đề tài bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài

Mục lục I. Sơ lược về bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài ...................................................... 3 II. Ý nghĩa của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài ........................................... 3 III. Phương pháp bảo quản nguồn gen in vitro trong thời gian dài ............................................ 3 III.1. Sự da dạng trong cách xử lý đóng băng của các mô thực vật chịu lạnh ........................ 4 III.2. Các bước tiến hành ........................................................................................................ 4 III.2.1. Tạo nguồn mô nuôi cấy và huyền phù tế bào vô trùng ........................................... 5 III.2.2. Bổ sung các tác nhân bảo quản đông lạnh ............................................................. 5 III.2.3. Xử lý lạnh đến nhiệt độ cực thấp ............................................................................. 6 III.2.4. Lưu trữ trong nito lỏng (1960C) ............................................................................. 7 III.2.5. Giải đông ................................................................................................................. 8 III.2.6. Loại bỏ tác nhân bảo quản đông lạnh .................................................................... 9 III.2.7. Xác định khả năng sống sót .................................................................................... 9 III.2.8. Tái sinh lại những tế bào đã được hồi phục và tiếp tục nuôi cấy để tạo cây hoàn chỉnh .................................................................................................................................... 9 III.3. Một số phương pháp được sử dụng trong bảo quản đông lạnh...................................... 9 III.4. Áp dụng cho đối tượng cụ thể (cây khoai sọ) .............................................................. 14 III.5. Các nhân tố ảnh hưởng đến sự hồi phục của tế bào đông lạnh .................................... 15 III.5.1. Độ tuổi, đặc tính và mật độ tế bào ........................................................................ 15 III.5.2. Các tác nhân bảo quản lạnh ................................................................................. 16 III.5.3. Tốc độ làm lạnh và phương pháp giải đông ......................................................... 16 III.5.4. Nhiệt độ lưu trữ ..................................................................................................... 16 IV. Ưu và nhược điểm của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài ...................... 16 IV.1. Ưu điểm ....................................................................................................................... 16 IV.2. Nhược điểm ................................................................................................................. 17 V. Khả năng ứng dụng của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài ...................... 17 VI. Kết luận .............................................................................................................................. 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 19 Tiếng Việt: ............................................................................................................................ 19 Tiếng Anh: ............................................................................................................................ 19 PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 20 Các chữ viết tắt: .................................................................................................................... 20 So sánh các phương pháp bảo tồn in vitro ............................................................................ 20 Khả năng làm sạch virus (Virus elimination) ....................................................................... 21

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA SINH HỌC

ĐỀ TÀI: BẢO TỒN NGUỒN GEN IN VITRO

TRONG THỜI GIAN DÀI

LÂM THỊ TUYẾT

Đà lạt, tháng 10 năm 2016

Mục lục

I Sơ lược về bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài 3

II Ý nghĩa của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài 3

III Phương pháp bảo quản nguồn gen in vitro trong thời gian dài 3

III.1 Sự da dạng trong cách xử lý đóng băng của các mô thực vật chịu lạnh 4

III.2 Các bước tiến hành 4

III.2.1 Tạo nguồn mô nuôi cấy và huyền phù tế bào vô trùng 5

III.2.2 Bổ sung các tác nhân bảo quản đông lạnh 5

III.2.3 Xử lý lạnh đến nhiệt độ cực thấp 6

III.2.4 Lưu trữ trong nito lỏng (-196 0 C) 7

III.2.5 Giải đông 8

III.2.6 Loại bỏ tác nhân bảo quản đông lạnh 9

III.2.7 Xác định khả năng sống sót 9

III.2.8 Tái sinh lại những tế bào đã được hồi phục và tiếp tục nuôi cấy để tạo cây hoàn chỉnh 9

III.3 Một số phương pháp được sử dụng trong bảo quản đông lạnh 9

III.4 Áp dụng cho đối tượng cụ thể (cây khoai sọ) 14

III.5 Các nhân tố ảnh hưởng đến sự hồi phục của tế bào đông lạnh 15

III.5.1 Độ tuổi, đặc tính và mật độ tế bào 15

III.5.2 Các tác nhân bảo quản lạnh 16

III.5.3 Tốc độ làm lạnh và phương pháp giải đông 16

III.5.4 Nhiệt độ lưu trữ 16

IV Ưu và nhược điểm của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài 16

