THU NHẬN ENZYM PAPAIN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM THU NHẬN ENZYM PAPAIN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH Trước hết, em x

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

THU NHẬN ENZYM PAPAIN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO

PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH

Trước hết, em xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô khoa Hóa trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TpHCM, đặc biệt là những thầy

cô đã tận tình dạy bảo cho em trong suốt thời gian học tập tại trường

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến GS.TS Trần Kim Qui, TS Lê Việt Tiến đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp em hoàn thành luận văn này

Nhân đây, em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị nghiên cứu sinh đã động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn anh Hồ Anh Vũ, anh luôn động viên

và đồng hành cùng em trong suốt thời gian học tập cũng như thời gian em thực hiện luận văn này

Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình

đã cho con có được thành quả như ngày hôm nay

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thiện luận văn bằng tất cả

sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn.

Tp.HCM – Ngày 12 tháng 09 năm 2009

Trang 2

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 2

1.1.1 Cysteine protease 2

1.1.2 Papain 2

1.1.2.1 Nguồn gốc 2

1.1.2.1.1 Giới thiệu về cây đu đủ 3

1.1.2.1.2 Phân bố sinh thái của cây đu đủ 4

1.1.2.1.3 Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ 4

1.1.2.2 Tính chất của papain 5

1.1.2.2.1 Tính chất vật lý 5

1.1.2.2.2 Tính chất hóa học 5

a) Cấu tạo hóa học 5

b) Cấu trúc không gian 6

c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain 7

d) Phản ứng của papain 7

e Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain 9

1.1.2.3 Ứng dụng của enzyme papain 10

1.1.2.3.1 Trong y học: 10

1.1.2.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm: 10

1.1.2.3.3 Trong các ngành công nghiệp khác: 10

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 10

1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 12

1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân 12

1.3.2 Quy trình thực hiện phản ứng thủy phân 13

1.3.3 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân: 14

1.3.4 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân 14

1.3.5 Ưu và nhược điểm của phản ứng thủy phân: 15

1.3.5.1 Ưu điểm: 15

1.3.5.2 Nhược điểm: 15

1.4 ỨNG DỤNG ENZYME PAPAIN LÀM XÚC TÁC CHO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 17

2.1.1 Hóa chất 17

2.1.2 Thiết bị 18

2.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 18

2.2.1 Phương pháp trích nhựa đu đủ từ trái 18

2.2.2 Phương pháp thu nhận papain tinh khiết 19

2.2.2.1 Loại bỏ các chất không tan ở pH 9 20

2.2.2.2 Quá trình phân đoạn bằng amonium sulfate 20

2.2.2.3 Quá trình phân đoạn bằng NaCl 20

2.2.2.4 Kết tinh 20

2.2.2.5 Tái kết tinh 21

2.2.2.6 Đông khô chân không 21

2.2.3 Xác định lượng protein theo phương pháp Lowry 22

2.2.4 Xác định hoạt tính protein theo phương pháp Anson 23

2.2.5 Xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl 24

2.2.5.1 Nguyên tắc: 24

2.2.5.2 Cách tính: 24

2.2.6 Phương pháp xác định đạm formol (phương pháp Sorensen) 25

2.2.6.1 Nguyên tắc 25

2.2.6.2 Tiến hành 25

2.2.6.3 Cách tính 26

2.2.7 Xác định đạm amoniac 26

2.2.7.1 Nguyên tắc 26

2.2.7.2 Tiến hành 27

2.2.7.3 Cách tính 27

2.2.8 Phương pháp chung tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng với xúc tác papain thô 27

2.2.8.1 Phương pháp loại béo: 27

2.2.8.2 Phương pháp thực hiện phản ứng 27

2.2.8.3 Hiệu suất thủy phân 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 KHẢO SÁT LƯỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ 30

3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƯƠI 30

3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHÔ 31

3.4 PHƯƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN 33

3.5 PHƯƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE 34

3.6 KHẢO SÁT LƯỢNG ENZYME THU ĐƯỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ 35

3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ 37

3.8 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI LƯỢNG PROTEIN TRONG CÁC CHẾ PHẨM PROTEASE THU ĐƯỢC THEO THỜI GIAN 39

3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN 41

3.10 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PAPAIN 44

3.10.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH 44

3.10.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 45

Trang 3

3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO

THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN 46

3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI XÚC TÁC PAPAIN THÔ 49

3.12.1 Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.25% so với cơ chất theo thời gian 50

3.12.3 Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.75% so với cơ chất 65

KẾT LUẬN 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain 5

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng 10

Bảng 1.3 Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng 11

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo 11

Bảng 1.5 Thành phần amino acid trong đậu phộng 11

Bảng 3.1 Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau 30

Bảng 3.2 Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ 30

Bảng 3.3 Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm 33

Bảng 3.4 Mật độ quang của tyrosin ở bước sóng 720nm 34

Bảng 3.5 Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau 36

Bảng 3.6 Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế 38

Bảng 3.7 Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian 40

Bảng 3.8 Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian 42

Bảng 3.9 Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH 44

Bảng 3.10 Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ 45

Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25% so với cơ chất 47

Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau 48 Bảng 3.15 Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% 51

Bảng 3.16 Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% 51

3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN 46

3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI XÚC TÁC PAPAIN THÔ 49

KẾT LUẬN 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain 5

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng 10

Bảng 1.3 Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng 11

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo 11

Bảng 1.5 Thành phần amino acid trong đậu phộng 11

Bảng 3.1 Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau 30

Bảng 3.2 Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ 30

Bảng 3.3 Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm 33

Bảng 3.4 Mật độ quang của tyrosin ở bước sóng 720nm 34

Bảng 3.5 Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau 36

Bảng 3.6 Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế 38

Bảng 3.7 Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian 40

Bảng 3.8 Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian 42

Bảng 3.9 Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH 44

Bảng 3.10 Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ 45

Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau 48 Bảng 3.15 Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% 51

Trang 4

Bảng 3.50 Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80O C và hàm lượng xúc tác là 1.00% 78

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 2.1 Các loại hoa và trái của cây đu đủ 3

Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của papain 6

Hình 1.3 Cấu trúc tâm hoạt động của papain 7

Hình 1.4 Phản ứng hóa học của papain 8

Hình 1.8 Sơ đồ phản ứng thủy phân 13

Hình 2.1 Cách lấy nhựa đu đủ 19

Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận papain từ nhựa đu đủ đông khô 21

