Nghiên cứu hội chứng chổi rồng trên cây nhãn (dimocarpus longan lour ) và biện pháp quản lý tổng hợp tại đồng bằng sông cửu long (TT)

Tuy nhiên, hiện nay sản xuất nhãn đang gặp trở ngại lớn là dịch bệnh Chổi Rồng CR xuất hiện và gây hại rất nghiêm trọng tại các vùng sản xuất nhãn trên cả nước, đặc biệt là các tỉnh phía

Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây nhãn (Dimocarpus longan Lour.) là một trong những loại cây ăn

trái chủ lực của Việt Nam với diện tích 88.227,5 ha, đứng hàng thứ ba, sau cây xoài và cây chuối (Cục Trồng trọt, 2011) Nhãn đang có thị trường tiêu thụ tại Trung Quốc, Mỹ và các nước châu Âu Tuy nhiên, hiện nay sản xuất nhãn đang gặp trở ngại lớn là dịch bệnh Chổi Rồng (CR) xuất hiện và gây hại rất nghiêm trọng tại các vùng sản xuất nhãn trên cả nước, đặc biệt là các tỉnh phía Nam với diện tích 39.181 ha, trong đó diện tích nhiễm bệnh 24.452 ha, chiếm 62,4% diện tích trồng nhãn (Trung tâm Bảo vệ thực vật phía Nam, 2012)

Bệnh CR xuất hiện ở Trung Quốc từ năm 1955 và một số nước như Thái Lan, Hồng Kông, Đài Loan, Brazil (Menzel và ctv., 1989), CR được xem là một trong những dịch hại quan trọng nhất trên nhãn (Chen và ctv., 1992; Coates và ctv., 2003) Tại Việt Nam, bệnh CR được ghi nhận tại miền Bắc vào năm 1999 (Đặng Vũ Thị Thanh và Hà Minh Trung, 1999) và tại miền Nam vào năm 2001 (Mai Văn Trị, 2004) Triệu chứng bệnh CR được ghi nhận trên chồi non, lá và hoa (Chen và Xu, 2001; Menzel và ctv., 1989) Zhang và Zhang (1999) đã mô tả triệu chứng bệnh CR là ngọn và phát hoa

co cụm lại, lá non và phát hoa trên chồi nhiễm CR sinh trưởng kém, biến dạng, hoa phát triển bất thường và không thể hình thành trái hoặc phát triển rất ít trái Bệnh này lây lan rất nhanh làm cho diện tích nhiễm bệnh ngày càng tăng, gây hại rất nghiêm trọng và gây thất thu năng suất nhãn từ 10-80%, tùy theo mức độ gây hại, thậm chí có những vườn bị nhiễm bệnh 100%, không cho thu hoạch, gây thiệt hại rất lớn đến thu nhập và đời sống của phần đông nhà vườn tại các vùng trồng nhãn tập trung như Vĩnh Long, Tiền Giang, Đồng Tháp, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Cần Thơ và Hậu Giang Ngoài ra, việc sử dụng nhiều thuốc BVTV hóa học ảnh hưởng đến môi trường, sức khỏe của người sản xuất và để lại dư lượng trong sản phẩm nhãn Do sản xuất nhãn bị thiệt hại nghiêm trọng nên Bộ Nông nghiệp và PTNT đã đưa CR vào danh mục dịch bệnh nguy hiểm được hưởng chính sách hỗ trợ của Nhà nước (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2010), đã có 7 tỉnh ĐBSCL đã công bố dịch CR

Do bệnh CR hại nhãn mới được ghi nhận tại Việt Nam, nên nhiều vấn

đề liên quan đến bệnh như tác nhân gây bệnh, môi giới truyền bệnh và biện pháp quản lý hiệu quả vẫn chưa được nghiên cứu và hiểu rõ Vì vậy, luận

án “Nghiên cứu hội chứng Chổi Rồng trên cây nhãn (Dimocarpus longan

Lour.) và biện pháp quản lý tổng hợp tại Đồng bằng sông Cửu Long” được

thực hiện là rất cần thiết và hết sức cấp bách nhằm góp phần ngăn chặn bệnh Chổi Rồng và khôi phục vùng sản xuất nhãn tại ĐBSCL

1.2 Mục tiêu và yêu cầu nghiên cứu

Kiểm tra sự hiện diện của vi sinh vật trong mẫu nhãn bệnh CR Xác

định được vai trò của NLN E dimocarpi đối với bệnh CR trên nhãn Xác định được đặc điểm sinh học của NLN E dimocarpi Nghiên cứu sản phẩm

sinh học trong việc quản lý hiệu quả NLN Xây dựng hoàn thiện quy trình

và thực hiện mô hình quản lý hiệu quả NLN và bệnh CR trên nhãn

1.3 Ý nghĩa khoa học của luận án

Đề tài có ý nghĩa khoa học cao vì nghiên cứu có hệ thống về hiện tượng

CR trên cây nhãn, ứng dụng nhiều phương pháp nghiên cứu mới như kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp với phương pháp truyền thống trong xác định tác nhân gây bệnh CR Đây cũng là công trình đầu tiên nghiên cứu về tác nhân gây bệnh CR bằng phương pháp quan sát mẫu nhãn bệnh dưới kính hiển vi điện tử tại Việt Nam Kết quả của đề tài cung cấp những kiến thức về đặc điểm sinh học của loài nhện mới thuộc họ Eriophyidae và xác định khả năng chống chịu bệnh CR của các giống nhãn ở ĐBSCL Đề tài còn là cơ sở cho việc thực hiện các nghiên cứu tiếp theo về NLN và hiện tượng CR, có thể sử dụng làm tài liệu tham khảo và học thuật cho sinh viên các bậc đại học

