vi sinh công nghiệp 9

tài liệu về các ứng dụng công nghiệp quan trọng của vi sinh vật

sự chuyển hoá sinh học, nó bao gồm sự sinh trưởng của vi sinh vật trong

những nỗi lên men lớn theo sau là sự bổ sung hoá chất cần được chuyển hoá tại một thời điểm thích hợp Tiếp tục lên men thêm một thời gian nữa

để vỉ sinh vật tác động lên hoá chất rồi tách chiết dịch lên men, và cuối cùng sản phẩm mong muốn được tinh khiết Mặc dù về ngnyên lý chuyển hoá sinh học có thể được sử dụng cho nhiều quá trình khác nhau song trong thực tế nó chỉ được ứng dụng để sản xuất một số hormone nhất định

I Sự chuyển hóa các steroid

Việc sử dụng vi sinh vật để thực hiện những sự chuyển hoá steroid

có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp dược phẩm Steroid hormones điều chỉnh những trạng thái trao đổi chất khác nhau ở động vật kể cả ở người Một trong những hormone đó, cortisone, có tác dụng làm giảm cơn đau có liên quan đến bệnh viêm khớp Các dẫn xuất cortisone khác làm dịu các triệu chứng liên quan đến các bệnh dị ứng hoặc viêm

Nhiều loại steroid hormones điều chỉnh hoạt động giới tính ở người trong đó một số đã được sản xuất thành dạng thuôc uống để tránh thụ thai Các đặc tính sinh lý của một steroid phụ thuộc vào bản chất và vị trí chính xác của các thành phần hoá học nằm trên cấu trúc vòng của steroid gốc Vào đầu những năm 1930, Kendall ở Trường Đại học Tổng hợp Basel đã tách được cortisone, một steroid do tuyến thượng thận tiết ra Khoảng một thập kỷ sau Hench chỉ ra rằng việc uống cortisone có thể làm dịu cơn đau ở các bênh nhân bị bệnh viêm khớp

Nhu cầu thực tế của hormone trở nên cấp bách và các phương pháp hoá tổng hợp steroid được phát triển vì thị trường tiềm tàng là rất lớn Tuy nhiên, hoá tổng hợp khá phức tạp yêu cầu tới 37 bước trong đó nhiều bước xảy ra dưới các điều kiện cực trị Cortisone tổng hợp được theo con đường này trị giá 200 đôla một gam

Một trong những điều phức tạp chủ yếu gặp trong hoá tổng hợp cortisone là việc phải đưa một nguyên tử oxygen vào một vị trí trong cấu trúc steroid 4 vòng được gọi là vị trí 11; đây là bước quyết định trong việc tạo nên hoạt tính sinh lý của phân tử

Vào năm 1952, Peterson và Murray thuộc hãng Upjohn đã phát hiện

ra rằng nấm mốc mọc trên bánh mì Rhizopus arrhizus có khả năng

hydroxyl hoá progesterone, một steroid khác, bằng cách đó đưa một nguyên tử oxygen vào vị trí 11 Progesterone là một tiền chất trong hoá tổng hợp cortisone, và bằng phương pháp hydroxyl hoá nhờ vi sinh vật

(trong công nghiệp thường dùng các chủng họ hàng với R arrhizus) việc

tổng hợp đã được rút ngắn từ 37 xuống 11 bước Nhờ vậy giá thành giảm xuống còn 6 đôla một gam

Sự hydroxyl hoá progesterone mang lại hiệu quả kinh tế do đã rút ngắn được sự tổng hợp hoá học Sự lên men có thể thực hiện ở 30oC với nước là dung môi và ở áp suất của khí quyển Các phản ứng dưới các điều kiện này rẻ hơn nhiều so với các phản ứng diễn ra dưới các điều kiện cực trị về nhiệt độ và áp suất và dung môi không phải là nước như trong hoá tổng hợp cortisone Đến nay đã có một số quá trình khác ứng dụng vi sinh

vật để tổng hợp công nghiệp các steroid Nấm Cunninghamella blakesleana cũng có khả năng hydroxyl hoá steroid cortesolon để tạo

thành hydrocortisone nhờ việc gắn oxygen vào vị trí số 11 Những sự chuyển hoá nhân steroid khác do vi sinh vật thực hiện bao gồm sự hydro hoá, sự loại hydro, sự epoxygent hoá, và sự loại hoặc thêm các chuỗi bên (hình 9.1)