IV.1 Ưu điểm 16

IV.2 Nhược điểm 17

V Khả năng ứng dụng của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài 17

VI Kết luận 17

TÀI LIỆU THAM KHẢO 19

Tiếng Việt: 19

Tiếng Anh: 19

PHỤ LỤC 20

Các chữ viết tắt: 20

So sánh các phương pháp bảo tồn in vitro 20

Khả năng làm sạch virus (Virus elimination) 21

I Sơ lược về bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài

Ngân hàng hạt

Bảo tồn trung hạn

Bảo tồn dài hạn

Trong đó:

- Bảo tồn ngắn hạn: nuôi cấy in vitro dưới điều kiện sinh trưởng bình thường

- Bảo tồn trung hạn: nuôi cấy in vitro trong điều kiện giảm cường độ ánh sáng,

nhiệt độ, thêm chất ức chế sinh trưởng,…

- Bảo tồn dài hạn: bảo tồn trong nito lỏng (-1960C), trên cơ sở này ngừng tất cả các quá trình trao đổi chất và phân chia tế bào

II Ý nghĩa của việc bảo tồn nguồn gen in vitro trong thời gian dài

- Duy trì sự phong phú đa dạng di truyền

- Là nguồn vật liệu cho chọn giống cây trồng, phục vụ khai thác, nghiên cứu sử dụng cho hiện tại và tương lai

- Bổ sung và thay thế để khắc phu ̣c những ha ̣n chế của những phương pháp khác

- Có thể duy trì được tính sạch bệnh trước khi bảo tồn, bảo tồn với số lượng lớn trên một diện tích nhỏ Điều kiện bảo quản hoàn toàn chủ động

III Phương pháp bảo quản nguồn gen in vitro trong thời gian dài

Sử dụng phương pháp ngừng sinh trưởng tạm thời (hay bảo quản đông lạnh trong nito lỏng)

- Đặc điểm: Mẫu nuôi cấy được bảo quản trong nito lỏng và trong thời gian bảo quản tế bào mô hoàn toàn ngừng sinh trưởng

- Thời gian bảo quản: 20 – 30 năm hoặc lâu hơn

- Đối tượng: Mẫu đem bảo quản thường ở dạng phôi, mô sẹo, các mô nuôi cấy (thường là mô phân sinh),… Trước khi đưa vào bảo quản mẫu cần được xử lý để tránh tạo thành các tinh thể nước kết tinh gây chết mẫu

III.1 Sự da dạng trong cách xử lý đóng băng của các mô thực vật chịu lạnh

Hình III.1 Sự đa dạng trong cách xử lý đóng băng của các mô thực vật chịu lạnh

Trong đó:

A: Làm đông ngoại bào trong các mô vỏ của cây Sambucus racemosa (cơm cháy) B: Làm đông ngoài cơ quan trong nụ hoa cây Cornus officinalis (1) (sơn thù du),

Rhododendron Dauricum (2) (đỗ quyên) và nụ hoa của thông rụng lá (3), PL = lá

nguyên thủy, fl = Hoa con, scale = vảy

C: Siêu lạnh sâu trong nhu mô xylem ray (R) của một cành táo

III.2 Các bước tiến hành

- Tạo nguồn mô nuôi cấy và huyền phù tế bào vô trùng

- Bổ sung các tác nhân bảo quản đông lạnh (cryoprotectant)

- Xử lý lạnh đến nhiệt độ cực thấp

- Lưu trữ tế bào trong nito lỏng (-1960C)

- Giải đông hoặc làm ấm nhanh tế bào

- Loại các tác nhân bảo quản đông lạnh bằng cách rửa nhiều lần

- Xác định khả năng sống sót

- Tái sinh lại những tế bào đã được hồi phục và tiếp tục nuôi cấy để tạo thành cây hoàn chỉnh

III.2.1 Tạo nguồn mô nuôi cấy và huyền phù tế bào vô trùng

- Khử trùng bề mặt: bằng các loại chất khử trùng như NaOCl, HgCl, … sau đó rửa nhiều lần bằng nước vô trùng trước khi cắt mẫu