và sau đại học tại các viện, trường khi nghiên cứu về lĩnh vực này

1.4 Những đóng góp mới của luận án

Luận án đã nghiên cứu được nhiều số liệu liên quan đến tác nhân gây bệnh, phương thức lan truyền và cách gây hại của bệnh CR trên nhãn tại

các tỉnh ĐBSCL Xác định được nhện lông nhung thuộc loài Eriophyes

dimocarpi (Acari: Eriophyidae) là môi giới truyền bệnh CR trên nhãn, cùng

đặc điểm hình thái, sinh học và sinh thái trên nhãn Đề tài đã khẳng định

ong mật Apis mellifera không có vai trò trong việc phát tán NLN, xác định

được khả năng mẫn cảm hay chống chịu của các giống nhãn đối với bệnh

CR và xây dựng được quy trình cùng mô hình quản lý tổng hợp hiệu quả NLN và bệnh CR trên cây nhãn tại ĐBSCL

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung gồm có: (1) Điều tra hiện trạng bệnh Chổi Rồng trên nhãn Tiêu da bò tại Tiền Giang và Vĩnh Long, (2) Nghiên cứu tác nhân gây bệnh Chổi Rồng và phương thức truyền bệnh trên nhãn, (3) Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và sinh thái của nhện lông nhung trên nhãn tại các tỉnh ĐBSCL, (4) Nghiên cứu mức độ mẫn cảm đối với bệnh Chổi Rồng của các

giống nhãn và (5) Nghiên cứu biện pháp quản lý tổng hợp nhện lông nhung

và bệnh Chổi Rồng trên nhãn

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Từ tháng 01/2011 đến tháng 11/2015

Địa điểm: Công tác điều tra và thu mẫu nghiên cứu (tác nhân, đặc điểm

sinh học, phổ ký chủ, thiên địch, biện pháp quản lý của NLN cũng như bệnh CR) và xây dựng mô hình quản lý tổng hợp được thực hiện trên các vườn nhãn tại 4 tỉnh Tiền Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh và Bến Tre Các thí nghiệm trong phòng, nhà lưới và phân tích được thực hiện tại Bộ môn Bảo

vệ thực vật và Bộ môn Công nghệ Sinh học (Viện Cây ăn quả miền Nam (VCAQMN)); Phòng Sinh học Phân tử-Viện Công nghệ Sinh học và Phòng Thí nghiệm Chuyên sâu (Trường Đại học Cần Thơ); Phòng Sinh học Phân tử-Viện Công nghệ Sinh học (Trường Đại học Nông Lâm-TP.HCM); Phòng Kính hiển vi điện tử (Viện Vệ sinh Dịch tể Trung ương-Hà Nội); Phòng Thí nghiệm Phân tích Trung tâm (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM) và Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TP.HCM

3.4.2 Nghiên cứu tác nhân gây bệnh Chổi Rồng và phương thức truyền bệnh trên nhãn

3.4.2.1 Nghiên cứu tác nhân gây bệnh Chổi Rồng trên nhãn

a Xác định tác nhân bằng phương pháp nhuộm DAPI Tổng số mẫu

được quan sát là 10 mẫu nhãn TDB có triệu chứng và 10 mẫu nhãn TDB sạch Mẫu nhãn quan sát là gân lá, cuống lá và ngọn Tiến hành các bước nhuộm DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole) và xem kết quả dưới kính hiển

vi huỳnh quang ở các độ phóng đại 10-40 lần, bước sóng của đèn UV 36 nm (Nolberto và ctv., 2013)

b Nghiên cứu tác nhân bằng sinh học phân tử Ly trích DNA tổng số

từ mẫu lá và chồi nhãn theo 2 quy trình: CTAB được mô tả bởi Rogers và Bendich (1988) có hiệu chỉnh và bộ kít DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) Ly trích RNA bằng bộ kít RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Đức)

(i) Giả thuyết tác nhân gây bệnh Chổi Rồng trên nhãn là phytoplasma Sử dụng kỹ thuật PCR tổ (nested-PCR) để kiểm chứng giả

thuyết Đây là một kỹ thuật PCR 2 giai đoạn nhằm tăng thêm độ nhạy của

PCR Các cặp mồi sử dụng để khuyếch đại là các cặp mồi chung dùng để phát hiện cho tất cả các phytoplasma đã được công bố Cặp đoạn mồi P1/P7, P1/Tint và R16mF2/R16mR1 được sử dụng trong giai đoạn đầu Sản phẩm của phản ứng PCR đầu tiên này được pha loãng từ 20-40 lần và tiếp tục làm mạch khuôn cho phản ứng PCR tiếp theo Các cặp mồi fU5/rU3, f01/r01, R16F2n/R16R2, R16F1/R16R0, R16(X)F1/R16(X)R1 và R16(V)F1/R16(V)R1, 16R758F/m23sR và R16(I)F1/R16(I)R1 được sử dụng trong phản ứng PCR giai đoạn 2

