Nghiên cứu phân lập nhóm vi khuẩn lactic acid có tính chất đối kháng với vi khuẩn edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra pangasianodon hypophthanlmus

Các nhà khoa học Nauy và Mỹ đã nghiên cứu hiệu quả kháng khuẩn của hai lọai peptide t ng hợp cecropin B và cecropin P1 đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên cá, trong đ c E.. 2.4.

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 1 MSSV:207111033

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Sản lượng cá tra tăng rất nhanh từ 52.248 tấn trong năm 2000 đến 1.128.014

tấn trong năm 2008, ước tính sản lượng tăng sấp xỉ 22 lần trong vòng 08 năm Sản

lượng cá tra ngày càng gia tăng đi đôi với sự suy thoái môi trường do nước thải và bùn ao nuôi cá tra thâm canh thải trực tiếp ra sông, dẫn đến bùng phát dịch bệnh, gây thiệt hại cho người dân Phương pháp phòng và trị bệnh truyền thống đã lạm dụng sử dụng kháng sinh và hóa chất diệt khuẩn đã tạo ra những chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc và tăng độc lực Để thay thế dần dần phương pháp phòng bệnh truyền thống, phương pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học ngày càng được ưa chuộng như vaccine, các chất tăng cường hệ miễn dịch (immunostimulants), probiotics Nghiên cứu về vaccine ứng dụng trên cá tra vẫn đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Vaccine được cho là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng ngừa một số bệnh gây ra b i vi huẩn và virus, nhưng chưa được sử dụng ph biến

c thể là do giá thành quá cao, thời gian nghiên cứu lâu và thường gây sốc cho cá hững thành công đáng ch là việc sử dụng các chất tăng cường hệ miễm dịch thân thiện với môi trường và c ph phòng ngừa bệnh rộng ơn thế nữa, phương pháp trị liệu sinh học bằng vi sinh v t c lợi probiotic được mong đợi và tr thành công cụ phòng ngừa, điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuôi tr ng thủy sản thông qua khả năng cải thiện môi trường nước và ức chế vi sinh gây bệnh Đặc biệt là các

vi sinh v t có lợi có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu (Quorum sensing) của các vi khuẩn gây bệnh nhằm làm giảm độc và đ ng thời ức chế sự phát triển của chúng Trong khuôn kh của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu phân l p nhóm vi khuẩn lactic từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, nước ao nuôi cá tra c đặc tính phân hủy

phân tử tín hiệu và đối kháng Edwardsiella ictaluri Và thực phẩm lên men truyền

thống

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 2 MSSV:207111033

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lâp các dòng vi khuẩn có tính chất đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri, gây bệnh cho cá tra nuôi các tỉnh đ ng bằng sông Cửu Long

1.3 Nội dung đề tài

- Thu th p mẫu cá Tra 3 tỉnh thuộc đ ng bằng sông Cửu Long: Tiền Giang, Vĩnh Long, Đ ng Tháp

- Sàng lọc các mẫu có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL)

- Dùng một số phương pháp để đánh giá hả năng đối kháng của các chủng vi

khuẩn phân l p đối với vi khuẩn gây bệnh gan th n mủ E ictaluri

- Khảo sát khả năng phân hủy L và đối kháng E ictaluri của các vi khuẩn

nh n từ ngân hàng vi sinh v t

- Bước đầu mô tả hình thái, nhộm gram các chủng có khả năng phân hủy AHL

và đối kháng

1.4 Phạm vi nghiên cứu đề tài

- Phân l p từ hệ vi sinh v t từ hệ tiêu hóa của cá tra nuôi và cá tra giống

- Phân l p từ hệ vi sinh v t nước của cá tra nuôi

- Phân l p từ hệ vi sinh v t trong thực phẩm lên men truyền thống

- Sàng lọc các chủng vi khuẩn phân l p và các chủng từ ngân hàng vi sinh khả

năng phân hủy phân tử tín hiệu A Ls và đối kháng Edwardsiella ictaluri

Giống cá tra dầu Pangasianodon

Loài cá tra Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878)

2.1.2 Phân bố

Cá tra phân bố lưu vực sông Mê Kông, có mặt cả 4 nước Lào, Việt Nam, Campuchia, Thái Lan Ở Thái Lan còn gặp chúng lưu vực sông Mê Kông và Chao phraya Ở nước ta cá bột và cá giống vớt được chủ yếu trên sông Tiền, cá trư ng thành chỉ thấy trong các ao nuôi, rất ít khi tìm thấy trong tự nhiên

2.1.3 Đặc điểm hình thái và sinh thái

Cá thân dài, không vẩy, màu sắc đen xám trên lưng, bụng hơi bạc, miệng rộng, có hai đuôi râu dài

Cá sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được vùng nước hơi lợ (10 - 14 %

độ muối), có thể chịu đựng được nước phèn với p ≥ 4 p dưới 4 thì cá bỏ ăn, bị sốc), ít chịu đựng được nhiệt độ thấp dưới 150C, chịu nóng tới 390C

2.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá hết noãn hoàn thì thích ăn m i tươi sống, vì v y ch ng ăn thịt lẫn nhau ngay trong

bể ấp, th m chí cá vớt trên sông vẫn thấy ch ng ăn nhau trong đáy vớt cá bột Chúng

ăn các loại phù động v t c ích thước vừa cỡ miệng của chúng

Khi cá lớn, tính ăn tạp thiên về động v t và dễ chuyển đ i loại thức ăn Trong ao nuôi cá Tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn, ể cả thức ăn bắt buộc như: mùn, bã hữu cơ, cám, rau, phân hữu cơ, động v t đáy,…

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 4 MSSV:207111033

2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng

Cá trong tự nhiên, có thể sống trên 20 năm Đã gặp cỡ cá trong tự nhiên 18 kg hoặc có mẫu dài tới 1,8m Trong ao nuôi cá bố mẹ cho đẻ đạt tới 25 kg cá 10 tu i uôi trong ao 1 năm cá đạt 1 - 1,5 g/con năm đầu tiên), những năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn, c hi đạt 5 - 6 g/năm

2.1.6 Đặc điểm sinh sản

Tu i thành thục: Cá Tra đực thành thục tu i thứ 2 và cá cái tu i thứ 3 tr lên

Cá Tra hông c cơ quan sinh dục phụ (thứ cấp), nên nhìn hình dáng ngoài khó phân biệt đực - cái

Ở thời kì thành thục, tuyến sinh dục cá đực phát triển lớn gọi là bu ng tinh,

cá cái gọi là bu ng trứng

Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 - 6 dương lịch),

cá đẻ tự nhiên trên sông những h c sông c điều kiện sinh thái phù hợp Cá không

đẻ phần sông của Việt Nam Ở Campuchia, bãi đẻ của cá nằm từ khu vực ngã tư giao tiếp 2 con sông Mê Kông và Tonlesap, từ Sombor, tỉnh Crache tr lên

