KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TINH DẦU GỪNG (Zingiber officinale Roscoe) THUỘC HỌ GỪNG (Zingiberaceae)

LỜI CẢM ƠN  Trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp với đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu gừng Zingiber officinale Roscoe

KHOA SƢ PHẠM

BỘ MÔN SƢ PHẠM HÓA HỌC

NGUYỄN THỊ HOÀNG YẾN

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA

TINH DẦU GỪNG (Zingiber officinale Roscoe)

THUỘC HỌ GỪNG (Zingiberaceae)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: SƢ PHẠM HÓA HỌC

2016

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA

TINH DẦU GỪNG (Zingiber officinale Roscoe)

THUỘC HỌ GỪNG (Zingiberaceae)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: SƯ PHẠM HÓA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths THÁI THỊ TUYẾT NHUNG

2016

LỜI CẢM ƠN



Trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp với đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu gừng

(Zingiber officinale Roscoe) thuộc họ gừng (Zingiberaceae)” tôi đã nhận được

rất nhiều sự giúp đỡ từ quý Thầy, Cô, gia đình và bạn bè

Trước hết tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Ths Thái Thị Tuyết Nhung người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các Thầy, Cô, Cán bộ trong Bộ môn Sư phạm Hóa học, Khoa Sư phạm, Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình chỉ bảo, động viên và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn này

Có được ngày hôm nay, con xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến Ba,

Mẹ và gia đình đã luôn tạo điều kiện về vật chất, tinh thần và luôn ủng hộ, động viên con

Ngoài ra, tôi xin chân thành cảm ơn đến tất cả các bạn sinh viên lớp Sư phạm Hóa K38 đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn!

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ths Thái Thị Tuyết Nhung

2 Đề tài: Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu

gừng (Zingiber officinale Roscoe) thuộc họ gừng (Zingiberaceae)

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hoàng Yến

chủng vi khuẩn Bacillus cereus, E coli, Staphylococus aureus)

Về tác phong làm việc với khoa học: với bước đầu tập làm nghiên cứu sinh viên Nguyễn Thị Hoàng Yến tỏ ra rất năng động, cần cù, cẩn thận, chính xác và nghiêm túc trong công việc Vì vậy, các kết quả nghiên cứu của sinh viên Nguyễn Thị Hoàng Yến có thể tin cậy và sử dụng được cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo sau này

Về việc trình bày và báo cáo luận văn: Luận văn gồm có 58 trang bao gồm 14 tài liệu tham khảo và phần phụ lục, được chia làm 5 phần chính: Giới thiệu (2 trang), Tổng quan (19 trang), Thực nghiệm (8 trang), Kết quả và biện luận (18 trang) và phần Kết luận và kiến nghị (1 trang) Văn phong đơn giản

và rất ít sai chính tả Báo cáo tập trung vừa phải, thu hút

Với những nhận xét trên, tôi có thể đánh giá tốt chất lượng của đề tài do sinh viên Nguyễn Thị Hoàng Yến đã thực hiện đồng thời qua việc thực hiện đề tài này nói lên rằng sinh viên Nguyễn Thị Hoàng Yến có nền tảng kiến thức tốt và có khả năng cho việc tiếp tục học tập và nghiên cứu sau này

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1

1 Cán bộ phản biện 1: TS Nguyễn Phúc Đảm

2 Đề tài: Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu

gừng (Zingiber officinale Roscoe) thuộc họ gừng (Zingiberaceae)

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hoàng Yến

MSSV: B1200651

Lớp: Sư phạm Hóa học – Khóa: 38

4 Nội dung nhận xét

a Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp (LVTN)

 Luận văn gồm có 58 trang bao gồm 14 tài liệu tham khảo và phần phụ lục, được chia làm 5 phần chính: Giới thiệu (2 trang), Tổng quan (19 trang), Thực nghiệm (8 trang), Kết quả và biện luận (18 trang) và phần Kết luận và kiến nghị (1 trang)

 Văn phong đơn giản, bố cục trình bày rõ ràng, sạch đẹp, dễ hiểu và ít lỗi chính tả

b Nhận xét về nội dung của LVTN

 Đánh giá nội dung thực hiện đề tài: trình bày ngắn gọn và khá đầy đủ chi tiết quá trình thực hiện và kết quả của quá trình nghiên cứu Nội dung chuyên môn phù hợp với đề tài nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên

 Kết quả: tác giả đã tổng hợp lý thuyết về gừng và ứng dụng của gừng, cũng như tinh dầu, các phương pháp ly trích tinh dầu và về hoạt tính sinh học quan tâm (kháng oxi hóa và kháng khuẩn) Tác giả đã tiến hành ly trích tinh dầu gừng bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự ly trích tinh dầu, xác định các chỉ số cơ bản của tinh dầu và thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa

và kháng khuẩn của tinh dầu điều chế được với kết quả khá khả quan (kháng oxi hóa gần bằng vitamin C, kháng lại 3 chủng vi khuẩn

Bacillus cereus, E coli, Staphylococus aureus)

c Kết luận, đề nghị và điểm

 Đạt yêu cầu một LVTN, đề nghị hội đồng thông qua

 Sinh viên nên cố gắng phát huy khả năng nghiên cứu để tiếp tục học tập nâng cao trình độ

 Chỉnh sửa luận văn theo yêu cầu về định dạng, lỗi chính tả

 Điểm số: 9/10

Cần Thơ, ngày 18 tháng 05 năm 2016

Cán bộ phản biện 1

TS Nguyễn Phúc Đảm

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 2

1 Cán bộ phản biện 2: Ths Ngô Quốc Luân

2 Đề tài: Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu

gừng (Zingiber officinale Roscoe) thuộc họ gừng (Zingiberaceae)

