quá trình và thiết bị công nghệ sinh học - Chương 15

quá trình và thiết bị công nghệ sinh học

Chương 15

MÁY ĐIỆN DI

Máy điện di dùng để phát hiện và xác định ADN trong tế bào vi sinh vật, thực vật và động vật

15.1 AXIT DEOXYRIBONUCLEIC (ADN) VÀ NGUYÊN TẮC XÁC ĐỊNH

Gen là đơn vị di truyền cơ bản Nó là một đoạn ADN (đôi khi ARN) mã hoá thông tin cho việc tổng hợp sản phẩm sinh học xác định (chủ yếu là protein) Những nghiên cứu hiện đại về cấu trúc và chức năng của nguyên sinh chất đã mở ra những hiểu biết mới về cấu tạo và chức năng hoạt động của tế bào

Cấu trúc ADN cho phép giải thích tại sao lại có khả năng tàng trữ và di truyền thông tin từ thế hệ này sang thế hệ khác một cách ổn định và bằng cách nào nó thông tin

di tuyền ở dạng thứ tự sắp xếp các gốc nucleotit lại chuyển hoá thành phân tử protein chức năng Nội dung nêu trên liên quan đến giáo lý trung tâm của di truyền phân tử gồm

3 điểm chính: sao chép thông tin di truyền từ ADN bố mẹ sang ADN con cái, chuyển đổi mã di truyền từ ADN sang ARN - quá trình phiên mã (transcription) và dịch mã di truyền (translation) - thông tin di truyền từ mARN được chuyển sang trình tự sắp xếp đặc hiệu của axit amin trong phân tử protein

Công nghệ ADN tái tổ hợp - hiện là nền tảng cho sự phát triển như vũ bão của ngành công nghệ sinh học hiện đại

Các phương pháp phân tích và tổng hợp hiện đại là tách DNA, xác định thứ tự, tổng hợp, gắn xen nó vào vị trí nhất định bên trong sợi ADN khác để nhân lên, và rồi lại tách ra

Hiện nay hoàn toàn có thể nhận biết chính xác những đoạn ADN đặc hiệu qua chẩn đoán các bệnh đặc biệt Đối với các bệnh khi các gel chưa được xác định thì việc chẩn đoán kém chính xác

Một bộ dò tìm đơn giản chỉ là một khúc ADN (hoặc ARN) có thể tìm khúc bổ sung với nó bằng cách lai (hybridization) Có thể phát hiện sự bắt cặp này bằng nhiều cách, nhưng phổ biến nhất là sử dụng phương pháp tự chụp phóng xạ với bộ dò tìm có 32p (hình 15.1)

Việc lai bộ dò tìm ADN với đoạn ADN tách rời gọi là Southern Blotting được mô tả trên hình 15.1 Các đoạn ADN hình thành sau khi ADN bị endonucleaza restrictaza cắt sẽ được tách rời ra bằng phương pháp điện di trên gel agaroza Khoảng cách di chuyển phụ thuộc vào kích thước đoạn Càng nhỏ chạy càng nhanh Sau khi đã tách rời, người ta dùng kiềm để làm biến tính các đoạn đó và chuyển chúng lên màng nylon Tấm màng này được ủ với dung dịch có chất dò tìm chất phóng xạ, nó chỉ lai với các đoạn ADN nào chứa thứ tự bổ sung

Việc xác định thứ tự ARN (ví dụ mARN) cũng có thể theo trình tự tách bằng điện

di ARN trên gel, chuyển lên màng nylon và cho lai với ADN probe đặc hiệu

Phương pháp này gọi là Northern Blotting

Hình 15.1 Lai “bộ dò tìm” với đoạn ADN, tách ra bằng điện di

và chuyển sang tấm nylon (Southern blotting)

15.2 CẤU TRÚC CỦA MÁY ĐIỆN DI

Máy điện di gồm ba bộ phận cơ bản: khay vận hành (hình 15.2), nắp có điện thế cao và buồng giảm xốc