Các steroid ít có ý nghĩa thương mại là các cocticosteroid như cortisone, hydrocortisone (hình 9.2, hình 9.3), prednison và dexametazon, kích tố tính đực testosteron và hormone động dục estrađiol (hai loại sau dùng cho các loại thuốc tránh thụ thai) và spironolacton (thuốc lợi tiểu) Nguyên liệu dùng cho tất cả các quá trình trên là các loại rượu phức tạp có tên là các sterol Có hai nguồn sterol thông thường : Sản xuất dầu đậu tương để lại một chất thải giàu stigmasterol và sitosterol; rễ của cây barbasco ở Mêhicô chứa diosgenin Ngoài ra, có thể sử dụng ergosterin lấy

từ nấm men hoặc các steroid sản xuất thuần tuý bằng con đường tổng hợp Nhiều vi sinh vật có khả năng thực hiền các phản ứng chuyển hoá steroid Tuy nhiên điều quan trọng là chúng có thể tiến hành phản ứng với tốc độ chuyển hoá cao, hiệu suất lớn và không tạo thành sản phẩm phụ hay không Do yêu cầu này mà số chủng có thể sử dụng cho công nghiệp bị

thu hẹp lại rất nhiều Để hydroxyl hóa người ta sử dụng xạ khuẩn và nấm

(đặc biệt là Fusarium và các loài Curvularia)

Để hydroxyl hoá vị trí 11-a của progesterone, thay cho hệ sợi nấm

người ta dùng bào tử trần của Aspergillus olivaceus Việc hydro hoá được tiến hành với các loài Saccharomyces, Streptomyces và Rhizopus Để loại hydro người ta dùng các vi khuẩn như Corynebacterium và nấm (Fusarium, Calonectria, Cylindrocarpon) còn để cắt vòng có thể dùng Penicillium chrysogenum hay Pseudomonas testosteroni chứa một

steroidizomerase đặc hiệu

Trong một quá trình chuyển hoá steroid điển hình, vi sinh vật trước hết được đưa vào một môi trường thích hợp không chứa steroid Người ta thường sử dụng các nồi lên men nhỏ (10-50m3) Thường vào cuối pha sinh trưởng logarit thì steroid mới được đưa vào với nồng độ 0,05-0,1% Vì các steroid tan yếu trong nước nên người ta dùng các dung môi hữu cơ hoà tan được trong nước (như methanol, propylenglycol, dimetylsulfoxygent) làm chất hoà tan trung gian

Thời gian chuyển hoá kéo dài từ 6 đến 48 giờ, thông thường thì quá trình được kết thúc sau 20 giờ bằng cách tách tế bào và chiết sản phẩm Hiệu suất đạt được là 60-95% Các sản phẩm của phản ứng nằm bên ngoài

tế bào

Việc theo dõi phân tích sự chuyển hoá để xác định thời gian lên men cực thích giữ vai trò rất quan trọng, vì nếu vượt ra ngoài thời gian đó sẽ xảy ra các phản ứng kế tiếp không mong muốn Nếu khống chế tốt thì có thể tiến hành hai phản ứng chuyển hoá mong muốn kế tiếp nhau trong cùng một nồi lên men Chẳng hạn 6α-fluo-21-acetoxygen-16α-methyl-4-pregnen-3,20-đion trước hết được hydroxyl hoá ở vị trí 11α nhờ

Aspergillus ochraceus và sau đó cũng trong môi trường ấy nhờ bổ sung Bacillus lentus mà lại được loại hydro ở vị trí 1,2

