Khảo sát một số tính chất, chức năng công nghệ của exopolysaccharide thu nhận từ vi khuẩn lactobacillus plantarum w1, w12 phân lập từ whey sữa đậu nành

Khả năng sản xuất exopolysacharide EPS từ vi khuẩn lactic rất được quantâm bởi vì bên cạnh việc đóng vai trò quan trọng cho hoạt động sống của tế bào,EPS được sử dụng như các chất phụ gi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ

Khoa Cơ khí - Công nghệ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI:

Khảo sát một số tính chất, chức năng công nghệ của

exopolysaccharide thu nhận từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum

W1, W12 phân lập từ Whey sữa đậu nành

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hường Lớp: Công nghệ sau thu hoạch 46

Thời gian thực hiện: 28/12/2015 – 08/05/2015 Địa điểm thực hiện: PTN khoa Cơ khí – Công nghệ Đại học Nông Lâm Huế

Giáo viên hướng dẫn: Th.S Trần Bảo Khánh

Bộ môn: Công nghệ sau thu hoạch

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay cùng với sự tiến bộ của khoa học công nghệ, con người ngàycàng tiếp cận gần hơn và có nhiều hiểu biết hơn về thế giới vi sinh vật cũng nhưnhững ứng dụng của chúng trong nghành thực phẩm Đặc biệt là vi khuẩn lactic,đây là nhóm vi khuẩn rất phổ biến, ngoài khả năng sinh axit lactic cho quá trìnhlên men thì vi khuẩn lactic còn có tiềm năng probiotic, có khả năng sinh tổnghợp bacteriocin, các exopolysaccharide… Vì vậy ngoài các ứng dụng trong lênmen thực phẩm chúng còn có nhiều ứng dụng quan trọng trong sản xuất các chếphẩm sinh học, y học

Các polysaccharide được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn là các đại phân tử baogồm polysaccharide nội bào, polysaccharide tạo cấu trúc cho thành tế bào vàexopolysaccharide (polysaccharide ngoại bào)

Khả năng sản xuất exopolysacharide (EPS) từ vi khuẩn lactic rất được quantâm bởi vì bên cạnh việc đóng vai trò quan trọng cho hoạt động sống của tế bào,EPS được sử dụng như các chất phụ gia làm hoàn thiện cấu trúc của thực phẩm

Nó làm tăng thêm tính hấp dẫn cho các sản phẩm thực phẩm và hoàn thiện tínhlưu biến cũng như lợi ích sức khỏe cho con người mà chúng mang lại trong cácsản phẩm sữa lên men như kích thích miễn dịch, có khả năng ngăn ngừa việchình thành các khối u, exopolysacharide tăng cường sức khỏe cho con người,chống virus, chống ung thư, giảm huyết áp, chống lão hóa

Xuất phát từ những lý do trên, đồng thời để hiểu rỏ hơn về những lợi ích

mà EPS mang lại tôi quyết định thực hiện đề tài “Khảo sát mội số tính chất,

chức năng công nghệ của EPS thu nhận từ vi khuẩn lactobacillusplantarum

W1, W12 phân lập từ whey sữa đậu nành” làm đề tài nghiên cứu tốt nghiệp

đại học

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Khả năng hòa tan trong nước của EPS thu nhận từ chủng L plantarum

W1 40Bảng 3.2: Khả năng hòa tan trong nước của EPS thu nhận từ chủng L

plantarum W12 40Bảng 3.3 Khả năng giữ nước của L plantarum W1 43Bảng 3.4 Khả năng giữ nước của EPS thu nhận từ L plantarum W12 44Bảng 3.5 Khả năng giữ dầu của EPS thu nhận từ vi khuẩn L plantarum W1 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình1.1: Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp EPS từ vi khuẩn lactic 16

Hình 2.1 Sơ đồ hoạt hóa vi khuẩn 27

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình nuôi cấy vi khuẩn 28

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tách chiết EPS 29

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình nuôi cấy, tách chiết và thu nhận EPS 31

Hình 3.1 Sơ đồ nuôi cấy, tách chiết, thu nhận EPS từ L plantarum 36

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng hòa tan trong nước của EPS sinh tổng hợp từ chủng L plantarum 39

Hình 3.3 Đồ thị so sánh khả năng hòa tan trong nước của EPS sinh tổng hợp từ hai chủng L plantarum W1 và L plantarum W12 41

Hình 3.4 Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng giữ nước của EPS sinh tổng hợp từ L plantarum 43

Hình 3.5 Đồ thị so sánh khả năng giữ nước của EPS sinh tổng hợp từ hai chủng L Plantarum W1 và L Plantarum W12 44

Hình 3.6 Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng giữ dầu của EPS sinh tổng hợp từ L plantarum 45 Hình 3.7 Đồ thị so sánh khả năng giữ dầu của EPS sinh tổng hợp từ hai chủng

MỤC LỤC

PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1

1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic 1

1.1.1 Định nghĩa 1

1.1.2 Phân loại 1

1.1.3 Vai trò, chức năng 2

1.1.4 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 2

1.1.5 Khả năng sinh các hợp chất có chức năng sinh học 4

1.1.5.1 Khả năng sinh Exopolysacharide 4

1.1.5.2 Khả năng sinh acid lactic 5

1.1.5.3 Sản xuất chế phẩm probiotic 5

1.1.5.4 Sản xuất bacteriocin 6

1.1.4 Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus plantarum 6

1.1.4.1 Đặc điểm về hình thái và sinh lý của Lactobacillus plantarum 6

1.1.4.2 Chức năng của Lactobacillus plantarum 7

1.2 Tổng quan về exopolysacharide 7

1.2.1 Định nghĩa 7

1.2.2 Phân loại 8

1.2.3 Tính chất 9

1.2.3.1 Tính lưu biến 9

1.2.3.2 Tính chất vật lý 10

1.2.4 Chức năng 10

1.2.5 Nguồn thu nhận 11

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp exopolysacharide 14

1.4.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường 14

1.4.1.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 14

1.4.1.2 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ 15

1.4.1.3 Ảnh hưởng của các vitamin và khoáng chất 16

1.4.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 17

1.4.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 17

1.4.2.2 Ảnh hưởng của pH 17

1.4.2.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 18

1.5 Tình hình nghiên cứu về EPS 19

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị 22

2.2.1 Hóa chất 22

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ sử dụng 22

2.3 Nội dung nghiên cứu 23

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Phương pháp vi sinh 23

2.4.1.1 Phương pháp hoạt hóa vi khuẩn, kiểm tra độ thuần chủng và thu nhận khuẩn lạc đơn 23

2.4.1.2 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn để thu nhận EPS 24

2.4.2 Phương pháp thu mẫu EPS 25

2.4.2 Phương pháp lý hóa 29

2.4.2.1 Phương pháp khảo sát khả năng hòa tan trong nước của EPS 29

2.4.2.2 Phương pháp khảo sát khả năng giữ nước 29

2.4.2.3 Phương pháp khảo sát khả năng giữ dầu của EPS 30

2.5 Phương pháp toán học 30

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả khảo sát khả năng hòa tan trong nước của EPS thu nhận từ các chủng L plantarum W1 và L plantarum W12 31

3.1.1 Kết quả khảo sát khả năng hòa tan trong nước của EPS sinh tổng hợp từ L plantarum W1 36

3.1.2 Kết quả khảo sát khả năng hòa tan trong nước của EPS sinh tổng hợp từ L plantarum W12 36

3.2 Khảo sát khả năng giữ nước của các chủng L plantarum W1 và P lantarum W12 38

3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng giữ nước của EPS thu nhận từ vi khuẩn L plantarum W1 39