Những đoạn ADN sau khi cắt bằng endonucleasa

Tách điện

di trên gel agarosa

Biến tính bằng kiềm để tách sợi trung hoà

Các đoạn ADN tách ra theo kích thước

Vị trí đoạn ADN chứa thư tự tương đồng probe nhân dòng

Định vị ADN bằng tia UV

Ủ vệt có ADN nhân dòng sợi đơn và có gắn phóng xạ

Rửa và sự chụp phóng xạû Phủ bằng

màng nylon

Khay vận hành bao gồm khuôn đúc gel, khay di động trong suốt và bọt đệm bằng caosu

Chuẩn bị khuôn gel như sau: lót miếng bọt đệm vào đáy khay di động và sau đó ấn mạnh miếng đệm vào cạnh khay (ép cho đáy khay di động lọt hoàn toàn vào khay khuôn trước khi hàn kín vào miếng bọt)

Trên nắp có đầu ra của mã màu, được nối với nguồn điện qua điện cực trên đế máy (hình 15.3) Buồng giảm xốc có ống nối điện cực, bục di chuyển và lỗ nạp etylen glycol / nước với tỷ lệ 50/50 (hình 15.4)

Ống nối điện cực

Bục di chuyển (hỗ trợ khay vận hành) Nơi (lỗ) nạp 50/50 etylen glycol / nước vào

Hình 15.4 Buồng giảm xốc

Hình 15.2 Khay vận hành

UV khay di động trong suốt

Mã màu đầu ra nối điện cực trên đế máy với nguồn điện

Nắp thiết bị

Hình 15.3 Nắp có điện thế cao

15.3 CẤU TRÚC VẬN HÀNH

15.3.1 Chuẩn bị dung dịch

- Chuẩn bị 250 ml dung dịch đệm Hai dung dịch đệm được sử dụng phổ biến cho điện di ADN được chuẩn bị theo công thức pha chế dưới đây

1 10X Tris- borate-EDTA Nguồn cung cấp chất đệm:

(0,89 M tris; 0,89 M axit boric; 20 mM EDTA; pH- 8,2; 1000 ml) Tris base(FW 121.1): 0,89 M 108, 0g

Axit boric (FW61.8): 0,89M 55,0 g

Dung dịch EDTA: (0,5M; pH 8,0) 0,02M 40,0 ml

Nước đã được khử ion hoá: 1000,0 ml

pH luôn luôn giữ ở 8,2

Trước khi sử dụng với dung dịch loãng

0,5 X với 45 mM base tris; 45 mM axit boric và 1 mM EDTA

thường dùng pha loãng bởi vì nước có nhiệt độ thấp

1X với 89 mM base tris; 89 mM axit boric và 2 mM EDTA

2 10X Tris- acetate -EDTA Cung cấp cho chất đệm

(0,4 M tris; 0,2 M axit axetic; 10 mM EDTA; pH- 8,4; 1000 ml)

Tris base(FW 121.1): 0,40 M 48,8 g

Axit axetic (99,5%): 0,20 M 114,1 ml

Dung dịch EDTA (0,5M; pH 0,8): 0,01M 20,0 ml

Nước đã được khử ion hoá: 1000,0 ml

Khuấy đều đừng làm giảm pH Pha loãng tới 1X trước khi sử dụng tới 40 mM base tris; 20 mM axit axetic và 1 mM EDTA

3 Dung dịch EDTA (etylen diamin tetraaxetic axit):

(0,5M; pH 8,0; 100 ml)

Na2EDTA.2H2O; (FW 372,2) 0,5 M 18,6 g

Nước đã được khử ion hoá: 70,0 ml

NaOH (10M) tới pH 8,0 5,0 ml

Nước đã được khử ion hoá: 100,0 ml

- Chuẩn bị bộ đệm tải mẫu

Để chuẩn bị bộ đệm mẫu cần chuẩn bị mẫu đệm thử (dung dịch mẫu) và bộ lược có dung tích khác nhau