Vào năm 1980 giá cortisone ở Mỹ đã chỉ còn 46 cent một gam, rẻ hơn 400 lần so với giá ban đầu Việc tìm được các ứng dụng khác của các steroid (dùng cho tránh thụ thai, bệnh thiếu hormone, các bệnh về da, viêm và dị ứng) cùng với tính hiệu quả cao của phương pháp sản xuất đã tạo ra một nhu cầu cấp thiết đối với các loại dược phẩm này Doanh thu 4 loại steroid chính (cortisone, aldosteron, prednison và prednisolon) trên thị trường thế giới vào năm 1987 là 300 triệu đô la

Hình 9.1: Sản xuất steroid bằng các biện pháp hoá học kết hợp với sự

chuyển hoá vi sinh vật

Acid Deoxycolic Cortisone

Hình 9.2: Coctisone được tổng hợp từ deoxycolic acide

Hình 9.3: Sự sản xuất 11 α-hydroxyprogesterone và hydrocortisone

II Sự tạo thành phenyl-axetylcacbinol, tiền chất của epheđrin

Epheđrin là một alcaloit có trong cây Ephedra vulgaris Giống như

ađrenalin, nó có tác dụng làm tăng huyết áp và được dùng làm thuốc để điều trị các bệnh suy nhược tuần hoàn, hen, viêm phế quản v.v Cấu tạo hoá học của nó như sau :

Tách chất này từ thực vật là một công việc tốn kém Hoá tổng hợp

nó cũng khó thực hiện bởi vì do hai nguyên tử C không đối xứng của phân

tử mà xuất hiện bốn đồng phân lập thể trong đó chỉ có dạng L là có dược tính

Nhờ Saccharomyces cerevisiae mà benzaldehyde có thể được

chuyển hoá thành phenyl-axetylcacbinol, tiền chất của epheđrin, với hiệu suất 50-60% khi được bổ sung vào môi trường chứa một nồng độ tế bào là 0,8- 1%

Trong sản phẩm chuyển hoá này, nhóm hydroxyl nằm ở cùng vị trí như trong L-ephedrin Trong phản ứng này, các tế bào nấm men gắn

"acetalđehyde hoạt động" được tạo thành trong sự đường phân vào benzalđehyde vừa bổ sung vào môi trường (phản ứng cacboligase):

Benzaldehyde ''Acetaldehyde hoạt động''

L-phenyl-acetylcacbinol Sau đó phenyl-acetylcacbinol được chuyển thành L-epheđrin bằng con đường hoá học nhờ một sự kết hợp hydro amin hoá

III Sản phẩm từ vi khuẩn acetic

Trong sự oxygen hoá ethanol thành acid acetic, chuyển hoá thực chất là một sự sử dụng cơ chất ở đây, NADPH2 xuất hiện được chuyển qua chuỗi hô hấp để thu nhận năng lượng, song cơ chất không bị phân giải

hoàn toàn do vậy quá trình cũng còn được gọi là sự oxygen hoá không hoàn toàn Loại chuyển hoá này có thể trải qua nhiều bước

Các đại diện của vi khuẩn acetic (Acetobacter, Gluconobacter)

oxygen hoá không chỉ ethanol mà cả một phổ rộng các rượu bậc một và rượu bậc hai cũng như các polyol

Các loài vi khuẩn mà sản phẩm của chúng được giữ lại được gọi là

các loai oxygen hoá thấp (suboxygendant) Thuộc về nhóm này có vi khuẩn acetic dùng trong công nghiệp là Acetobacter suboxygendans Các

loài chỉ tích luỹ acid acetic tạm thời sau đó lại oxygen hoá tiếp được xếp

vào nhóm oxygen hoá cao (peroxygendant), chẳng hạn Acetobacter peroxygendans, Acetobacter pasteurianum) Giữa hai nhóm này có các

Hydro được NADP nhận và qua các xitocrom được chuyển đến O2

là chất nhận điện tử cuối cùng Sự tạo thành acid acetic đồi hỏi cung cấp oxygen mạnh Khi thông khí không đầy đủ có thể xảy ra sự hoá hai của axetaldehyde thành acid acetic và ethanol theo phương trình sau đây (phản ứng Canizzaro) :