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hoàng Yến

MSSV: B1200651

Lớp: Sư phạm Hóa học – Khóa: 38

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp

 Luận văn gồm có 58 trang bao gồm 14 tài liệu tham khảo và phần phụ lục, được chia làm 5 phần chính: Giới thiệu (2 trang), Tổng quan (19 trang), Thực nghiệm (8 trang), Kết quả và biện luận (18 trang) và phần Kết luận và kiến nghị (1 trang)

 Văn phong đơn giản, bố cục trình bày rõ ràng, sạch đẹp, dễ hiểu và ít lỗi chính tả

b Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp

Đánh giá nội dung thực hiện đề tài: Trình bày ngắn gọn, đầy đủ chi tiết quá trình thực hiện và kết quả của công trình nghiên cứu Nội dung chuyên môn phù hợp, kết quả nghiên cứu đáp ứng yêu cầu của một luận văn tốt nghiệp đại học

c Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài

Thông qua việc thực hiện đề tài, sinh viên Nguyễn Thị Hoàng Yến tỏ

ra có năng lực nghiên cứu Kết quả có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

d Kết luận, đề nghị và điểm

 Đạt yêu cầu một LVTN, đề nghị hội đồng thông qua

 Sinh viên nên cố gắng phát huy khả năng nghiên cứu để tiếp tục học tập nâng cao trình độ

 Chỉnh sửa luận văn theo yêu cầu về định dạng, lỗi chính tả

 Điểm số: 9/10

Cần Thơ, ngày 18 tháng 05 năm 2016

Cán bộ phản biện 2

Ths Ngô Quốc Luân

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện dựa trên những nội dung sau:

- Ly trích tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chưng cất tinh dầu gừng như: thời gian, lượng nước chưng cất, độ héo của nguyên liệu

- Khảo sát các chỉ số vật lí và chỉ số hóa học của tinh dầu

- Xác định thành phần hóa học có trong tinh dầu gừng bằng phương pháp sắc

ký khí ghép khối phổ (GC/MS)

- Thử hoạt tính sinh học của tinh dầu gừng sản phẩm

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ii

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1 iv

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 2 vi

TÓM TẮT viii

MỤC LỤC ix

DANH SÁCH BẢNG xii

DANH SÁCH HÌNH xiii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiv

GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về gừng 3

1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.2 Sơ lược về gừng 3

1.1.3 Thành phần hóa học 5

1.1.4 Công dụng 6

1.2 Tinh dầu 7

1.2.1 Trạng thái tự nhiên 7

1.2.2 Phân bố 7

1.2.3 Vai trò của tinh dầu đối với đời sống thực vật 8

1.2.4 Công dụng của tinh dầu 9

1.2.5 Tính chất đặc trưng của tinh dầu 10

1.3 Một số phương pháp ly trích tinh dầu 12

1.4 Chỉ số acid 18

1.5 Chỉ số savon hóa 18

1.6 Chỉ số ester 18

1.7 Hoạt tính sinh học 19

1.7.1 Kháng oxi hóa 19

1.7.2 Kháng khuẩn 20

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 22

2.1 Trích ly tinh dầu gừng 22

2.2 Xác định bằng cảm quan 23

2.2.1 Màu sắc 23

2.2.2 Mùi 24

2.2.3 Vị 24

2.3 Xác định các chỉ số hóa học 24

2.3.1 Chỉ số acid 24

2.3.2 Chỉ số savon hóa 25

2.3.3 Chỉ số ester 26

2.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất ly trích tinh dầu 26

2.4.1 Thời gian ly trích 27

2.4.2 Khảo sát lượng nước chưng cất 27

2.4.3 Khảo sát độ héo của nguyên liệu 27

2.5 Xác định thành phần hóa học của tinh dầu 27

2.6 Kiểm định hoạt tính sinh học 27

2.6.1 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa bắt gốc tự do DPPH 27

2.6.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch

28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 30

3.1 Xác định các chỉ tiêu hóa lý của tinh dầu 30

3.1.1 Đánh giá cảm quan 30

3.1.2 Các chỉ tiêu hóa lí 30

3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ly trích tinh dầu 31

3.2.1 Thời gian 31

3.2.2 Lượng nước chưng cất 32

3.2.3 Khảo sát độ héo của nguyên liệu 33

3.3 Xác định thành phần hóa học của tinh dầu bằng phương pháp GC/MS 34

3.4 Khảo sát hoạt tính sinh học của tinh dầu gừng 44

3.4.1 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa bắt gốc tự do DPPH 44

3.4.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch 47

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Kiến nghị 48

PHỤ LỤC 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 1 Các phương pháp ly trích tinh dầu 13

Bảng 3 1 Kết quả khảo sát thời gian ly trích tinh dầu 31

Bảng 3 2 Kết quả khảo sát lượng nước chưng cất 32

Bảng 3 3 Kết quả khảo sát độ héo của nguyên liệu 33

Bảng 3 4 Kết quả thành phần và hàm lượng của tinh dầu gừng 34

Bảng 3 5 Công thức hóa học của các cấu tử có trong tinh dầu gừng 36

Bảng 3 6 Kết quả khảo sát khả năng kháng oxi hóa của tinh dầu gừng bằng DPPH 44

Bảng 3 7 Kết quả khảo sát khả năng kháng oxi hóa của vitamin C bằng DPPH 45

Bảng 3 8 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu gừng bằng phương pháp đục lỗ thạch 47