Mẫu đệm thử

Dung dịch mẫu

(5X; 25% ficoll 400; 25% phenol bromua xanh; 10 ml)

Nước đã được khử ion hoá: 7,0 ml

Phenol bromua xanh (F 691,9): 25,0 mg

Nước đã được khử ion hoá: 10,0 ml

Chú ý 1: Sucroza và glyxerol có thể sử dụng để thay thế cho ficoll 400

Chú ý 2: Xylen cyanol (0,25 %) mà di chuyển chậm hơn phenol bromua xanh, thì có thể tăng thêm một lượng nếu mong muốn, sự cô cạn dung dịch agaroza được xác định khi thêm vào có liên quan đến polynucleotit

Thể tích bểø

Bảng 15.1 Những loại lược

mm

Độ rộng,

mm

Dung tích Độ sâu

- Chuẩn bị khoảng 7 ml dung dịch agaroza ứng với mỗi mililit chiều dày gel (ví dụ

1 gel 3 mm cần 0,3×7×10 = 21 ml)

Hoà tanagaroza trong dung dịch đệm , điều chỉnh nhiệt độ hỗn hợp Cho phép làm mát dung dịch đến 500C trước khi rót vào khuôn

Để quan sát sự phân ly trong hiện tượng điện chuyển thường thêm 0,5 mg/ml etydi bromua vào dung dịch gel

15.3.2 Đúc gel

- Thiết bị đặt khay di động: Một tay giữ chặt khuôn đúc, tay kia đặt đầu khay di động áp vào miệng bọt đệm và sau đó hạ thấp rồi đặt lên đoạn cuối của khuôn đúc Đặt đầu còn lại của khay áp sát miệng bọt đệm

- Chuẩn bị lược: Lắp hai rãnh trong lược vào giữa những đầu ốc và mặt sau lược Siết chặt ốc Đặt lược vào mép khuôn và chỉnh phần cuối của lược để cách khay di động khoảng 1 mm Siết chặt ốc để giữ chắc lược

- Di chuyển lược: Đặt khuôn lắp ráp lên mặt phẳng nằm ngang Đặt ống nivô lên khay di động, nó như thiết bị kiểm tra xem khuôn có đúng vị trí nằm ngang không

Hình 15.5 Mặt sau lược, lắp trên vành của khuôn đúc, vị trí lược trong gel Hai ốc hiệu chỉnh lược

Để tạo hai rãnh, đặt lược thứ hai vào giữa gel

- Đổ dung dịch agaroza (được làm lạnh đến 500C) vào khuôn đúc Định hướng lược để các bề mặt lược gần miếng đệm bọt nhất và đặt nó lên cạnh khay Lược luôn luôn ở vào vị trí thẳng đứng để tránh sự vặn vẹo hình dạng Để chạy lượng mẫu gấp 2 lần, đặt lược thứ hai vào chính giữa khay Cho phép thời gian tối thiểu để gel đặc lại là

30 phút

- Khi gel đã kết lại, lần lượt tháo lược cẩn thận Nhấc một phần và nghiêng nhẹ một đầu của lược, sau đó rút từ từ ra khỏi gel (kéo thẳng lược, tạo ra một khoảng không để có thể nhấc gel ra khỏi khay)

- Tháo khay di động và gel bằng cách nắm lấy tay cầm của khay, ấn đầu áp vào miếng bọt đệm Khi khay đã sạch đệm thì nhấc ra Chuyển khay và gel tới chỗ mát

15.3.3 Vận hành điện di

1 Làm lạnh nền trước khi tiến hành, đặc biệt khi dùng điện áp cao hơn hoặc khi sự phân ly quy định trên 30 phút

Chú ýï: Để tiến hành phân ly, hoặc là thêm 0,5 mg/ml etydi bromua vào dung dịch đệm hoặc thêm 50 mg/ml etydi bromua vào bộ đệm mẫu Để quan sát, hãy cắt điện, tháo phần nắp và giữ đèn cực tím gần gel

