SƠ LƯỢC PHÂN LOẠI THỤ THỂ THEO CẤU TRÚC VÀ VỊ TRÍ HOẠT ĐỘNG

SƠ LƯỢC PHÂN LOẠI THỤ THỂ THEO CẤU TRÚC VÀ VỊ TRÍ HOẠT ĐỘNG 6.1 Nhóm thụ thể của Neurotransmitters: neurotransmitters receptors-NR Về mặt tổng quát, nhóm thụ thể này là những heterotetr

SƠ LƯỢC PHÂN LOẠI THỤ THỂ THEO CẤU TRÚC VÀ VỊ TRÍ HOẠT ĐỘNG

6.1 Nhóm thụ thể của Neurotransmitters: (neurotransmitters receptors-NR)

Về mặt tổng quát, nhóm thụ thể này là những heterotetramer hoặc heteropentamer và mỗi tiểu đơn vị được mã hóa trên một hoặc nhiều gene khác nhau trên cùng hay khác nhiễm sắc thể Tất

cả các NR đều là protein bậc IV và chịu rất nhiều nguy cơ đột biến gene cũng như sai lệch trong quá trình biểu hiện gene

Synapses là nơi mà neuron giải phóng neurotransmitter, tác động đến hậu synapse của tế bào đích (có thể là một neuron, cơ hay các tế bào tuyến) Trong phần này chúng ta sẽ tập trung vào một số vấn đề quan trọng liên quan đến sự truyền tín hiệu (impulse transmission):

- Neurotransmitter được tạo ra ở đầu tận sợi trục như thế nào

- Cái gì tạo ra điện thế hoạt động tại đầu tận sợi trục (axon termini) tại presynapse để kích thích tiết neurotransmitter

- Bằng cách nào việc gắn neurotransmitter vào thụ thể tương ứng tại postsynapse dẫn đến thay đổi điện thế màng

- Neurotransmitter được loại bỏ như thế nào sau khi nó kích thích tế bào postsynapse Thụ thể neurotransmitter được chia làm hai loại chính: Ligand-gated ion channels – có khả năng

mở ra ngay lập tức khi neurotransmitter bám vào và thụ thể G protein-coupled Neurotransmitter bám vào thụ thể G protein-coupled làm mở hay đóng các kênh ion riêng lẽ bởi quá trình kéo dài

từ vài giây đến vài phút Những thụ thể neurotransmitter loại “chậm” này đã được đề cập chi tiết khi thảo luận về cấu trúc lẫn chức năng của thụ thể G protein-coupled Ở phần này, chúng ta sẽ cùng nhau làm rõ hơn cấu trúc và hoạt động của nhóm thụ thể nicotinic acetylcholine – nhóm được tìm thấy rất nhiều ở các synapse thần kinh-cơ Đây là kênh ion đầu tiên được phát hiện, phân dòng, là cơ sở các hệ luận của các kênh ion neurotransmitter khác

Cấu trúc của thụ thể acetylcholine hướng ion

Thụ thể acetylcholine ở tế bào cơ bám xương là một protein pentamer với các tiểu đơn vị cấu tạo lần lượt là α2βγδ Tiểu đơn vị α, β, γ có tính tương đồng trong trình tự cấu tạo, bình thường khoảng 35-40% Thụ thể hoàn chỉnh là một cấu trúc 5 vòng xoắn, lòng ion là một cấu trúc hiện hữu trong lòng thụ thể tương thích với 5 tiểu đơn vị

Kênh này mở ra khi acetylcholine nối kết tại vùng nằm trên mặt ngoài tế bào tại vị trí của αγ và

αδ Khi sự nối kết xảy ra, kênh sẽ mở trong một vài micro giây Các nghiên cứu định lượng tính thấm với các cation cho thấy lòng kênh khá hẹp, đường kính khoảng 0.65 đến 0.80 nm, đủ để cho ion Na+ và K+ đi ngang qua khi chúng ở trong phức thể với phân tử nước Do vậy, thụ thể acetylcholine có khả năng vận chuyển cation được hydrated hóa, không giống các kênh Na+ và K+ thông thường khác (chỉ vận chuyển được ion đơn thuần)

Hình 6.1: Minh họa cấu trúc thụ thể acetylcholine

Mặc dù cấu trúc trung tâm kênh vẫn chưa được làm sáng tỏ ở mức độ phân tử, có nhiều bằng chứng cho thấy rằng nó được cấu tạo bởi 5 xoắn α M2 xuyên màng tương đồng nối kết với từng đơn vị dưới của kênh Xoắn M2 được cấu tạo ởi phần lớn các amino acid không phân cực hay kị nước, nhưng luôn có phần mang điện tích âm của aspartate hay glutamate ở mỗi đầu tận, gần bề mặt màng; ngoài ra còn có một vài serine hay threonine ở gần trung tâm Các đột biến xảy ra đối với thụ thể acetylcholine thay đổi vùng điện tích âm bởi điện tích dương (của lysine) đã được xác định