(ii) Giả thuyết tác nhân gây bệnh Chổi Rồng trên nhãn là vi khuẩn

Các cặp mồi sử dụng để khuyếch đại là các cặp mồi chung dùng để phát hiện các vi khuẩn được thiết kế trên trình tự 16S rRNA của vi khuẩn đã được công bố (Bảng 3.3) như 27F/1492R, 27F/1489R, 27F/1525R, G1/L1, P8FPL/P806R, 395F/871R, 395F/1492R, 799F/1492R, UNI-OL/UNI-OR

và UNI-IL/UNI-IR

(iii) Giả thuyết tác nhân gây bệnh Chổi Rồng trên nhãn là vi rút

Các cặp mồi được sử dụng là các cặp mồi chung của một số nhóm vi rút có genome là ssRNA và có cấu trúc dạng hình sợi như Nib2-F/Nib3-R và

CN48/Oligo-dT cho nhóm EAPV/Potyvirus; A1/D1, B1/C1, A2/D2 và B2/C2 cho nhóm Emaravirus; Tymorep-F/Tymorep-R cho nhóm

Tymovirus; CTV-F/CTV-R cho nhóm Closterovirus/CTV; TMV-F/TMV-R

cho nhóm Tobamovirus/CMV Ngoài ra, một số vi rút có genome là ssDNA

được tiến hành trong thí nghiệm này như Begomo-F/Begomo-R cho nhóm

Begomovirus/PLCV và BBTV-R/BBTV-F cho nhóm Babuvirus

* Giải trình tự, so sánh với ngân hàng gen và phân tích phả hệ: Sản phẩm phản ứng PCR từ các cặp mồi P1/P7 và R16F2n/R16R2 của phytoplasma, 395F/1492R và 799F/1492R của vi khuẩn được giải trình tự theo quy trình của công ty Hóa Sinh (Việt Nam) và so sánh trên ngân hàng gen NCBI (Pruitt và ctv., 2007) bằng phần mềm BLAST (Zhang và ctv., 2000) Cây phả hệ được xây dựng theo phương pháp Neibour-Joining (NJ)

d Nghiên cứu giả thuyết nhện lông nhung là nguyên nhân gây bệnh Chổi Rồng nhãn Thiết lập quần thể NLN trong phòng thí nghiệm Thí

nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 6 nghiệm thức (NT1-NT5: 5, 10, 15, 20, 50 con NLN/cây), 10 lần lặp lại

3.4.2.2 Xác định phương thức lan truyền BCR trên nhãn tại ĐBSCL

a Khảo sát vai trò của nhện lông nhung đối với bệnh Chổi Rồng trên nhãn Thí nghiệm được thực hiện trong nhà kính, bố trí theo kiểu

hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nghiệm thức: lây nhiễm bệnh lên cây nhãn con bằng NLN sạch bệnh, NLN nhiễm bệnh và không lây nhiễm NLN) và 7 lần lặp lại, 10 cây nhãn con/lần lặp lại (theo Quy chuẩn QCVN 01-38:2010/BNNPTNT; Nguyễn Công Thuật, 1997)

b Xác định phương thức truyền bệnh Chổi Rồng bằng cách ghép

Thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức (NT1: Ghép mắt (Gốc ghép sạch bệnh, mắt ghép nhiễm bệnh); NT2: Ghép mắt (Gốc ghép nhiễm bệnh, mắt ghép sạch bệnh); NT3: Ghép áp (Cây sạch bệnh ghép trên cây nhiễm bệnh); NT4: Đối chứng 1 (Cây sạch bệnh); NT5: Đối chứng 2 (Cây nhiễm bệnh)) và 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 cây/1 mắt ghép

c Khảo sát hàm lượng các chất điều hoà sinh trưởng trong cây nhãn

bị bệnh và sạch Thu thập mẫu nhãn TDB có và không triệu chứng CR và

mẫu nhãn Xuồng cơm vàng Các mẫu lá được thu có cùng độ tuổi là giai đoạn lá non, gửi mẫu đến Phòng thí nghiệm phân tích trung tâm của Trường Đại học khoa học tự nhiên TP.HCM, Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP.HCM để phân tích các chỉ tiêu về hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng trong cây nhãn như IAA, ABA, Polyphenol, Gibberelic acid (GA3)

* Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng IAA đến

bệnh Chổi Rồng trên nhãn Thí nghiệm được bố trí trong nhà lưới theo kiểu

hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức (NT1 (IAA 100 ppm), NT2 (IAA

200 ppm), NT3 (IAA 500 ppm), NT4 (đối chứng (phun nước sạch)) và 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 cây nhãn nhiễm CR Tiến hành phun IAA lên cây nhãn 3 tháng tuổi đã nhiễm CR hoàn toàn, phun 2 tuần/lần, bắt đầu phun vào giai đoạn cây chuẩn bị ra đọt non (khoảng 3-5 ngày trước khi ra đọt non)