Thêm từ từ etydi bromua vào dung dịch đệm hay đệm mẫu Phát hiện bằng phương pháp này không nhạy bằng cách nhuộm màu và nhìn qua thiết bị soi

2 Đổ dung dịch vào các khoang sao cho đến khi đệm cao hơn gel khoảng 1 mm (khoảng 220 ml)

3 Nạp mẫu Thêm mẫu vào 5X bộ đệm tải mẫu và trộn (1/5 thể tích là đệm nạp vào) Sử dụng micropipet để nạp mẫu, chú ý tránh đâm thủng hoặc tạo nên nhiều bong bóng

4 Đặt nắp để catot (−, dây đen) ở đoạn cuối gần mẫu nhất (Mẫu axit nucleic di chuyển về phía anôt, +, dây đỏ) Nối các dây màu (đỏ với đỏ, đen với đen) tới các nguồn điện, như là ESP 2A200 Đặt mức điện áp và thiết bị bấm giờ (nếu có sẵn) theo mức độ phân ly

Mặt sau lược Ốc (2)

Lược

Nhanh, điện áp cao

Những ứng dụng nào đó, như là kiểm tra các mẫu, có thể thực hiện nhanh dưới điều kiện điện áp cao Làm lạnh (−200C ) và giới hạn thời gian vận hành 5 phút hoặc ít hơn ở điện áp 500 V

Chậm hơn, điện áp cao hơn

Một gradient điện áp 12V/cm (150V) trong 30 ÷ 40 phút (sử dụng dung dịch đệm 1% gel agaroza và 0,5 X TBE) cắt Hind III của lamda ADN thành các đoạn 0,1 ÷ 23 kb Hoặc, dùng dung dịch như vậy, mẫu này có thể chạy ở 24 V/cm (300V) thì có thể phân cắt trong 20 ÷ 30 phút Làm lạnh thiết bị trước khi tiến hành

Chú ý:

- Nếu không đổ thêm màu vào chất lỏng làm nguội thì đặt trên nền tối để quan sát dễ dàng hơn

- Đặt thiết bị còn nóng lên nền được làm lạnh có thể ảnh hưởng đến nhiệt độ xung quanh Nếu sự quá nhiệt không được kiểm soát, gel sẽ tan hoặc thiết bị sẽ cong

- Etydi bromua là chất ăn da mạnh, nên cần mang bao tay

- Đeo kính chắn tia UV và bảo vệ da khi sử dụng đèn UV

- Tính gradient điện áp, chia điện áp đặt vào cho khoảng cách giữa các cực 12,7 cm

Bảng 15.2 Điện áp đặt vào và thời gian đề nghị (1)

Ghi chú: (1) Để thời gian chạy ít hơn hoặc bằng 20 phút, sử dụng 0,5X TBE và làm lạnh nền đến −200C trước khi sử dụng

Sau khi phân ly

1- Ngắt điện, tháo dây dẫn, tháo nắp

2- Nếu không thêm etydi bromua vào gel hoặc mẫu trước khi chạy, nhuộm gel trong dung dịch 0,5 ÷ 1 mg/ml etydi bromua trong nước hoặc đệm

3- Làm sạch thiết bị

Vận hành

Các loại gel agaroza được chuẩn bị lần đầu trong khuôn đúc gel Những mẫu được nạp vào trong các bể chứa và được phân ly Thuốc nhuộm huỳnh quang C12H20BrN3 có thể được thêm vào chất đệm điện di hoặc gel hoặc cả hai để tìm ra dấu hiệu của quá trình phân ly Sau khi điện di, gel có thể cho màu, ghi lại màu, thấm màu thêm hoặc sấy tự động

- Đổ đầy lỗ với chất tải lạnh Dù không làm lạnh đi nữa thì điều quan trọng là phải đổ đầy lỗ với dung dịch làm lạnh đặc trưng trước khi sử dụng vì dung dịch cung cấp nguồn nhiệt cần thiết