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 1 Minh họa cho cây gừng (Zingiber officinale Roscoe) 4

Hình 1 2 Củ gừng 4

Hình 3 1 Tinh dầu gừng 30

Hình 3 2 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian đến thể tích tinh dầu 31

Hình 3 3 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của lượng nước chưng cất 32

Hình 3 4 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của độ héo đến thể tích tinh dầu 33

Hình 3 5 Đồ thị biểu diễn khả năng kháng oxi hóa của tinh dầu gừng 45

Hình 3 6 Đồ thị biểu diễn khả năng kháng oxi hóa của vitamin C 46

Hình P 1 Nguyên liệu thô 49

Hình P 2 Nguyên liệu được cắt nhỏ 49

Hình P 3 Hệ thống chưng cất 50

Hình P 4 Sản phẩm tinh dầu gừng 50

Hình P 5 Vòng vô khuẩn của tinh dầu gừng với Escherichia coli O157:H7 51

Hình P 6 Vòng vô khuẩn của tinh dầu gừng với Bacillus cereus 51

Hình P 7 Vòng vô khuẩn của tinh dầu gừng với Staphylococcus aureus ATCC 25923 51

Hình P 8 Hàm lượng thành phần các hợp chất trong tinh dầu gừng bằng phương pháp GC/MS 53

Hình P 9 Sắc ký đồ tinh dầu gừng 54

Hình P 10 Kết quả khả năng kháng oxi hóa của tinh dầu gừng 55

Hình P 11 Kết quả khả năng kháng khuẩn của tinh dầu gừng 56

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CFU Colony forming units

DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DPPH-H 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine ĐKVK Đường kính vòng vô khuẩn

GC/MS Sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ HTCO Hoạt tính chống oxi hóa

GIỚI THIỆU

1 Đặt vấn đề

Nước ta có khí hậu nhiệt đới gió mùa thuận lợi cho nhiều loại thực vật phát triển Do đó các nghiên cứu về chiết xuất tinh dầu từ thực vật không ngừng tăng lên

Từ xa xưa, gừng được dùng nhiều trong việc điều trị các bệnh khác nhau

Vì thế cũng như gừng nguyên chất thì tinh dầu gừng cũng có tác dụng tương

tự như: chữa và điều trị bệnh thấp khớp, rối loạn dạ dày, giảm đờm trong cổ họng [1] Gừng hữu ích trong việc giảm mức cholesterol và ngăn ngừa đông máu, giúp giảm nguy cơ tắc nghẽn mạch máu và giảm tỷ lệ đột quỵ cho tim Gừng có khả năng chống oxi hóa và chống viêm mạnh mẽ, giúp ngăn ngừa các u bướu có mầm mống ung thư [2] Đã có gần 17 nghiên cứu khác nhau trên cả động vật và con người đều cho thấy gừng không chỉ làm thu hẹp lại các khối u mà còn ngăn ngừa và làm giảm sự di căn của tế bào ung thư đến các bộ phận khác của cơ thể

Xuất phát từ thực tế chung đó, việc khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu gừng là một việc làm cần thiết, từ đó góp phần tạo thêm hướng ứng dụng cho tinh dầu gừng, khai thác tiềm năng và nâng cao giá trị của loại cây này

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng quy trình ly trích, khảo sát thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học của tinh dầu thu được

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nghiên cứu cơ sở lí luận và thực tiễn của đề tài

- Tiến hành thực nghiệm ly trích tinh dầu gừng bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

- Xác định một số chỉ số hóa lý và thành phần hóa học của tinh dầu

- Thử hoạt tính sinh học về khả năng kháng khuẩn và kháng oxi hóa của tinh dầu gừng

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC GIỚI THIỆU

4 Các phương pháp nghiên cứu

- Nghiên cứu lí thuyết: thu thập, phân tích, tổng hợp tài liệu

- Thực nghiệm hóa học:

 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

 Phương pháp xác định các hợp chất hữu cơ: GC/MS

 Phương pháp sinh hóa: thử hoạt tính sinh học của tinh dầu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về gừng

1.1.1 Nguồn gốc

Theo những nghiên cứu về gừng của Hoffman, gừng được biết đến và được quý trọng bởi người Hy Lạp và La Mã cổ xưa Họ nhập khẩu loại gia vị này từ những thương gia Ả Rập qua vùng biển Đỏ Gừng được đưa vào Đức, Pháp thế kỉ IX và vào Anh thế kỷ X, và cũng bằng con đường buôn bán, trước năm 1547 gừng được đưa từ Jamaica vào Tây Ban Nha

Những vùng sản xuất gừng quan trọng nhất là Jamaica, Cochin và Calicut (bờ biển Labamar, Nam Ấn), Sierra Leone, Nigeria (Tây Phi) Gừng ở Jamaica được đánh giá là tốt nhất, có mùi thơm và hương vị nhẹ nhất Thứ hai

là gừng Cochin, gừng ở đây có mùi chanh đặc trưng Xếp thứ ba là gừng Tây Phi, gừng này có mùi long não nhẹ, mùi và hương vị không kém hơn gừng ở Jamaica và Cochin, màu gừng cũng sậm hơn Ngược lại gừng Tây Phi cho sản phẩm dầu cao nhất và có độ cay lớn nhất, vì vậy nó được dùng phần lớn cho việc chưng cất tinh dầu và trích ly nhựa dầu, nhưng giá thành của nó lại thấp hơn gừng Jamaica và Cochin