Khi thụ thể nối kết với acetylcholine, nhất thiết phải thúc đẩy sự biến đổi lập thể của thụ thể và dẫn đến việc nới rộng lòng kênh

Hình 6.2: Minh họa sự đóng/mở lòng kênh

Neurotransmitter đƣợc tải vào túi synapse (synaptic vesicles) bởi H +

-linked antiport proteins

Có rất nhiều các phân tử nhỏ hoạt động như là một neurotransmitter tại các synapse khác nhau, ngoại lệ là acetylcholine, một loại neurotransmitter có bản chất là một dẫn xuất của amino acid Các nucleotide, như ATP chẳng hạn và những nucleoside tương ứng (không gắn gốc phosphate) cũng đóng vai trò là neurotransmitter Mỗi neuron có khả năng sản xuất chỉ một loại neurotransmitter mà thôi

Tất cả các neurotransmitter cổ điển (classic neurotransmitter) đều được tổng hợp trong tế bào chất và được vận chuyển ra các túi synapse bám màng tại đầu tận của sợi trục và được dự trữ ở

đó Những túi synapse này có đường kính khoảng 40-50 nm, và có tính acid, được tổng hợp bởi

sự hoạt động của nhóm V bơm H+ (V-class proton pump) tại màng tế bào của túi

Ví dụ, acetylcholine được tổng hợp từ acetyl coenzyme A (chất trung gian trong quá trình thoái hóa glucose và acid béo) và choline với sự xúc tác của choline acetyltransferase:

Hình 6.3: Phản ứng tạo thành acetylcholine

Túi synapse thu giữ acetylcholine từ bào tương thông qua quá trình vận chuyển ngược với radient nồng độ bằng cách sử dụng H+/acetylcholine antiporter tại màng tế bào Có điều lạ là gene mã hóa cho cái antiporter này có vị trí tại vùng intron đầu tiên của gene mã hóa cho choline acetyltransferase, cách sắp đặt này là nguyên nhân bảo tồn được cơ chế điều hòa tương tác rất chặt chẽ biểu hiện của cả hai protein này Ngoài ra còn có những protein H+/neurotransmitter antiport khác được sử dụng để đưa các loại neurotransmitter khác vào trong túi synapse

Dòng Ca2+ nhập bào thông qua kênh cổng điện thế Ca2+ (Voltage-gated Ca2+ channels) kích thích tiết neurotransmitter

Neurotransmitter được giải phóng qua quá trình xuất bào Quá trình này có sự hỗ trợ của các tải nội bào chế tiết và các protein xuyên màng Có 2 điều làm cho sự xuất bào ở synapse khác với những tế bào chế tiết khác:

- Sự tiết liên quan chặt chẽ đến hoạt động điện thế màng tại đầu tận của sợi trục

- Túi synapse được tái cấu trúc tại khu vực hoạt động của nó, ngoại trừ acetylcholine

Sự khử cực của màng tế bào không thể tự gây ra sự hòa màng của các túi synapse Để có sự hòa màng xảy ra, một hoạt động điện nhất thiết phải được biến đổi thành một tín hiệu hóa học – sự gia tăng nồng độ Ca2+

trong tế bào chất Kênh cổng điện thế Ca2+ sẽ mở ra để dòng Ca2+ nhập bào khi sự khử cực xảy ra Dòng Ca2+ nhập bào này làm gia tăng nồng độ Ca2+ trong tế bào chất của các túi synapse kế cận từ <0.1μM ở điện thế nghỉ lên đến từ 1-100μM Ion Ca2+ sẽ bám vào protein nối kết với túi synapse và màng tế bào, đưa neurotransmitter xuất bào Bơm Ca2+ sau đó

sẽ nhanh chóng đưa Ca2+ xuất bào thông qua quá trình vận chuyển tiêu tốn ATP, đưa điện thế nội bào về lại trạng thái nghỉ (resting state), giúp cho đầu tận sợi trục sẵn sàng đáp ứng với các kích thích điện thế khác

Có một thí nghiệm đã chứng tỏ được tầm quan trọng của kênh cổng điện thế Ca2+ trong quá trình giải phóng neurotransmitter Bằng cách khóa kênh này bằng tetrodotoxin (thuốc ức chế kênh cổng điện thế Na+) để ngăn chặn sự thay đổi điện thế hoạt động của tế bào, người ta thấy rằng không có sự chế tiết neurotransmitter Nếu màng tế bào của sợi trục sau đó được khử cực bằng cách sử dụng 100mM KCl, neurotransmitter lại tiếp tục được giải phóng bởi vì dòng Ca2+ lại vào được tế bào thông qua kênh cổng điện thế Ca2+, tương tự như quá trình khử cực bằng kênh cổng điện thế Na+