Hình 3.1a Điện di đồ của nhựa khô ở trái non sơ chế bằng dung môi etanol 31

Hình 3.1 b Điện di đồ của chế phẩm Merk và papain tinh chế từ nhựa đu đủ đông khô 32

Hình 3.2 Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ albumin 33

Hình 3.3 Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ tyrosin 34

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên lượng protein sau mỗi giai đoạn tinh chế 36

Hình 3.5 Sự biến thiên hoạt tính của protein sau các giai đoạn tinh chế 39

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng protein theo thời gian 40

Hình 3.7 Sự biến đổi hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian 42

Hình 3.8 Hoạt tính của protein P(UI/ml) trong nhựa khô biến đổi theo pH 44

Hình 3.9:Hoạt tính của protein trong nhựa khô theo nhiệt độ 46

Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian phản ứng 48

Hình 3.11 Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 0.25% 52

Tại pH 7.0, hiệu suất phản ứng ở mỗi nhiệt độ khác nhau được trình bày trong bảng 3.36 – 3.38 67

Hình 3.23 Kết quả điện di của dung dịch sau phản ứng ở các hàm lượng xúc tác khác nhau 79

Trang 5

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

Hiện nay vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm và ô nhiễm môi trường đang là

vấn đề được quan tâm hàng đầu Trong quá trình sản xuất nước chấm có hàm lượng

đạm cao, người ta thường dùng các phương pháp thủy phân protein tạo thành các

dung dịch amino acid Có 3 phương pháp tiến hành phản ứng thủy phân protein:

Phương pháp hóa học: thủy phân protein với xúc tác acid, thời gian tiến hành

phản ứng là 24 giờ Nhược điểm của phương pháp này là tạo thành sản phẩm phụ

3-MCPD, một chất độc gây ung thư

Phương pháp dùng men vi sinh: sử dụng chủng nấm Aspergillus oryzae để

xúc tác phản ứng thủy phân protein Nhược điểm của phương pháp này là thời gian

thực hiện phản ứng khá dài khoảng từ 6 – 8 tháng

Phương pháp hóa sinh: sử dụng xúc tác là các enzyme protease có nguồn gốc

động thực vật làm xúc tác Phương pháp này có thời gian phản ứng ngắn và không

tạo sản phẩm phụ có khả năng gây ung thư

Các phản ứng sử dụng xúc tác enzyme được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh

vực này vì chúng không những cho hiệu suất cao mà thời gian thực hiện phản ứng

cũng ngắn hơn so với phản ứng được tiến hành theo phương pháp cổ điển Hơn nữa

các enzyme thường được phân bố rất rộng rãi trong tất cả các mô, cơ quan động vật

và thực vật, tế bào vi sinh vật nên tương đối dễ tìm

Trong phạm vi luận văn này chúng tôi sẽ tiến hành thu nhận enzyme papain

có trong nhựa đu đủ và ứng dụng tính chất thủy phân protein của enzyme papain để

làm xúc tác cho phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng đã được ép

lấy dầu Chúng tôi chọn enzyme papain vì đây là enzyme có hoạt tính protease cao,

hiện diện nhiều trong nhựa trái đu đủ, một loại cây được trồng rất phổ biến ở nước

Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzyme trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp

Có hai loại cysteine proteases là exopeptidase (cathepsin X, carboxypeptidase B) và endopeptidases (bromelain, ficain, cathepsin ) Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó endopeptidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide

1.1.2 Papain

1.1.2.1 Nguồn gốc[2,17, 19, 32 ]

Papain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được

phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya) Đây cũng

là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis

et al., 1894) Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác

như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines and Brock-lehurst, 1979) Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn định quanh năm

Trang 6

3

1.1.2.1.1 Giới thiệu về cây đu đủ.[7, 8, 41]

A: hoa cái B: hoa lưỡng tính C: hoa đực

D: trái của cây cái E: trái lưỡng tính F: cây đực

Hình 2.1 Các loại hoa và trái của cây đu đủ

Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricaceae

Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan

qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái)

Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên

phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái Vài cây đu đủ cũng có thể

trổ cả ba loại hoa nói trên Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực,

cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa Khuynh hướng

thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ như khô hạn và thay đổi nhiệt độ

4

1.1.2.1.2 Phân bố sinh thái của cây đu đủ [7, 26, 33]

Chi Carica L có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ Ở vùng núi cao

(1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất có thể là giống

lai tự nhiên của loài C peltata Hook & Ann Vào khoảng thế kỷ 16, người Tây Ban

Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribê và một số nước Đông Nam Á Từ các địa điểm này, cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và châu Phi

1.1.2.1.3 Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu

1 Nhựa đu đủ có thể gây viêm da

2 Ở Trung Mỹ, trong dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵ amip (Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến chứng áp- xe gan

3 Ở Samoa, người dân dùng phần dưới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng nhức răng

4 Nhựa đu đủ có chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp Chính do tác dụng này, khi dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt sẽ mềm hơn Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung

Mỹ cho biết họ có thể dùng khẩu phần với số lượng lớn thịt cá nhưng vẫn không hề

gì nếu ăn đu đủ xanh sau đó

5 Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm như kem nền (mặt), kem đánh răng, xà bông gội đầu

6 Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain

để dùng trong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa đệm) Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibiotic activity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dương (gram-positive bacteria) Nó còn được dùng để điều trị lở loét, làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hóa Trong công nghiệp, papain được dùng để

Trang 7

tinh chế bia; xử lý len và lụa trước khi nhuộm; là phụ gia trong công nghệ chế biến

cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm papain vào gan trước khi chiết

xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A và D hơn Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh

cỡ vừa cho được khoảng 650g papain

Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, không tan

trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine

Bền nhiệt

1.1.2.2.2 Tính chất hóa học [8, 34]

a) Cấu tạo hóa học

Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 acid

amin trong đó không có chứa methionine Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử

là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc

cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức

năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị

trí 25

b) Cấu trúc không gian

Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao

và mạch chính

bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe Phần xoắn  chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử

Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của papain

Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159 Khoảng

pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là 50 – 57OC

Trang 8

7

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain

Tâm hoạt động của papain gồm cĩ nhĩm –SH của cysteine 25 và nitrogen

bậc 3 của histidine 159 Bên cạnh đĩ nhĩm imidazole của His 159 cũng liên kết với

Asp 175 bởi liên kết hydrogen

Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid

là:

Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys

Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động

của papain gần giống như của ficin hay trypsin, mặc dù chúng cĩ nguồn gốc khác

Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nĩ đĩng

vai trị vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase

8

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

S

NH HN

R' N H

R

NH N

Cys25 C R O

OH

R Cys 25

Không màu

Có màu

Hình 1.4 Phản ứng hĩa học của papain

Trang 9

e Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain[8, 6, 38]

 Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao Ở dạng nhựa

khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC Còn ở dạng dung dịch papain bị

mất hoạt tính sau 30 phút ở 82.5oC và nếu nhiệt độ tăng cao hơn (>100oC) thì nó sẽ

bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch

Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 100oC thì cấu

trúc tâm hoạt động của papain bị phá hủy hoàn toàn

Điều đáng lưu ý là sau khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain

có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa, do trong nhựa còn chứa các protein

khác có tác dụng bảo vệ papain

Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng Trong dung

dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng Trong

khi đó hầu hết các enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự phân hủy hoặc oxy

hóa

Khi thủy phân các protein khác nhau, thì tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ

thích hợp cho papain cũng khác nhau chẳng hạn đối với cơ chất là casein thì nhiệt

độ tối ưu cho phản ứng là 37oC Papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu

nhiệt độ sấy ở 115oC trong thời gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%

 pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4.5-8.5 nhưng lại

dễ biến tính trong môi trường acid có pH < 4.5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh

có pH > 12

Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu

sẽ khác nhau Chẳng hạn, papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7-7.5

Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme được ổn

định, có thể chịu được các pH = 1.5 và pH = 8.5 trong 90 phút

 Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong dung môi là

methanol 70% và không thay đổi độ nhớt trong dung môi methanol 50% Trong

dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm

giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu hình của papain Các chất gây biến tính mạnh

như TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của papain

1.1.2.3 Ứng dụng của enzyme papain[7, 8, 25, 29, 46]

1.1.2.3.1 Trong y học:

Papain được dùng làm thuốc chống giun sán, ăn không tiêu, chống biếng ăn,… papain còn dùng làm thuốc rửa ráy tai, dùng trong phẫu thuật

Papain có tác dụng lên hệ mạch dùng trị bệnh bạch cầu, viêm họng…

1.1.2.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm:

Papain được dùng để làm mềm thịt, dùng để thủy phân gan cá ngừ làm thuốc

bổ Papain còn được dùng trong sản xuất bia vì nó giúp tiêu hóa các protein còn hòa tan trong bia

1.1.2.3.3 Trong các ngành công nghiệp khác:

Papain được dùng làm mềm da trong ngành công nghiệp thuộc da, dùng tẩy các vết máu trên quần áo Trong công nghiệp mỹ phẩm, papain được dùng để tẩy các vết nám, tàn nhang trên da

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG

Đậu phộng có hàm lượng lipid cao nên thường được dùng để ép dầu Đậu phộng sau khi ép lấy dầu được gọi là bánh dầu phộng

Theo tài liệu công bố, trung bình trong hạt đậu phộng có thành phần như bảng 1.2:

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng

Trang 10

11

Trong lipid của đậu phộng có hai loại acid béo no và không no với hàm

lượng tính theo phần trăm như bảng 1.3:

Bảng 1.3 Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng

Tên acid béo Không no (%) No (%)

Oleic 50 – 70 6 - 11

Linoleic 13 – 26 2 – 6

Linolenoic 13 – 26 5 – 7

Bánh đậu phộng đã tách dầu có thành phần theo bảng 1.4:

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo

Hàm lượng acid amin bao gồm các acid amin cơ bản theo bảng 1.5 :

Bảng 1.5 Thành phần acid amin trong đậu phộng

1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân [13, 14, 15]

Phản ứng thủy phân là phản ứng phân hủy các chất có sự tham gia của nước Phản ứng thủy phân là phản ứng quan trọng trong các ngành công nghiệp, đặc biệt

là trong công nghiệp thực phẩm Người ta ứng dụng phản ứng thủy phân trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất ra hàng loạt sản phẩm mới khác xa với tính chất của nguyên liệu ban đầu về tính cảm quan, về tính dinh dưỡng của sản phẩm Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp phản ứng thủy phân có hại cho các sản phẩm thực phẩm trong quá trình bảo quản

Phương trình tổng quát của phản ứng thủy phân

Trang 11

1.3.2 Quy trình thực hiện phản ứng thủy phân

ee

Hình 1.8 Sơ đồ phản ứng thủy phân

Quá trình chuyển từ protein bánh đậu phộng thành acid amin là một quá trình

khá phức tạp Dưới điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân, enzyme sẽ tham

gia phản ứng theo sơ đồ sau:

E + S -> ES > S + P

Người ta cho rằng ban đầu enzyme sẽ liên kết với cơ chất (bánh dầu đậu

phộng), sau đó mới diễn ra sự thủy giải và tạo ra các sản phẩm là các acid amin và

các đoạn peptid ngắn

Ở đây E là enzyme papain và S là protein đậu phộng, ES là phức hợp trung gian giữa enzyme và cơ chất, P là sản phẩm (chủ yếu là các acid amin và các peptid cấp thấp)

Sự tạo thành và chuyển biến của hợp chất trung gian ES xảy ra qua 3 bước: Bước 1: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức enzyme – protein (ES) Bước 2: Có sự thay đổi mật độ điện tử và sự biến dạng hình học của các mối liên kết đồng hóa trị trong phân tử cơ chất S cũng như trung tâm hoạt động của E Bước 3: Giai đoạn tạo thành acid amin hay peptid cấp thấp và giải phóng enzyme

1.3.3 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân:

Những nghiên cứu về sự liên kết enzyme và cơ chất đề ra giả thuyết: phần lớn các enzyme trở nên hấp thụ với bề mặt ngoài của protein đậu phộng theo một tiến trình tương đối nhanh, sau đó sự khuếch tán những phân tử enzyme vào trong những thành phần này xảy ra chậm hơn Sự thủy phân những nối peptid của protein đậu phộng có thể chia làm hai pha:

Pha nhanh (pha động): xảy ra ở giai đoạn đầu Trong suốt pha này, một số lớp peptid bị phá hủy trong một đơn vị thời gian và một phần chất hòa tan được phóng thích vào trong dung dịch

Pha chậm (pha tĩnh): tốc độ thủy phân càng về sau càng giảm, tiến trình hầu như ít có sự thay đổi cho đến khi phản ứng thủy phân kết thúc

1.3.4 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân [16]

Tính chất quan trọng nhất của sản phẩm là tính dinh dưỡng Chiều dài chuỗi peptid của sản phẩm thủy phân có tầm quan trọng đặc biệt Khả năng hòa tan, khả năng nhũ tương, vị đắng …đều phụ thuộc ít nhiều vào kích thước và trọng lượng phân tử của các loại proteint có trong sản phẩm Tất cả các sản phẩm thủy phân đều

có vị đắng ở những mức độ khác nhau làm hạn chế rất nhiều tính cảm quan của sản phẩm Vị đắng là nhược điểm chung của các sản phẩm thủy phân với xúc tác enzyme và được cho là có liên quan đến những peptid có trọng lượng phân tử thấp (khoảng 6,000 Da) Ta không thể khử được vị đắng nhưng có thể giảm bớt được

Trang 12

15

bằng cách kiểm soát mức độ thủy phân để cho những peptid có phân tử lượng lớn

chiếm ưu thế

Việc sử dụng enzyme làm xúc tác có nhược điểm là thủy phân không triệt để,

sau thủy phân còn khoảng 20% nitơ tổng số vẫn không tan, do đó người ta thường

phối hợp thủy phân bằng hóa chất để nâng cao hiệu suất thủy phân

1.3.5 Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng thủy phân:

1.3.5.1 Ƣu điểm:

Do enzyme hydrolase có tính đặc hiệu cao nên ít hoặc hầu như không tạo

thành sản phẩm phụ Dịch thủy phân thu được có độ thuần khiết cao

Sử dụng enzyme xúc tác phản ứng có thể định hướng được phản ứng xảy ra

và sản phẩm tạo thành

Có thể điều chỉnh được phản ứng nhằm tạo ra sản phẩm mong muốn

Hiệu suất thủy phân của enzyme khá cao, chỉ cần một lượng nhỏ enzyme

cũng có thể thủy phân được một lượng rất lớn cơ chất

Trong phản ứng xúc tác bởi enzyme thì yêu cầu về độ thuần khiết của cơ

chất không cao

Không như một số phản ứng hóa học khác, phản ứng thủy phân với xúc tác

enzyme xảy ra ở những điều kiện ít khắc nghiệt hơn

Phản ứng thủy phân bằng enzyme có biệt tính chọn lọc lập thể cao

1.3.5.2 Nhƣợc điểm:

Thời gian thủy phân với xúc tác enzyme thường kéo dài hơn so với thủy

phân với xúc tác acid

Dịch sau thủy phân thường khó lọc

1.4 ỨNG DỤNG ENZYME PAPAIN LÀM XÚC TÁC CHO PHẢN ỨNG

THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG

Trong luận văn này, chúng tôi điều chế enzyme papain để thủy phân protein

trong bánh dầu đậu phộng với các nội dung sau:

1 Thu nhận enzyme papain từ nhựa trái đu đủ

 Khảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain

16

 Định lượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh chế

 Khảo sát sự biến đổi lượng và hoạt tính enzyme papain theo thời gian

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain

2 Khảo sát phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng

 Xác định hàm lượng đạm formol và đạm amoniac theo thời gian phản ứng

 Khảo sát sự thay đổi hàm lượng xúc tác, pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng thủy phân

Trang 13

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

Dung dịch Na2HPO4 1/15M: cân chính xác 5.9690g Na2HPO4.12H2O hòa tan

trong nước cất và định mức cho đủ 250ml

Dung dịch KH2PO4 1/15M: cân chính xác 0.9072g KH2PO4 hòa tan trong

nước cất và định mức lại cho đủ 100ml

Dung dịch đệm Sorosen 1/15M, pH 7.6: trộn chung 177ml dung dịch

Na2HPO4 1/15M và 23ml dung dịch KH2PO4 1/15M

Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong dung dịch đệm

Sorensen cho đến khi tan hoàn toàn rồi định mức lại cho đủ 100ml

Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5g TCA trong nước cho đủ 100ml

Dung dịch NaOH 0.5N: hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml

Dung dịch HCl 0.2N: trộn 4.25ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250ml

Dung dịch Tyrosin 20 mM/l: khuấy nghiền 1.8119 Tyrosin trong dung dịch

HCl 0.2N vừa đủ 500ml

Dung dịch Tyrosin chuẩn 1mM/l trong dung dịch HCl 0.2N: pha loãng 5ml

dung dịch Tyrosin 20mM/l trong dung dịch HCl 0.2N thành 100ml

Nhựa đu đủ lấy mẫu tại thị trấn Xuyên Mộc - tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu

Bánh dầu đậu phộng lấy mẫu tại chợ Lái Thiêu

2.1.2 Thiết bị

Máy quang phổ UV Aglient 8453

Máy đông khô chân không Christ, Alpha 1- 2 Ldplus Cùng các thiết bị khác của phòng thí nghiệm : máy ly tâm, máy khuấy từ gia nhiệt

2.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 2.2.1 Phương pháp trích nhựa đu đủ từ trái [3, 8, 11, 16, 10, 20]

Quả: lấy ở những quả đang còn xanh, vỏ quả mịn, có trọng lượng từ 0.3-1 kg

là tốt nhất Quả non quá cho ít nhựa, quả quá già hoặc quả to vừa cho nhựa ít, vừa không sánh sệt, hoạt tính enzyme không cao Quả có vỏ sần sùi, chia thùy cũng cho

ít nhựa Để thu enzyme có hoạt tính cao nhất, nên lấy nhựa ở quả đang độ 10 tuần tuổi

Thời gian lấy nhựa: sáng sớm, kết thúc vào giữa buổi sáng (giai đoạn có độ

ẩm không khí cao) Khi độ ẩm không khí thấp, dòng nhựa chảy chậm và đặc rất khó thu nhận