- Cắt mẫu: cắt bỏ các phần bị chất khử trùng làm cho hoại tử Các mẫu thường được nuôi cấy là chồi nách, lá non, đoạn thân non,…được cấy vào các môi trường phù hợp

- Tiến hành nuôi cấy vô trùng trên môi trường có Agar, có bổ sung các chất ĐHST thích hợp để nhân nhanh số lượng mẫu cấy gồm sẹo, phôi hoặc mô phân sinh

- Chuyển sang nuôi cấy lỏng lắc trong môi trường có chứa nồng độ auxin và Cytokinin thấp Tùy theo kết cấu của mô sẹo, huyền phù tế bào đầu tiên sẽ được tạo ra trong vòng 1 – 2 tuần Ta có thể cấy chuyền định kì để nhân số lượng huyền phù

- Các mô nuôi cấy và huyền phù tế bào được tạo ra từ các mẫu cấy non đang tăng trưởng mạnh

III.2.2 Bổ sung các tác nhân bảo quản đông lạnh

- Các bình có chứa mẫu cấy được chuyển vào bể ủ nước đá, phần huyền phù bên trong được để cho lắng và phần môi trường thừa bên trên được hút ra bằng pipet

- Mỗi ml mẫu có chứa tế bào nuôi cấy mật độ cao được phân phối vào 1 ống nhựa

vô trùng và loại bỏ phần môi trường còn sót lại

Bổ sung tác nhân bảo quản đông lạnh phù hợp (thường là DMSO 5 – 10%) được

bổ sung từ từ 1ml vào ống chia làm 4 lần, mỗi lần 0,25 ml trong thời gian 5 phút

- Để yên khoảng 20 – 30 phút (trong bể nước đá) Sau khi bổ sung tác nhân bảo quản lạnh, các ống nhựa được đặt ở nhiệt độ cực thấp và đông lạnh

- Trong các tác nhân bảo quản đông lạnh thì DMSO được sử dụng rộng rãi và có tính chất bảo quản lạnh rất tốt Tuy nhiên phải sử dụng các tác nhân bảo quản ở

lớn sẽ gây ra hiện tượng co nguyên sinh chất của tế bào

- Yêu cầu của một chất bảo quản lạnh: Có khối lượng phân tử thấp, có thể trộn lẫn dễ dàng với dung môi, không độc ngay cả khi ở nồng độ thấp, dễ dàng rửa đi khỏi tế bào và trên hết là thấm nhanh vào trong tế bào

- Cơ chế hoạt động của các tác nhân bảo quản (chỉ là giả thiết):

+ Chúng có thể làm giảm nồng độ muối nội bào và giảm hình thành tinh thể đá + Sự khử nước tế bào mà theo sau là sự tổn thương do đông lạnh là sự hình thành liên kết SS cảm ứng và các tác nhân bảo quản ngăn chặn hoặc ức chế hình thành liên kết này

+ Các tác nhân bảo quản tương tác trực tiếp hoặc gián tiếp với màng tế bào để cố định các cấu trúc bậc 3 phức hợp nước – lipid – protein Tại màng tế bào, sự đông lạnh làm tổn thương tính toàn vẹn sinh học, tuy nhiên hoạt động sinh hóa của các tác nhân bảo quản tại màng tế bào thì chưa rõ

- Các tác nhân bảo quản ở nồng độ cao có tác hại:

Ở nồng độ cao nó có thể làm giảm hô hấp, ức chế RNA và ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào và mô thực vật bị cô lập, do đó phải sử dụng nó ở nồng độ tối

ưu (thường dùng 5 – 10%)

- Ngoài ra, nên sử dụng kết hợp 2 hay nhiều tác nhân bảo quản để cho hiệu quả cao hơn (ví dụ như trường hợp của cây khoai sọ bên dưới)

- Các tác nhân bảo quản thường được sử dụng:

+ Dimethyl Sulfoxide (DMSO)