Hình 6.5: Trình tự hoạt hóa sự co cơ.Điện thế nơi tận tại presynapse của neuron vận động làm

mở kênh cổng điện thế Ca2+ (b1) và kích thích giải phóng acetylcholine, hoạt hóa sự mở thụ thể acetylcholine tại màng tế bào cơ (b2) Kết quả của quá trình trên là sự nhập bào của Na+, rồi khử điện thế màng gây hiện tượng mở kênh cổng điện thế Na+

, Na+ tiếp tục nhập bào gây ra một điện thế hoạt động (b3) Khi Sự khử cực truyền tế ống T, nó tạo ra kích thích mở kênh cổng điện thế

Ca2+ trên màng tế bào Ca2+ của sarcoplasmic reticulum sẽ đi vào tế bào chất (b4) Chính Ca2+này sẽ kích thích quá trình co cơ (có thể tìm hiểu cơ chế cụ thể ở các tài liệu khác) (Theo Guyton’s medical physiology)

Hình 6.6: Các tiểu đơn vị và polymere của thụ thể neurotransmitter

Hoạt động của chất trung gian ở neuron hậu synapse - Chức năng của thụ thể

Hình 6.7: Minh họa hoạt động của chất trung gian ở neuron hậu synapse (Theo Guyton’s Medical physiology)

Màng neuron hậu synapse chứa rất nhiều protein thụ thể Các thụ thể này được cấu tạo bởi 2 thành phần chính: (1) protein bám màng, hướng ra màng đến khe synapse – đây là nơi tiếp nhận chất dẫn truyền thần kinh từ đầu tận của thần kinh tiền synapse, (2) các ion được truyền từ màng vào bên trong của thần kinh hậu synapse bởi các thể mang ion Các thể mang ion này tồn tại ở 2 dạng (1) kênh ion- cho phép 1 số ion chuyên biệt qua màng, (2) chất kích hoạt chất thông tin thứ hai – phân tử này hướng về phía bào tương và kích hoạt một hoặc nhiều chất bên trong neuron hậu synapse chứ không đơn thuần là một kênh ion

Các kênh ion ở màng thần kinh hậu synapse có 2 loại (1) kênh cation (chủ yếu là Na+ đôi khi cũng cho K+

và Ca2+ đi qua), (2) kênh anion (kênh này chủ yếu cho Cl- và 1 số ít các anion khác

đi qua) Kênh Na+

mang điện tích âm Chính điện tích âm này giúp kênh vận chuyển được ion

Na+ khi đường kính của kênh lớn hơn đường kính của ion Na+ Anion Cl- và các anion khác không qua được kênh này mà đi qua các kênh dành riêng cho chúng (có đường kính đủ lớn) Nguyên nhân chủ yếu làm cho Na+, K+, Ca2+ không qua được các kênh dành cho anion là vì thể hydrate hóa của các ion này có kích thước quá lớn

Các chất dẫn truyền trung gian có nhiệm vụ mở kênh cation được gọi là chất dẫn truyền kích hoạt, ngược lại các chất làm nhiệm vụ mở kênh anion được gọi là chất dẫn truyền ức chế Các kênh ion được mở ngay lập tức khi các chất dẫn truyền trung gian kích hoạt chúng (chưa đến 1 ms) và khi các chất dẫn truyền trung gian không còn nữa các kênh này sẽ được đóng lại với tốc

độ tương tự Vậy, sự điều khiên của các neuron hậu synapse được nhanh chóng là nhờ sự

đóng-mở các kênh ion

Hệ thống chất thông tin thứ 2 ở neuron hậu synapse

Một vài chức năng của hệ thần kinh như sự ghi nhớ cần có những thay đổi trong neuron từ vài giây đến hằng tháng kể từ khi chất dẫn truyền thần kinh không còn nữa Kênh ion đóng trong vòng vài ms sau khi chất dẫn truyền biến mất nên nó không có khả năng gây ra những thay đổi neuron hậu synapse kéo dài Thay vào đó, các kích thích hoặc hạn chế các thay đổi neuron hậu synapse bằng cách kích thích hệ thống chất thông tin thứ 2 ở trong chính những neuron hậu synapse đó Và chất thông tin thứ 2 sẽ giúp kéo dài sự thay đổi

Hệ thống chất thông tin thứ 2 có nhiều loại Loại phổ biến nhất là G-Proteins G-protein bám vào phần thụ thể hướng vào bên trong tế bào G-protein gồm 3 phần phần α - phần kích hoạt và phần