Trong sinh sản nhân tạo, ta có thể nuôi thành thục sớm và cho đẻ sớm hơn trong tự nhiên (tháng 3)

Trong tự nhiên không gặp tình trạng tái phát dục Chỉ c trong điều kiện nuôi nhân tạo, cá Tra có thể tái phát dục 1 - 2 lần trong năm

Số lượng trứng đếm được trong bu ng trứng của cá ta gọi là sức sinh sản tuyệt đối Sức sinh sản tuyệt đối của cá Tra có thể từ 200.000 đến vài triệu trứng

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 5 MSSV:207111033

2.2.1 Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas

Tác nhân gây bệnh: Nhóm vi khuẩn gây bệnh chủ yếu thuộc giống

Aeromanas: A hyrophila, A caviae, A sobria Vi khuẩn có mặt trong nước có nhiều

chất hữu cơ Cá con dễ mẫn cảm hơn cá trưỡng thành, có thể gây chết đến 80%

Dấu hiệu bệnh lý: Cá bị bệnh sẫm màu từng vùng bụng, xuất hiện từng mảng đỏ trên cơ thể, hoại tử đuôi, vây, xuất hiện các vết thương trên lưng, các khối u trên bề mặt cơ thể, mắt l i, mờ đục và sưng phù, xoang bụng chứa dịch, nội tạng hoại

tử

2.2.2 Nhiễm khuẩn do Pseudomonas (Bệnh đốm đỏ)

Tác nhân gây bệnh : Pseudomonas fluorescens, P.anguillise, P.chlororaphis

Dấu hiệu bệnh lý: Xuất huyết từng đốm nhỏ trên da, xung quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng, bề mặt cơ thể chảy máu, tuột nhớt nhưng hông xuất huyết

vây và h u môn Pseudomonas spp gây nhiễm khuẩn huyết thường xâm nh p vào cơ

thể cá qua các thương t n mang, da, vẩy

2.2.3 Nhiễm khuẩn huyết do Edwardsiella (Edwarsiellosis)

a Tác nhân gây bệnh: Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella tarda gây ra

b Dấu hiệu bệnh lý

Xuất hiện những vết thương nhỏ trên da (phía mặt lưng , đường kính khoảng 3-5m Những vết thương này sẽ phát triển thành những khối u rỗng bên trong cơ và

da bị mất sắc tố Cá mắc bệnh sẽ mất chức năng v n động do vây đuôi bị rách, gẫy

Có thể xuất hiện những vết thương bên dưới biểu bì, cơ, hi ấn vào sẽ phát ra khí có mùi hôi Các vết thương này sẽ gây hoại tử vùng cơ xung quanh Biết xuất hiện khi chất lượng nước trong môi trường nuôi xấu, nuôi với m t độ dày Nhiệt độ thích hợp

để phát triển khoảng 300

C

c Đặc điểm sinh hóa

The Hawke et al (1981) Edwardsiella ictaluri là loài thuộc Enterobacteria

cea, gram âm, hình que ngắn ích thước 0.75x1.5-2.5μm di động yếu 25-300C,

Oncorhynchus mykiss Lương Trần Thục Đoan, 2006

Ở Việt Nam, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh chủ yếu trên cá tra (

tất cả các giai đoạn phát triển) Tỷ lệ hao hụt lớn trên cá tra giống, nhưng gây thiệt hại về kinh tế lớn nhất giai đoạn cá tra thịt cỡ 300-500g (Từ Thanh Dung và ctv,

2004) Theo Ferguson et al (2001), bệnh này được ghi nh n xuất hiện ĐBSCL

vào cuối năm 1998 và c tên là B P Bacilliaty ecrosis of Pangaius

Từ Thanh Dung 2005 cũng phân l p vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá

tra nuôi bè Việt Nam, với dấu hiệu có nhiều nốt trắng trên gan

2.2.4 Bệnh ký sinh trùng

Bệnh trùng bánh xe (Trichodinosis)

+ Dấu hiệu bệnh lý: Thân cá có lớp nhớt màu trắng hơi đục, mang cá đầy nhớt Cá thường n i đầu và t p trung nơi c nước chảy, đôi hi nhô đầu lên mặt nước lắc mạnh đầu Cá bệnh nặng thường lờ đờ, đảo lộn vài vòng, chìm xuống đáy r i chết Trùng bánh xe ký sinh chủ yếu trên da, mang, các gốc cây

Bệnh trùng quả dưa Ichthyopthisiosis

+ Dấu hiệu bệnh lý: Trùng quả dưa sinh trên da, mang và vây Trùng bám thành các hạt lấm tấm rất nhỏ, đường kính lớn nhất bằng 0,5-1mm, có thể thấy được bằng mắt thường Da và mang cá có nhiều nhớt, màu sắc nhợt nhạt Cá n i đầu từng đàn trên mặt nước, bơi lờ đờ do trùng bám nhiều mang, phá hoại biểu mô mang làm cá ngạt th

2002 đã đạt 450.000 tấn, chiếm 46% sản lượng nuôi tr ng và khai thác thủy sản nội

địa Trong các loài cá nuôi nước ngọt, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài

cá nuôi nước ngọt truyền thống được nuôi chủ yếu trong bè, ao và đăng quần với các mức độ thâm canh, bán thâm canh và qui mô nông hộ ao h nhỏ hầu hết các tỉnh Nam bộ, trong đ t p trung chủ yếu các tỉnh An Giang, Đ ng Tháp, và Cần Thơ Sản lượng nuôi cá tra ước tính đạt khoảng 300.000 tấn năm 2004, đạt 400.000 tấn năm 2005, đạt trên 800.000 tấn năm 2006, đạt 1.000.000 tấn năm 2007 và 1.128.000 tấn năm 2008 Đ thị 1) (Sáng et al., 2007)

Đ thị 1 Sản lượng nuôi cá tra từ năm 2000-2008 (Vietnam association of Seafood

Exporters and Producers-VASEP, 2008

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 8 MSSV:207111033

Tuy nhiên, tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra trong mấy năm qua đang thể hiện sự thiếu bền vững Có rất nhiều nguyên nhân chủ quan, khách quan khác nhau đang được Chính phủ, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, các Bộ ngành, các địa phương, các t chức Hiệp hội nuôi cá và chế biến xuất khẩu đang chung tay triển khai các giải pháp đ ng bộ để khắc phục một cách hữu hiệu (Sáng et al., 2007) Trong đ , vấn đề về môi trường bị nhiễm dẫn đến dịch bệnh bùng phát đã tác động

nghiệm trọng đến người nuôi và đ ng thời giảm chất lượng sản phẩm của cá tra 2.3.2 Nghiên cứu về bệnh gan thận mủ

Bệnh do ký sinh trùng:

Cryptobia spp., Ichthyophthyrius multifiliis, Trichodina, Epistylis

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 9 MSSV:207111033

640.000 tấn sản phẩm cá tra philê, đạt kim ngạch gần 1,5 tỷ USD, tăng hơn 48% so với năm 2007 Chỉ trong vòng khoảng 10 năm, từ năm 1998 đến năm 2008, từ một loài cá bản địa, cá tra đã tr thành sản phẩm chiến lược quốc gia, với sản lượng nuôi tăng gấp 65 lần, xuất khẩu sang hơn 140 nước, chiếm hơn 50% t ng sản lượng thủy sản xuất khẩu Việt am, đ ng g p hoảng 2% GDP của cả nước (Thủy sản Việt Nam, số 13/2009) Với sự phát triển ngày càng cao của cá tra cùng thị trường to lớn cho xuất khẩu, hàng ngàn nông dân đã chạy theo lợi nhu n từ con cá tra một cách vô điều kiện, với năm 2008 là đỉnh điểm của phong trào nuôi cá tra ĐBSCL gười nuôi đã ạt m rộng diện tích nuôi, tăng m t độ nuôi một cách tự phát, cung cấp một lượng lớn thức ăn dẫn đến môi trường trong ao nuôi dễ dàng bị ô nhiễm, là điều kiện

để bệnh bộc phát, gây thiệt hại cho người nuôi Nghề nuôi cá tra trong những năm gần đây c tỉ lệ hao hụt khá cao (khoảng 40-50%), cao gấp đôi so với các năm trước (www.vasep.com.vn) Các bệnh thường gặp trên cá tra bao g m bệnh do vi khuẩn

(bệnh gan th n mủ, bệnh đốm đỏ do Pseudomonas, bệnh nhiễm trùng máu do

Edwardsiella tarda), nấm (nấm thủy mi, ) và ký sinh trùng (trùng bánh xe, trùng

quả dưa, sán lá đơn chủ, sán song chủ, ) Theo kết quả điều tra của Nguyễn Thanh Phương 2007 về các bệnh do tác nhân vi khuẩn xuất hiện trong các ao nuôi cá tra thâm canh tỉnh An Giang, 68,3% số hộ điều tra nh n thấy bệnh đỏ mỏ đỏ đuôi, 61% số hộ ghi nh n bệnh gan-th n-mủ, 51,2% số hộ ghi nh n bệnh phù đầu, 24,4%

số hộ ghi nh n bệnh vàng da Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan (2008), tần suất xuất hiện bệnh năm 2007 các tỉnh ĐBSCL bao g m bệnh gan th n mủ: 52,80%; xuất huyết: 42,50%; phù đầu, phù mắt: 20,70%; vàng da: 21,60% Trong đ bệnh gan th n mủ (hay bệnh đốm trắng nội tạng) gây thiệt hại nhiều nhất cho người nuôi Bệnh này xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ĐBSCL vào cuối năm 1998 Khi cá nhiễm bệnh, tỉ lệ chết tăng cao 10-90%), có thể lên đến 100% tùy thuộc vào cách quản lý và kích cỡ cá nuôi, đ ng thời trên gan, th n và tụy tạng xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1-3 mm bên trong chứa dịch màu trắng đục Khi cá bệnh người nuôi thường dùng hóa chất hoặc thuốc háng sinh để chữa trị Tuy nhiên người ta đã

phát hiện rằng tác nhân gây bệnh, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (theo kết quả định danh của Crumlish et al., 2002), đã háng với khá nhiều loại háng sinh như:

vi khuẩn kháng thuốc và gây ô nhiễm môi trường nước Ngoài ra t n dư chất kháng sinh trong thịt cá tra sẽ ảnh hư ng đến vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm, và làm giảm uy tín của sản phẩm cá tra xuất khẩu ra thị trường nước ngoài

Để giải quyết vấn đề trên, chúng ta phải tìm các giải pháp thay thế cho việc chữa trị bằng kháng sinh và thuốc hóa học Hiện nay biện pháp sử dụng vaccine để phòng bệnh đang được đánh giá là có hiệu quả và kinh tế Từ năm 2005, Viện Nghiên cứu Nuôi tr ng Thủy sản II đã phối hợp với Công ty Thuốc thú y Trung ương II avetco thực hiện đề tài cấp Bộ “ ghiên cứu vaccine phòng bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, cá basa, cá mú, cá giò, cá h ng Mỹ nuôi công nghiệp”, trong đ đối tượng được quan tâm đặc biệt là cá tra Sau ba năm thực hiện, việc nghiên cứu vaccine phòng bệnh gan th n mủ cho cá tra đã đạt được một số kết quả khả quan và

có triển vọng áp dụng vào thực tế Hiện nay loại vaccine này đã nh n được lời mời hợp tác từ công ty c phần Vĩnh oàn Đ ng Tháp), công ty nuôi và xuất khẩu cá tra lớn thứ ba của Việt Nam Ngoài ra, các nghiên cứu hợp tác giữa t p đoàn Bayer và công ty sản xuất vaccine Pharmaq của Nauy trên bệnh gan th n mủ của cá tra cũng

đã bước đầu khẳng định tác nhân gây bệnh là vi khuẩn E ictaluri, hiện đang tiếp tục

nghiên cứu để chế tạo vaccine

Tuy nhiên, các loại vaccine nói trên là vaccine bất hoạt (sử dụng kháng nguyên là tế bào vi khuẩn giết bằng formalin 0,4%), có một số nhược điểm là tỉ lệ bảo hộ chưa cao, thời gian bảo hộ khá ngắn (hai tháng, trong khi một vụ nuôi cá tra kéo dài tới 5-6 tháng , đòi hỏi phải b sung một số chất b trợ để làm tăng hiệu quả

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 11 MSSV:207111033

của vaccine Biện pháp phòng bệnh t ng hợp luôn luôn đòi hỏi sự kết hợp của nhiều cách tiếp c n khác nhau: quản l môi trường nuôi, quản lý chất lượng con giống, tăng cường sức khỏe v t nuôi, sử dụng các hợp chất kích thích miễn dịch, vaccine bất hoạt, vaccine sống nhược độc, các chế phẩm sinh học có ngu n gốc thảo dược, các chế phẩm vi sinh v t

Hiện nay, một số chế phẩm vi sinh đã được ứng dụng trong sản xuất giống và nuôi thương phẩm cá tra nhằm thay thế cho việc sử dụng kháng sinh Các chế phẩm này được b sung vào trong thức ăn dưới dạng men vi sinh, đ ng thời được b sung vào nước để xử l môi trường Gần đây, chế phẩm sinh học Bo ashi được chiết xuất

từ lá trầu của nhóm nghiên cứu Khoa Thủy sản, trường Đại học Nông Lâm Huế được xem là một trong những hướng nghiên cứu đột phá trong việc phòng và trị bệnh cho tôm cá Thành phần hệ vi sinh v t trong chế phẩm này bao g m vi khuẩn lactic (50%), vi khuẩn quang hợp (20%), nấm men (20%), xạ khuẩn (5%), nấm sợi (5%) Qua kết quả thử nghiệm của Công ty TNHH Hải Nông Phát thành phố H Chí Minh trên một số ao nuôi cá tra, basa từ tháng 4/2006 đến nay đã đạt được những thành công nhất định trong việc phòng bệnh gan th n mủ (Nguyễn Khoa Diệu Hà, 2009)

b Bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn và một số nghiên cứu về biện pháp phòng bệnh