Mùa khô: nhựa ít, đặc, nồng độ protein cao Mùa mưa: nhựa nhiều, loãng, nồng độ protein thấp Tiến hành

Nhựa đu đủ lấy ở quả xanh còn ở trên cây Dùng dao inox có đầu nhọn rạch vài đường dọc theo quả ở chỗ đường kính quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm (không rạch sâu quá 2cm, nếu không dịch nước và tinh bột từ quả sẽ trộn lẫn vào nhựa và làm giảm chất lượng nhựa thu được)

Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 – 6 phút, sau khi lấy nhựa xong đậy nắp kín và bảo quản lạnh, giữ trong tối nhằm tránh không cho nhựa tiếp xúc lâu với không khí và để bảo đảm hoạt tính của papain có trong nhựa

Trang 14

19

Khi lấy nhựa cần lau sạch trái nhằm tránh không cho chất bẩn hoặc côn trùng

lẫn vào

Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì nó làm giảm chất lượng nhựa

Hình 2.1 Cách lấy nhựa đu đủ

Quả có thể được rút nhựa trong suốt khoảng thời gian từ 4 – 7 ngày Lần đầu

tiên có thể chỉ cần một rạch là đủ, ở những lần thu nhựa sau, rạch 2 – 3 đường giữa

những đường rạch trước đó

Khi tiến hành các thao tác với nhựa tươi, tránh không cho nhựa tiếp xúc vào

da vì dễ gây bỏng Đồng thời cũng không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm

từ kim loại nặng như sắt, đồng, …để tránh làm biến màu và giảm hoạt tính enzyme

Lọ, dao, muỗng,… phải được làm bằng nhựa hoặc thép không rỉ

Nhựa tươi không bền vì thế nên đông khô chân không ngay sau khi thu nhận,

nhựa đông khô được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu

2.2.2 Phương pháp thu nhận papain tinh khiết [8, 18, 23, 28, 40, 42, 44]

Trong thành phần của nhựa đu đủ tươi ngoài enzyme papain, chymopapain

còn có một số loại enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo,… và các tạp

chất khác Để có được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả

thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ, mục đích là để loại bỏ các chất cặn, nhựa,

tạp lớn

20

Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kỹ trong cối ở nhiệt độ phòng với 200-300ml dung dịch cysteine 0.04M (hòa tan 6.3g cysteine hydrochloride trong 1000ml dung dịch NaOH 0.054M, kiềm được sử dụng

để đưa pH dịch chiết tới 5.7) Khi dịch nhựa tạo thành thể huyền phù, gạn bỏ lớp nổi ở trên Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300ml dung dịch cysteine Sau

đó rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích lên 1000ml Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1 Thời gian lọc phụ thuộc vào nhựa khô được sử dụng và quá trình này có thể rất chậm Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5.7 Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzyme được tiến hành trong điều kiện lạnh.[25, 27, 28]

2.2.2.1 Loại bỏ các chất không tan ở pH 9

Dịch chiết thu được ở trên được điều chỉnh lên pH 9 bằng cách thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M Tủa xám tạo thành có thể được loại ra bằng lọc hoặc ly tâm ở 4000rpm trong 30 phút Dịch trích ở giai đoạn này phải trong do các tủa gây biến tính protein đã được loại bỏ

2.2.2.2 Quá trình phân đoạn bằng amonium sulfate

Cho amonium sulfate vào dịch enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly tâm ở 4000rpm Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giữ lại để lấy chymopapain Tủa được rửa một lần với 400-500ml dung dịch amonium sulfate 40% độ bão hòa

2.2.2.3 Quá trình phân đoạn bằng NaCl

Hòa tan tủa trong 600ml dung dịch cysteine 0.02M (pH 7-7.5), tủa papain tạo thành khi thêm từ từ 60g NaCl rắn Sau một giờ, ly tâm ở 4000rpm trong 40 phút để thu tủa, bỏ dịch lỏng

2.2.2.4 Kết tinh

Tủa được tạo thành dịch huyền phù với 400ml dung dịch cysteine 0.002M ở

pH 6.5 và điều kiện nhiệt độ phòng pH của dung dịch huyền phù được điều chỉnh lại đến 6.5 sau khi cho protein vào Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, sau đó duy trì ở 4oC qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 4000rpm trong 1 giờ

để thu nhận tinh thể

Trang 15

2.2.2.5 Tái kết tinh

Hòa tan tinh thể thu được ở giai đoạn kết tinh trong nước cất (tạo dung dịch

có nồng độ protein khoảng 1%) ở nhiệt độ phòng Sau đó cho vào từ từ (đồng thời

khuấy đều) dung dịch NaCl bão hòa (10ml/300ml dung dịch protein) Khi 75% thể

tích dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng Dịch

huyền phù được giữ ở 4oC qua đêm, sau đó ly tâm thu tủa Hoạt độ riêng của

enzyme có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên

2.2.2.6 Đông khô chân không

Tủa protein thu được đem đông khô chân không để loại bỏ nước Protein sau

khi đông khô chân không được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu

tiếp theo

Qui trình thu nhận papain tinh khiết có thể được tóm tắt lại theo sơ đồ

2.2

Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận papain từ nhựa đu đủ đông khô

2.2.3 Xác định lượng protein theo phương pháp Lowry [1, 4, 12, 36]

Nguyên tắc

Hầu hết các protein đều có chứa tyrosin và tryptophan Hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein Vì vậy, những protein cùng loại với nhau có hàm lượng các acid amin này giống nhau

Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng tyrosin và tryptophan (cũng

là hàm lượng protein) Vì thế ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein

Hóa chất

Dung dịch A: cân 2g Na2CO3 hòa tan trong NaOH N/10 thành 100ml Dung dịch B: cân 0.5g CuSO4.5H2O hòa tan trong Citrat Natri 1% tạo thành 100ml

Dung dịch C (chỉ pha để dùng trong ngày): là hỗn hợp của hai dung dịch A

và B được pha theo tỷ lệ 49:1

Dung dịch Albumin 0.1%: cân chính xác đến 4 chữ số khoảng 0.1g albumin pha với nước cất thành 100ml