3.2.2 Kết quả khảo sát khả năng giữ nước của EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn L plantarum W12 40

3.3 Khảo sát khả năng giữ dầu của các chủng L plantarum W1 và P lantarum W12 41

3.3.1 Kết quả khảo sát khả năng giữ dầu của EPS thu nhận từ vi khuẩn L plantarum W1 42

3.3.2 Kết quả khảo sát khả năng giữ dầu của EPS thu nhận từ vi khuẩn L plantarum W12 42

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1 Kết luận 45

4.2 Kiến nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic

Các chủng vi khuẩn thuộc nhóm này có đặc điểm sinh thái khác nhaunhưng đặc tính sinh lý tương đối giống nhau, đều là các vi khuẩn Gram dương,

không tạo thành bào tử (trừ Sporolactobacillus) và không di động Vi khuẩn

lactic thường có dạng hình cầu, hình oval và hình que Khác với các vi khuẩnđường ruột cũng sinh ra axit lactic, các vi khuẩn lactic là nhóm lên men bắtbuộc, không chứa các cytochrome và catalase Tuy nhiên, chúng có thể sinhtrưởng được khi có mặt oxy

Vi khuẩn lactic gồm các chi chính sau: Aerococcus, Carnobacterium,Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus,Pediococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissell Các chi thường được

sử dụng trong các quá trình công nghiệp là Lactococcus, Lactobacillus,Leuconostoc, Pediococcus, Oenocococcus và Streptocococcus.[7]

1.1.2 Phân loại [3],[1]

Có nhiều cách để phân loại vi khuẩn lactic

Nếu chỉ dựa vào đặc điểm kiểu hình (phenotype) có thể chia chúng thành

hai loại: trực khuẩn (bacilli) và cầu khuẩn (cocci).

Dựa vào cơ chế chuyển hóa gluxit người ta có thể chia vi khuẩn lacticthành hai nhóm: vi khuẩn lactic lên men đồng hình và lên men dị hình

Thuộc nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình có một số loài thuộc các chi

khác nhau như: L lactic, L plantarum, L axitophilus, L Bulgaricus, L casei,

L delbrueckii hoặc một số cầu khuẩn như: Streptococcus, S thermophilus, L.cremoris, Pedicoccus crevisiae Nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình, quá

trình phân giải glucose theo con đường EMP với đặc trưng tạo ra các axit lacticnhư là sản phẩm cuối cùng duy nhất

Còn các vi khuẩn lactic lên men dị hình chuyển hóa glucose theo conđường oxy hóa khử pentosephotphat Ngoài axit lactic còn rất nhiều sản phẩmphụ được tạo ra như các axit hữu cơ, ethanol, CO2, H2, một số chất thơm (este,

diaxetyl) Một số loài đại diện thường gặp ở nhóm này như: Ln mensenteroides,

Lc cremoris, Bifidobacterium, L brevis, L fermentum.

1.1.3 Vai trò, chức năng

Vi khuẩn lactic lên men cacbonhydrat tạo ra một lượng lớn axit lactic,chúng có thể lên men được các loại đường monosaccharide và disaccharide.Một số vi khuẩn lactic có khả năng tạo thành màng nhầy, một số khác cókhả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thốirữa thực phẩm Ngoài axit lactic thì vi khuẩn lactic còn sản sinh ra axit axetic,ethanol, bacteriocin, exopolysaccharide, hợp chất thơm và một số enzym quantrọng khác Các vi khuẩn lactic được tìm thấy trong thực phẩm (sản phẩm từsữa, thịt lên men, bột chua, rau lên men, đồ uống, thức ăn ủ rượu…), trong nướcthải, nhưng cũng có thể là trong đường sinh dục, đường ruột và hô hấp của conngười và động vật

Trong ngành công nghiệp thực phẩm, vi khuẩn lactic hoạt động như là sinhvật có lợi và đồng thời cũng là các sinh vật gây hư hỏng Chúng được sử dụngtrong sản xuất các sản phẩm sữa lên men như sữa chua, pho mát, bơ, cũng nhưtrong sản xuất xúc xích, dưa chua, ….Kết quả của những quá trình lên men là ổnđịnh chất lượng và tạo hương vị đặc trưng cho các sản phẩm Tuy nhiên, cầnphải kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn lactic nếu không chúng có thể là mộtnguyên nhân chính gây hư hỏng thực phẩm

Có 2 kiểu lên men lactic là lên men lactic đồng hình và lên men lactic dịhình Trong lên men lactic đồng hình thực tế chỉ xuất hiện sản phẩm chủ yếu làaxit lactic, còn trong lên men lactic dị hình các sản phẩm cuối cùng khá đa dạngnhư axid lactic, ethanol, axit axetic và CO2

1.1.4 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khácnhau Chúng có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản nhưcacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh ngoài ra còn có nhu cầu về một số chấtcần thiết khác như vitamin, muối vô cơ…

2

Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydratcacbon từ cácmonosaccaride như: glucoza, fructoza, manoza , các disaccarit như: saccaroza,lactoza, maltoza cho đến các polysaccarit như: tinh bột, dextrin Vi khuẩn lacticcũng có thể sử dụng được cả các polysaccharide (dextrin, tinh bột) cho mục đíchnăng lượng của chúng Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp nănglượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho các quá trình lên men đồngthời tạo ra các axit hữu cơ như axit lactic, malic, fumalic, pyruvic, axetic,ethanol và CO2

Một số vi khuẩn lactic lên men dị hình, phân lập từ thực phẩm, còn có thể

sử dụng được các axit gluconic và galactorunic làm nguồn dinh dưỡng cacbonnhờ sự xúc tác của các hệ enzyme tương ứng Quá trình cũng tạo ra axit lactic,axit axetic và CO2

Các vi khuẩn lactic khác nhau có nhu cầu đối với các nguồn thức ăn cacbonkhác nhau, điều này cũng có thể quyết định sự sinh trưởng của chúng Ví dụ,

Lactobacillus dalbrueckii phát triển tốt trên cơ chất có nguồn gốc thực vật, có

thể lên men các loạt đường maltoza, glucoza, galactoza và saccharoza nhưng

không sử dụng đường lactoza và rafinoza Trong khi Lactobcillus bungaricus lại

chỉ có thể sử dụng được lactoza mà không len men maltoza và saccharoza

Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Căn cứ vào nhu cầu dinh dưỡng nitơ người ta chia vi khuẩn lactic thành 3nhóm sau:

Các vi khuẩn cần hỗn hợp phức tạp các axit amin trong môi trường

Các vi khuẩn có thể phát triển tốt trên môi trường có chứa cystein và cácmuối amon

Các vi khuẩn có thể phát triển tốt trên môi trường chỉ chứa nguồn dinh

dưỡng nitơ duy nhất là muối amon ( giống Streptococus).

Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chấtchứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sửdụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Các nguồn ni tơ vi khuẩn lactic cóthể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa,pepton,…Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có

hiệu quả nhất.