Chuẩn bị 600 ml với 50/50 C2H2(OH)2/H2O

- Để giúp xem các bể chứa được rõ ràng hơn trong khi nạp mẫu, thêm 1 hoặc 2 giọt thuốc nhuộm hoà tan hoặc màu thực phẩm vào dung dịch làm lạnh

Tìm ra hai lỗ hỏng nạp nước ở phần trên của lỗ Đổ đầy lỗ hỏng đến mức có thể như chất làm lạnh bằng ống phun hoặc máy bơm với 50 ml

Bấm nút caosu màu nâu vào mỗi lỗ

- Sắp xếp dung dịch đã chuẩn bị trong thùng đá hoặc bên trong máy lạnh hoặc tủ lạnh để không dưới 200C trong khoảng 1 giờ trước khi sử dụng (hoá chất được dự trữ trong phòng lạnh hay tủ lạnh)

Chú ý: - Không đổ đầy lỗ với chất chống đông thương mại, dung môi hữu cơ hoặc nước cất

- Không cần thiết thay thế chất làm lạnh

15.3.4 Tính kết quả

Hiện tượng điện di chất gel có thể sử dụng những mảnh nhỏ ADN khoảng 0,1 kb hay nhỏ hơn loại gel polyacrylamit thường sử dụng những mảnh nhỏ hơn 1 kb

Tính điện di của ADN Nồng độ agaroza qui định cho quá trình phân ly thành

những mảnh vỡ với những kích thước khác nhau được cho trong bảng 15.3

Bảng 15.3 Nồng độ để điện di của các mảnh vỡ ADN đối với các loại chất khác

với sự phân giải

Những nhân tố khác ảnh hưởng đến kết quả quá trình phân ly bao gồm: chất đệm, điện áp đặt vào, nhiệt độ , cấu tạo và sự có mặt của etydi brommua, các agaroza đặc biệt có sẵn

Tiêu chuẩn chung cho đoạn Hind III phage λ Loại cho 8 mảnh vỡ sắp xếp trong khoảng từ 0,1 đến 23 kb cho mỗi cặp 2 sợi

Để phân giải tốt, di chuyển trên đoạn 10 cm mất 45 phút 1% gel agaroza trong gel 0,5 X TBE ở điện áp 150V

Tính điện di của ARN

ARN có thể phân chia đựa theo kích thước cơ bản Để tránh tác động đến thời kỳ chuyển hoá cấu trúc ARN được biến tính trước hay suốt thời gian điện di

Ví dụ: đoạn ARN đã biến tính trước với glyoxal và đimetyl sunfoxit có thể gel agaroza độc lập, hay ARN có thể bị cắt phân đoạn Gel agaroza chứa hydroxyt thuỷ ngân II metyl hay focmaldehyt

15.3.5 Sự phát hiện ADN

ADN có thể được phát hiện nhờ sự phát huỳnh quang của liên kết etydi bromua (C2H10BrN3) hay nhờ phương pháp chụp ảnh bằng tia X của đồng vị phóng xạ ADN Etydi bromua (0,5 µg/ml) có thể được thêm vào dung dịch đệm di chuyển, để quan sát sự biến động của mẫu, vì sự phát huỳnh quang của thuốc nhuộm dưới tác dụng của tia cực tím sẽ được biểu hiện ở dạng dải (để xác định được sự biến đổi đó; tắt nguồn cung cấp năng lượng và chuyển đổi thành phần agaroza cũ ra nắp thiết bị định tia cực tím gần khay vận hành Đặt nắp lại và bật đèn để bắt lại sự điện di) Ngoài ra, sau khi điện di, gel biến màu trong dung dịch hoà tan (etydi bromua 10,5 µg/ml H2O) khoảng từ 10 đến