Bệnh gan th n mủ trên cá tra xuất hiện lần đầu tiên vào cuối năm 1998, tác nhân gây bệnh l c đầu được xác định b i nhóm nghiên cứu của trường Đại học

Stirling phối hợp với trường Đại học Cần Thơ là Bacillus sp (Ferguson et al., 2001)

Đến năm 2002 nh m nghiên cứu này đã đính chính lại tác nhân gây bệnh gan th n

mủ trên cá tra là vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Crumlish et al., 2002) E ictaluri được báo cáo đầu tiên trên cá nheo Mỹ, Ictalurus punctatus, vào năm 1979 aw e, 1979) E ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá da trơn, hội

chứng này được gọi tắt là ESC (Enteric Septicaemia of Catfish) và có thể dẫn đến tỉ

lệ chết cao cá nheo Mỹ (Austin & Austin, 1999)

Bệnh này được tìm thấy tại bất cứ nơi nào nuôi cá nheo tại nước Mỹ Bệnh xảy ra tất cả các kích cỡ cá nuôi nhưng t p trung giai đoạn cá hương và cá giống

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 12 MSSV:207111033

(USDA/APHIS, 2003) Sự thiệt hại cho nghề nuôi công nghiệp của cá da trơn do ESC được ước tính hàng năm hoảng 4-6 triệu USD từ năm 1990 và đã tăng nhanh sau đ Khoảng 70% các hộ nuôi được khảo sát vào năm 1996 cho thấy nguyên nhân

từ ESC đã gây ra thiệt hại cao nhất cho các hộ nuôi cá da trơn, với 57% số hộ nuôi bị thiệt hại nặng (USDA/APHIS, 1997) Bệnh xảy ra theo mùa, đặc biệt xảy ra thường xuyên khi nhiệt độ nước nằm trong khoảng 20 – 29oC (Tucker et al., 2004) Cá bị bệnh ESC thường giảm ăn, lờ đờ, bơi dạng xoay vòng, xuất huyết xung quanh vùng miệng và phần bụng Nhiều vết l loét nhỏ màu trắng có thể xuất hiện trên bề mặt da

Cá nhiễm bệnh thường l i mắt và bụng trương to Tuc er et al., 2004

Có khá nhiều nghiên cứu trên thế giới trong lĩnh vực sản xuất vaccine phòng

bệnh do E ictaluri gây ra trên cá da trơn Shoema er và ctv 1999 nghiên cứu ảnh

hư ng của ba loại vaccine sống cải tiến dưới dạng đông khô (Immuno X+5, Immuno2 X+5, Serial 1A) và một loại vaccine sống truyền thống (RE-33) Cá nheo

Mỹ (Ictalurus punctatus được gây miễn dịch bằng phương pháp ngâm các ngày

tu i khác nhau (từ 7 ngày tu i đến 31 ngày tu i) Kết quả cho thấy hiệu lực của vaccine đã thể hiện được ngay từ hi cá được gây miễn dịch giai đoạn 7 ngày tu i

và 10 ngày tu i Tỉ lệ sống của cá 7 ngày tu i được gây miễn dịch dao động trong khoảng 58,4 – 77,5%, đối với cá 10 ngày tu i thì dao động trong khoảng 64,1 –

78,9% Ba năm sau đ , nh m tác giả này cũng đã nghiên cứu phương pháp in ovo đối

với việc sử dụng các loại vaccine sống cải tiến này, khi gây miễn dịch từ giai đoạn trứng của cá nheo Mỹ, bằng phương pháp ngâm trong thời gian 10 phút Kết quả cho thấy phương pháp gây miễn dịch này là khá hiệu quả, với tỉ lệ bảo hộ khoảng 59,7% (Shoemaker et al., 2002)

Trong những năm gần đây, một số nhóm nghiên cứu đã quan tâm đến việc phát

triển các chế phẩm vi sinh (probiotic) và một số chế phẩm sinh học khác b sung vào

thức ăn để phòng bệnh ESC cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus)

Shelby và ctv (2007) b sung hai loại chế phẩm vi sinh có chứa Pediococcus sp

và Enterococcus sp (riêng lẻ hoặc phối hợp với nhau) vào thức ăn của cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) giống và cho ăn trong vòng 5-8 tuần Sau đ tiến hành đo các

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 13 MSSV:207111033

chỉ tiêu: tăng trọng, hệ số chuyển đ i thức ăn FCR và các thông số miễn dịch như protein huyết thanh, immunoglobulin, lysozyme, complement Các số liệu về vi sinh cho thấy hai chủng vi khuẩn probiotic vẫn t n tại được trong thức ăn sau hi b sung trong thời gian bảo quản trong vòng 4 tuần Tuy nhiên các tác giả không tìm thấy sự khác biệt nào về tăng trọng, đáp ứng miễn dịch cũng như tính háng bệnh của cá sau thời gian cho ăn thức ăn c b sung probiotic

Aboagye và ctv (2008) thử nghiệm ảnh hư ng của chế phẩm vi sinh Lymnozyme đến tỉ lệ sống của cá nheo Mỹ sau hi được gây nhiễm thực nghiệm với

Edwardsiella ictaluri Kết quả nghiên cứu cho thấy, nghiệm thức có b sung

Lymnozyme vào nước hàng ngày liên tục trong hai tuần, tỉ lệ chết của cá sau khi gây

nhiễm Edwardsiella ictaluri (45%) giảm một cách c nghĩa thống kê (p = 0,002) so

với nghiệm thức đối chứng (80%)

Các nhà khoa học Nauy và Mỹ đã nghiên cứu hiệu quả kháng khuẩn của hai

lọai peptide t ng hợp cecropin B và cecropin P1 đối với một số chủng vi khuẩn gây

bệnh trên cá, trong đ c E ictaluri (Kjuul et al., 1999) N ng độ ức chế tối thiểu

(MIC) của cecropin B dao động từ 0,3-1,3 µM Các dẫn xuất của cecropin B đã được biết đến có họat tính kháng khuẩn đối với nhiều lòai vi khuẩn gây bệnh, và có khả

năng tăng cường tính đề kháng của cá nheo Mỹ gây cảm nhiễm với E ictaluri (Kelly

et al., 1993)