Nhu cầu vitamin

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của

tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vikhuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần phải bổ sungvào môi trường các loại vitamin cần thiết Các chất chứa vitamin thường sửdụng như nước chiết từ khoai tây, cà rốt, ngô

Nhu cầu về các hợp chất hữu cơ khác

Ngoài các axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu

cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ Axit xitric, axitoleic có ảnh hưởng thuận lợi đến tóc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic Nênhiện nay người ta sử dụng các muối xitrat, dẫn xuất của axit oleic làm thànhphần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quả các chủng vi khuẩn lactic Ngoài

ra axit axetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào.Nên người ta thường sử dụng axit axetic dưới dạng các muối axetat để làm chấtđệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

Nhu cầu về các muối vô cơ khác

Vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ để đảm bảo cho sự sinh trưởng vàphát triển Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali,photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan Mangan giúp ngăn ngừa quátrình tự phân và ổn định cấu trúc của tế bào

1.1.5 Khả năng sinh các hợp chất có chức năng sinh học

1.1.5.1 Khả năng sinh Exopolysacharide[10]

Vi khuẩn lactic sản xuất EPS đóng một vai trò quan trọng trong ngành côngnghiệp thực phẩm Vi khuẩn có thể sản xuất ra polyme sinh học đa dạng vớinhững tính chất hóa học khác nhau thông qua việc sử dụng những hợp chất đơngiản đến phức tạp

Các EPS được sử dụng trong các hệ thống thực phẩm như các chất làm bền

hoặc các chất tạo cấu trúc Các chủng của nhiều loài vi khuẩn lactic như Str.

thermophilus, Lab rhamnosus, Lab helveticus, Lab casei và Lac lactic tạo ra

nhiều EPS khác nhau, chứa các đơn vị glucose, galactose, rhamnose, mannose

và các hydrat cacbon khác

Vi khuẩn lactic thường được công nhận là an toàn Do đó, EPS được bàitiết bởi vi khuẩn lactic có thể được coi là polymer sinh học an toàn và cung cấpmột nguồn polysaccharide vi sinh vật sử dụng trong thực phẩm hoặc các ngành

4

công nghiệp khác.

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng lượng EPS và đặc tính của nó phụ thuộcrất nhiều vào vi sinh vật và điều kiện, thành phần môi trường nuôi cấy Ngoài ra,exopolysacharide được thu nhận từ vi khuẩn lactic có trọng lượng phân tử tươngđối cao và đã được nghiên cứu rộng rãi

1.1.5.2 Khả năng sinh acid lactic

Acid lactic là một acid có vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm,nhuộm thuộc da, y dược

Este của acid lactic không tan trong nước được dùng trong sản xuất mực,chất dẻo, sơn, đáng chú ý là acid lactic được dùng nhiều trong công nghiệp thựcphẩm, thay thế một phần acid acetic và acid tactric để sản xuất bánh kẹo, nướcgiải khát và các loại đồ hộp như thịt cá

Nhờ khả năng sinh axit lactic của vi khuẩn lactic mà pH của môi trườngđược hạ xuống và sinh một số chất kháng khuẩn khác như H2O2, bacteriocinnên vi khuẩn lactic có thể ức chế các vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm

Nguyên liệu để sản xuất acid lactic là tinh bột, rỉ đường, glucoza, maltoza

1.1.5.3 Sản xuất chế phẩm probiotic [13]; [18]

Một vi sinh vật được coi có chức năng probiotic do có các đặc điểm như :không gây bệnh, có sức đề kháng cao để đi qua ruột và có lợi cho hệ thống miễndịch Nói chung, chúng được coi là có lợi cho cơ thể của vật chủ và sức khỏe

con người ví dụ như Lactobacillus fermentum đã được xác định là có tiềm năng

Tuy nhiên, không phải tất cả những vi sinh vật sống nào cũng là probiotic.Theo đánh giá của tổ chức FAO và WHO, tiêu chuẩn quan trọng nhất để chọnchủng vi khuẩn probiotic sử dụng dưới dạng thực phẩm là chủng vi khuẩn đóphải có khả năng sống sót qua hệ tiêu hóa và phải có khả năng phát triển trongđường ruột

Tiềm năng probiotic là những đặc tính có lợi của vi khuẩn lactic khi tồn tạitrong hệ tiêu hóa của con người hay động vật như kích thích tiêu hóa, giảmcholesterol trong máu, ngăn ngừa bệnh ung thư, tăng hệ miễn dịch ở người vàđộng vật Việc khảo sát những tiềm năng probiotic để tuyển chọn làm lợi khuẩnprobiotic có ý nghĩa lớn trong y học cũng như trong công nghệ thực phẩm.

1.1.5.4 Sản xuất bacteriocin[10]; [7]

Thuật ngữ bateriocin hiện nay được sử dụng để chỉ một nhóm các peptidhoạt động sinh học được tạo ra bởi nhiều chủng vi khuẩn từ các nhóm Gramdương và Gram âm

Bacteriocin được tạo ra bởi nhiều chủng vi khuẩn lactic có khả năng diệtkhuẩn đối với các vi khuẩn gây hư hỏng và gây bệnh khác nhau Một số loài bao

gồm Lactococcus, Str thermophilus, Lab acidophilus, Lab plantarum,

Ped.acidilactic, Ent faecalis, Tetragenococcus halophilus Ngày nay, dường

như các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin thường gặp trong môi trườngthực phẩm, nó được coi như các chất bảo quản sinh học an toàn và có tiềm năng

sử dụng để giết chết các vi khuẩn mẫn cảm gây hư hỏng thực phẩm rất nhanh

và có hoạt lực cao ở một nồng độ rất thấp

1.1.4 Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus plantarum.

Lab plantarum là một loài vi khuẩn trong chi rất lớn và tương đối đa dạng

của Lactobacillus, trong đó bao gồm khoảng 90 loài có tên hợp lệ ( Molin G,

“Lactobacillus plantarum 299v”, (09/2010) )

1.1.4.1 Đặc điểm về hình thái và sinh lý của Lactobacillus plantarum

Lab plantarum được tìm thấy trong hệ tiêu hóa, ngoài ra còn được phân

lập tìm thấy trong nước bọt của con người, trong các sản phẩm sữa lên men,nguyên liệu thực vật và thức ăn ủ chua Nó là một loại vi khuẩn gram dươngthuộc loại vi khuẩn lactic sử dụng nguồn cacbon để lên men (kỵ khí), khônghình thành bào tử Các tế bào nhỏ (0,5-1,2 x 1,0 - 10μm), thuôn dài giống hìnhm), thuôn dài giống hìnhque trực khuẩn lắp ráp trong cặp hay trong các chuỗi có chiều dài thay đổi Nó

có thể phát triển ở 15 – 450C, pH 3.2 và cao hơn [17]

Khả năng dị hóa arginine, và sinh ra nitric oxit là tính chất đặc trưng duy

nhất của Lab plantarum Lab plantarum không có khả năng phân giải amino

axit nào ngoại trừ tyrosine và arginine, và có đến 6 con đường khác nhau chuyểnhóa arginine, và đều sinh ra NO Việc sinh ra NO giúp ngăn chặn các vi sinh vật

gây bệnh như Candida abicans, E coli, Shigella, Helicobacter pylory, các

amip và kí sinh trùng [31]

Lab plantarum có thể tồn tại ở pH thấp của dạ dày và tá tràng, chống lại

các tác động của axit mật trong ruột non khi ăn, và tạm thời xâm nhập quađường tiêu hóa bằng cách gắn vào niêm mạc ruột và đại tràng Vì vậy, Lab

plantarum được sử dụng để thử nghiệm việc điều trị hội chứng ruột kích thích 1.1.4.2 Chức năng của Lactobacillus plantarum