60 phút rồi quan sát và chụp ảnh mẫu bằng phương pháp chiếu tia cực tím

Để chụp ảnh gel, dùng phương pháp chiếu tia cực tím trên bề mặt tại mỗi vị trí ở đĩa vận hành hoặc di chuyển nhẹ bản gel trên bề mặt sẽ quan sát được tối đa (Đĩa vận hành có 95 % ánh sáng trắng với bước sóng 254 nm và 40 % ánh sáng trắng với bước sóng 254 nm) Quan sát mẫu bằng tia cực tím ở bước sóng 366 nm hoặc làm giảm cường độ tia cực tím xuống 302 nm để giảm sự phát huỳnh quang của etydi bromua không liên kết, gel có thể bị mất màu bởi sự hút ẩm của nó trong 5 phút với MgCl2 0,01M hoặc trong 1 giờ với MgSO4 0,001M Sự mất màu đã tạo điều kiện dễ dàng để phát hiện hàm lượng ADN nhỏ

15.3.6 Những chú ý cần thiết

Nắp an toàn phải được lắp trước khi nối nguồn điện với nguồn cung cấp năng lượng

Tắt tất cả các công tắc điện và ngắt nguồn cung cấp điện trước khi tháo nắp an toàn Trước khi sử dụng lần đầu, làm đầy lỗ với 1 lượng 600 ml 50/50 etylen glycol/ nước để ngăn chặn sự tổn thất không thể hồi phục cho thiết bị Lỗ chứa lượng trên có thể đổ đầy ngay cả khi không cần làm lạnh theo yêu cầu

Không sử dụng nước cất, chất chống đông thương mại hoặc bất kỳ dung môi hữu

cơ nào để đổ vào lỗ đó Nước được lấy ra khi đóng băng Nếu không nó bị hút vào bên trong dung dịch và phá vỡ liên kết Dung môi hữu cơ sẽ gây ra sự tổn thất hoá chất không thể hồi phục cho thiết bị

Không làm lạnh lượng dung dịch cho vào lỗ đó dưới −200C (−40F) Có thể làm lạnh lượng dung dịch đó trong thùng đá, máy làm lạnh hoặc trong tủ lạnh

Không điều chỉnh nhiệt độ dung dịch đệm hoặc gel trên 500C Ngăn chặn sự đun nóng quá nhiệt bằng cách làm lạnh lượng dung dịch đó trước khi sử dụng Để ngăn chặn sự đun nóng quá nhiệt trong quá trình kéo dài chạy điện áp cao, thay thế lượng dung dịch thứ nhất bằng lượng dung dịch thứ 2 đã được làm lạnh Sự đun nóng quá nhiệt sẽ gây ra sự tổn thất không thể hồi phục cho thiết bị

Làm sạch

Sau mỗi lần sử dụng, làm sạch thiết bị bằng chất tẩy nhẹ và nước, súc cẩn thận với nước cất và làm khô bằng không khí Không được đặt thiết bị vào dung dịch hoặc khí thơm hoặc các hydrocacbon halogen hoá, xeton, este, alcol (trên 30%) hoặc axit đặc (trên 25%)

Để tránh làm bẩn DNaza và ARNza, ngâm các khoang chứa đệm hoặc khuôn đúc khoảng 10 phút trong dung dịch H2O2 3%, sau đó súc cẩn thận với DEPC được xử lý rồi cho vào nồi hấp (dùng nước đã được ion hoá để hấp)

Thay thế miếng bọt đệm

Tháo những miếng bọt đệm mòn Tháo vỏ miếng đệm mới Sắp đệm cho thẳng và để nó vào vị trí cuối của khay dọc theo cạnh ngắn (7 cm), mặt sau của tường và sau đó ép vào đúng vị trí Lặp lại với miếng đệm thứ hai trên tường đối diện với miếng đệm thứ nhất

15.3.7 Điều chỉnh thiết bị điện di

Bể chắn mẫu Để cho gel đặc lại tối thiểu là 30 phút và giữ ở nhiệt độ phòng

trước khi tháo lược

Khi tháo lược giữ ở cạnh ngắn và nâng nhẹ để tránh gẫy gel

Giữ để không hỏng bể chứa, dùng pipet để lấy mẫu, cố gắng cho vào giữa bể và không làm thủng đáy bể