Dựng đường chuẩn

Ta thực hiện đường chuẩn với một loại protein tinh khiết có sẵn, thường là albumin của bò đã đông khô Tiến hành pha albumin có nồng độ khác nhau vào các ống nghiệm được đánh số từ 0 đến 5 như bảng bên dưới

Nồng độ protein mg/ml 0 50 100 150 200 250 Dung dịch albumin 0.1% (ml) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Nước cất (ml) 10 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 Hút 0.4ml dung dịch protein có nồng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa pha ở trên theo thứ tự từ 1 đến 6 vào 6 ống nghiệm sạch khác Thêm vào đó 2ml dung dịch C Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau đó thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml Đem

Trang 16

23

đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 750nm Sau đó vẽ đường chuẩn biểu diễn sự

biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ albumin chuẩn (mg/ml)

Xác định hàm lượng protein có trong mẫu:

Hút 0.4ml dung dịch protein cần xác định hàm lượng cho vào một ống

nghiệm sạch và đã được sấy khô Thêm vào đó 2ml dung dịch C Lắc đều và để yên

ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau đó, thêm vào 0.2ml thuốc thử Folin, lắc đều

trong 5 – 10 phút, thêm nước cất vào cho đủ 5ml Đem đo mật độ quang (OD) ở

bước sóng 750nm Dựa vào đường chuẩn để ngoại suy ra hàm lượng protein có

trong mẫu nghiên cứu

2.2.4 Xác định hoạt tính protein theo phương pháp Anson [1, 4]

Nguyên tắc

Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo

thành sản phẩm là các đoạn peptid ngắn hòa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác

định tyrosin và tryptophan hòa tan bởi thuốc thử Folin

Dựng đường chuẩn Tyrosin

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm

Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 1 2 3 4 5 6

Lượng Tyrosin tương ứng (M) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Dung dịch HCl 0.2N (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Dung dịch NaOH 0.5N (ml) 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0

Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 720nm

Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TT) Vẽ

đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và độ hấp thu quang ở

bước sóng 720nm

Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và OD

Xác định lượng Tyrosin trong dung dịch nghiên cứu

Cân chính xác 0.1g mẫu protein hòa tan trong 100ml nước cất, tạo thành

dung dịch protein có nồng độ 0.001g/ml

24

Thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch NaOH 0.5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút, đo OD ở bước sóng 660nm hoặc 720nm Dựa vào đồ thị chuẩn

để suy ra được M Tyrosin

2.2.5 Xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl [1, 4]

2.2.5.1 Nguyên tắc:

Chất đạm khi đem vô cơ hóa sẽ chuyển thành dạng ammonium sulfat, khi cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac theo phương trình như sau:

(NH4)2SO4 + NaOH -> 2NH3 + H2O + Na2SO4

Lượng amoniac phóng thích ra sẽ được hơi nước lôi cuốn bằng một dụng cụ

là máy Parnas – Wargner và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thừa H2SO4 Từ đây, cho phép chúng ta xác định được lượng amoniac phóng thích

ra, có nghĩa là xác định hàm lượng đạm trong mẫu nguyên liệu

2NH3 + H2O + H2SO4 -> (NH4)2SO4 + H2O

2.2.5.2 Cách tính:

N = 1.4*V (mg/ml) Trong đó:

Trang 17

N: Số gam đạm tổng số có trong 1 lít nguyên liệu loãng hay 1kg nguyên liệu

Trong phân tử acid amin, peptid, protein có một đầu chức là nhóm –COOH

như là một acid còn đầu kia là nhóm –NH2 được xem như là một base, còn các amin

tự do cũng như amoniac khi hòa tan thường ở dưới dạng amonium NH4 kết hợp với

một anion thường là clorur, sulfat, phosphat…

Như vậy khi ta cho tác dụng các phân tử “phi protein” này với formol,

formol sẽ tác dụng lên nhóm -NH2 để tạo thành phức chất methylen (mono, tri hoặc

hexamethylen)

HOOC C

R

NH2H

R N H

CH2+ H2O

Sản phẩm của phản ứng là hợp chất methylen và một chức –COOH tự do

(trong trường hợp acid amin) hoặc HCl (trong trường hợp amin tự do hoặc

amoniac) Nên ta có thể định phân bằng NaOH, từ đây cho phép ta xác định một

cách gián tiếp được lượng –NH2

Khi hàm lượng đạm formol không tăng theo thời gian có nghĩa là phản ứng

thủy phân đã kết thúc

2.2.6.2 Tiến hành

Trung hòa formol ½: lấy 50ml formol ½, thêm vào đó vài giọt

phenolphtalein 3%, cho NaOH N/10 từng giọt cho đến khi dung dịch chuyển màu

hồng nhạt, ta được formol ½ đã trung hòa

Hút 10ml dung dịch nguyên liệu đã pha loãng từ 5 đến 20 lần (trong đề tài này chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu 10 lần) thêm vào đó 10ml dung dịch formol

½ đã trung hòa và vài giọt phenolphtalein 3%, lắc đều để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó định phân bằng NaOH x N/10 cho đến khi dung dịch chuyển màu hồng

Thực hiện ba sự thử thật và ba sự thử không (thay dung dịch đạm bằng nước cất) lấy trị số trung bình

vì thế nếu đứng về khía cạnh dinh dưỡng thì loại đạm này không cần cho cơ thể, nếu có sự hiện diện của nó với hàm lượng cao thì nguyên liệu được đánh giá là “mất phẩm chất’

Những loại đạm này thường có tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng với MgO thì những loại đạm này sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, nên chúng sẽ được lôi cuốn theo hơi nước qua một bình đựng lượng thừa acid Sau đó đem định phân lượng acid dư, cho phép chúng ta xác định được loại đạm này