3.4.3 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và sinh thái của nhện lông nhung trên nhãn tại các tỉnh ĐBSCL

3.4.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học của nhện lông nhung

Nhện được nuôi trên cây nhãn con có 2 lá thực ở trong lồng kính, theo dõi lá và đọt nhãn để lấy trứng làm thí nghiệm NLN được nuôi trên cây nhãn con có 2

lá thực ở trong lồng kính, theo dõi lá và đọt nhãn để lấy trứng làm thí nghiệm Lấy những trứng đẻ cùng 1 ngày làm vật liệu nghiên cứu vòng đời Khi trứng

nở, ấu trùng được tách ra nuôi cá thể bằng cách chuyển qua đọt chồi nhãn mới

Tiến hành theo dõi hàng ngày vào một giờ cố định (8 h sáng) để theo dõi các chỉ tiêu Theo dõi thí nghiệm ở mỗi lần với số lượng cá thể n = 30 Mẫu NLN được phân loại dựa theo phương pháp của Kuang (1997) và Keifer (1962) Sau khi được phân loại, tiến hành nhân nuôi cá thể và quần thể NLN trong phòng thí nghiệm dựa theo phương pháp của Walter và Krantz (2009) Đo và tính chiều dài cơ thể theo phương pháp của Magud và ctv (2007)

3.4.3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh thái của nhện lông nhung

a Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự gia tăng quần thể của nhện lông nhung Tiến hành nhân nuôi cá thể NLN trên cây nhãn con có 2

lá thực ở trong điều kiện nhiệt độ khác nhau, ẩm độ 70% trong tủ nhân nuôi Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức (mỗi nghiệm thức là 1 mức nhiệt độ

10, 20, 25, 30 và 35oC) với 40 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 cây nhãn con (1 cá thể NLN cái/cây nhãn con) Tiến hành theo dõi mật số NLN ở các nghiệm thức thí nghiệm

b Khảo sát sự phân bố tự nhiên của nhện lông nhung trên cây nhãn Thí nghiệm khảo sát mật số NLN ở 4 hướng khác nhau và 4 giai

đoạn tuổi lá khác nhau trên cây nhãn TDB nhiễm bệnh CR 70% được thực hiện vào mùa nắng (4-5 dương lịch) và mùa mưa (7-8 dương lịch) Thí nghiệm bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên 2 yếu tố: (1) yếu tố A gồm 4 nghiệm thức theo hướng Đông, Tây, Nam và Bắc, và (2) yếu tố B gồm 4 nghiệm thức ở các giai đoạn tuổi lá như đọt non, lá non, lá thành thục chưa hoàn chỉnh, và lá thành thục hoàn chỉnh (bánh tẻ) với 5 lần lặp lại, 2 cây/lần lặp lại (theo Quy chuẩn QCVN 01-38:2010/BNNPTNT)

c Theo dõi diễn biến mật số của nhện lông nhung trên nhãn Tiêu da

bò Chọn cố định 2 vườn nhãn TDB nhiễm CR với tỷ lệ nhiễm 100%, mỗi

vườn khảo sát 5 điểm ngẫu nhiên, mỗi cây/điểm, quan sát 4 hướng/cây, 1 cành cấp 3/hướng, 10 lá chét/cành, cố định các cây này trong suốt quá trình khảo sát (theo Nguyễn Công Thuật, 1997) Định kỳ mỗi tháng thu thập mẫu

lá về phòng thí nghiệm đếm số lượng NLN trên lá (10 lá chét) để xác định diễn biến mật số của NLN trong năm

d Nghiên cứu khả năng phát tán của nhện lông nhung trên cây nhãn (i) Khảo sát sự hiện diện của nhện lông nhung trên cơ thể của ong mật, ong dại và bọ xít nhãn Tiến hành thu thập các loài ong trên 60 vườn

nhãn TDB nhiễm bệnh CR từ 50-80%, có trung bình mật số NLN trên 60

con/lá chét và hoa Tại mỗi vườn thu 20 cá thể của 2 loài ong mật Apis

mellifera và ong dại A dorsata (Hymenoptera: Apidae) trên lá và hoa của

cây nhãn, khi cây nhãn ở giai đoạn ra hoa Đối với bọ xít nhãn Tessaratoma

sp tiến hành thu thập 20 cá thể/vườn

(ii) Khảo sát khả năng tự phát tán của nhện lông nhung Thí nghiệm

được thực hiện trong nhà kính 16 m2 Thí nghiệm được thiết kế đặt các chậu nhãn con theo đường tròn vườn tâm, sau đó đặt cây nhãn có chứa NLN (100 con/lá chét) vào “tâm” của thí nghiệm

(iii) Khảo sát khả năng phát tán của nhện lông nhung nhờ bọ xít

nhãn Thí nghiệm được thực hiện tương tự thí nghiệm trên, có thả thêm 50

thành trùng bọ xít nhãn vào “tâm” của thí nghiệm

e Xác định cây ký chủ của nhện lông nhung tại ĐBSCL Tiến hành

khảo sát vào thời điểm mật số NLN cao trong điều kiện tự nhiên trên các chủng loại cây ăn trái quan trọng có trồng xen trong vườn nhãn TDB nhiễm