- Điều chỉnh tốc độ làm lạnh chậm: 1- 50C/phút tùy đối tượng

Có thể kết hợp cả 2 phương pháp: Ví dụ, huyền phù tế bào của cây Sung dâu (Acer psedoplatanus) sẽ được tiền đông lạnh dần dần (theo các khoảng thời gian 3 phút

ở -150C, -230C, -300C, -400C, -500C và -700C và đưa xuống -1960C sẽ có tỉ lệ sống khoảng 30%

+ Bước xử lý này sử dụng các loại máy đông lạnh: Biologicail Freezer-6, Biogical Dry Freezer DPF 30, Mini – Freezer R 202,…

Bước tiền đông lạnh có hiệu quả trong việc ngăn chặn và giảm sự hình thành tinh thể nước đá nội bào Sẽ có một nhiệt độ xác định mà tại đó hầu hết lượng nước có thể đông đá trong tế bào có thể bị loại ra khỏi tế bào nhờ sự đông lạnh ngoại bào,

tế bào và mô ở trạng thái này không bị tổn thương, thậm chí khi tiếp xúc với nhiệt

thể thay đổi theo mức độ chịu lạnh của thực vật Ở nhiệt độ này, lượng nước dễ đông lạnh hầu như được loại ra khỏi tế bào (khử nước một phần) nhờ hình thành nước đá liên bào

Hình III.2.3 Máy đông lạnh Biogical Dry Freezer DPF 30 (có thể đông lạnh đến -190 0 C

Mẫu cấy được lưu trữ trong nito lỏng với nhiều độ dài thời gian khác nhau, có thể được lấy ra và giải đông bất cứ lúc nào

Thời gian lưu trữ còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: phương thức xử lý mẫu, loại mẫu, phương pháp làm lạnh,…và cần kiểm tra định kì

Hình III.2.4a một số dụng cụ chứa mẫu để lưu trữ trong nito lỏng

Hình III.2.4b Cấc mẫu in vitro được lưu trữ trong nito lỏng

III.2.5 Giải đông

Ta không nên làm ấm dần dần vì sẽ làm tái tạo các tinh thể nước đá còn làm ấm nhanh sẽ làm các tinh thể nước đá tan trước khi chúng có thể tái tạo tinh thể và phát triển Các nghiên cứu cho rằng việc các tế bào làm lạnh nhanh bị chết là do

sự phát triển của các tinh thể nước đá nội bào hơn là sự hình thành tinh thể ban

đầu Sự tổn thương của các tế bào có thể là do áp lực tạo tinh thể nước đá gây ra làm đứt gãy màng plasma của các bào quan

Tốc độ làm ấm ảnh hưởng đáng kể lên LT50 của tế bào Với tế bào động vật thì làm ấm chậm tốt hơn còn tế bào thực vật thì ngược lại, có thể do vách tế bào dày, tuy nhiên cũng tùy đối tượng Vd: lá thông làm lạnh đến -450C sống sót khi giải đông ở tốc độ 50C/giờ nhưng sẽ chết nếu tốc độ là 100C/giờ Ngược lại, tế bào vỏ

trong không khí

III.2.6 Loại bỏ tác nhân bảo quản đông lạnh

Mẫu nuôi cấy sau khi giải đông sẽ được mang đi li tâm, tác nhân bảo quản được hút ra bằng pipet và tế bào được rửa ít nhất 3 lần với môi trường phù hợp để loại

bỏ các tác nhân bảo quản còn tồn đọng trong mẫu Nếu không được loại bỏ các tác nhân này có thể gây độc hoặc kìm hãm sự sinh trưởng của mẫu

- Đo sự tăng trưởng: Bằng cách sử dụng các thông số khác nhau (chỉ số nguyên phân, số lượng tế bào, thể tích nuôi cấy tế bào, trọng lượng khô và tươi,…), sự tăng trưởng của mẫu nuôi cấy đông lạnh có thể được so sánh với đối chứng

III.2.8 Tái sinh lại những tế bào đã được hồi phục và tiếp tục nuôi cấy để tạo cây hoàn chỉnh