Lab plantarum đã được xác định là một probiotic, nó có một tác động tích

cực đối với sức khỏe con người, đặc biệt là với những người có vấn đề về tiêu

hóa Lab plantarum là một probiotic và có nhiều lợi ích như có thể sự cải thiện

sự cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột, ổn định enzyme tiêu hóa và có tính miễndịch đồng thời nó có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn có hại Ngoài

ra, nó cũng đang được khai thác để sản xuất nhiên liệu sinh học và chế phẩmsinh học [17]

Lab plantarum ngăn chặn sự bám dính của E coli vào màng nhầy, làm

giảm nội độc tố do E coli tiết ra Lab plantarum có vai trò quan trọng trong

việc bảo vệ các chất chống vi sinh vật và chống lại một cách hiệu quả các vi sinhvật gây bệnh nội bào và ngoại bào [31]

Lab plantarum có khả năng giúp tiêu hóa các chất xơ có trong lúa mì, lúa

mạch đen, và trong men bia Do đó chúng cải thiện tốt những vấn đề tiêu hóanhư đầy hơi, chướng bụng [31]

Zhang và cộng sự (2013) đã nghiên cứu hoạt động chống oxy hóa của một

exopolysaccharide phân lập từ Lab plantarum C88 Kết quả chứng minh rằng EPS từ Lab plantarum C88 có chất chống oxy hóa hiệu ứng mà có thể liên quan

đến việc quét gốc tự do ở các phản ứng oxy hóa (ROS), tăng sự điều chỉnh củaenzyme và các hoạt động chống oxy hóa phi enzyme, và giảm peroxy lipid [30]

1.2 Tổng quan về exopolysacharide

1.2.1 Định nghĩa [8]; [10]; [20]

Polysaccharides là polymer carbohydrate phân tử gồm chuỗi dài củamonosaccharide đơn vị liên kết với nhau bằng mối liên kết glycoside và thủyphân cung cấp cho các thành phần monosaccharides hoạc oligosaccharideschúng có cấu trúc từ tuyến tính để phân nhánh cao, ví dụ như polysaccharidelưu trữ như tinh bột và glycogen, polysaccharide cấu trúc như cellulose vàchitin.[32]

Polysaccharide sinh học là thành phần quan trọng có trong các cơ thể sốngnhư thực vật, tảo biển, vi sinh vật Polysaccharide sinh học được hình thành từ

8

quá trình biến đổi sinh học như: quá trình hoạt động sống của vi sinh vật, quátrình sinh trưởng của thực vật, động vật.

Các hợp chất polysaccharide được vi sinh vật tổng hợp có thể phân loạitheo vị trí của chúng trong tế bào Một số được tìm thấy trong các tế bào, thành

tế bào chất, nơi chúng được sử dụng bởi các vi khuẩn như một nguồn nănglượng Một số khác là các peptidoglycan và axit teichoic Một nhóm nữa củapolysaccharide được bài tiết ra bên ngoài tế bào được gọi là EPS Thuật ngữ

"exopolysaccharide" hoặc "polysaccharide exocellular" đã được đề xuất bởiSutherland (1972) và Cerning (1994) cũng là tên dành để gọi nhómnày.EPS Các polysaccharide hoặc có thể được tiết ra trường xung quanh hoặcduy trì liên kết với bề mặt tế bào dưới dạng vỏ bao EPS

Vi sinh vật tổng hợp nhiều loại polysaccharide đa chức năng bao gồmpolysaccharide nội bào, polysaccharide cấu trúc ( lipopolysaccharide,peptidoglycan,…) và polysaccharide ngoại bào hay còn gọi làexopolysaccharide(EPS)

Một số vi khuẩn acid lactic (LAB) được biết để tổng hợp EPS EPS thườngtồn tại dưới hai dạng tùy thuộc vào vị trí của họ: exopolysaccharides cell-ràngbuộc (c-EPS) mà tuân thủ chặt chẽ với bề mặt của vi khuẩn, và phát hànhexopolysaccharides (r-EPS) mà phóng ra xung quanh

Các EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn có khối lượng phân tử cao, được vi sinhvật tổng hợp trong tế bào sau đó tiết ra môi trường xung quanh, có khi chỉ tổnghợp bên trong tế bào như levan và dextran nhờ tác động của enzyme

EPS bao gồm các monosaccharide và một số nhóm chức như: acetate,pyruvate, succinate và photphate EPS là polymer tích điện, có chức năng hấpthụ các phân tử tích điện khác liên quan đến các mối tương tác bề mặt tế bào

Số lượng, thành phần EPS sinh tổng hợp được có sự khác nhau giữa cácchủng vi sinh vật, thành phần môi trường và điều kiện sinh trưởng trong quátrình nuôi cấy

Sự khác nhau của EPS còn được thể hiện qua thành phần monomer, khốilượng phân tử và cấu trúc của chúng

1.2.2 Phân loại

EPS được chia thành hai nhóm chính là homopolysaccharide vàheteropolysaccharide Homopolysaccharide được sản xuất ở nồng độ cao hơnheteropolysaccharide (De Vuyst và Degeest, 1999) [27]

Homopolysaccharide có thể có cấu trúc khác nhau, được phân loại thànhbốn nhóm: α-D-glucans, β-D-glucans, fructans và polygalactane.Homopolysaccharide gồm có các cellulose, dextran, mutan, alternan, pullulan,levan, curdlan, riêng genllan và xanthan thuộc nhóm heteropolysaccharide [10]Heteropolysaccharide được cấu tạo từ nhiều loại đường khác nhau Cáchợp chất heteropolysaccharide được hình thành từ nhiều đơn vị lặp đi lặp lại vớikích thước từ disaccharide đến octasaccharide Bên cạnh đó, còn sự có mặt củacác nhóm khác trong phân tử heteropolysaccharide như nhóm phosphate, aminohoặc acetyl.[ 10]

Các chủng có khả năng tổng hợp heteropolysaccharide là Str.

thermophilus,Lac.lactic, Lab delbrueckii, và Lab Helveticus.[16]

Heteropolysaccharide được sử dụng làm phụ gia thực phẩm trong các sảnphẩm sữa [18]

1.2.3 Tính chất

1.2.3.1 Tính lưu biến

EPS có tính chất lưu biến đặc biệt như chất ổn định, chất tạo độ nhớt, tạogel hoặc chất nhũ hóa và rất có tiềm năng trong phụ gia thực phẩm Các tínhchất lưu biến của EPS được sản xuất bởi vi khuẩn lactic là do khối lượng phân

tử của chúng, khối lượng phân tử đa dạng, các gốc đường trong thành phần, cácliên kết giữa các đường monomer và sự hiện diện của các nhóm bên [14]

Trong đó khối lượng phân tử là một trong những đặc điểm quan trọngnhấtquyết định đến các tính chất lưu biến và các tương tác của chúng với các thànhphần thực phẩm khác Nếu khối lượng phân tử thấp hơn sẽ làm giảm độ nhớtcủa EPS trong dung dịch Mặt khác, polysaccharide ngắn hơn có thể tương táctốt hơn với các protein, làm tăng sự ổn định của các hỗn hợp protein -polysaccharide Như vậy, những đặc tính sẵn có của EPS như kích thước củachuỗi khác nhau sẽ cung cấp tính chất chức năng đa dạng do đó sẽ mở rộng ứngdụng của chúng trong thực phẩm

EPS có khả năng thay đổi nhanh chóng độ nhớt của hệ thống thực phẩm,chống lại các biến dạng của thực phẩm Độ nhớt gồm hai loại:

Nhớt bên trong: là một đặc tính rất quan trọng đối với polysacharide giúpchúng tách ra khỏi dung dịch Polysacharide có độ nhớt bên trong cao thì khốilượng phân tử lớn và có cấu trúc bền vững

Nhớt bên ngoài

10

Do đó các EPS sản xuất từ các chủng vi sinh vật khác nhau làm cho độnhớt của sản phẩm khác nhau.