Ethanol lại đi vào phản ứng thứ nhất và cuối cùng cũng được oxygen hoá thành acid acetic

Ethanol hoặc acid acetic không thể được dùng làm nguồn cacbon duy nhất vì người ta không tìm thấy các enzyme cần thiết của chu trình

glyoxylate ở Acetobacter xylinum Vì vậy để sinh trưởng vi khuẩn cần

được bổ sung các nguồn C khác như glucose

Sự cung cấp oxygen có tính chất quyết định đến kỹ thuật sản xuất dấm Trước kia quá trình được tiến hành bằng phương pháp nuôi bề mặt

nhờ một lớp váng của Acetobacter xylinum (phương pháp Orléans), trong

đó vi khuẩn được cố định trên các vỏ bào gỗ giẻ Vỏ bào đựng trong một thùng gỗ hình trụ (generator) được thông khí từ phía dưới và tưới các dung dịch chứa rượu (ví dụ các loại rượu vang kém phẩm chất) từ phía trên (hình 9.4)

Ngày nay các phương pháp chìm ngày càng có ý nghĩa hơn Hiện tại người ta dùng các nồi lên men đặc biệt (acetator) được thông khí rất mạnh trong đó dịch dinh dưỡng được thay thế từng phần bằng dịch dinh dưỡng

bổ sung cũng đã được thông khí đầy đủ

Sau khi ethanol đã được chuyển hoá thành acid acetic, phần lớn dịch dinh dưỡng trong nồi được lấy đi và thay thế vào đó là dịch dinh dưỡng mới Nhờ đó có thể đạt được một phương thức giống như nuôi cấy liên tục

Quá trình lên men được tiến hành nhờ các chủng chọn lọc của

Acetobacter suboxygendans trong một dịch dinh dưỡng chứa glucose với

10-12% ethanol Ethanol gần như được chuyển toàn bộ thành acid acetic Nồng độ acid acetic cao nhất đã đạt được là 13% Quá trình diễn ra ở 28-

30oC và kéo dài khoảng 48 giờ Trong phương pháp cổ điển Orléans, sự lên men kéo dài tới 5 tuần lễ Trong các phương pháp hiện đại với nồng độ rượu hoặc acid acetic cao là 12%, thì một sự ngừng thông khí từ 10 đến 20 giây sẽ làm chết tới một phần ba số vi khuẩn ở những nồng độ cơ chất thấp hơn, sự phụ thuộc vào oxygen không đến nỗi khắt khe tới như vậy

Vi sinh vật oxygen hóa ethanol thành acid acetic thường được gọi là các vi khuẩn acetic, các vi khuẩn này thực hiện trao đổi chất ở pH môi trường thấp, điều này phân biệt chúng với các vi khuẩn khác

Các vi khuẩn acid acetic là bọn đa hình, tế bào từ hình elip tới hình que thẳng hoặc hơi cong 0,5-0,8 × 0,9-4,2 μm, đứng một mình, thành cặp hoặc thành chuỗi có dạng không chuyển động và dạng chuyển động với tiên mao ở cực hoặc vòng quanh cơ thể Chúng là bọn hiếu khí bắt buộc, một số tạo thành sắc tố, một số tạo thành cellulose Người đầu tiên tìm cách phân loại các vi khuẩn acid acetic là Hansen (1894)

Ngày nay các vi khuẩn acid acetic mới phân lập được xếp vào hai

chi chính, Acetobacter, Gluconobacter Các loài của Acetobacter (trên 60)

chứa 5 đặc điểm: có mặt catalase, oxygen hóa ethanol qua acid acetic tới

CO2 và H2O, oxygen hóa lactate thành cacbonate, oxygen hoá glycerol

thành DHP và sự sản sinh acid gluconic từ glucose Các vi khuẩn trong chi

Acetobacter thường được chia thành bốn nhóm : oxygen hoá mạnh,

oxygen hoá, oxygen hoá trung bình và oxygen hoá yếu

Hình 9.4: Thiết bị sản xuất dấm theo phương pháp cổ điển

IV Sản xuất vitamin C ( acid L-ascocbic )