CR Mỗi chủng loại cây khảo sát 10 vườn (theo Nguyễn Công Thuật, 1997) Khảo sát 2 đợt (đợt 1: tháng 4/2012 và đợt 2 tháng 4/2013) Theo dõi vị trí xuất hiện, tần suất xuất hiện của NLN

f Khảo sát thành phần thiên địch của nhện lông nhung trên nhãn tại ĐBSCL Tiến hành khảo sát 20 vườn nhãn TDB, xác định thành phần loài côn

trùng và nhện nghi ngờ là thiên địch của NLN trên cây nhãn vào giai đoạn cây

ra đọt non và ra hoa, phân loại dựa vào tài liệu của Ren và ctv (2007)

3.4.4 Nghiên cứu mức độ mẫn cảm đối với bệnh Chổi Rồng của các giống nhãn

3.4.4.1 Đánh giá mức độ mẫn cảm với bệnh Chổi Rồng của các giống nhãn được trồng phổ biến tại Tiền Giang Tiến hành khảo sát 4 giống

nhãn được trồng phổ biến là TDB, Xuồng cơm vàng, Edor và Thạch kiệt Mỗi giống khảo sát 3 vườn Chỉ tiêu theo dõi: (1) Tỷ lệ nhiễm CR (%), (2) Đánh giá mức độ mẫn cảm của giống nhãn đối với bệnh CR (theo Croxall

và ctv., 1952; Mustafa và ctv., 2015) và (3) Vị trí xuất hiện, mức độ xuất hiện của NLN (theo Nguyễn Công Thuật, 1997)

3.4.4.2 Đánh giá mức độ mẫn cảm đối với bệnh Chổi Rồng của các giống nhãn tại ĐBSCL Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn

ngẫu nhiên gồm 14 nghiệm thức (mỗi nghiệm thức là 1 giống nhãn) với 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 1 cây nhãn ghép

3.4.5 Nghiên cứu biện pháp quản lý tổng hợp nhện lông nhung và bệnh Chổi Rồng trên nhãn

3.4.5.1 Biện pháp canh tác

a Đánh giá hiệu quả của việc tỉa cành ở các mức độ khác nhau đối với quản lý bệnh Chổi Rồng trên nhãn

(i) Thí nghiệm 1 Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu

nhiên với 3 nghiệm thức (NT1: Cắt tỉa cành 50 cm; NT2: Cắt tỉa cành 30 cm; NT3: Đối chứng (không cắt tỉa cành)) và 7 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại bố trí

trên 1 cây nhãn Sau khi thu hoạch trái, tiến hành cắt tỉa xung quanh tán cây, mỗi cây ở 1 mức cắt tỉa, độ dài cắt tỉa tính từ đầu cành Ghi nhận tỷ lệ chồi nhiễm bệnh CR ở thời điểm trước khi xử lý, 3, 4, 5 và 6 tuần sau xử lý

(ii) Thí nghiệm 2 Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn

ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức (NT1: Cắt tỉa cành 30 cm; NT2: Cắt tỉa cành

35 cm; NT3: Cắt tỉa cành 40 cm; NT4: Đối chứng (không cắt tỉa cành)) và

5 lần lặp lại Theo dõi tình hình sinh trưởng, phát triển của cây nhãn Mật

số NLN hiện diện trên lá nhãn Tỷ lệ chồi nhiễm bệnh CR

b Đánh giá hiệu quả của các mức phân bón khác nhau đối với quản

lý bệnh Chổi Rồng trên cây nhãn Thí nghiệm bố trí theo kiểu khối hoàn

toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức (NT1: 480 g N-240 g P2O5-480 g

K2O+5 kg hữu cơ; NT2: 480 g N-240 g P2O5-480 g K2O+10 kg hữu cơ; NT3: 480 g N-240 g P2O5-480 g K2O; NT4: 480 g N-240 g P2O5-960 g

K2O+5 kg hữu cơ; NT5: Đối chứng (nông dân) 460 g N-380 g P2O5-280 g

K2O) (công thức phân bón dựa theo quy trình của Bộ môn kỹ thuật canh tác-VCAQMN có điều chỉnh lượng phân hữu cơ và kali) và 4 lần lặp lại Tỷ

lệ chồi nhiễm bệnh CR (trên mỗi cây theo dõi 4 hướng, mỗi hướng chọn 1 cành cấp 3, đếm số chồi nhiễm trên tổng số chồi khảo sát tại mỗi hướng ở các ngày lấy chỉ tiêu) Ghi nhận tỷ lệ chồi nhiễm bệnh CR; Mật số NLN trên lá; Các yếu tố cấu thành năng suất

c Nghiên cứu thời điểm xử lý thuốc BVTV hợp lý trong quản lý bệnh Chổi Rồng trên nhãn Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn

toàn ngẫu nhiên, gồm 5 nghiệm thức (NT1-NT5: 6-3 lần phun) với 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 cây nhãn Ghi nhận mật số NLN trên lá; Tỷ lệ nhiễm bệnh CR theo từng giai đoạn cây ra đọt non, ra hoa