Độ nhớt của dung dịch EPS phụ thuộc vào cấu trúc và khối lượng của nó

và bị ảnh hưởng nhiều bởi các yếu tố như nồng độ muối, cường độ ion, pH vànhiệt độ Độ nhớt phụ thuộc vào pH, ở pH trung tính độ nhớt có xu hướng giảmkhi pH giảm thì độ nhớt lại tăng lên Các tính chất lưu biến của EPS được pháthiện ở trong nước, sữa, muối cũng có sự khác nhau ở pH, thời gian và tốc độ cắtkhác nhau Những kết quả pH này rất quan trọng đối với các sản phẩm sữa lênmen, sản phẩm luôn cần tính axit EPS có đặc tính có lợi ở pH có tính axit

Độ đàn hồi: EPS giúp phục hồi lại trạng thái ban đầu của thực phẩm saukhi bị biến dạng

1.2.3.2 Tính chất vật lý

EPS tan trong nước có khả năng giữ nước tốt và liên kết với dầu Các tínhchất này là do cấu trúc của các chuỗi polymer trong EPS mà có thể giữ mộtlượng nước lớn thông qua liên kết hydro

Do khả năng giữ nước tốt nên EPS có tiềm năng được sử dụng trong cácsản phẩm lên men

1.2.4 Chức năng

Exopolysaccharides Capsular có thể bảo vệ vi khuẩn gây bệnh và góp phầnvào khả năng lây bệnh nhân tạo của chúng Phần đính kèm của vi khuẩn cố địnhnitơ ở rễ cây và các phần tử trong đất, có ý nghĩa quan trọng đối với vùng xungquanh trong đất của vùng rễ và lây nhiễm của thực vật, có thể được trung gianbởi EPS Một ví dụ cho việc sử dụng công nghiệp của EPS là ứng dụng dextrantrong bánh mì panettone và các ngành công nghiệp bánh.EPS cũng có một vaitrò quan trọng trong các bệnh nhiễm trùng nội nha

Chức năng sinh lý của EPS: EPS đã được tìm thấy được liên kết với nhiềuchức năng trong tế bào vi khuẩn EPS của vi sinh vật được cho là đóng một vaitrò trong việc bảo vệ các tế bào vi khuẩn trong họ môi trường tự nhiên chống lạiđiều kiện bất lợi như khô hạn, căng thẳng thẩm thấu, thuốc kháng sinh hoặc cáchợp chất (ví dụ như các ion kim loại độc hại độc hại, sulfur dioxide, và ethanol)

…

Khả năng của một vi sinh vật bao quanh thân với một lớp EPS cao ngậmnước có thể giúp tự bảo vệ chống lại sự khô hạn và bị ăn thịt bởi sinh vật đơn bào.

Sự hiện diện của một lớp polysaccharide gel hóa xung quanh tế bào có thể

có ảnh hưởng quan trọng tới các tính chất khuếch tán, một số nhà nghiên cứu đãkhẳng định rằng EPS tế bào liên quan làm giảm độ nhạy cảm của vi khuẩnchống khuẩn và lysozyme

1.2.5 Nguồn thu nhận

Exopolysacharide được thu nhận từ rất nhiều nguồn khác nhau

EPS là sản phẩm được thu nhận từ quá trình nuôi cấy vi sinh vật, trong đó

có vi khuẩn lactic Các chủng của nhiều loại vi khuẩn lactic như: Streptococcus

thermophilus, Lactobacillus rhamnosus, L helveticus, L casie tạo ra nhiều

loại EPS khác nhau, chứa các đơn phân như: glucose, galactose, rhamnose,manose và các hydrat khác Tỉ lệ của các đơn phân trong EPS là khác nhau vàtùy loại Các nhóm hydrat thường gặp trong EPS: N-acetylglucosamine(GlcNAc), N-acetylgalactosamine (GalNAc) hoặc axit glucuronic (GlcA), ngoài

ra còn có các nhóm thế như phosphate, acetyl và glycerol EPS từ vi khuẩn lactic

là một trong những phát hiện mới mang tính đột biến có nhiều ứng dụng quantrọng trong công nghiệp, nông nghiệp cũng như trong lĩnh vực y tế, mỹ phẩm.Nhiều loại vi sinh vật như nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và tảo đã đượccông bố đều có khả năng sinh tổng hợp EPS EPS của chúng cũng khác nhaudựa trên thành phần monomer, khối lượng phân tử và cấu trúc

1.3 Quá trình sinh tổng hợp của exopolysacharide của vi khuẩn lactic

EPS sản xuất từ vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn có rất nhiều đặc tính vượttrội hơn hẳn so với các polysaccharide chiết xuất từ thực vật và tảo Thậm chí,một vài EPS tổng hợp từ vi khuẩn có thể thay thế các polysaccharide chiết xuất

từ thực vật (như pectin) hoặc chiết xuất từ tảo (như carrageenan hoặc alginate)

do các tính chất vật lý của chúng được cải thiện hơn

Con đường tổng hợp EPS của vi khuẩn bao gồm:

khuẩn lactic như Str thermophilus, Lab rhamnosus, Lab helveticus, Lab casei

và Lac lactic tạo ra nhiều EPS khác nhau, chứa các đơn vị glucose, galactose,

rhamnose, mannose và các hydrat cacbon khác

Hầu hết các EPS được vi khuẩn tổng hợp trong tế bào và tiết ra ngoài môitrường Một vài trường hợp ngoại lệ như levans và dextrans thì sự tổng hợp vàtrùng hợp xảy ra bên ngoài tế bào dưới tác dụng của các enzym ngoại bào Conđường tổng hợp sinh học của vi khuẩn bao gồm sự hấp thu các phân tử đường từmôi trường, vào trung tâm tổng hợp polysaccharide Tùy thuộc vào gốc đường

mà nó có thể thể được vận chuyển vào tế bào một cách thụ động hoặc qua một

hệ thống vận chuyển tích cực

Hình1.1: Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp EPS từ vi khuẩn lactic

(Nguồn: Freitas và cộng sự (2011))

Cơ chế tổng hợp EPS trong tế bào được mô tả như sau: Trước tiên, cơ chất

đi vào tế bào thông qua những con đường vận chuyển riêng biệt theo cơ chế chủđộng hay bị động Ví dụ glycerol vận chuyển vào trong tế bào thông qua cơ chếkhuếch tán thụ động nhờ sự chênh lệch gradient nồng độ giữa bên trong vàngoài tế bào, do nồng độ glycerol bên ngoài tế bào cao hơn so với trong tế bào.Còn đối với các loại đường như glucose, frutose thì vận chuyển qua màng tế bàobằng cơ chế vận chuyển chủ động, chúng được vận chuyển vào trong tế bào nhờđược cung cấp năng lượng ATP nên có thể đi qua màng tế bào theo chiều ngượcgradient nồng độ Sau đó, cơ chất được chuyển hóa theo con đường photphorylhóa nội bào, hoặc cũng có thể được vận chuyển và bị oxy hóa thông qua conđường periplasmic oxy hóa trực tiếp Các con đường oxy hóa periplasmic chỉtồn tại trong một số vi khuẩn, trong khi các con đường phosphorylative nội bào

là phổ biến giữa các vi khuẩn Cả hai hệ thống này đã được báo cáo ở một sốchủng sản xuất EPS và chúng có thể hoạt động đồng thời nếu có sẵn các phân tửđường