β, phần γ bám vào phần α và bên trong màng tế bào kế cận của protein thụ thể Khi có kích thích thần kinh, phần α tách khỏi phần β và γ để găn vào bào tương

Trong bào tương, tùy vào từng loại neuron mà phần α thực hiện 1 hay nhiều nhiệm vụ khác nhau Hình thể hiện 4 thay đổi có thể xảy ra Đó là các dạng:

1 Mở 1 vài kênh ion thông qua màng tế bào hậu synapse Ở bên góc trái của hình: kênh K+ được

mở nhờ G-protein, nhờ G- protein kênh này được mở ra rất lâu so với cơ chế không dùng hệ thống chất thông tin thứ 2

2 Kích hoạt cAMP hay cGMP ở trong tế bào thần kinh cAMP, cGMP có khả năng kích hoạt những hệ thống chuyển hóa chuyên biệt trong neuron nên chúng có thể gây ra sự thay đồi lâu dài trong cấu trúc tế bào, và chúng cũng nhạy cảm với các kích thích của neuron

3 Sự kích hoạt các enzyme nội bào G-protein có thể kích hoạt một hoặc nhiều enzyme nội bào Các enzyme này sẽ thực hiện một vài chức năng hóa học nhất định trong tế bào

4 Kích hoạt sự phiên mã Đây là một trong những tác dụng quan trọng nhất của hệ thống thông tin thứ 2 vì sự phiên mã có thể tạo ra những protein mới trong neuron, các protein này sẽ thay đổi

bộ máy chuyển hóa hay cấu trúc của tế bào Thật vậy , sự thay đổi cấu trúc được gây ra bởi neuron xảy ra ở qui trình ghi nhớ dài hạn

Rõ ràng là sự kích hoạt hệ thống thông tin thứ 2 trong neuron bởi G-protein hay các loại khác, rất quan trọng trong việc đáp ứng lâu dài ở những con đường dẫn truyền thần kinh khác nhau

Sự kích hoạt hoặc kìm hãm thụ thể trong màng neuron hậu synapse

Vài thụ thể hậu synapse khi được kích hoạt có thể kích thích hay ức chế các neuron hậu synapse

Sự kích thích hay ức chế này rất quan trọng trong chức năng của hệ thần kinh Các thụ thể khác nhau sẽ sử dụng những cơ chế màng và phân tử khác nhâu để kích hoạt và ức chế

Sự kích hoạt

1 Sự mở của kênh Na+ cho phép 1 lượng lớn điện tích dương chảy vào bên trong tế bào hậu synapse Sự tăng về nồng độ các điện tích dương làm cho điện thế dương nội màng tăng đến mức ngưỡng kích thích để tạo ra kích thích

2 Giảm lượng ion vận chuyển qua kênh chloride và postassium Nó làm giảm sự khuếch tán Cl- vào bên trong neuron hậu synapse hay giảm sự khuếch tán của K+ ra ngoài Nó làm cho màng nội bào dương hơn mức bình thường, đó là sự kích thích

3 Sự thay đổi đa dạng trong chuyển hóa nội bào của neuron hậu synapse kích hoạt hoạt động tế bào (sự tăng lên các thụ thể màng kích hoạt hay giảm xuống các thụ thể màng ức chế)

1976 Sự có mặt của protein bám GTP riêng lẽ, khác biệt với các enzyme adenylate cyclase, được xác định bởi Alfred Gilman và đồng nghiệp người đã tái thiết lại GPP (NH)-p-, 1 chất kích thích hoạt động adenylate cyclase trong màng từ dòng đột biến tế bào ung thư hạch (cyc-) - có

adenylate cyclase nhưng thiếu G-protein bằng cách bổ sung thêm yếu tố 40kDa GTP bám riêng biệt Năm 1980, Howlett và Gilman cho rằng sự kích hoạt lâu dài của G-protein kích hoạt cyclase làm giảm lượng phân tử protein, nhấn mạnh rằng G-protein được tạo thành bởi những tiểu đơn vị có thể li giải được Cấu trúc tam thể (3 thành phần) của G-protein được phát hiện bởi Stryer và cộng sự Họ đã chứng tỏ được rằng sự kích hoạt Gt bởi Gpp(NH)-p và ánh sáng dẫn đến sự phân ly của phức hợp trimeric αβγ, tạo nên Gpp(NH)-p bám αt và βγ (αt có vai trò kích hoạt sự khử phosphoryl hóa) Năm 1985, α-transducin được tạo thành bởi 4 nhóm với các trưởng nhóm là Numa, Boume, Khorana, và Simon; Năm 1986, cấu trúc của tiểu đơn vị α được xác định đầy đủ bởi nhóm của Gilman Rodbell và Gilman được trao giải Nobel vào năm 1994