Prebiotic là những hợp chất b sung vào thức ăn, c tác dụng kích thích sinh trư ng và họat tính của hệ vi khuẩn có lợi hịện diện trong hệ tiêu hóa của v t chủ Delzenne & Roberfroid, 1994 Prebiotic thường được sử dụng kết hợp với probiotic (gọi là synbiotic) Các hợp chất đường mạch ngắn đang được sử dụng ph biến như

là prebiotic b sung vào thức ăn thủy sản, trong số đ bao g m: Inulin, oligosaccharide (FOS), transgalacto-oligosaccharide, lactulose (Mahious, 2005), isomalto-oligosaccharide (IMOS) (Li et al., 2009) Hiệu quả về dinh dưỡng và sức khỏe của một số oligosaccharide đã được chứng minh trên cá (Glencross et al., 2003;

fructose-Li & Gatlin, 2005; Pryor et al., 2003) Isomalto-oligosaccharide n ng độ 0,2% sử

dụng kết hợp với vi khuẩn probiotic Bacillus OJ (108 CFU/g thức ăn b sung vào

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 14 MSSV:207111033

thức ăn cho tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei đã gi p điều chỉnh hệ vi sinh v t

đường ruột, tăng cường phản ứng miễn dịch và khả năng đề háng đối với virus đốm trắng, thông qua hiệu ứng tương hỗ của hai loại chế phẩm này (Li et al., 2009) Mannan-oligosaccharide (MOS), một loại prebiotic chiết xuất từ nấm men, đã được chứng minh là có hiệu quả tăng cường đáp ứng miễn dịch và tính đối háng đối

với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus (Welker et

al., 2007)

2.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng probioic trong nuôi trồng thủy sản trên thới giới và tại Việt nam

2.4.1 Tình hình nghiên cứu probiotic trên thế giới

Sản lượng nuôi tr ng thủy sản hiện nay chiếm đến 40% t ng sản lượng thủy sản, với t ng giá trị vào khỏang 78 tỉ USD (FAO, 2008) Vai trò quan trọng của nuôi

tr ng thủy sản ngày càng gia tăng đáng ể, do sản lượng khai thác thủy sản đã tr nên bão hòa và nhu cầu tiêu thụ hải sản ngày càng tăng Tuy nhiên, vấn đề dịch bệnh

đang gây t n thất rất lớn cho nghề nuôi thủy sản Những bệnh gây ra b i Vibrio spp.,

Aeromonas spp., Pseudomonas spp., Streptococcus spp., xảy ra rất ph biến và dẫn

đến tỉ lệ chết cao của tôm cá nuôi (Watson et al., 2008)

Khi người nuôi gặp phải vấn đề dịch bệnh, thông thường biện pháp đối phó đầu tiên là sử dụng các hóa chất diệt khuẩn hoặc kháng sinh Việc sử dụng những hóa chất này đã đem lại hiệu quả trong việc phòng và trị bệnh trên v t nuôi (Schwarz

et al., 2001; Phillips et al., 2004) Tuy nhiên, việc lạm dụng hóa chất diệt khuẩn và kháng sinh trong nông nghiệp cũng như trong nuôi tr ng thủy sản đã dẫn đến sự xuất hiện các dòng vi khuẩn kháng thuốc (Schwarz et al., 2001; Akinbowale et al., 2006) Những thiệt hại lớn nhất đã xảy ra cho nghề nuôi tôm trên thế giới, khi việc nuôi tôm thiếu quy họach cộng với việc lạm dụng háng sinh đã đưa đến hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và suy giảm về năng suất nuôi nhiều nước châu Á (Karunasagar et al., 1994; Moriarty, 1999) Nghiêm trọng hơn, những dòng vi khuẩn kháng thuốc có thể

Trong một số trường hợp, những vi khuẩn ứng cử viên sau khi sàng lọc in vitro

sẽ được kiểm tra in vivo qui mô nhỏ về đặc tính an toàn đối với v t chủ (Chythanya et al., 2002; Hjelm et al., 2004) và khả năng bảo vệ v t chủ khi gây cảm nhiễm ngược với tác nhân gây bệnh (Irianto & Austin, 2002; Lategan et al., 2004) Trong một số nghiên cứu khác, các ứng cử viên sau khi sàng lọc sẽ tiếp tục được kiểm tra những đặc tính hác như hả năng chịu đựng muối m t (Chabrillon et al., 2006), khả năng ích thích hệ miễn dịch (Irianto & Austin, 2003), cạnh tranh vị trí bám (Chabrillon et al., 2006), cạnh tranh chất dinh dưỡng (Gram et al., 1999) Trong

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 16 MSSV:207111033

thực tế, những nghiên cứu này là cần thiết để kiểm tra các vi khuẩn probiotic ứng cử viên có thể hiện những cơ chế tác động nào khác hay không Ngoài ra, những thử nghiệm in vivo là rất cần thiết, b i vì một chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn khác điều kiện in vitro, không nhất thiết là sẽ thể hiện đặc tính đối háng đ hi c

sự hiện diện của v t chủ

2.4.2 Tình hình sử dụng các chế phẩm probiotics trong hoạt động nuôi trồng thuỷ sản ở Việt Nam

hững năm gần đây, để giảm thiểu những bất lợi do sử dụng h a chất trong nuôi tr ng thủy sản, việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm sinh học để phòng bệnh và cải thiện môi trường trong quá trình nuôi tôm nước ta đang phát triển mạnh FICen, 2007 iện nay c hàng trăm loại chế phẩm sinh học được sử dụng trong lĩnh vực nuôi tr ng thủy sản, bao g m chế phẩm trộn vào thức ăn và chế phẩm

xử l nước Đa số các chế phẩm c ngu n gốc ngoại nh p hay sử dụng công nghệ từ nước ngoài để sản xuất phân phối tại Việt am Tuy nhiên, yếu tố lợi nhu n được đặt lên hàng đầu, chưa th t sự quan tâm đ ng mức đến quyền lợi của người sử dụng Chưa ể đến tác dụng của chế phẩm ra sao b i vì những chế phẩm ngoại nh p hay chủng vi sinh v t từ nước ngoài đưa vào Việt am c phù hợp với điều iện của Việt

am hay hông thì việc đưa một lượng đáng ể chủng vi sinh v t vào Việt am cũng là một mối nguy hiểm tiềm tàng, xét về hía cạnh an toàn sinh học Lương Đức Phẩm, 2007

Giá bán của các loại chế phẩm này há cao, nên đã gây h hăn cho người nuôi

tr ng thủy sản trong việc lựa chọn một sản phẩm vừa đạt chất lượng vừa c giá thành

rẻ Với l do đ ,việc đẩy mạnh nghiên cứu để sản xuất probiotic dùng trong chăn nuôi và nuôi tr ng thủy sản là một yêu cầu tất yếu Tuy nhiên sản phẩm tinh chế thì giá thành còn cao nên nước ta hiện nay vẫn sử dụng ngu n nguyên liệu chủ yếu là các loại phụ phẩm của ngành nông nghiệp Do đ giá thành của probiotic giảm xuống nhiều và cũng gi p cho v t nuôi tiêu h a tốt hơn, giảm tỉ lệ bệnh và g p phần cải thiện môi trường