Tổng hợp polysaccharide đòi hỏi sự sinh tổng hợp các tiền chất kích hoạtnhư monosacarit giàu năng lượng, đường diphotphat chủ yếu là nucleoside(NDP-sugar), có nguồn gốc từ các loại đường photphoryl hóa Sự tiết EPS làmột quá trình đầy thử thách cho các loại vi khuẩn, với tính ưa nước, polymer cóphân tử lượng cao sắp xếp trong tế bào chất phải đi qua các lớp thành tế bào, màkhông ảnh hưởng đến tính chất rào cản quan trọng

Sau khi tổng hợp xong, EPS sẽ được tiết ra môi trường ngoại bào.Ngượclại, với sự đa dạng của các cấu trúc phân tử được tìm thấy trong EPS, những conđường cho sinh tổng hợp và tiết ra môi trường bên ngoài của chúng trong hầuhết các vi khuẩn Gram âm đã được báo cáo theo một trong hai cơ chế:con đườngWzx–Wzy và con đường ABC

Trong hệ thống phụ thuộc Wzx-Wzy: Các tiểu đơn vị được tổng hợp từ cácloại đường NDP được gắn vào hệ thống vận chuyển lipit polypreninphotphatđến hệ thống Wzx-Wzy Trên hệ thống Wzx, các tiểu đơn vị được vận chuyểnqua màng trong tế bào đến lớp peptidoglycan của tế bào Còn tại hệ thống Wzy,nơi đây quá trình trùng hợp xảy ra nhờ sự tác động của polymeaza.Polysaccharide hình thành tại màng trong tế bào và đi ra ngoài tế bào nên gọi làEPS.Trong quá trình vận chuyển này, EPS đi qua một kênh được hình thànhgiữa PCP (copolymeraza polysaccarit) gắn vào màng trong tế bào và một thànhphần protein gắn vào màng ngoài của tế bào

14

Trong hệ thống vận chuyển ABC: Các polysaccharide được polyme hóa ởmàng tế bào chất (màng trong tế bào) Và các polyme này được tiết ra ngoàithông qua hệ thống vận chuyển ABC, tiếp tục chuyển vị nó đến lớp nhầy giữamàng tế bào chất và màng ngoài tế bào, mang tính chất peptidoglycan và cuốicùng đến màng ngoài tế bào và ra ngoài môi trường Tương tự như con đườngWzx-Wzy, EPS cũng được vận chuyển qua kênh được hình thành giữa PCP vàmột thành phần protein gắn vào màng ngoài của tế bào.

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp exopolysacharide

EPS được sinh tổng hợp từ các chủng của vi khuẩn lactic, mà vi khuẩnlactic lại có nhiều chủng thuộc các giống khác nhau Vì vậy, các chủng khácnhau sẽ có một quá trình sinh tổng hợp EPS khác nhau

Mặc khác, theo như ta đã biết, EPS là chất được vi khuẩn tiết ra trong môitrường nuôi cấy, nên thành phần và các yếu tố của môi trường nuôi cấy vi khuẩncũng ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp EPS Các yếu tố môi trường và điềukiện nuôi cấy có thể tác động đáng kể sản xuất exopolysaccharide về sản lượngcũng như kích thước và thành phần hoá học của các polysaccharide Yếu tố quantrọng cho sản xuất exopolysaccharide bao gồm, các thông số như: thời gian tăngtrưởng của vi khuẩn, nguồn carbon, nguồn nitơ, tỷ lệ oxy, nhiệt độ và pH

1.4.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường

1.4.1.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon [9], [21]

Nguồn cacbon là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến

sự sinh tổng hợp EPS Các nguồn cacbon bao gồm saccharose, glucose, lactose,maltose, mannitol, sorbitol, whey, tinh bột Ngoài ra một số nguồn cacbonkhông phải là đường như methanol và C9 đến C16 n-ankan, cũng có thể được sửdụng để tổng hợp EPS của vi sinh vật

Tuy nhiên, nguồn cacbon thích hợp cho sự phát triển của tế bào vi sinh vậtkhông phải luôn luôn dẫn đến sự tăng khả năng sinh tổng hợp EPS

Trong một bài báo của Sung – Hwanko và cộng sự năm 2000 về điều kiệntối ưu cho sản xuất EPS bởi Marine Microorganism Hahella chejuensis :glucose, galactose, fructose, lactose, sucrose, và tinh bột đã được sử dụng để xácđịnh ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh EPS-R, Chủng này đã

kết quả cho thấy khi sữ dụng sucarose để cung cấp như là nguồn carbon chính

sẽ tăng năng suất tổng hợp EPS-R và thu được EPS cao nhất [23]

Zhang và cộng sự (2012) tiến hành nuôi cấy chủng Lactobacillus

plantarum C88 trên môi trường MRS có bổ sung 2% glucose để thu EPS Kết

quả cho thấy hàm lượng EPS đạt cực đại được 69 (mg/l) [29]

Các loại nguồn cacbon khác nhau không những ảnh hưởng đến khả năngsinh tổng hợp EPS mà còn ảnh hưởng đến các thành phần của

EPS Lab delbrueckii subsp bulgaricus NCFB 2772 tạo ra EPS từ môi trường

nuôi cấy có glucose cao hơn ba lần so với fructose Theo (Grobben et al., 1997)EPS được tạo ra bởi LAB cũng đã bị ảnh hưởng bởi các nguồn đường khácnhau Grobben và cộng sự (1996) cho rằng, quy định của con đường sinh tổng

hợp EPS bởi Lab bulgaricus NCFB 2772 có thể phụ thuộc vào các nguồn

Glucose ở dạng D-glucose, là loại monosaccharide dễ hấp thụ nhất, chúngluôn được vi sinh vật sử dụng đầu tiên Vì vậy, trong quá trình sinh tổng hợpEPS người ta thường đưa về loại đường này để vi sinh vật dễ hấp thụ

Lactose là loại đường có trong sữa người và động vật, nó là mộtdisaccharide Một số chủng LAB có khả năng sử dụng lactose làm nguồn dinhdưỡng vì chúng có khả năng sinh enzyme β-galactosidase Enzyme này thủyphân lactose thành glucose và galactose, giúp cho quá trình trao đổi chất của vikhuẩn được dễ dàng

Monosaccharide và disaccharide là hai nguồn năng lượng quan trọng nhấtcho LAB Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựngcấu trúc tế bào

1.4.1.2 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ [20]

Nitơ cũng là một yếu tố cần thiết cho sự sống của vi sinh vật Nitơ đóng vaitrò rất quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Vi sinhvật sản xuất EPS có thể sử dụng nhiều nguồn nitơ gồm : amoni, nitrat, nitrit vàcác axit amin Nhưng theo Sutherland thì muối amoni và các axit amin là đượcdùng phổ biến nhất Sản lượng EPS được biết là khác nhau phụ thuộc vào nguồnnitơ sử dụng Khi thay đổi nguồn nitơ ban đầu sẽ ảnh hưởng đến kích thướcphân tử của EPS hình thành

16

Đối với Lb plantarum nuôi cấy trong môi trường whey, dịch chiết nấm

men có nguồn gốc nitơ hiệu quả hơn để sản xuất EPS so với peptide từ đậunành, peptone