Cấu trúc của G-protein

G-protein được gồm 3 thành phần: tiểu đơn vị α có KLPT ~39–45 kDa, tiểu đơn vị β có KLPT

~37 kDa và tiểu đơn vị γ có KLPT ~8 kDa Có khoảng 20 gen mã hóa nhiều loại tiểu đơn vị α,

6 gen đối với tiểu đơn vị β và 12 gen cho tiểu đơn vị γ Ở trạng thái trimer hóa, G-protein bám vào mặt trong của màng tế bào thông qua đuôi kị nước của tiểu đơn vị α và γ (myristoyl và palmitoyl trên α, farnesyl hoặc geranylgeranyl trên γ) Tiểu đơn vị β và γ được nối lại với nhau bởi liên kết giữ lõi với lõi để tạo nên βγ-dimer; tiểu đơn vị β của βγ-dimer này sẽ bám vào tiểu đơn vị α bằng theo kiểu bổ sung ở vùng liên kết peptide trên 2 protein và sự tương tác với đuôi kị nước Khi G-protein được kích hoạt, liên kết giữa tiểu đơn vị α và β bị đứt, trimer bị phân ly thành tiều đơn vị monomeric α và tiểu đơn vị dimeri βγ Tiểu đơn vị α và βγ đều bám vào màng

tế bào nhưng cũng dễ dàng tách khỏi màng khi cần

Hình 6.8: Mô tả cấu trúc G-protein (Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed - J

Foreman_ T Johansen)

Tiểu đơn vị α có 2 vùng chức năng quan trọng khác ngoài vùng để nối kết với tiểu đơn vị β

Một là, tiểu đơn vị α tác động với thụ thể ở vị trí 5 amino acid cuối của đầu C tận Hai là nó mang vùng gắn kết với guanine nucleotide binding pocketđể thực hiện chức năng GTPase của G-protein Mặc khác, cả 2 tiểu đơn vị α và βγ đều có thể tác động đến bề mặt tác động của G-

protein

Sự xáo trộn của chu trình G-Protein

Chu trình của G-protein có thể bị xáo trộn bởi những con đường sau:

1 Sự đảo của chu trình dựa vào sự thủy phân của γ-phosphate của GTP Điều này xảy ra khi một dẫn xuất của GTP nối kết vào thụ thể nhưng không có khả năng thủy phân hay thủy phân chậm nối kết với tiểu đơn vị Ví dụ,

5′-guanylylimidophosphate (Gpp(NH)-p) hay guanosine 5′-O-(3-thiotriphosphate)

(GTPγS),hay thêm vào AlF4, tạo các triphosphate giả (pseudo phosphate) trên GDP trong Gα- GDP Trong những điều kiện này, sự hoạt hóa các chất tác hiệu trở thành không thuận nghịch Thụ thể được kích hoạt sẽ xúc tác chu trình G-protein, về bản chất cũng giống như khi có ligand kết nối nhưng chậm hơn từ 100 đến 1000 lần Khi thiếu sự kích hoạt thụ thể bởi ligand, chu trinh

cơ bản chậm sẽ xảy ra Nguyên nhân có thể là vì phần nhỏ của thụ thể hiện diện trong thể hoạt động ngay cả khi thiếu ligand Kết quả là, sự thay đổi Gpp(NH)-p hay GTPγS bởi GTP hay sự có mặt của AlF4 đóng vai trò tạo ra các đáp ứng tác hiệu (effector response) trong khi thiếu ligand thụ thể Tuy vậy, sự kích hoạt vẫn chậm hơn khi có sự hiện diện của ligand

Hình 6.9: Minh họa một số cấu trúc (Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed - J

Foreman_ T Johansen)

2 Chu trình có thể chậm lại khi thêm vào những GDP dư thừa hay, guanosine

5′-O-(2-thiodiphosphate) (GDPβS) – một dẫn xuất ổn định hơn Không giống GTPγS, GDPβS

có liên kết thuận nghịch nên nó chỉ cạnh tranh với GTP Do vậy nó sẽ chỉ hoạt động ở nồng độ cao hơn tiêu chuẩn từ 10 lần trở lên

3.Khi có sự hiện diện của NAD+, tiểu đơn vị α của G-protein có thể bị ADP-ribosylated bởi 2 loại

Protein vi khuẩn Độc tố của vi khuẩn Ho gà (whooping-cough) (PTx) ADP-ribosylates cysteine

ở đầu C tận của G-protein của nhóm Gi và Go ngăn cản sự bắt gặp của G-protein thụ thể và năng chặn sự hoạt hóa GPCR N-ethyl-maleimide (NEM) cũng alkyl hóa cysteins theo cùng cơ chế

