA – TTGCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCTTTGGTGGCGGGAGCAATCCTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACCAAACTTTTTAT

:97 :96 :96 :96 :96 :96

100 120 140 160 180

Ctrop-CN(5 :

Ctrop-PK(5 :

M11-H2-030 :

M12-H3-061 :

M9 - S-084 :

M12- S-103 :

M17- S-129 :

TTACAGTCAAACTTGATTTATTATTACAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAC

TTACAGTCAAACTTGATTTATTATTACAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAC

TTACAGTCAAACTTGATTTATTATTACAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAC

TTACAGTCAAACTTGATTTATTATTACAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAC

TTACAGTCAAACTTGATTTATTATTACAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAC

TTACAGTCAAACTTGATTTATTATTACAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAC

TTACAGTCAAACTTGATTTATTATTACAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAC

:194 :193 :193 :193 :193 :193 :193

200 220 240 260 280

Ctrop-CN(5 :

Ctrop-TW(4 :

Ctrop-PK(5 :

M11-H2-030 :

M9 - S-084 :

M12- S-103 :

M17- S-129 :

GTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTC

GTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTC

GTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTC

GTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTC

GTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTC

GTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTC

GTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTC

:291 :289 :290 :290 :290 :290

300 320 340 360 380

Ctrop-CN(5 :

Ctrop-TW(4 :

Ctrop-PK(5 :

M11-H2-030 :

M9 - S-084 :

M12- S-103 :

M17- S-129 :

TCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGCTAGGTTTGTTTGAAAGAATTTAACGTGGAAACTTATTTTAAGCGACTTAGGTTTATCCAA

TCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGCTAGGTTTGTTTGAAAGAATTTAACGTGGAAACTTATTTTAAGCGACTTAGGTTTATCCAA

TCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGCTAGGTTTGTTTGAAAGAATTTAACGTGGAAACTTATTTTAAGCGACTTAGGTTTATCCAA

TCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGCTAGGTTTGTTTGAAAGAATTTAACGTGGAAACTTATTTTAAGCGACTTAGGTTTATCCAA

TCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGCTAGGTTTGTTTGAAAGAATTTAACGTGGAAACTTATTTTAAGCGACTTAGGTTTATCCAA

TCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGCTAGGTTTGTTTGAAAGAATTTAACGTGGAAACTTATTTTAAGCGACTTAGGTTTATCCAA

TCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGCTAGGTTTGTTTGAAAGAATTTAACGTGGAAACTTATTTTAAGCGACTTAGGTTTATCCAA

:388 :385 :387 :387 :387 :387

400 420 440 460

Ctrop-CN(5 :

Ctrop-TW(4 :

Ctrop-PK(5 :

M11-H2-030 :

M12-H3-061

:M9 - S-084 :

M12- S-103 :

M17- S-129 :

AAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCAT : 474

AA - CGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCAT : 470

AAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCAT : 473

AAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCAT : 473

AAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCAT : 473

AAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCAT : 473

AAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCAT : 473

AAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCAT : 473

AAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCAT : 473

AAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCAT : 473

AAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCAT : 473

Hình.3: So sánh trình tự nucleotid chuỗi gen ITS của 6 chủng C tropicalis các

mẫu nghiên cứu với 3 chủng C tropicalis của thế giới