3.4.5.2 Biện pháp sinh học và dịch trích thảo mộc

a Khảo nghiệm hiệu quả của dịch trích thảo mộc đến tỷ lệ chết của nhện lông nhung

(i) Chọn lọc dịch trích có hiệu quả trong điều kiện phòng thí

nghiệm Thí nghiê ̣m được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 7 nghiê ̣m thức

là dịch trích ớt đỏ, ớt xanh, củ gừng, rễ vạn thọ, củ hành, củ nghệ và thuốc Prodife’s 6WDG) với 3 lần lă ̣p la ̣i, mỗi lần lặp lại là 1 cây nhãn con 2 tuần tuổi Tiến hành thí nghiệm bằng cách dùng cọ lông mịn thả 50 ấu trùng NLN tuổi 2 trên đọt cây nhãn con để NLN ổn định trên đọt nhãn 2 giờ, rồi phun các dịch thảo mộc và thuốc Emamectin benzoate lên tán lá Hiệu lực của thuốc được tính theo công thức Abbott (1925)

(ii) Chọn lọc nồng độ thích hợp của dịch trích củ hành, củ nghệ và

ớt xanh để phòng trừ nhện lông nhung ở điều kiện phòng thí nghiệm

Từ kết quả của thí nghiệm trên, 3 loại dịch trích củ hành, củ nghệ và ớt xanh đã được chọn Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5

nghiê ̣m thức là Đối chứng (phun nước), Dịch trích củ hành (Allium cepa)

0,1%, 0,05% và 0,01% và Emamectin benzoate, 4 lần lặp la ̣i , mỗi lần lặp lại là 1 cây nhãn con

(iii) Khảo nghiệm hiệu quả của dịch trích thảo mộc tại điều kiện ngoài vườn Từ kết quả của 2 thí nghiệm trên, tiếp tục chọn dịch trích và

nồng độ có hiệu quả cao trong diệt NLN để khảo sát ở điều kiện ngoài vườn Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5

nghiê ̣m thức là Đối chứng (phun nước), dịch trích ớt xanh (Capsicum

annuum), củ hành (Allium cepa), củ nghệ (Curcuma longa) và Abamectin)

với 4 lần lă ̣p la ̣i, mỗi lần lặp lại là 1 cây nhãn (vườn nhãn 5 năm tuổi nhiễm

CR nặng 70%) (TCN 522-2002) Ghi nhận mật số NLN trên lá Tính hiệu lực của dịch trích với NLN ở 3, 7, 10 và 14 ngày sau xử lý theo công thức của Henderson-Tilton (1955)

b Khảo nghiệm hiệu quả của các loài nấm ký sinh đối với nhện lông nhung trên nhãn

(i) Điều kiện nhà lưới Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn

ngẫu nhiên gồm 5 nghiê ̣m thức (NT1: Đối chứng (phun nước); NT2: Nấm

Paecilomyces sp (1x109 bào tử/g, 0,4 g chế phẩm + 0,1 lít nước); NT3:

Nấm Metarhizium anisopliae (1x109 bào tử/g, 0,78 g chế phẩm + 0,1 lít

nước); NT4: Nấm Beauveria bassiana (1x109 bào tử/g, 0,8 g dịch trích + 0,1 lít nước); NT5: Emamectin benzoate(0,1%, 0,1 ml + 0,1 lít nước)) với 4 lần lă ̣p la ̣i , mỗi lần lặp lại là 1 cây nhãn con 45 ngày tuổi Ghi nhận số lượng nhê ̣n lông nhung sống/tổng số nhê ̣n lông nhung ở các thời điểm 3, 7

và 10 ngày sau xử lý Hiệu lực của thuốc được tính theo công thức của Abbott (1925)

(ii) Điều kiện ngoài vườn Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn

toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức (NT1: Đối chứng (phun nước); NT2: Nấm

Paecilomyces sp (1x109 bào tử/g); NT3: Nấm Metarhizium anisopliae (1x109

bào tử/g); NT4: Dịch trích củ hành (Allium sepa) (0,1%); NT5: Emamectin

benzoate (0,1%)) với 4 lần lặp la ̣i, mỗi lần lặp lại là 2 cây nhãn

c Khảo nghiệm hiệu quả của các loại thuốc BVTV sinh học đối với nhện lông nhung trên nhãn tại điều kiện ngoài vườn Thí nghiê ̣m được

bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiê ̣m thức (các loại thuốc BVTV được chọn làm thí nghiệm là các thuốc sinh học, thuộc nhóm độc III, các hoạt chất này có khả năng diệt nhện) và 6 lần lă ̣p la ̣i, mỗi lần

lặp lại là 2 cây nhãn (theo TCN 522-2002)

3.4.5.3 Biện pháp hóa học Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 13 nghiệm thức (các loại thuốc BVTV được chọn làm thí nghiệm là các thuốc hóa học ít độc thuộc nhóm độc III, các hoạt chất này có khả năng diệt nhện) và 3 lần lă ̣p la ̣i , mỗi lần lặp lại là 2 cây nhãn (theo TCN 522-2002)