Các nguồn nitơ khác nhau như chiết xuất từ cao thịt, nấm men, tryptone,peptone, ammoniumsulfate, Ammonium oxalate và sodium nitrate cũng đã đượcthử nghiệm

Seesuriyachan và cộng sự (2011) nghiên cứu khả năng sinh EPS bởi

Lab.confusus TISTR 1498 trong môi trường nước dừa có bổ sung các thành phần

peptone, cao thịt, cao nấm với tỉ lệ nhất định Kết quả cho thấy nguồn Nitơ hữu

cơ được cung cấp từ cao thịt, cao nấm ảnh hưởng đáng kể đến sự tổng hợp EPS

bởi Lab confuses TISTR 1498, cụ thể việc sản xuất EPS với hàm lượng tối đa là

4,33 g/l, khi nồng độ peptone và nấm men chiết xuất tương ứng là 7,5 và 3 g/l(cao hơn gần 25% so với việc nuôi cấy không có bổ sung các peptone, cao nấm).Còn Prasertsan và cộng sự (2008) đưa ra kết quả mô tả cho EPS được tạo

ra bởi chủng Enterobacter cloacae WD7 Khi bổ sung polypeptone thì làm giảm

năng suất EPS sinh ra bởi chủng này Trong một nghiên cứu khác của Lo và

cộng sự (1997) cũng có kết quả tương tự, khi sản xuất xanthan từ Xanthomonas

campestris, nếu nồng độ nitơ cao thì kết quả hàm lượng EPS tạo thành thấp 1.4.1.3 Ảnh hưởng của các vitamin và khoáng chất [10]

Khoáng chất và vitamin cũng có ảnh hưởng đến sự phát triển của LAB vàkhả năng sinh tổng hợp EPS.Vitamin có thể được bổ sung vào môi trường pháttriển sản xuất để nângcao mức tăng trưởng và sản xuất EPS EPS thu được bởi

Lab casei CRL 7 tăng gấp đôi sau khi thêm Mn 2+ vào trong môi trường nuôicấy đã xác định (Mozzi etal., 1995) Grobben và cộng sự (1998) đã khảo sát các

nhu cầu dinh dưỡng của Lab delbrueckii ssp bulgaricus NCFB 2772 bằng cách

sử dụng một môi trường xác định Kết quả cho thấy có sự gia tăng hàm lượngEPS: hàm lượng EPS 130 mg/l - 250 mg/l sau khi bỏ sót một số vitamin khôngcần thiết của môi trường đã xác định Cuối cùng, Macedo và cộng sự (2002) đãkhông tìm thấy một tác động đáng kể nào của vitamin EPS sản xuất

bởi Lab rhamnosus RW-9595M trong môi trường whey và chiết xuất nấm men

thì các vitamin đã có một ảnh hưởng lớn và làm tăng đáng kể sản lượngEPS Sản xuất tối đa của EPS trong nghiên cứu này là 2775 mg/l đã đạt đượctrong môi trường whey có bổ sung cao nấm, các khoáng chất, muối và axitamin

Ngoài ra nhiều chất dinh dưỡng khác cũng cần thiết, thường với số lượng

rất ít Các dưỡng chất này bao gồm kali, magie, canxi, photpho…

1.4.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

1.4.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng, phát triển và tổnghợp EPS

Nhiệt độ tối ưu cho sản xuất exopolysacharide là 360C đến 390C nhưng tùy

thuộc vào các chủng LAB như sau: L lactis ở 250C, Str thermophilusở 400C, L.

rhamnosus từ 20 – 250C, Leuconostoc sp ở 300C

Zhang và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng sinh EPS của chủng

Lactobacillus fermentum F6 qua nghiên cứu cho thấy hàm lượng EPS sinh tổng

hợp bởi chủng Lactobacillus fermentum F6 đã được công bố đạt cao nhất khi

nuôi cấy trong môi trường sữa gầy, ở nhiệt độ 370 C và pH = 6,5 [22]

Những ảnh hưởng của nhiệt độ đối với việc sản xuất exopolysacharide

so với ở 300 C hoặc 370 C

Lactobacillus sake tăng trưởng ở nhiệt độ thấp hơn, và tổng hợp EPS ở

nhiệt độ cao hơn tuy nhiên tốc độ tăng trưởng trong giai đoạn này giảm theo cấp

số nhân ở nhiệt độ thấp

Tốc độ tăng trưởng và sản xuất EPS thường được ưa chuộng bởi nhiệt độ tối

ưu Sutherland (1990) cho thấy rằng khi tăng trưởng của tế bào bị chậm lại (tức làtại nhiệt độ tăng trưởng thấp hơn), tổng hợp polymer tế bào sẽ bị chậm lại

Sau đây là một số nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tổng hợpEPS:

Garibay và Marshall (1991) cho thấy hàm lượng EPS tạo ra bởi

Lab delbrueckii ssp bulgaricus ở 48°C cao gấp hai lần so với nhiệt độ tối

ưu cho sự phát triển của chủng này là 37 - 42°C Nhưng khi nuôi cấy ở nhiệt độthấp hơn nhiệt độ tối ưu thì vẫn không làm thay đổi lượng EPS sinh ra bởi LAB

ưa nhiệt (Zelger và Sebastiani, 1998)

Tương tự đối với chủng Lab rhamnosus RW-9595M khi tiến hành thay đổi

nhiệt độ nuôi cấy trong môi trường từ 32 - 37°C và trong khoảng từ 22 - 42°C(Smith et al., 2000; Madeco et al., 2002)

1.4.2.2 Ảnh hưởng của pH

18

Vi khuẩn Propionic có pH tối ưu là 6.0 được quan sát trong môi trường củadịch chiết nêm men và sữa tách kem là chính.

Một nghiên cứu của Kivanc (1999) cho thấy rằng giá trị pH thấp sẽ làmgiảm đáng kể sản lượng EPS, đặc biệt trong phạm vi có tính axit

Torino và cộng sự (2005) đã nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp EPS

của Lab helveticus, Lac Helveticus Kết quả cho thấy lượng EPS được tạo ra

nhiều hơn trong điều kiện môi trường có tính axit với pH từ 4,5 – 5,9 so với giátrị thu được ở pH kiềm (6,2) khi nuôi ở 37°C trong sữa.[25]

EPS sản xuất từ Str themophilus ST 111 rất thấp tại các giá trị pH khác

nhau trong môi trường sữa tuy đã thêm nguồn Nitơ nhưng vẫn không có tácđộng tích cực Tuy nhiên khi kiểm soát pH= 6,2 và bổ sung thêm whey proteinhydrolysate lại nâng cao sự sản xuất EPS lên gấp năm lần

Theo Zhang Y và cộng sự (3/2011) nghiên cứu về ảnh hưởng của pH ban

đầu trong môi trường lên khả năng sinh tổng hợp EPS bởi Lab fermentum F6

khi chủng được nuôi cấy ở 37°C trong sữa tách kem được điều chỉnh các mức

pH khác nhau Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng Lab fermentum F6 phát triển và

tạo ra nhiều EPS ở pH cao hơn (6,0; 6,5 và 7,0) Hàm lượng EPS sinh ra nhiềunhất là 14,61mg/l ở pH 6,5 trong 32 giờ Hàm lượng EPS tối đa thu được ở cácmức pH 5, 5,5, 6 và 7 tương ứng là 5,86 mg/l (40 giờ), 7,86 mg/l (40 giờ), 10,11mg/l (32 giờ) và 8,32 mg/l (32 giờ) Cả sự tăng trưởng của vi khuẩn và cả hàm

lượng EPS sinh ra bởi Lab fermentum F6 đều bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi tính

axit của môi trường (Ph thấp).[28]