Các mẫu được nuôi cấy lỏng lắc hoặc trải trực tiếp lên môi trường Agar

Điều chỉnh các điều kiện dinh dưỡng (môi trường nuôi cấy với các chất ĐHST thích hợp) và vật lý (cường độ ánh sáng, nhiệt độ, thời gian chiếu sáng,…) phù hợp để tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh Không phải tất cả các đỉnh chồi còn sống đều có thể tái sinh chồi, nếu bổ sung Pluronic F – 68 với nồng độ thấp (0,0005%) sẽ cho tỉ lệ tái sinh chồi cao hơn Hoặc chiếu sáng cường độ thấp trong thời gian đầu (6 µmol) và cường độ cao hơn trong thời gian tiếp (40 µmol) cũng

có thể tăng tỉ lệ tái sinh

III.3 Một số phương pháp được sử dụng trong bảo quản đông lạnh

- Phương pháp lạnh chậm truyền thống (Two – step Cooling) (0,50C –

20C/phút): Các mẫu cấy được xử lý với sự có mặt của dung dịch bảo vệ đông lạnh,

thường dùng DMSO nồng độ trung bình 5 – 15% hoặc glycerol, sucrose…, Sau

đó chúng được làm lạnh từ từ với tốc độ 0,2 – 0,3oC/phút cho đến -35oC, rồi ngâm trong nito lỏng Khả năng tái sinh dao động từ 4 – 85% tùy loài

Nhìn chung, phương pháp bảo quản này khá phức tạp và tốn thời gian, cần các thiết bị đặc biệt Sau khi hạ nhiệt độ xuống -300C đến -40oC, dung dịch trong tế bào đông kết dạng trong như kính khi nhúng trong nito lỏng Phương pháp này ngày nay sử dụng bảo tồn các mô không tổ chức như callus và dung dịch tế bào huyền phù

- Tạo hạt nhân tạo/khử nước (Encapsulatin/Dehydration): Các mô thực vật

được gói trong vỏ alginate (có chứa muối khoáng, chất hữu cơ) Những hạt này sau đó được xử lý trong đường sucrose nồng độ cao, giảm độ ẩm xuống 20 – 30% (bằng dòng không khí hoặc chất hút ẩm gel silica) và làm đông lạnh nhanh trong nito lỏng Thường thì ta có thể giảm độ ẩm nhờ loại bỏ phần nước tự do trong tế bào, còn phần nước liên kết thì không thể loại bỏ Các chất dinh dưỡng bao quanh

mô có thể kích thích mô tái sinh sau khi làm tan đóng băng có lợi cho sử dụng

- Phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification): Đây là phương pháp được sử dụng

phổ biến nhất Quá trình thủy tinh hóa được mô tả như sự đông đặc của chất lỏng nhưng không kết tinh Khi các dung dịch trong tế bào trở thành dạng thủy tinh, các tế bào đó đang ở trong một “trạng thái thủy tinh” và vô định hình Chúng thiếu các cấu trúc tổ chức nhưng có các đặc tính cơ học và vật lý của một chất rắn

Kĩ thuật xử lý dung dịch đông lạnh đậm đặc lên mô thực vật (15 phút – 2giờ), sau

đó nhúng trong nito lỏng mà không có bước khử nước do đông lạnh cảm ứng (tế bào và mô phân sinh được khử nước theo cách thẩm thấu trong dung dịch thủy tinh hóa nồng độ cao) Khác với các phương pháp tiền đông lạnh truyền thống (thủy tinh hóa một phần, chỉ có cytosol được thủy tinh hóa) Quá trình thủy tinh hóa cần một dung dịch thủy tinh hóa nồng độ cao, có thể khử nước đầy đủ cytosol

mà không gây ra tổn thương do đó chúng chuyển thành dạng thủy tinh bền vững khi được đưa vào nito lỏng Kết quả là cả dung dịch đông lạnh và dung dịch trong

tế bào đều đông kết

+ Dung dịch đông lạnh này gồm hỗn hợp chất bảo vệ đông lạnh thấm và không thấm Chất thông thường nhất gồm PVS2 (độc tính thấp): 30% glycol, 15% DMSO và 0,4M sucrose, không thấm vào cytosol trong suốt quá trình khử nước Dung dịch này có thể dễ dàng hạ nhiệt độ xuống -1000C theo tốc độ làm lạnh thực