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 17 MSSV:207111033

Viện Sinh học hiệt đới đã thành công trong việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm probiotic BioII g m hỗn hợp các vi sinh v t sống và enzyme tiêu h a dùng trong nuôi tr ng thủy sản Chế phẩm này đã được hảo nghiệm trên ao nuôi tôm s các tỉnh cho ết quả hả quan và được Công ty thuốc th y và nuôi tr ng thủy sản đưa ra thị trường Võ Thị ạnh và ctv, 2004

Các nhà hoa học tại Viện h a học các hợp chất thiên nhiên đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm EBS2 để b sung vào thức ăn trong nuôi tr ng thủy sản EBS2 c vai trò quan trọng như những vitamin ích thích trong quá trình sinh trư ng của các đối tượng nuôi tr ng thủy sản Kết quả thử nghiệm với cua biển cho thấy trong 22 ngày đầu lô cua dùng thức ăn t ng hợp c b sung EBS2 đạt tốc độ tăng trư ng 3,5% Trong hi đ lô hông b sung EBS2 c tốc độ tăng trư ng là 0,9% và lô dùng thức ăn tự nhiên c tốc độ tăng trư ng là 0,5% Phòng h a sinh biển, 2001

goài ra, chế phẩm sinh học Biochie bao g m một số chủng thuộc chi

Bacillus (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis) và Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus) Ch ng c chức năng phân hủy hợp chất

hữu cơ bằng cách tiết ra các enzyme như protease, amylase Ch ng còn c hả năng

t ng hợp chất háng huẩn làm giảm số lượng vi sinh v t gây bệnh phát triển quá

mức như Vibrio, Aeromonas… Sử dụng chế phẩm sinh học Biochie để xử l nước

nuôi tôm cá c tác dụng làm giảm lượng bùn hữu cơ, giảm chu ỳ thay nước và cải thiện môi trường tăng oxi hòa tan, giảm COD, BOD Bên cạnh đ , còn c tác dụng giảm đáng ể tỷ lệ chết, tỷ lệ còi cọc, tăng sản lượng và giảm mùi hôi của ngư trường

Vũ Thị Thứ và ctv, 2004a

goài những chế phẩm probiotic trên, chế phẩm sinh học BioF c chứa chủng

Lactobacillus acidophillus được sử dụng trong nuôi tr ng thủy sản c tác dụng tăng

hả năng hấp thụ thức ăn và hạn chế bệnh do Aeromonas, Vibrio… gây ra hững

nghiên cứu gần đây đã cho thấy hi b sung BioF vào thức ăn tôm làm tăng tỷ lệ sống và đặc biệt tăng đáng ể sản lượng tôm trong ao Kết quả bước đầu cho thấy sử

EM dạng lỏng được nhân giống từ EM gốc của h t Bản với m t độ tế bào vi sinh

v t c lợi cho nuôi tr ng thủy sản thấp < 107 CFU/ml nên hiệu quả sử dụng hông cao Để g p phần hoàn thiện và nâng cao hiệu quả chế phẩm EM, phòng Vi sinh ứng dụng - Viện Sinh học hiệt đới đã nghiên cứu sản xuất ra chế phẩm VEM sử dụng

b sung với chế phẩm BioII Chế phẩm VEM Vietnamese effective microorganisms g m t p hợp các vi sinh v t hữu ích c trong chế phẩm EM goài

ra, còn c thêm một số lòai vi huẩn Bacillus spp được chọn lọc và vi huẩn quang

dưỡng, hông chỉ c tác dụng cải thiện môi trường nước nuôi tr ng thủy sản mà còn cạnh tranh và đối háng với các loài vi huẩn gây bệnh tôm, cá Võ Thị ạnh và ctv, 2004)

Tại Bạc Liêu, nhiều hộ nuôi tôm đã áp dụng phương pháp nuôi c b sung chế phẩm vi sinh Mô hình này bước đầu mang lại hiệu quả há cao Ưu điểm của

mô hình nuôi tôm sử dụng chế phẩm vi sinh là tạo nên môi trường sạch, chi phí thấp, tôm phát triển nhanh và hạn chế dịch bệnh, nhất là bệnh đốm trắng, đầu vàng, phân trắng FICen, 2007

Tại xã Tân ưng Đông - huyện Cái ước – Tỉnh Cà Mau, việc áp dụng mô hình nuôi tôm bằng chế phẩm EM.ZEO bước đầu mang lại hiệu quả hả quan, giữ cho môi trường của ao luôn sạch, tôm hoẻ mạnh mà hoàn toàn hông sử dụng các hoá chất độc hại, háng sinh Trong suốt quá trình nuôi, tôm phát triển tốt và hông

bị nhiễm bệnh Đây là mô hình nuôi tôm công nghiệp mang tính bền vững vì quy trình của dự án sử dụng chủ yếu vi sinh EM.ZEO FICen, 2007

Việc sử dụng các chế phẩm vi sinh đã mang lại nhiều lợi ích cho người nuôi như: Sẽ giảm được vất vã, tăng lợi nhu n và thức hơn về việc bảo vê môi trường xung quanh; đối với v t nuôi thì mang lại sự hỏe mạnh, sức đề háng tốt hơn với bệnh t t, tốc độ tăng trư ng nhanh hơn,…và cải thiện được môi trường nuôi Tuy

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 19 MSSV:207111033

nhiên, người nuôi cần ch đến những thông tin về sản phẩm c thể hỏi iến của các chuyên gia, tránh lạm dụng quá mức hay sử dụng các chế phẩm vi sinh hông phù tại Việt am

2.5 Ứng dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản

2.5.1 Định nghĩa probiotic

Đã c há nhiều định nghĩa cho thu t từ này của các tác giả hác nhau như: Probiotic là những vi sinh v t như vi huẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh v t đường ruột của sinh v t chủ (Parker, 1974)

Van De Kerkove (1979) Barows và Deam (1985 , Lestradet 1995 cũng cho rằng probiotic được sử dụng như một liệu pháp trong việc chũa tri bệnh tiêu chảy hay như là cách phòng bệnh người và động v t để giảm đến mức tối thiểu sự phát triển tán của vi sinh v t đường ruột, sự kháng lại liệu pháp sinh học và sự di căn của chứng viêm dạ dày và ruột

avenaar 1992 đã m rộng định nghĩa về probiotic : “ Probiotic được định nghĩa như là các chủng riêng lẻ hay h n hợp các vi sinh v t sống có ảnh hư ng có lợi cho sinh v t chủ bằng cách cải thiện những đặc tính của vi sinh v t bản địa”