Độc tố dịch tả (CTx) ADP-ribosylates arginine trong G-proteins của lớp Gs (adenylate stimulating) ở gần vị trí GTPase Nó làm ngăn cản chức năng của GTPase xúc tác và gây ra sự hoạt hóa Gs/adenylate cyclase lâu dài Tranducin và gustducin (tín hiệu nhìn và nếm) đều được ADP-ribosylated bởi cả 2 loại độc tố trên Phản ứng này có thể được dùng để phân lập các G-protein có thể bị ADP-ribosylated

cyclase-Sự điều hòa tín hiệu G-protein

RGS Protein

RGS protein thuộc họ các protein liên kết lỏng lẻo giống nhau ở vị trí RGS 130 amino acid cho phép chúng bám vào tiều đơn vị α của G-protein Khi RGS protein bám vào, nó điều hòa tín hiệu G-protein theo 2 cách Cách thứ nhất (quan trọng nhất), nó có vai trò như GAPs (protein kích hoạt GTPase), tăng cường sự thủy phân GTP bằng cách hoạt hóa G-protein, sau đó chúng kích hoạt GαGTP hay Gβγ tăng cường sự khôi phục của các phần tử tác hiệu (effector) RGS protein không ảnh hưởng đến tỉ lệ GDP-GTP và tỉ lệ G-protein được kích hoạt bởi thụ thể Cách thứ 2 RGS protein làm giảm khả năng bám của GαGTP vào các phần tử tác hiệu, ngăn chặn phản ứng

Ta có thể thấy tiểu đơn vị α được kích hoạt bở GTPγS không thủy phân được Ví dụ, RGS protein, RGS4, ngăn cản sự đáp ứng của PLC-β1đối với GTPγS kích hoạt Gq

Có rất nhiều loại RGS protein vì vậy cũng có rất nhiều độ chọn lọc cho từng tiểu đơn vị α và cũng có nhiều tác động lên từng hệ thống tác động khác Những thuộc tính này thường được đánh giá trong hệ thống biểu hiện khôi phục Hiện nay vai trò của RGS protein riêng biệt trong tế bào vẫn chưa được rõ

Một trong những điều thú vị của vấn đề này đó là sự liên kết giữa RGS protein và tiểu đơn vị α

có thể bị phá vỡ bởi điểm đột biến trên tiểu đơn vị α mà không ảnh hưởng đến chức năng của

Gα Sự kết hợp đột biến này với đột biến khác giúp loại bỏ tính nhạy cảm của PTx (hình 7.10) RGS protein nội sinh có vai trò trong việc ức chế dòng Ca2+ trong thần kinh giao cảm bởi Go được kích hoạt bởi noradrenaline Ví dụ: sự thay thế Goα bằng Goα đột biến giúp giảm sự nhạy cảm của noradreanaline đi 10 lần và làm chậm quá trình khởi động và khôi phục sự ức chế Tuy

nhiên, vấn đề này liên quan đến khả năng hoàn nguyên của hệ gene

Hình 6.10: Minh họa một số vai trò của RGS protein Protein hoạt hóa GTPase hoạt động nhƣ một phân tử tác hiệu

Enzyme có vai trò như GAP - tăng cường sự thủy phân GTP, điều khiển sự bất hoạt nhanh của các ezyme được hoạt hóa bởi G-protein Ví dụ, Gαq-GTP thuần có hoạt tính GTPase rất yếu (tiêu tốn 10-60s) nhưng hoạt tính này sẽ tăng lên 50 lần khi có mục tiêu tác hiệu của nó, như PLC-β1 chẳng hạn, điều nay làm cho chu kì bán hủy hoạt tính sinh học của nó chỉ kéo dài trong 1s Như

thế, sự thêm vào phosphodiesterase rút ngắn chu kì bán hủy của GTP-bound α-transducin từ 20s xuống còn 5s Tác dụng tăng cường của phosphodiesterase kết hợp với tác động visual RGS được đề cập ở trên Các tác hiệu của kênh ion có vai trò như GAP khi thiếu RGS protein vẫn chưa rõ cơ chế

6.3 Nhóm thụ thể Tyrosine Kinase: (Tyrosine kinase receptors)

Distinct mechanisms of small-molecule inhibitors and monoclonal antibodies for targeting receptor tyrosine kinases in cancer cells a | Epidermal growth factor receptor (EGFR) and receptor tyrosine kinase (RTK)-dependent growth signalling in cancer cells The extracellular region of EGFR consists of four domains, the ligand-binding domains (L1 and L2) and the cysteine-rich domains (CR1 and CR2), and the C-terminal domain of EGFR contains six tyrosine residues (Y; only two are depicted here for simplicity) Following the activation of EGFR by ligand binding or ligand-independent dimerization, the Ras–Raf– MEK–MAPK pathway is activated through the growth factor receptor-bound protein 2 (GRB2)–SOS complex EGFR-mediated signalling also activates the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)–AKT