tế và cuối cùng hóa rắn ở -1150C

+ Để cảm ứng khả năng chịu đựng sự khử nước, các chồi đỉnh được cắt từ cây con in vitro được cấy vào môi trường nồng độ sucrose cao (0.3 – 0.6M) trong 16 giờ và sau đó xử lý với hỗn hợp glycerol 2M bổ sung sucrose 0.4M (dung dịch LD) trong 20 phút trước khi khử nước với PVS2 Trong phương pháp này, các ảnh hưởng gây tổn thương do quá trình khử nước được giảm hoặc loại bỏ bằng

cách tối ưu hóa thời gian tiếp xúc với PVS2 và bằng cách khử nước đỉnh chồi dần trong 2 bước: dung dịch LD ở 250C, sau đó là dung dịch PVS2 ở 00C

+ Vấn đề chủ yếu để lưu trữ lạnh thành công bằng phương pháp này là cảm ứng

sự chịu đựng của mẫu đối với sự khử nước với dung dịch thủy tinh hóa nồng độ cao Trong phương pháp thủy tinh hóa, tế bào mô phân sinh được cắt thường được nuôi cấy trước trên môi trường giàu sucrose và sobitol trong 1 hoặc 2 ngày để cảm ứng khả năng chịu đựng sự khử nước Nồng độ đường hoặc sobitol tích lũy cao trong suốt quá trình nuôi cấy trước khi bảo quản được cho là rất quan trọng trong việc nâng cao khả năng sống sót của tế bào và mô phân sinh được trữ lạnh Sự tích lũy đường tăng độ ổn định của màng dưới điều kiện mất nước nghiêm trọng

- Sarkar và Naik (1998) sử dụng phương pháp thủy tinh hóa đầu tiên cho giống

S Tuberosum (cây nguyệt hạ dương) ‘Kufri Basha’, ‘Kufri Chandramukhi’,

‘Kufri Lalima’, ‘Kufri Lauvkar’ và ‘Kufri Sindhuri’ Trong phương pháp thủy tinh hóa này, các đỉnh chồi có kích thước 0,5 – 0,7 mm lần đầu tiên được phân lập

từ cây con 30 ngày tuổi và tiền nuôi cấy trong 2 ngày trên cầu giấy lọc trên môi

sucrose (0.3, 0.5 và 0.7M) và mannitol (0, 0.2 và 0.4M) trong 16h chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng khoảng 40 µmol m-2s-1, ở 240C Các đỉnh chồi sau

ngâm trong nước đá) tiếp theo là 100% PVS2 đông lạnh (5 phút) hoặc trực tiếp tại 100% PVS2 (5 phút)

- Năm đỉnh chồi được chuyển vào một cryovial đầy với 0,7 ml PVS2 và cuối cùng cho vào nito lỏng Sau khi làm ấm nhanh ở 350C trong một cốc nước trong 1 phút, các cryovial đã được đổ vào môi trường pha loãng (MS với 1,2M sucrose) và ủ trong 30 phút Sau đó các đỉnh chồi được nuôi cấy trên môi trường tái sinh (MS

Độ) và nuôi cấy dưới ánh sáng khuếch tán (khoảng 6 µmol m-2s-1, 16h chiếu sáng)

ở 240C trong 1 tuần

Sau đó, các đỉnh chồi được chuyển vào môi trường chuẩn (MS với 0.09M sucrose,

m-2s-1, ở 240C, 16 giờ chiếu sáng

- Để tái sinh thành công, tiền nuôi cấy với sự kết hợp giữa sucrose và mannitol là cần thiết, nồng độ mannitol trên 0.2M là bất lợi Các đáp ứng cao nhất được quan sát ở cách áp dụng tiền nuôi cấy với 0.3M sucrose và 0.2 M mannitol sau thủy tinh hóa tuần tự với tỉ lệ tái sinh chồi cao nhất là 56%

- Phương pháp DMSO giọt – giọt đóng băng (DMSO Droplet Method –

Droplet Freezing): Đây là phương pháp tối ưu hóa các phương pháp làm lạnh

cực nhanh Từ “giọt” đề cập đến những giọt chất bảo vệ lạnh trên một lá nhôm,