Đa số động vật tổng hợp được toàn bộ lượng vitamin C cần thiết cho nhu cầu của mình và do vậy vitamin này được tìm thấy trong các mô của chúng (chủ yếu trong gan và thận với nồng độ 10-40 mg/100g) Tuy nhiên, người và một số động vật có xương sống cũng như côn trùng lại phụ thuộc hoàn toàn vàọ nguồn vitamin C từ bên ngoài Chủ yếu là rau (bắp cải, spinat, cà chua, 30-150 mg/100g) và quả (cam, chanh, 40-50mg/100g).đã cung cấp cho con người lượng vitamin C cần thiết (45-70 mg/ngày)

Một số vi sinh vật (nấm, nấm men, tảo) sản sinh một lượng rất nhỏ acid L-ascocbic cần cho các quá trình trao đổi chất của chúng Cho đến nay chưa tìm thấy acid ascorbic ở vi khuẩn, hình như chúng không cần acid này

Ở động vật có vú (trừ bọn linh trưởng và một số khác) acid ascorbic được tổng hợp từ D-glucose trong đó C1 của glucose trở thành C6của acid ascorbic và ngược lại Sự tổng hợp diễn ra từ D-glucose tới acid D-glucuronic và sau đó thành lacton của acid L-gulonic

L-Sự oxy hoá sau đó của gulonolacton ở vị trí C2, được xúc tác bằng L-gulonolacton dehydrogenase, một enzyme không tìm thấy ở người, theo sau là sự enol hóa sẽ cho acid L-ascorbic (hình 9.5) ở thực vật, acid L-ascorbic được tạo thành từ D-glucose hay D-galactose qua một số con đường chuyển hóa

Một trong những con đường này giữ không làm cho trật tự của chuỗi cacbon bị thay đổi, song các sản phẩm trung gian của con đường sinh tổng hợp thì còn chưa biết rõ Có thể con đường này cũng giống con đường tổng hợp ở động vật

Hình 9.5: Con đường sinh tổng hợp acid L-ascocbic

Từ trên 50 năm nay, công nghiệp đã có thể đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về vitamin C của con người nhờ phương pháp bán tổng hợp từ glucose Nhiều quá trình hoá học và sinh hóa kế tiếp nhau tham gia vào quá trình này và tất cả đều qua một sản phẩm trung gian là acid 2-keto-L-

gulonic, từ đó sẽ thu được acid L-ascorbic nhờ con đtrờng hoá học bằng cách lacton hoá và đồng phân hoá (hình 9.6)

Acid-keto-Lgulonic Methyl-2keto-Lgulonate Acid L-ascobic Hình 9.6: Sự chuyển hoá hoá học acid 2-keto-L-gulonic thành acid L-

1.Các quy trình bắt dầu bằng sự khử D-glucose

Quy trình công nghiệp này được Reinstein và Gruessner đề ra từ năm 1934

và đến nay vẫn còn sử dụng Nó bao gồm 5 bước phản ứng kế tiếp nhau, tất cả đều đạt sản lượng tới 90-95% (hình 9.7)

Hình 9.7: Sự tổng hợp acid 2-keto-Lgulonic từ glucose qua socbitol và L-socboza

D-1 Khử D-glucose thành D-sorbitol với sự có mặt của niken Raney, sau đó loại tới mức tối đa niken hòa tan bằng cách xử lý dung dịch sorbitol với nhựa cation

2 Oxygen hóa D-sorbitol thành L-sorbose nhờ vi sinh vật : có nhiều

chủng Acetobacter chịu được nồng độ niken tới 10-20 mg/l, thực hiện

nhanh chóng phản ứng này trong các môi trường chứa nồng độ sorbitol cao Quá trình lên men diễn ra ở 30oC trong một môi trường chứa 200 g/l sorbitol, 10 g/l cao ngô, và 0,5 g/l CaCO3 với một chủng Acetobacter suboxygendans đã hoàn tất trong 24 giờ và cho khoảng 180g sorbose trong

một lit Sau khi lọc, loại ion và cô đặc dịch nuôi, sorbose được kết tinh (tới