3.4.5.4 Xây dựng quy trình và mô hình quản lý tổng hợp hiệu quả bệnh Chổi Rồng trên nhãn Từ kết quả đạt được của các thí nghiệm trên tiến

hành xây dựng quy trình và làm mô hình quản lý tổng hợp hiệu quả bệnh

b Mô hình 2: Xã Hiệp Đức của huyện Cai Lậy (Tiền Giang) Mô

hình được bố trí trên vườn nhãn TDB 15 năm tuổi, nhiễm bệnh CR 100% với diện tích 4.000 m2 được chia làm 2 lô Lô thí nghiệm áp dụng biện pháp quản lý bệnh CR theo quy trình quản lý bệnh, còn lô đối chứng được thực hiện theo nông dân

c Mô hình 3: Xã Hòa Khánh của huyện Cái Bè (Tiền Giang) Mô

hình được bố trí trên vườn nhãn TDB 15 năm tuổi, nhiễm bệnh CR 100% với diện tích 5.000 m2 được chia làm 2 lô Lô thí nghiệm áp dụng biện pháp quản lý bệnh CR theo quy trình quản lý bệnh, còn lô đối chứng được thực hiện theo nông dân

3.5 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu về sự phân bố, ảnh hưởng của

nhiệt độ đến sự gia tăng quần thể của NLN, đánh giá khả năng nhiễm bệnh

CR của các giống nhãn, ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng IAA đến bệnh CR và quản lý NLN trên cây nhãn được xử lý bằng phần mềm thống

kê MSTATC Phân tích phương sai (ANOVA) để đánh giá sự khác biệt giữa các nghiệm thức, so sánh các giá trị trung bình bằng phép thử Duncan, LSD Số liệu về mô hình quản lý bệnh CR trên nhãn TDB được phân tích thống kê qua phép thử T-test

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Hiện trạng bệnh Chổi Rồng trên nhãn Tiêu da bò tại Tiền Giang

và Vĩnh Long Kết quả điều tra cho thấy bệnh CR xuất hiện phổ biến nhất

theo cơi đọt non của cây nhãn và vào mùa nắng Giống nhãn TDB được trồng rất phổ biến, chiếm 92%, nên áp lực đối với bệnh này rất cao Thiệt

hại về năng suất do bệnh CR gây ra tại các huyện điều tra là từ 11,5 đến 66,0% (năm 2011)

4.2 Tác nhân gây bệnh Chổi Rồng và phương thức truyền bệnh trên nhãn 4.2.1 Tác nhân gây bệnh Chổi Rồng trên nhãn

a Xác định tác nhân gây bệnh Chổi Rồng bằng nhuộm DAPI Kết

quả nhuộm DAPI ghi nhận trên mẫu nhãn có triệu chứng bệnh có hiện tượng phát huỳnh quang, xuất hiện các điểm nhỏ tập trung gần vách tế bào trong các tế bào của mô dẫn, nhưng các điểm này không thấy trong cây không có triệu chứng bệnh Kết quả này cũng tương tự như DAPI nhuộm

trên cây Ugni molinae và Gaultheria phillyreifolia nhiễm bệnh CR

(Nolberto và ctv., 2013) Như vậy, phương pháp nhuộm DAPI chỉ ra rằng bệnh CR trên nhãn có hiện diện của vi sinh vật

b Xác định tác nhân gây bệnh Chổi Rồng trên nhãn bằng phương pháp sinh học phân tử

(i) Giả thuyết tác nhân gây bệnh là phytoplasma

Bảng 4.9: Kết quả PCR/nested-PCR trên nhãn khi sử dụng các cặp mồi của phytoplasma

thước DNA dự đoán

Kết quả nested-PCR và kích thước đoạn DNA khuyếch đại

sạch

Đối chứng dương

Ghi chú: +: kết quả dương tính; -: kết quả âm tính; NA: không áp dụng

Kết quả PCR khi sử dụng kỹ thuật nested-PCR giữa cặp mồi P1/Tint, R16mF2/R16mR1 và P1/P7 lần 1, sau đó PCR lần 2 với một trong các cặp mồi f01/r02, fU5/rU3, R16F2n/R16R2, R16F1/R16R0, R16(X)F1/R16(X)R1, 16R758F/m23sR, R16(I)F1/R16(I)R1, R16(V)F1/R16(V)R1, M1/M2, PA2F/R, NPA2F/R, Fra4/Fra5 và SecAfor1/SecAfor2/SecArev3, trong đó cặp mồi R16F2n/R16R2 dùng để phát hiện tất cả các chủng phytoplasma (Lee và ctv., 1995) Kết quả (Bảng 4.9) cho thấy 2 mẫu mía bị bệnh chồi cỏ do phytoplasma gây ra cho phản ứng dương tính với cặp mồi này và sản phẩm khuyếch đại có kích thước tương đương 1.200 bp, trong khi các mẫu nhãn nhiễm bệnh CR cho sản phẩm có kích thước khoảng 950 bp và không có từ mẫu nhãn sạch Khi giải trình tự theo quy trình của Công ty Hóa Sinh và so sánh chuỗi ký tự trên ngân hàng gen NCBI, kết quả đọc trình tự gen của các mẫu nhãn nhiễm bệnh CR cho thấy tất cả các sản phẩm đều có chất lượng tốt và có chiều dài 950 bp, trong khi mẫu mía nhiễm bệnh chồi cỏ có kích thước khoảng 1200 bp Phân tích cây phả hệ cho thấy mẫu nhãn nhiễm bệnh CR nằm gần với nhóm vi khuẩn không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo proteobacteria thuộc nhóm phụ gramma Phytoplasma, tác nhân gây bệnh chồi cỏ mía, tách thành một nhóm riêng biệt trên cây phát sinh loài Điều này cho thấy chưa phát hiện được sự hiện diện của phytoplasma trên mẫu nhãn nhiễm bệnh CR, phù hợp với kết quả của Sdoodee và ctv (1999) Tuy nhiên, theo kết quả của Thuy và ctv (2012), khi sử dụng 2 cặp mồi R16mR2/R16mR1