Riêng đối với động v t thủy sản vốn có mối quan hệ gần gủi với môi trường xung quanh Mầm bệnh nguy hiểm có thể t n tại tự do trong môi trường nước và tăng trư ng độc l p với v t chủ (Hansen và Olafsen;Verschuere et al., 2000 được động v t thủy sản ăn vào liên tục thông qua quá trình điều tiết thẩm thấu và bắt m i Dựa trên mối quan hệ phức tạp mà một loại vi sinh v t nước có với môi trường xung quanh, định nghĩa probiotic trong nuôi tr ng thủy sản cũng cần thay đ i Verschuere

và ctv 2000 đưa ra định nghĩa mới nhất “ Probiotic là chất b trợ vi khuẩn của môi trường xung quanh hoặc hệ vi khuẩn c liên quan đến v t chủ, đảm bảo việc cải thiện chất lượng thức ăn hoặc làm tẳng giá trị dinh dư ng của n , nâng cao đáp ứng của

v t chủ đối với mầm bệnh hoặc cải thiện chất lượng nước”

2.5.2 Các thành phần của probiotic

Các chủng loại vi sinh v t sử dụng trong probiotcs được xác định có sự hiện diện của cả vi khuẩn gram âm, vi khuẩn gram dương, bacteriophages, nấm men và cả

nấm đơn bào Irianto va Austin, 2002

a Vi khuẩn gram âm

Pseudomonas fluorescens được chứng minh là c hả năng ức chế Saprolenia

và A salmocinida trên các loài cá c vây và ngăn chặn các mầm bệnh trên tôm từ

Vibrio spp, đ ng thời c tác dụng làm giảm tỷ lệ chết trên cá h i Irianto và Austin,

2002)

Một vi huẩn gram âm hác cũng c tác dụng cải thiện chất lượng của ấu

trùng cua, hàu và cá bơn, đ là V proteolyticus Chủng này cải thiện quá trình tiêu

h a protein cá bơn hi được cung cấp qua con đường cho ăn, Alteromonas làm

tăng tỷ lệ sống của ấu trùng pacific oyster Irianto và Austin, 2002

b Vi khuẩn gram dương

Cá vi sinh v t gram dương, hiếu hí và sinh bào tử như chủng Bacillus spp

được sử dụng như probiotics nhằm mục đích nâng cao chất lượng nước ao nuôi do ức chế hệ vi sinh v t gây hại trong nước và làm giảm số lượng mầm bệnh Một lợi ích trực tiếp trong việc sử dụng trực huẩn này là làm giảm việc sử dụng háng sinh, h a chất trong việc nuôi tr ng thủy sản Irianto và Austin, 2002

goài các chủng Bacillus, vi huẩn lactic trong các chế phẩm probiotics được

ứng dụng há nhiều trong nuôi tr ng thủy sản như sử dụng chế phẩm chứa

Lactobacillus bulgaricus, L acidophillus, L sporogenes, L casei, L plantarum, Streptococcus thermophillus (Venkat et al., 2004 Lợi ích của việc sử dụng vi huẩn

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 21 MSSV:207111033

lactic trong chế phẩm probiotics là làm giảm tỷ lệ chết cảu ấu trùng cá Irianto và

Austin, 2002) đ ng thời tăng hiệu quả hấp thu thức ăn Ven at et al., 2004)

cá thơm và từ đ họ đi đến ết lu n rằng bacteriophages làm giảm nhanh chống số

lượng tế bào vi huẩn P plecoglossicida trong th n của ca thơm và trong môi trường

nước Irianto và Austin, 2002

d Nấm men

ấm men được ứng dụng trong probiotic ph biến nhất là chủng

Saccharomyces cerevisiae Với sự hiện diện của nấm men, n sẽ bám dính vào ruột,

làm nâng cao sự tiết enzyme amylase và ích thích các enzyme màng ấu trùng sau

27 ngày tu i Irianto và Austin, 2002

e Vi tảo

Vi tảo Tetraselmis suecica, được sử dụng làm thức ăn cho các loài tôm thuộc

họ tôm he và các loài cá thuộc họ cá h i đã phát hiện ra rằng loài nấm này làm giảm

m t độ bệnh do vi huẩn Trên cơ s đ , một số tác giả cũng đã đưa ra phương thức hoạt động của vi nấm này chống lại các tác nhân gây bệnh dựa vào sự hiện diện của các hợp chất háng huẩn hông chuyên biệt trên tế bào vi tảo Irianto và Austin, 2002)

2.5.3 Cơ chế tác động của pobiotic

a Tạo các hợp chất có khả năng ức chế

Những loài vi khuẩn khác nhau có thể giải phóng ra một số hợp chất hóa học

có khả năng tiêu diệt hoặc kiềm hãm các cộng đ ng vi khuẩn hác để đấu tranh giành lấy năng lượng hay các chất hóa học (Fredrickson và Stephanopoulos,

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 22 MSSV:207111033

1981).Có rất nhiều nghiên cứu in vitro đã chứng minh khả năng ức chế vi khuẩn gây

bệnh của một số chủng vi khuẩn được chọn lựa b sung vào môi trường ương nuôi

ấu trùng hưng cần phải nhấn mạnh những hợp chất ức chế hay đối kháng với các

vi khuẩn khác trong các nghiên cứu in vitro hông đảm bảo rằng những chủng probiotic có tiềm năng này vẫn còn có hiệu quả trong các nghiên cứu in vivo trong

cùng một điều kiện ứng dụng (Gram et al., 2001) Vì v y, chỉ có một số nghiên cứu, hầu hết là trên ấu trùng của giáp xác và nhuyễn thể đã công nh n hiệu quả ức chế vi khuẩn gây bệnh của một số chủng vi khuẩn probiotic khi ứng dụng trong thực nghiệm

Maeda và Liao 1992 đã thử nghiệm hiệu quả một số chủng vi khuẩn được tách chiết từ môi trường nuôi tôm sú lên sự phát triểu của ấu trùng tôm Trong số bảy chủng được thử nghiệm, chủng PM-4, được b sung cùng với tảo huê đã cho tỉ lệ sống và tỉ lệ lột xác của ấu trùng cao so với những lô thí nghiệm khác chỉ được b sung tảo khuê Trong một thí nghiệm kiểm soát sinh học, Maeda 1994 sau đ đã

chứng minh rằng chủng PM-4 có khả năng iềm chế sự phát triển của Vibrio spp

bằng cách tạo ra các hợp chất c đặc tính kháng khuẩn Riquelme et al 1997 cũng

đã lựa chọn các chủng vi khuẩn có lợi xuất hiện điều kiện tự nhiên có khả năng làm

tăng tỉ lệ tăng trư ng và tỉ lệ sống của ấu trùng điệp Chi Lê Argopecten purpuratus