Ở Nhật cũng có giống gừng có độ cay cao nhưng lại thiếu mùi đặc trưng của gừng

Gừng Trung Quốc được trồng nhiều ở phía Tây Bắc Kwangtung và nó được xuất khẩu dưới dạng siro đường, vì vậy nó không được dùng cho chưng cất và trích ly tinh dầu

Ở Việt Nam, gừng mọc hoang dại trên núi Ba Vì, mọc nhiều ở vùng Cao Lạng, Hà Sơn Bình và trồng nhiều ở các tỉnh phía Nam [4]

1.1.2 Sơ lược về gừng

Gừng (tên khoa học: Zingiber officinale Roscoe) là loài cây thảo sống lâu

năm Cao khoảng 1 m, có thân rễ phình ra thành củ, có xơ khi già Lá không cuống, mọc cách, hình mũi mác, dài 20 cm, rộng 2 cm Hoa có cánh môi màu

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

vàng, viền tía Ra hoa vào mùa hạ và mùa thu Ở Việt Nam được trồng ở khắp nơi để lấy củ làm gia vị, làm mứt, làm thuốc, làm nguyên liệu chế rượu, bia Trong củ gừng có 2 – 3% tinh dầu, 5% nhựa dầu, 3% chất béo, còn lại là tinh bột và các chất cay [5]

Hình 1 1 Minh họa cho cây gừng (Zingiber officinale Roscoe)

Hình 1 2 Củ gừng

Sơ đồ phân loại và mô tả thực vật học của cây gừng:

Các nghiên cứu về mùi vị của gừng thường được thực hiện hầu hết trên tinh dầu chưng cất từ gừng khô Tuy nhiên tinh dầu này có thành phần và đặc tính cảm quan khác với tinh dầu bay hơi có tự nhiên trong gừng tươi

Tinh dầu gừng thu hồi bằng phương pháp chưng cất hơi nước từ gừng tươi là một chất lỏng màu vàng rơm, linh động, độ nhớt tăng dần theo thời gian tồn trữ và phơi bày ra không khí Theo Aretander gừng có mùi ẩm, mùi

gỗ tươi và mùi gia vị Mùi ban đầu của tinh dầu gừng rất giống tinh dầu của cam, sả, chanh, nhưng lại có hậu vị ngọt, mạnh, bền Tinh dầu gừng có đặc tính cảm quan thay đổi tuỳ theo nguồn gốc của gừng Ví dụ tinh dầu gừng

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

châu Phi có vị ngọt béo, màu sậm trong khi tinh dầu gừng Jamaica khi mới chưng có mùi cao su, còn tinh dầu gừng Ấn Độ lại có mùi chanh, mùi này càng rõ rệt hơn ở tinh dầu gừng của Úc

Hàm lượng tinh dầu gừng thường bị tác động bởi một số yếu tố như: giống gừng, độ chín vào lúc thu hoạch củ, cách xử lý gừng, phương pháp chưng cất

b Thành phần nhựa dầu gừng

Gừng được đánh giá cao qua vị cay của nó, để thu hồi những cấu tử tạo nên vị cay này gừng được ngâm chiết với những dung môi dễ bay hơi (acetone, rượu, ete, ) Sau khi cô đặc và đuổi dung môi ra khỏi dung dịch ta thu được nhựa dầu gừng, trong đó toàn bộ chất cay của gừng được giữ lại Khối lượng và thành phần của nhựa dầu gừng phụ thuộc vào dung môi sử dụng Thông thường nó gồm các chất:

- Gingerol: là cấu tử chính của nhựa dầu gừng, là một chất không thuần nhất Hơn 70 năm trước, Thresh đã gặp phải khó khăn trong việc trích

ly gingerol ở dạng tinh khiết, do chất này dễ bị ảnh hưởng bởi các tác chất khác (nó sẽ phá huỷ nhanh chóng khi gia nhiệt hoặc thuỷ phân trong môi trường kiềm)

- Zingeron: sau Thresh, Nomura đã trích ly gừng với ete, sau đó xử lý với kiềm, ông ta đã thu được một chất có hương vị rất cay, dạng như một ceton mà ông gọi là zingeron có công thức phân tử C11H22O3

- Shogaol: được tách ra từ gừng mang tính chất cay có công thức phân

tử là C17H34O3, là đồng đẳng của zingeron

Ngoài ra trong củ gừng còn chứa các thành phần khác: dầu cô định chiếm khoảng 3 – 4%, tinh bột chiếm khoảng 40 – 60%, các hoạt chất cay, chất khoáng, chất phẩm màu,… [6]

1.1.4 Công dụng

Gừng không chỉ là gia vị mà còn là vị thuốc chữa viêm khớp, chống ung thư, chống nghẽn mạch máu, trị rụng tóc,… Các kết quả nghiên cứu khoa học hiện đại cho thấy trong gừng có các chất chống oxi hóa, ức chế hình thành

những chất gây viêm Trong một nghiên cứu công bố trên tạp chí Med Hypotheis năm 1989, các nhà khoa học đã cho 18 người viêm khớp, 10 người đau cơ dùng gừng 3 – 30 tháng (liều 500 – 1.000 mg gừng khô) Kết quả 75% người viêm khớp và 100% người đau cơ đã giảm đau, giảm sưng Ở một thí nghiệm khác, 7 người bị thấp khớp nặng không đáp ứng với nhiều loại thuốc Tuy nhiên, khi dùng 5 g gừng tươi hoặc 100 – 1.000 mg gừng khô/ngày, bệnh của họ biến chuyển rõ rệt, giảm đau, giảm cứng khớp vào buổi sáng Các nhà nghiên cứu Đan Mạch cho người bệnh uống 5 g gừng tươi/ngày, kéo dài trong một tuần lễ và nhận thấy gừng có tác dụng ngăn chặn cơ thể sản xuất ra dramacin, một chất gây kết dính tiểu cầu tạo thành cục máu đông làm nghẽn mạch Do vậy, gừng hơn hẳn aspirin dùng để phòng ngừa bệnh nghẽn mạch máu mà lại rẻ tiền và an toàn hơn [1-3, 5]