2(NH4)+ + Mg(OH)2 -> 2NH3 + 2H2O + Mg2+

2NH3 + H2SO4 > (NH4)2SO4

Trang 18

27

2.2.7.2 Tiến hành

Lấy 50ml dung dịch nguyên liệu đã pha loãng 20 lần (hoặc cân chính xác

một lượng m gam nguyên liệu đã nghiền nhuyễn cho đồng nhất) cho vào trong bình

cầu 500ml, thêm vào đó 150ml nước cất và vài giọt phenolphtalein, tiếp tục thêm

vào bình cầu 5g MgO, dung dịch phải có màu hồng nhạt, đậy nút ngay để tránh

amoniac bay ra, lắc đều, đun sôi và hơi nước được chưng cất sang một bình tam

giác có chứa sẵn 10ml H2SO4 N/10 và vài giọt thuốc thử Tashiro, đầu nhọn của ống

sinh hàn nhúng chìm trong dung dịch H2SO4 N/10 Chưng cất trong 15-20 phút kể

từ khi dung dịch trong bình cầu sôi Sau 15-20 phút chất đạm amoniac sẽ được hấp

thụ vào dung dịch H2SO4 Lấy bình tam giác ra (rửa đầu ống sinh hàn trước khi lấy

ra)

Định phân lượng acid dư bằng NaOH có chuẩn độ là x N/10 từ màu xanh tím

sang màu xanh xám, nếu dư NaOH thì chuyển thành màu xanh ve chai Thực hiện

ba lần thử thật và ba lần thử không

2.2.7.3 Cách tính

Số gam đạm NH3 có trong 1 lít nguyên liệu = (1.4*V)/2.5

được hấp thụ trong H2SO4

2.2.8 Phương pháp chung tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng

với xúc tác papain thô [15, 27]

2.2.8.1 Phương pháp loại béo:

Sử dụng dung môi eter dầu hỏa: cho dung môi vào bánh dầu đậu phộng đã

xay nhuyễn với tỷ lệ khối lượng dung môi trên cơ chất là 3:2 Khuấy đều trong 3

giờ ở 70oC, sau đó lọc bỏ dung môi (tiến hành 3 lần) Sau đó cho nước vào với tỷ lệ

trên sản phẩm là 2:1, khuấy đều, đem lọc Thực hiện sự rửa này 7 lần Sản phẩm thu

được đem sấy khô ta được bánh dầu đậu phộng đã loại béo

2.2.8.2 Phương pháp thực hiện phản ứng [5, 30, 31, 37]

Phản ứng thủy phân được thực hiện tại tỉ lệ của bánh dầu đậu phộng với

dung dịch đệm phosphate là 1:10 Cân 5g bánh dầu đậu phộng đã loại béo cho vào

28

erlen 100ml, thêm vào 50ml dung dịch đệm phosphate 0.1M Bánh dầu đậu phộng được trộn với dung dịch đệm phosphate để đạt được pH mong muốn, hỗn hợp sau

đó được gia nhiệt và khuấy từ liên tục Khi phản ứng đạt đến nhiệt độ cần khảo sát, cho enzyme vào với tỉ lệ thích hợp, phản ứng được tiến hành trong 26 giờ Sau mỗi

2 giờ phản ứng, lấy 0.1 gam dịch thủy phân từ erlen trên, thêm nước sôi để ngừng phản ứng, định mức thành 100ml dung dịch, đem lọc Hút 10ml dịch lọc đem xác định hàm lượng đạm formol theo phương pháp Sorensen, phần dung dịch còn lại trong bình định mức dùng để xác định lượng protein theo phương pháp Lowry

2.2.8.3 Hiệu suất thủy phân [39]

Papain có tính chất của endopeptidase thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng chủ yếu thành peptide theo phản ứng sau:

R1 N C H

H

R 3

C

O N

H C

Hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân H(%) được tính theo công thức như sau:

H: hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân (%)

Trang 19

G: hàm lượng acid amin tan của dung dịch sau thủy phân xác định theo

phương pháp Lowry

P: hàm lượng protein ban đầu trong bánh dầu đậu phộng xác định theo

phương pháp Kjeldahl

3.1 KHẢO SÁT LƯỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát lượng nhựa ở ba loại quả (quả non, quả già xanh, quả gần chín) ở trên cùng một loài và cùng một phương pháp làm khô Kết quả được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau

quả (g)

Khối lượng nhựa lấy (g)

Tỉ lệ nhựa thô trên quả (%) Quả non (dưới 40 ngày tuổi) 120 0.2576 0.21 Quả già xanh (50-100 ngày tuổi) 580 1.5153 0.26 Quả gần chín (100-120 ngày tuổi) 1700 3.0292 0.18 Nhận xét: lượng papain thô thu được ở quả già xanh cao hơn so với quả non

và quả gần chín đồng thời chiếm hàm lượng khá cao Qua kết quả này, chúng tôi nhận thấy thời gian thích hợp để thu nhận nhựa thô là khi quả đu đủ được 50 – 100 ngày tuổi

3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƯƠI

Nhựa tươi được làm khô ngay, ở nhiệt độ nhỏ hơn 50oC bằng các phương pháp khác nhau Kết quả được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ

Phương pháp làm khô Hình thức cảm quan

Sấy nóng, có quạt gió 24 giờ Vón cục, vàng nhạt Đông khô chân không 8 giờ Vẩy mỏng, óng ánh và trắng sáng Nhận xét:

Chất lượng papain thô thu được từ các phương pháp xử lý khác nhau rất khác nhau Hình thức cảm quan phản ánh rõ chất lượng của sản phẩm: màu càng thẫm chất lượng càng kém

Trang 20

31

Tuy có nhiều phương pháp khác nhau để làm khô nhựa tươi nhưng phương

pháp đông khô chân không là phương pháp hiệu quả nhất và ít ảnh hưởng đến chất

lượng nhựa Do đó, toàn bộ nhựa tươi được đông khô chân không để loại nước và

nhựa sau đông khô được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu tiếp

theo

Từ 100ml dung dịch nhựa tươi, chúng tôi tiến hành đông khô trong 8 giờ và

thu được 5 gam chế phẩm đông khô

3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHÔ

Nhựa tươi sau khi đã đông khô chân không, chúng tôi tiến hành sơ chế bằng

dung môi hữu cơ được làm lạnh để loại bỏ các tạp chất Sản phẩm sau quá trình sơ

chế được chạy điện di để phân tích sơ bộ thành phần protein Kết quả chạy điện di

của sản phẩm sau giai đoạn sơ chế được trình bày trong hình 3.1a:

Hình 3.1a Điện di đồ của nhựa khô ở trái non sơ chế bằng dung

môi etanol

32

1 – thang protein chuẩn

2 – nhựa đu đủ non đông khô sơ chế bằng etanol Nhận xét: quá trình sơ chế bằng dung môi còn lẫn khá nhiều protein tạp, do