pathway, which contributes to anti-apoptotic effects of EGFR activation Additionally, signal transducer and activator of transcription (Stat) proteins (STAT1, STAT3 and STAT5) are also activated The

coordinated effects of these EGFR downstream signalling pathways lead to the induction of cellular responses including proliferation, differentiation, cell motility, adhesion and angiogenesis The

deregulation of EGFR-mediated signalling in some cancer cells leads to aberrant proliferation, invasion, metastasis and neovascularization.[9] b | Small-molecule tyrosine kinase inhibitors (TKIs) such as

gefitinib function as ATP analogues and inhibit EGFR signalling by competing with ATP binding within the catalytic kinase domain of RTKs As a result, the activation of various downstream signalling

pathways is blocked Each TKI has a different selectivity for RTKs, and some are dual- or multi-selective, which might provide a therapeutic advantage c | By contrast, therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) bind to the ectodomain of the RTK with high specificity (for example, cetuximab binds to the L2 domain

of EGFR, and thereby inhibits its downstream signalling by triggering receptor internalization and

hindering ligand–receptor interaction Unlike small-molecule inhibitors, mAbs also activate dependent phagocytosis or cytolysis by immune-effector cells such as neutrophils, macrophages and natural killer cells by inducing complement-dependent cytotoxicity (CDC) or antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC).[107] MAPK, mitogen-activated protein kinase; MEK, mitogen-activated protein kinase kinase

Fcγ-receptor-Khám phá thụ thể Tyrosine kinase

Khoảng hơn 30 năm trước, các thụ thể của hormone polypeptide như là insulin và GH đã được phát hiện như là vùng nối kết kích hoạt hoạt động của màng tế bào, tế bào hoặc các protein xuyên màng bằng cách sử dụng protein đánh dấu phóng xạ Tuy nhiên, sự truyền tín hiệu của những thụ thể này vẫn còn là điều bí mật trong suốt 10 năm sau đó cho đến khi hoạt tính của PTK được khám phá RTK đầu tiên được khám phá cả về cấu tạo và chức năng là thụ thể EGF (epidermal growth factor) Stanley Cohen và đồng sự đã tách ly được thụ thể EGF và chứng minh nó là một glycoprotein trong màng tế bào và có trọng lượng là 170kDa, ngoài ra người ta còn thấy nó có một vùng nối kết đặc biệt Cấu trúc hoàn chỉnh của thụ thể EFG được phát hiện nhờ vào phương pháp phân dòng cDNA (cDNA cloning) và trình tự mRNA, PTK được cố định

ở trong bào tương tại thụ thể chuỗi polypeptide (receptor polypeptide chain) Ligand nối kết làm nhị hợp hóa thụ thể EGF và nhanh chóng kích hoạt PTK tự phosphoryl hóa một vài phân tử tyrosine tại đầu C của thụ thể Các phosphotyrosine là vùng nối kết cho vùng Src homology 2 (SH2) hoặc vùng gắn kết phosphotyrosine (phosphotyrosine-binding domain, PTB) của một vài phân tử protein tín hiệu

Sau đó, RTKs được phát hiện có 20 dòng nhỏ khác nhau và tất cả đã được phân lập Những cấu trúc này hằng định trong vùng xúc tác của PTK nhưng chúng biến động rất lớn trong khu vực ngoại bào cũng như là tại juxtamembrane và vị trí tại đầu C trong bào tương Sự phân loại các dòng nhỏ (subfamilies) dựa vào các trình tự tương đồng chính yếu (primary-sequence homology)

và sự tương khớp trong cấu trúc bậc 2 Vùng giàu cysteine, vùng immunoglobulin-like (Ig-like), vùng giàu leucine, vùng giàu cadherin-like, vùng fibronectin type III, vùng EGF-like, và vùng kringle-like chỉ rõ đặc điểm của khu vực ngoại bào của RTKs

Hình 6.11: Minh họa 20 họ của siêu họ RTK (Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed

- J Foreman_ T Johansen)

Nhìn chung, tyrosine kinase là họ thụ thể được cấu tạo bởi 2 thành phần chính: Ngoại bào và nội bào, chúng nối kết với nhau bằng một chuỗi polypeptide xuyên màng Thành phần ngoại bào là nơi gắn kết với ligand (khu vực gắn ligand, ligand biding domain-LBD) Thành phần nội bào có những amino acid tyrosine, là vị trí phosphoryl hóa dưới sự xúc tác của tyrosine kinase Chuỗi polypeptide xuyên màng là một vòng α có cấu trúc bậc II, cấu trúc mỏng manh của vòng xoắn α làm thành phần ngoại bào dễ bị lệch trục khi màng bào tương trở nên giảm linh động do sự tích hợp của protein, cholesterol tự do hay acid béo no lên màng bào tương nên LBD không thể gắn được với ligand Tình trạng này được xem là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng kháng insulin trong hội chứng chuyển hóa cũng như tình trạng miễn dịch kém trong hội chứng này, vì thụ thể insulin và cytokines thuộc họ RTK