1.2 Tinh dầu

1.2.1 Trạng thái tự nhiên

Tinh dầu là một hỗn hợp nhiều hợp chất dễ bay hơi, có mùi đặc trưng tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu cung cấp tinh dầu Về mặt thực hành, tinh dầu có thể xem như một hỗn hợp thiên nhiên có mùi, phần lớn có nguồn gốc

từ thực vật, thường là thể lỏng ở nhiệt độ phòng, bay hơi hoàn toàn mà không

Sau đây là 3 họ có nhiều cây tinh dầu:

 Họ cúc (Asteraceae) bao gồm hơn 1.000 giống và 25.000 loài chủ yếu trong vùng bán khô cằn nhiệt đới, cận nhiệt đới

 Họ Hoa môi (Lamiaceae) có mặt khắp nơi trên thế giới, bao gồm khoảng 200 giống và từ 2.000 đến 5.000 loài

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

 Họ Hoa tán, Ngò (Umbelliferae, Apiaceae) bao gồm khoảng hơn 300 giống và 3.000 loài, được phân bố khắp nơi, một số loài tập trung ở vùng ôn đới

- Phân bố theo bộ phận:

Tất cả các bộ phận của cây, trên nguyên tắc đều có thể chứa tinh dầu như: rễ, thân, cành, lá, hoa, trái, hạt,…

 Lá: khuynh diệp, bạc hà, tía tô, sả, tràm, hương nhu, kinh giới,…

 Thân: trầm hương, long não, quế,…

 Rễ: gừng, nghệ, xuyên khung, đương quy,…

 Quả: cam, chanh, bưởi, hồi, sa nhân,…

 Hoa: hoa hồng, hoa lan, hoa cúc, hoa nhài, hoa quế,…

Tinh dầu ở mỗi bộ phận trên cùng một cây có thể giống nhau hoặc khác nhau rất nhiều về thành phần hóa học và hàm lượng tinh dầu Hàm lượng tinh dầu phụ thuộc vào giống, di truyền, đất đai, phân bón, thời tiết, ánh sáng, lượng mưa, thời điểm thu hoạch,… [7]

1.2.3 Vai trò của tinh dầu đối với đời sống thực vật

Vấn đề về vai trò của tinh dầu trong đời sống của cây đã được đề cập tới trong rất nhiều công trình nghiên cứu Theo quan niệm được trình bày trong các công trình khác nhau, vai trò của tinh dầu được quy tụ trong các nội dung sau đây (Ph X Tanaxienco, 1985):

- Bảo vệ cây khỏi các tác động của sâu bệnh

- Che phủ các vết thương ở cây gỗ

- Nhóm các tinh dầu có chức năng sinh lý được cây sử dụng trong quá trình sinh trưởng

- Nhóm các tinh dầu không có chức năng sinh lý, không được cây sử dụng, chúng đơn thuần chỉ là các chất tiết của cơ thể và được tích lũy trong các bể chứa tinh dầu [7]

1.2.4 Công dụng của tinh dầu

Tinh dầu hiện nay là nguồn nguyên liệu không thể thiếu trong nhiều lĩnh vực:

- Thực phẩm: gia vị làm sẵn, thức ăn nhanh, nước ngọt, đồ hộp, kem lạnh, bánh kẹo, nước chấm,…

- Dược phẩm: dùng làm thuốc chữa một số bệnh thông thường, hương

vị liệu pháp, át mùi thuốc,…

- Mỹ phẩm: dầu thơm, kem dưỡng da, chất khử mùi, dầu gội đầu, son,…

Một số tinh dầu là nguồn dược liệu có giá trị như:

- Tinh dầu gừng giúp dễ tiêu hóa, điều hòa thân nhiệt, kháng viêm, giảm đau, chống suy nhược, kích thích hệ thần kinh và phục hồi năng lượng cho cơ thể

- Tinh dầu bạc hà có chứa nhiều methol có tác dụng kích thích thần kinh, giúp giảm đau tại chỗ và thường dùng trong các chế phẩm dầu xoa, cao xoa

- Tinh dầu sả đuổi muỗi rất hiệu quả Gần đây, các nhà nghiên cứu còn khám phá tinh dầu sả có tác dụng giảm đau ngang ngửa với aspirin

- Tinh dầu tỏi, tinh dầu hành có tác dụng làm giảm cholesterol, ngừa bệnh xơ cứng động mạch và ung thư

- Tinh dầu chanh và khuynh diệp có tác dụng giải độc cho làn da, giúp loại bỏ những tế bào chết, chất độc, cũng như chất bẩn tích tụ mang lại

vẻ tươi sáng cho làn da

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

- Tinh dầu nghệ, tinh dầu tràm có tính kháng khuẩn mạnh, làm mau lành vết thương

- Tinh dầu hoa trà và oải hương giúp thư giãn toàn thân, giảm căng thẳng, ngủ ngon, làm mềm da