Wang và cộng sự (2010) khi nghiên cứu về đặc tính của exopolysaccharide

sản xuất bởi chủng L.plantarum KF5 phân lập từ sữa chua Kefir Tác giả đã

công bố rằng khi nuôi cấy ở pH=6,3 trong khoảng thời gian 30 giờ lượng EPSđược sinh tổng hợp ra từ chủng này là 95,580.[26]

Một số nghiên cứu cho thấy trong môi trường nuôi cấy có pH được kiểmsoát thì sẽ làm tăng hàm lượng của EPS

1.4.2.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

EPS tối đa được tổng hợp từ LAB đạt được sau 24 – 36 giờ tùy thuộc vàochủng và môi trường nuôi cấy

Khi vi khuẩn sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy giống nhau, tốc độtăng trưởng và khả năng sản xuất EPS của chúng thay đổi theo thời gian Đốivới nhiều loại vi khuẩn, tăng trưởng và sản xuất EPS xảy ra đồng thời Thời gian

mà tại đó sản xuất EPS đạt tối đa thay đổi với từng loài vi khuẩn Một số nghiên

cứu đã chỉ ra rằng trong khi sản lượng EPS thay đổi theo giai đoạn phát triển của

vi khuẩn, thành phần EPS không thay đổi theo chu kỳ tăng trưởng

1.5 Tình hình nghiên cứu về EPS

Cùng với sự tiến bộ về khoa học và công nghệ cũng như những lợi ích màEPS mang lại trong nghành công nghệ thực phẩm, trong y dược thì việc nghiêncứu về EPS ở các nước trên thế giới rất được quan tâm Cho tới thời điểm này đã

có rất nhiều công trình nghiên cứu về EPS, sau đây là kết quả của một số côngtrình nghiên cứu:

Rabha và cộng sự (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

lên khả năng sinh EPS của Str thermophilus BN1 Kết quả nghiên cứu đã chứng

minh rằng hàm lượng EPS sinh tổng hợp bởi Str thermophilus BN1 ở 37°C caohơn ở 42°C Do đó, 37°C là nhiệt độ phát triển tối ưu của chủng này [19]

Vamanu Emanuel và cộng sự (2010) đã nghiên cứu ảnh hưởng của glucides

đến khả năng tổng hợp exopolysaccharides bởi chủng Lactobacillus sp.IL2 và

Lactobacillus sp IL3, nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon, thời gian nuôi

cấy đến khả năng tổng hợp EPS Kết quả cho thấy nuôi cấy chủng L.paracasei

IL2 trong môi trường MRS bổ sung glucose, ở 370C trong thời gian 48 giờ thì

hàm lượng EPS tổng hợp được lớn nhất là 201mg/l Còn chủng L.plantarum II3

nuôi trong môi trường đó cho lượng EPS là 92 mg/l [12]

Yanping Wang cùng cộng sự (2010) đã nghiên cứu về khả năng sinh EPS

của chủng Lactobacillus plantarum KF5 được phân lập từ nấm Kefir Tây Tạng Qua nghiên cứu cho thấy chủng L plantarum KF5 nuôi trong môi trường sữa

lỏng và ủ trong vòng 24 – 48 giờ, được ly tâm ở 10000 rpm 40C trong vòng 15phút thì năng suất sẽ là 75,57 mg/l Khi nuôi cấy trong 30 giờ, pH ban đầu là6,3, nồng độ cấy 3%, thì số lượng EPS được sản xuất bởi KF5 có thể lên tới95,58 mg/l, tăng 26,48% so với điều kiện lên men ban đầu [26]

Zhang và cộng sự (2011) đã nghiên cứu khả năng phát triển và quá trình

sinh tổng hợp EPS bởi L fermentum F6 trong môi trường chứa sữa gầy, và phát hiện thấy rằng khả năng sinh tổng hợp EPS bởi L fermentum F6 trong môi

trường chứa 10% sữa gầy đạt cao nhất ở nhiệt độ 370C, pH = 6,5 sau 32 giờ nuôicấy Tác giả cũng công bố rằng glucose là nguồn carbon có ảnh hưởng lớn nhất

Thành phần monomer của EPS do những tác giả này xác định gồm glucose vàgalactose với tỉ lệ 4:3 [28]

Ahmed và cộng sự (2013) đã ghiên cứu tính chất của EPS được sinh tổng

20

hợp bởi L kefiranofaciens ZW3 được phân lập từ sữa chua Tây Tạng Kết quả

thu được khối lượng phân tử của EPS là 5.5x104 Da Tác giả này cũng công bố

độ hòa tan, giữ nước và khả năng liên kết với dầu của EPS này tương ứng là14,25%, 496% và 884,74% và EPS thu được có bề mặt nhẵn với cấu trúc nhỏgọn Nghiên cứu tính chất lưu biến cho thấy muối không ảnh hưởng tới độ nhớtcủa EPS và ở pH có tính axit thì độ nhớt cao EPS nóng chảy ở nhiệt độ93,380C, nhiệt độ suy thoái là 299,620C [6]

Gorska-Fra˛czek nghiên cứu về cấu trúc của EPS được tách chiết từ

sinh tổng hợp từ L.rhamnosus KL37B là một chuỗi lặp lại của các

monosaccharide gồm glucose và galactose với tỉ lệ 3:6 [15]

Fukuda và cộng sự (2010) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến

tính chất lý hóa của EPS được sinh tổng hợp từ Lab fermentum TDS030603.

Kết quả cho thấy EPS đạt cao nhất sau 24 đến 48 giờ và suy giảm dần sau 72 giờ

ủ trong môi trường MRS Tác giả cũng công bố khối lượng phân tử của EPS thu

EPS này gồm glucose và galactose với tỉ lệ 2,6:2,8 [14]

Dupont và cộng sự (2000) nghiên cứu so sánh khả năng sinh tổng hợp EPS

bởi hai chủng L hamnosus 9595M và L paracasei Type V trong các môi trường có thành phần khác nhau cho thấy chủng L rhamnosus 9595M sinh exopolysaccharide cực đại ở giá trị 1275 mg/L Trong môi trường sữa, L.

rhamnosus 9595M có khả năng sinh EPS mạnh hơn (280 mg/L) so với L paracasei Type V (80 mg/L) pH và nhiệt độ nuôi cấy không ảnh hưởng đến

khả năng sinh EPS của L rhamnosus 9595M [11]

Torino và cộng sự (2005) nghiên cứu nuôi cấy L helveticus ATCC 15807

trong môi trường có pH là 4,5 và có bổ sung đường lactose, kết quả cho thấychủng này có khả năng sinh tổng hợp EPS cao EPS sinh tổng hợp được trong

monomer bao gồm glucose và galactose theo tỉ lệ 2:1 [24]

So với thế giới thì việc nghiên cứu, khai thác EPS sinh tổng hợp bởi vikhuẩn ở trong nước ít được quan tâm, nghiên cứu nhiều bởi việc nghiên cứu còngặp một số khó khăn, thiếu thốn trong công tác chuẩn bị và tiến hành Sau đây làmột số nghiên cứu về EPS ở trong nước:

Trần Đình Toại, Nguyễn Văn Năm (2007), nghiên cứu Fucoidan –