đó chúng tôi tiến hành qui trình tinh chế với các phân đoạn khác nhau để tinh sạch protein Đồng thời, chúng ta cũng dễ dàng nhận thấy rằng trong vạch điện di của nhựa đu đủ non không có xuất hiện enzyme papain do đó chúng tôi tiến hành lấy nhựa trên trái trưởng thành để thu nhận papain Điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trước đây về enzyme trong nhựa đu đủ: enzyme papain chỉ hình thành trong giai đoạn trưởng thành của trái

Tinh chế:

Tiến hành tinh chế papain từ nhựa đông khô theo phương pháp đã trình bày trong phần thực nghiệm, từ 90 gam nhựa khô ban đầu chúng tôi thu được 1g papain Kết quả điện di được trình bày trong hình 3.1b:

Hình 3.1 b Điện di đồ của chế phẩm Merk và papain tinh chế từ nhựa đu đủ đông khô

1- Thang protein chuẩn 2- Chế phẩm Merck

3 - papain

Trang 21

3.4 PHƯƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN

Kết quả đo mật độ quang ∆OD ở bước sóng 750nm của các ống nghiệm có

nồng độ albumin từ 50 – 250mg/ml được trình bày trong bảng 3.3 (phụ lục 1)

Bảng 3.3 Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm

Từ kết quả trên, vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ∆OD

(AU) theo nồng độ protein chuẩn (mg/ml) theo hình 3.2 với phương trình đường

chuẩn là y = 0.0007x – 0.0004

Hình 3.2 Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang

vào nồng độ albumin

Cách tính

Từ phương trình đường chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa

mẫu protein Từ đó suy ra nồng độ của protein trong nguyên liệu là x (mg/ml)

Hàm lượng protein M (có trong 1g nguyên liệu được tính theo công thức):

m n x

M 0.001* (mg/g) với x: là nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng (mg/ml) n: hệ số pha loãng

m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích (g) 3.5 PHƯƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE

Kết quả đo mật độ quang ∆OD ở bước sóng 720nm của các ống nghiệm có lượng tyrosin tương ứng từ 0.2 – 1.0M được trình bày trong bảng 3.4 (phụ lục 2)

Bảng 3.4 Mật độ quang của tyrosin ở bước sóng 720nm

Lượng tyrosin tương ứng (M) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Độ hấp thu quang OD(AU) 0.1059 0.1812 0.3138 0.3464 0.4688 Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TT) Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và biến thiên độ hấp thu quang ở bước sóng 720nm như hình 3.3 với phương trình đường chuẩn là y = 0.4454x + 0.016

Đường chuẩn Anson

y = 0.4454x + 0.016

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5

Trang 22

35

Cách tính

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong

điều kiện chuẩn (35.5oC, pH 7.6 …) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản

phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở

bước sóng 660nm tương ứng với 1M Tyrosin trong đường chuẩn

Hñ P = Tyrosin*V*L

t*m*v (UI)

với

Hđ P: hoạt tính protein (UI)

V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml)

v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)

t: thời gian thủy phân (phút)

m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g)

L: độ pha loãng mẫu enzyme

M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn

3.6 KHẢO SÁT LƢỢNG ENZYME THU ĐƢỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN

TINH CHẾ

Trong quá trình tinh chế enzyme chúng tôi tiến hành khảo sát lượng protein

thu được sau mỗi phân đoạn bằng cách lấy ra 0,1g dung dịch enzyme, sau đó định

mức thành100ml bằng nước cất để xác định hàm lượng protein theo phương pháp

Lowry Kết quả được trình bày trong bảng 3.5 với cách tính như sau:

Thế giá trị mật độ quang ∆OD ở mỗi phân đoạn vào phương trình đường

chuẩn xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry là y = 0.0007x –

0.0004 ta suy ra được nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng là x Sau đó, áp

dụng công thức

m n x

để tính lượng protein trong nguyên liệu là M (mg/g)

Bảng 3.5 Lƣợng protein thu đƣợc ở các phân đoạn tinh chế khác nhau

pH 5.7 pH 9 (NH4)2SO4 NaCl Kết tinh Tái kết tinh

Các giai đoạn tinh chế

Phân đoạn tủa với ammonium sulfat 0.129 184.86 5

Trang 23

3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH

CHẾ

Trong quá trình tinh chế enzyme ngoài việc khảo sát lượng protein thu được

sau mỗi phân đoạn, chúng tôi cũng tiến hành đồng thời việc khảo sát hoạt tính

protein ở mỗi giai đoạn tinh chế với cách thực hiện như sau:

Cân 0.1g mẫu protein ở mỗi giai đoạn tinh chế định mức thành 100ml dung

dịch bằng nước cất Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch protein đã pha loãng

và các dung dịch khác như sau

Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới

Lấy 2 ống nghiệm mới, sạch đánh dấu A và B Cho vào ống A 5ml dịch lọc

từ ống nghiệm 1 và ống B 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 2

Thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch NaOH 0.5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc

mạnh, sau 10 phút, đo ∆OD1 và ∆OD2 ở bước sóng 720nm từ đó dựa vào đồ thị

chuẩn để suy ra được M Tyrosin

Hoạt tính protein được xác định theo phương pháp Anson Kết quả được

trình bày trong bảng 3.6 với cách tính như sau:

Thế giá trị y = (∆OD1 - ∆OD2) vào phương trình đường chuẩn xác định hoạt

tính theo Anson y = 0.4454x + 0.016 ta suy ra được x chính là lượng tyrosin Từ giá

trị của x ta tính được hoạt tính protease theo công thức:

Hñ P = Tyrosin*V*L

t*m*v (UI)

với

Hđ P: hoạt tính protein (UI) V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml)

v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)

t: thời gian thủy phân (phút) m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g) L: độ pha loãng mẫu enzyme

M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn

Bảng 3.6 Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế

Tỉ lệ hoạt tính sau mỗi giai đoạn tinh chế (%)

Phân đoạn tái kết tinh 0.097 0.062 36.78 55.34 15

Định dạng
Số trang	46
Dung lượng	2,96 MB