Tinh dầu thường có tính kháng vi khuẩn, nấm mốc và nấm men bằng cách ức chế sinh trưởng và phát triển của các vi sinh vật này

1.2.5 Tính chất đặc trưng của tinh dầu

Ở nhiệt độ thường hầu hết tinh dầu ở thể lỏng, có khối lượng riêng nhỏ hơn 1 (trừ một số tinh dầu như quế, đinh hương có khối lượng riêng lớn hơn 1)

Tinh dầu thường không màu hay có màu vàng, một số có màu nâu sẫm (như tinh dầu quế), đa số có mùi dễ chịu, một số có mùi hắc khó chịu, thường

đó người ta có thể đánh giá sơ bộ tinh dầu [7]

1.2.6 Tình hình nghiên cứu tinh dầu gừng

b Thành phần hóa học

- Nghiên cứu trong nước:

 Theo Đỗ Tất Lợi gừng chứa 2-3% tinh dầu với thành phần chủ yếu

là các hợp chất hydrocacbon sesquiterpen: β-zingiberene (35%), curcumene (17%), β-farnesene (10%) và một lượng nhỏ các hợp chất alcol monoterpenic như geraniol, linalol, borneol Nhựa dầu chứa 20-25% tinh dầu và 20-30% các chất cay Thành phần chủ yếu của nhóm chất cay là zingerone, shogaol và zingerol, trong đó gingerol chiếm tỷ lệ cao nhất Ngoài ra, trong tinh dầu gừng còn chứa α-camphene, β-phelandrene, eucalyptol và các gingerol Cineol trong gừng có tác dụng kích thích khi sử dụng tại chỗ và có

tác dụng diệt khuẩn [1]

 Công trình nghiên cứu của Tống Thị Ánh Ngọc và cộng sự (2011),

“Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chưng cất tinh dầu gừng” cho thấy các thành phần trong tinh dầu gừng bao gồm: 2-heptanol (0,14%), tricylene (0,11%), alpha-pinene (2,03%), camphene (5,01%), beta-pinene (0,45%), beta-myrcene (2,18%), 2-Thujene (3,38%), eucalyptol (5,67%), 4-carane (0,3%), linalool (1,41%), camphor (0,11%), citronellal (0,32%), borneol (0,97%), 4-terpineol (0,21%), alpha-terpineol (1,44%), citronellol (1,59%), nerol (6%), neral (13,99%), bornyl acetate (0,32%), cis-2,6-dimethyl-2,6-octadiene (0,46%), copaene (0,25%), beta-farnesene (0,27%), alloaromadendren (0,23%), curcumene (2,57%), zingiberene (10,62%), anphal-farnesene (8,05%), beta-bisabolene (2,94%), epi-bicyclosesquiphellandrene (0,37%), beta-sesquiphellandrene (5,37%), nerolidol (0,78%), gama-elemene

(0,33%), beta-selinol (0,63%), farnesal (0,12%) [13]

- Nghiên cứu ngoài nước:

 Năm 1981, D.J Hervey nghiên cứu thành phần hóa học của gừng

và xác định sự có mặt của những gingerdione

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

 Năm 1982, Fumiyuki Kiuchi và các cộng sự, trường đại học Tokyo (Nhật Bản) đã tách và định danh được 6-dehydrogingerdione, 6-gingerdione, 10-gingerdione từ cao n-hexane và 6-gingerol, 10-dehydrogingerdione từ cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc

Công trình nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Thuyền và cộng sự (2012),

“Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu gừng

(Zingiber officinale Rocoe) và tinh dầu tiêu (Piper Nigrum L.)” cho thấy tinh dầu gừng có khả năng kháng các chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis ATCC

6633, Enterococus feacalis ATCC 29212, Staphylococus aureus ATCC

25923, Samonella typhi Ty2 và Candida albicans ATCC 10231

1.3 Một số phương pháp ly trích tinh dầu

Người ta thường có một số phương pháp ly trích tinh dầu phổ biến như:

- Phương pháp cơ học

- Phương pháp tẩm trích

- Phương pháp hấp thu

- Phương pháp chưng cất hơi nước

- Các phương pháp mới trong việc ly trích tinh dầu: dung môi dioxit carbon, vi sóng [8]

Mỗi phương pháp có những ưu, nhược điểm khác nhau, nhưng dù có tiến hành theo bất cứ phương pháp nào, quy trình sản xuất đều có những điểm chung sau đây:

- Tinh dầu thu được phải có mùi thơm tự nhiên như nguyên liệu

- Quy trình khai thác phải phù hợp với nguyên liệu

- Tinh dầu phải được lấy triệt để khỏi nguyên liệu với chi phí thấp nhất Bảng 1 1 Các phương pháp ly trích tinh dầu [7]

ly trích hoặc bằng tay hoặc bằng máy

Tinh dầu thu được

có mùi, vị tự nhiên hơn các phương pháp khác vì không

có tác dụng của nhiệt hoặc dung môi

Phương pháp cổ điển, thủ công, hiệu suất tinh dầu thu được kém

Sản phẩm thu được thường có mùi thơm

tự nhiên Hiệu suất sản phẩm thu được thường cao hơn các phương pháp khác

Yêu cầu cao về thiết bị Thất thoát dung môi Quy trình tương đối phức tạp

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Nguyên liệu được ngâm trong dung môi hữu cơ thích hợp vài ngày, để tăng khả năng ly trích người ta

có thể xay nhỏ nguyên liệu Lọc hỗn hợp thu được dung dịch ly trích, sau đó

xử lý dung dịch để loại bỏ nhựa và chất béo sẽ thu được tinh dầu

cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước

ở nhiệt độ cao Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian nhất định Trường hợp mô thực vật có

- Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản

- Thiết bị gọn, dễ chế tạo

- Thời gian tương đối nhanh

- Không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp

- Chất lượng tinh dầu có thể

bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấu phần dễ bay hơi

- Không lấy được các loại nhựa và sáp có trong nguyên liệu

chứa sáp nhựa, acid béo chi phương dây dài thì phải dùng nhiều hơi nước hơn

và sự chưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm giảm áp suất hơi chung của hệ thống

và làm cho sự khuếch tán trở nên khó khăn

- Trong nước chưng luôn luôn

có một lượng tinh dầu tương đối lớn

- Những tinh dầu có độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém

tế bào thực vật bị nóng lên thật nhanh,

áp suất bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa tinh dầu bị vỡ

ra Tinh dầu thoát ra bên ngoài, bị lôi cuốn theo hơi nước sang hệ thống ngưng tụ (phương pháp lôi cuốn hơi nước) hoặc hòa tan vào dung môi hữu cơ đang bao phủ bên ngoài nguyên liệu (phương pháp tẩm trích)

Sự đun nóng rất có hiệu quả, thời gian nhanh và đặc biệt bảo vệ được các hợp chất dễ bị phân hủy nhiệt

Yêu cầu cao về thiết bị

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản, thiết bị gọn, dễ chế tạo và phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Do đó, nghiên cứu được thực hiện bằng phương pháp này

 Những ảnh hưởng chính trong sự chưng cất hơi nước

- Sự khuếch tán:

Ngay khi nguyên liệu được làm vỡ vụn thì chỉ có một số mô chứa tinh dầu bị vỡ và cho tinh dầu thoát tự do ra ngoài theo hơi nước lôi cuốn đi Phần lớn tinh dầu còn lại trong các mô thực vật sẽ tiến dần ra ngoài bề mặt nguyên liệu bằng sự hòa tan và thẩm thấu Von Rechenberg đã mô tả quá trình chưng cất hơi nước như sau: “Ở nhiệt độ nước sôi, một phần tinh dầu hòa tan vào trong nước có sẵn trong tế bào thực vật Dung dịch này sẽ thẩm thấu dần ra bề mặt nguyên liệu và bị hơi nước cuốn đi Còn nước đi vào nguyên liệu theo chiều ngược lại và tinh dầu lại tiếp tục bị hòa tan vào lượng nước này Quy trình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các mô thoát ra ngoài hết.”

Vì các cấu phần trong tinh dầu được chưng cất hơi nước theo nguyên tắc nói trên cho nên thông thường những hợp chất nào dễ hòa tan trong nước

sẽ được lôi cuốn trước

- Sự thủy giải:

Những cấu phần ester trong tinh dầu thường dễ bị thủy giải cho ra acid

và alcol khi đun nóng trong một thời gian dài với nước Do đó, để hạn chế hiện tượng này, sự chưng cất hơi nước phải được thực hiện trong một thời gian càng ngắn càng tốt

- Nhiệt độ:

Nhiệt độ cao làm phân hủy tinh dầu Do đó, khi cần thiết phải dùng hơi nước quá nhiệt (trên 1000C) Nên thực hiện việc này trong giai đoạn cuối cùng của sự chưng cất, sau khi các cấu phần dễ bay hơi đã lôi cuốn đi hết Thực ra, hầu hết các tinh dầu đều kém bền dưới tác dụng của nhiệt nên vấn đề là làm sao cho thời gian chịu nhiệt độ cao của tinh dầu càng ngắn càng tốt

Tóm lại, dù ba ảnh hưởng trên được xem xét độc lập nhưng thực tế thì chúng có liên quan với nhau và quy về ảnh hưởng của nhiệt độ Khi tăng nhiệt

độ sự khuếch tán, thẩm thấu và sự hòa tan tinh dầu trong nước sẽ tăng nhưng

sự phân hủy cũng tăng theo

 Chưng cất bằng nước

Trong trường hợp này, nước phủ kín nguyên liệu, nhưng phải chừa một khoảng không gian tương đối lớn phía bên trên lớp nước, để tránh khi nước sôi mạnh làm văng chất nạp qua hệ thống hoàn lưu Nhiệt cung cấp có thể đun trực tiếp bằng củi lửa hoặc bằng hơi nước dẫn từ nồi hơi vào (sử dụng bình có hai lớp đáy) Trong trường hợp chất nạp quá mịn, lắng chặt xuống đáy nồi, lúc

đó nồi phải trang bị những cánh khuấy trộn đều bên trong trong suốt thời gian chưng cất

Sự chưng cất này không thích hợp với những tinh dầu dễ bị thủy giải Những nguyên liệu xốp và rời rạc rất thích hợp cho phương pháp này Những cấu phần có nhiệt độ sôi cao, dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi trong khối lượng lớn nước phủ đầy, khiến cho tinh dầu sản phẩm sẽ thiếu những chất này Thí dụ điển hình là mùi tinh dầu hoa hồng thu được từ phương pháp chưng cất hơi nước kém hơn sản phẩm tẩm trích vì eugenol và ancol phenetil nằm lại trong nước khá nhiều, vì thế người ta chỉ dùng phương pháp này khi không thể

sử dụng các phương pháp khác

 Thu hồi thêm tinh dầu từ nước chưng

Thường tinh dầu trong nước chưng nằm dưới hai dạng: phân tán và hòa tan Dạng phân tán thì có thể dùng phương pháp lắng hay ly tâm, còn ở dạng hòa tan thì phải chưng cất lại Nếu trọng lượng riêng của tinh dầu và nước quá gần nhau thì có thể thêm NaCl để gia tăng tỷ trọng của nước làm tinh dầu tách

ra dễ dàng

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.4 Chỉ số acid

Chỉ số acid (IA) là số mg KOH cần thiết để trung hòa các acid tự do có trong 1 gam tinh dầu