và R16(V)F1/R16(V)R1, cho kết quả dương tính của mẫu nhãn nhiễm bệnh

CR, nên các tác giả này bước đầu ghi nhận tác nhân của bệnh CR là do phytoplasma nhóm phụ V Mặc dù vậy, tác giả không thực hiện PCR trên mẫu nhãn sạch bệnh để đối chứng và kết quả cũng chưa được lặp lại, nên kết quả này cần được chứng minh bệnh bằng dịch tể học

Chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử của lát cắt siêu mỏng của mẫu nhãn nhiễm bệnh CR đã không tìm thấy sự hiện diện của phytoplasma ở bất kỳ hình dạng nào, trong khi cũng với phương pháp này ảnh chụp phytoplasma gây bệnh trên bắp cho hình ảnh rất rõ (Trần Thị Thanh Bình và ctv., 2011) Chen và ctv (1989) và Nguyễn Văn Hòa và ctv (2008) cho biết khi sử dụng kháng sinh Oxytetracylin 10% đã không hiệu quả trong việc điều trị bệnh CR trên nhãn Đồng thời, khảo sát ở điều kiện ngoài vườn nhãn cho thấy bệnh CR xuất hiện không theo hệ thống mạch dẫn như: trên cùng một cây bệnh chỉ có một vài cành thể hiện triệu chứng, ngay cả trên cùng một cành chỉ một số chồi non thể hiện triệu chứng, thậm chí trên một lá kép chỉ

một vài lá chét thể hiện triệu chứng Nhiều trường hợp chồi non mọc ra từ một chồi nhiễm bệnh trước đó cũng không thể hiện triệu chứng và phát triển bình thường Một số cây nhãn bị nhiễm CR một thời gian rồi sau đó không thấy xuất hiện triệu chứng nữa, mặc dù không áp dụng các biện pháp phòng trừ (Mai Văn Trị và ctv., 2005) Kết quả nghiên cứu của Tiwari và ctv (2013) đối với bệnh phytoplasma trên ớt, khi sử dụng cặp mồi P1/Tint

để khuyếch đại vùng 16S rRNA của phytoplasma trên ớt và trình tự đoạn DNA thu được lại trùng khớp với nhóm vi khuẩn không nuôi cấy và gần

với vi khuẩn Pseudomonas spp Tóm lại, trong nghiên cứu này bằng kỹ

thuật sinh học phân tử chưa phát hiện được sự hiện diện của phytoplasma trong mẫu nhãn nhiễm bệnh CR

(ii) Giả thuyết tác nhân gây bệnh Chổi Rồng trên nhãn là vi khuẩn

Bảng 4.10: Kết quả PCR trên nhãn khi sử dụng các mồi cho vi khuẩn

đoạn DNA (bp)

Kết quả PCR và kích thước đoạn DNA

Ghi chú: +: kết quả dương tính; -: kết quả âm tính

Trong nghiên cứu này, các cặp đoạn mồi chung cho vi khuẩn được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn trong mẫu lá/chồi nhãn nhiễm bệnh CR Kết quả được trình bày ở Bảng 4.10 Tóm lại, đối với sản phẩm của các cặp mồi 395F/1492R và 799F/1492R có sự khác biệt giữa các mẫu nhãn bệnh CR với mẫu nhãn sạch và có sự ổn định từ các lần thí nghiệm lặp lại, nên sản phẩm PCR của mẫu nhãn nhiễm bệnh CR được giải trình tự theo quy trình của công ty Hóa Sinh và so sánh chuỗi ký tự trên ngân hàng gen NCBI

* Giải trình tự, so sánh với ngân hàng gen và phân tích phả hệ: DNA của 2 mẫu nhãn nhiễm bệnh CR thu được đối với cặp mồi 395F/1492R, khi tiến hành so sánh chuỗi ký tự trên ngân hàng gen NCBI đều cho kết quả có trình tự DNA đồng nhất với nhau và tương tự với trình tự của vi khuẩn thuộc nhóm Beta-proteobacterium, trong khi ở kết quả giải trình tự với giả thuyết bệnh CR do phytoplasma gây ra thì cho thấy mẫu nhãn nhiễm bệnh