Hình 6.12: Cấu trúc SH2 Các học thuyết về sự kích hoạt thụ thể Tyrosine Kinase

Các nghiên cứu trên chức năng của thụ thể EGF đã xác lập được 2 hệ luận trong sự hoạt hóa RTK và sự truyền tín hiệu

Trước hết, RTKs được kích hoạt bởi sự nhị hợp hóa phát sinh bởi sự liên kết với ligand Ngoại trừ họ thụ thể insulin, tất cả các thụ thể RTK khác (EGF, thụ thể platelet-derived growth factor (PDGF)) đều có cấu trúc monomer trên màng tế bào Khi ligand nối kết với thụ thể đã khiến nó trải qua quá trình dimer hóa và quá trình tự phosphoryl hóa xảy ra trên vùng C (nội tế bào chất) của nó Thụ thể insulin là một thụ thể dimer disulfide, 2 chuỗi polypeptide được gọi là α2β2

heterotetramer Insulin nối kết với tiểu đơn vị α ngoài màng tế bào dẫn đến quá trình sắp xếp lại (rearrangement) trong cấu trúc của thụ thể (quaternary heterotetrameric) và kích hoạt PTK, tăng cường quá trình tự phosphoryl hóa của vùng nội bào Thể hoạt hóa của thụ thể insulin và các thụ thể monomer PTK khác đều ở trạng thái dimer, và cơ chế hoạt hóa các thụ thể này rất tương đồng với nhau

Hình 6.13: Minh họa sự dimer hóa của RTK (Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed

- J Foreman_ T Johansen) Thứ hai, thụ thể tự phosphoryl hóa tạo ra vùng phosphotyrosine (phosphotyrosine sites) tại vị trí trong màng bào tương của thụ thể, tạo ra một vùng neo (docking site) để nối kết với vùng SH2

và PTB Hơn nữa, để cho thấy vai trò trung tâm trong quá trình điều hòa hoạt động của PTK, sự

tự phosphoryl hóa tyrosine của RTK là một quá trình thiết yếu để tái cấu trúc và kích hoạt các phân tử protein tín hiệu Hầu hết các vùng tự phosphoryl hóa tyrosine đều nằm ở vùng không xúc tác (noncatalytic regions) của vùng nội bào phân tử thụ thể Những vùng này gồm đuôi C (C-terminal tail) (như với thụ thể EGF) hoặc vùng nối phosphate (kinase insert region) (như đối với thụ thể PDGF) Sự tương tác giữa vùng SH2 và các motif phosphotyrosine tạo ra cơ chế hiệp đồng và tái cấu trúc của phức hợp tín hiệu (signaling complex) bằng cách kích hoạt RTK Do vậy, tất cả RTK cần phải được biết đến không chỉ dưới vai trò thụ thể (PTK activity) mà còn phải xem như là nền tảng của sự nhận diện và tái cấu trúc (bổ sung) các thành phần đặc biệt của phân

tử protein tín hiệu

Hình 6.14: Thụ thể của Growth hormone (GH) Các cấu trúc monomer GH kết hợp với phần

khác để tạo thành cấu trúc dimer khi có GH nối kết Quá trình này được xúc tác bởi JAK2 kinase trans-phosphorylate JAK2 và thụ thể GH, yếu tố phiên mã STAT được phosphoryl bởi JAK2.(Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed - J Foreman_ T Johansen)

Hình 6.15: Các dạng RTK tiêu biểu và cấu trúc bất hoạt/hoạt động

Chi tiết sự hoạt hóa dimer hóa tysosine

Trong gần 20 năm trở lại đây, những quá trình tín hiệu đã được hiểu rõ dựa vào sự hiểu biết về nền tảng phân tử của quá trình dimer hóa RTKs Nền tảng này được các nghiên cứu hóa sinh học

về việc nối kết ligand và hoạt hóa RTK chứng minh là đúng Tuy nhiên, các phân tử nền tảng chính xác cho sự hình thành này vẫn chưa được biết đầy đủ Các hiểu biết về ligand trong phức hợp của nó với vùng kết nối thụ thể đã cho thấy cơ chế tự nhiên của sự dimer hóa này Một vài cấu trúc lập thể của thụ thể trong phức hợp của nó với ligand tương ứng đã được chứng minh, bao gồm cả cytokin cũng như các thụ thể của yếu tố tăng trưởng (growth factor) Những ligand