KOH trung hòa các acid tự do trong tinh dầu theo phản ứng:

RCOOH + KOH RCOOK + H2O

Chỉ số acid được tính bằng công thức:

Với:

: là khối lượng tinh dầu (g)

: là thể tích dung dịch KOH (ml)

: là nồng độ dung dịch KOH (N)

1.5 Chỉ số savon hóa

Chỉ số savon hóa (IS) là số mg KOH cần thiết để tác dụng với tất cả acid

tự do và acid kết hợp dưới dạng ester có trong 1 gam tinh dầu

Savon hóa được thực hiện bằng cách đun tinh dầu với KOH Sau đó định phân lượng KOH thừa bởi acid HCl Thực hiện song song một mẫu trắng

Với :

: thể tích dung dịch acid HCl dùng trong mẫu trắng (ml)

: thể tích dung dịch acid HCl dùng trong mẫu tinh dầu (ml)

: trọng lượng mẫu tinh dầu (g)

1.6 Chỉ số ester

Chỉ số ester (IE) là số mg KOH cần thiết để trung hòa lượng acid phóng thích ra khi thủy giải các ester có trong 1 gam tinh dầu

Các ester được thủy giải bằng cách đun tinh dầu với KOH:

R1COOR + KOH R1COOK + ROH

Chỉ số ester được tính theo công thức: IE = IS – IA

1.7 Hoạt tính sinh học

1.7.1 Kháng oxi hóa

Houlihna và cộng sự (1985) nhận thấy một số tinh dầu có hoạt tính kháng oxi hóa Các tinh dầu này đều có chứa dẫn xuất phenol là cấu phần chính Những hợp chất này bắt lấy gốc tự do, không cho phản ứng peroxid hóa xảy ra, bảo vệ các lipid

a Sự hình thành các gốc tự do

Nguồn gốc hình thành các gốc tự do (OH•, NO•,…) như tia UV, bức xạ ion hóa, ô nhiễm không khí, hút thuốc, trao đổi chất, sự cháy, căng thẳng,… Các gốc tự do là nguyên nhân gây tổn thương tế bào, protein, acid nucleic, DNA,… và dẫn tới các căn bệnh nguy hiểm như ung thư, lão hóa, tiểu đường, tim mạch,… Do đó, để tránh sự gây hại của các gốc tự do thì cần thiết phải loại bỏ chúng bằng cách sử dụng các chất chống oxi hóa bổ sung như các vitamin (A, C, E,…), polyphenols, flavonoids,…

b Hoạt động quét gốc tự do DPPH

Năm 1922 Goldschmidt và Renn đã phát hiện ra một gốc tự do bền có màu tím đậm, hầu như không phân hủy, không nhị trùng hóa và cũng không phản ứng với oxi đó chính là gốc tự do DPPH DPPH•là một gốc tự do có màu tím giống như màu của dung dịch KMnO4, không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ Dung dịch DPPH có cực đại hấp thu tại bước sóng 517 nm

và sản phẩm khử của nó là DPPH-H có màu vàng cam

Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình oxi hóa bằng sự chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn định hơn Như vậy, khi có mặt của chất chống oxi hóa nó sẽ khử gốc tự do DPPH

và làm cho dung dịch nhạt màu (chuyển từ tím sang vàng nhạt), do đó độ hấp

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất kháng oxi hóa được minh họa bằng phản ứng được mô tả bên dưới:

khuẩn (vi trùng) trong điều kiện in vitro, thông qua việc đo đường kính vòng

vô khuẩn (vô trùng)

Có nhiều phương pháp được dùng để xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu và nghiên cứu được tiến hành bằng phương pháp đục lỗ Đường kính của lỗ thường được chọn là 6 mm

Đường kính vòng vô trùng càng to có nghĩa là khả năng ức chế vi khuẩn tương ứng của tinh dầu chọn thử nghiệm càng cao Thường tinh dầu được pha loãng ở các nồng độ khác nhau để tìm MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) và đôi khi tinh dầu ở dạng nguyên chất lại có tính kháng khuẩn kém vì khả năng khuếch tán trên mặt thạch kém Tinh dầu thử nghiệm được tẩm bão hòa vào đĩa giấy hoặc cho một thể tích nhất định vào lỗ đã đục sẵn

Trong một số trường hợp, để xem cấu phần chánh có phải là tác nhân kháng khuẩn chủ yếu trong tinh dầu không, người ta thường cô lập chúng

riêng ra và thử chung với tinh dầu, nếu hoạt tính kháng khuẩn của nó yếu hơn thì chính phần còn lại trong tinh dầu quyết định tính kháng khuẩn

Kabara và Villar nhận thấy rằng các hợp chất cấu hình cis có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn cấu hình trans và nhóm định chức hidroxi trong ancol

và phenol là những nhóm định chức có hoạt tính kháng khuẩn quan trọng [11]