Mười một trong số 506 chủng vi khuẩn đã sản xuất ra hợp chất có khả năng ức chế

Vibrio anguillarum c liên quan đến mầm bệnh của ấu trùng (VAR: Vibrio anguillarum-related) Một trong số những chủng này (thuộc nhóm Vibrio sp.) có thể

bảo vệ ấu trùng của con điệp Chi Lê chống lại mầm bệnh từ VAR trong một sự gây

nhiễm sau đ Tương tự, chủng Roseobacter sp BS107 cũng tiết ra hợp chất kháng khuẩn chống lại Vibrio anguillarum Hoạt tính kháng khuẩn hoạt động cao nhất sau khi nuôi cấy chủng V.anguillarum 48 giờ trong dịch n i của BS107 Trong thực

nghiệm, dịch n i không tế bào của chủng BS107 th c đẩy một cách đặc hiệu tỉ lệ

sống của ấu trùng điệp Chi Lê (Ruiz-Ponte et al,1999) Chủng Aeromonas media A199 đã bảo vệ ấu trùng con hầu Thái Bình Dương Crassostrea gigas) khi chúng được cảm nhiễm với Vibrio tubiashii ơn nữa, A199 còn thể hiện hoạt tính đối

kháng chống lại một dãy rộng các vi khuẩn gây bệnh trên cá, nhóm giáp xác và

kháng khuẩn kháng nấm rộng Lactobacillus brevis (108 CFU/ml được sử dụng để

kiểm soát sự phát triển của Vibrio alginolyticus trong môi trường nuôi Artemia Trong một nghiên cứu in vitro khác, các sản phẩm ngoại bào được tiết ra từ L.breví cũng c thể ức chết sự phát triển của V.alginolyticus (Villamil et al., 2003)

Trong tất cả các nghiên cứu trên, hiệu quả của probiotic được đo bằng sự cải thiện tỉ lệ tăng trư ng và tỉ lệ sống của ấu trùng thông qua các khảo sát trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên, không có một nghiên cứu nào t p trung vào việc xác định

n ng độ các hợp chất kháng khuẩn trong các nghiên cứu in vivo nhằm thiết l p mối

quan hệ n ng độ phản ứng Một số nghiên cứu có kiểm soát với các chủng probiotic đột biến bị làm mất khả năng sản xuất ra các hợp chất có khả năng ức chế nên được

thực hiện nhằm giải thích cơ chế tác động in vivo

b Đấu tranh giành lấy các chất hóa học và năng lượng có sẵn

Đấu tranh giành lấy các chất dinh dưỡng hay năng lượng có sẵn có thể đ ng một vai trò quan trọng trong việc hình thành hệ vi sinh v t đường ruột hay trong môi trường nuôi thủy sản Đã c ba nghiên cứu thực nghiệm về lĩnh vực này được ghi

nh n, các nghiên cứu này được thực hiện trong các hệ thống nuôi thức ăn tự nhiên nghèo chất hữu cơ và trong ương cá bơn bột Rico-Mora et al 1998 đã chọn một chủng vi khuẩn (SK-05) có khả năng phát triển trên cơ chất nghèo hữu cơ, và hi cấy

vào dung dịch nuôi tảo khuê (Skeletonema costatum) chúng có thể ngăn cản sự phát triển của Vibrio alginolyticus khi vi khuẩn này được cấy vào Hiệu quả ức chế

V.alginolyticus của SK-05 đã được chứng minh trong điều kiện in vitro, các tác giả

đã công bố rằng chủng này có thể lấn át hoàn toàn V.alginolyticus b i khả năng cạnh

tranh hấp thu các chất tiết của tảo khuê với vi khuẩn Verschuere và cộng sự (1999)

đã chọn chín chủng vi khuẩn có khả năng ảnh hư ng lên tỉ lệ sống và tỉ lệ sinh

trư ng của Artemia nauppli Khi b sung các chủng vi khuẩn này vào môi trường

đã chết để xác định có phải ảnh hư ng của dinh dưỡng c liên quan đến khả năng bảo vệ này hay không Siderophore là những tác nhân với trọng lượng phân tử nhỏ

có khả năng gắn kết phân tử sắt có thể hòa tan được sắt bị kết tủa hoặc tách nó ra khỏi hỗn hợp chất này, do đ c lợi cho sự phát triển của vi khuẩn (Neilands, 1981) Các chủng vi khuẩn không gây hại có khả năng sản xuất ra siderophore có thể được

sử dụng như probiotic để cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh khi tính sinh bệnh có liên quan đến việc sản xuất siderophore và đấu tranh giành lấy các phân tử sắt trong môi trường thiếu sắt trong giai đoạn cần thiết (Verschuere et al., 2000b) Chủng vibrio E có thể cải thiện khả năng đề háng đối với vi khuẩn gây bệnh vibrio P,

Vibrio splendidus của cá bơn bột Sự mô tả in vitro cho thấy rằng, vibrio E có thể

phát triển trong môi trường đã bị tách hết sắt trong khi vẫn sản xuất ra siderophore

b i phương pháp nhuộm chrome azurol S trong hi vibrio P thì hông ơn nữa, cá

bơn bột được cho ăn rotifer được làm giàu chất siderophore deferoxamine của vibrio

E đã đạt được tỉ lệ sống cao hơn sau hi gây nhiễm với vibrio P, so với lô đối chứng

(Gatesoupe, 1997) Từ những kết quả có liên quan trong các thí nghiệm in vitro và in

vivo, các nhà khoa học đã ết lu n rằng hiệu quả probiotic của vibrio E có thể một

phần là do sự đấu tranh giành lấy phân tử sắt với tác nhân gây bệnh

c Sự đóng góp về mặt dinh dưỡng

Một số tài liệu đã chứng minh rằng đối với một số loài động v t thì hệ thống

vi khuẩn đường ruột đ ng một vai trò quan trọng trong dinh dưỡng của v t chủ Vì

v y, nhiều cách khác nhau trong việc thay đ i hệ thống vi khuẩn đường ruột để đạt được những hiệu quả có lợi như tăng sự tăng trư ng và khả năng tiêu h a của v t

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 25 MSSV:207111033

chủ, đã được khảo sát trên gia s c và trên người (Burr et al, 2005) Một vài nghiên cứu đã chứng minh ảnh hư ng về mặt dinh dưỡng của vi khuẩn probiotic lên sự phát triển và tỉ lệ sống của ca, nhóm giáp xác và nhuyễn thể Ấu trùng của con hầu vô

trùng (Crassostrea gigas được cho ăn tảo giáp vô trùng (Isochrysis galbana) có b

sung thêm dòng vi khuẩn CA2, đã làm tăng tỉ lệ sống (từ 21% đến 22%) và tốc độ tăng trư ng (từ 16% đến 21%) so với lô đối chứng (Douillet và Langdon, 1993) Việc sử dụng thực phẩm vô trùng cho ấu trùng hào vô trùng có thể ngăn chặn sự xâm

nh p của các vi khuẩn đường ruột hác, do đ những hiệu quả được ghi nh n có thể qui cho chủng CA2 Tuy nhiên, tác giả không kiểm tra trường hợp cho ấu trùng hàu

ăn tảo được b sung vi khuẩn chết để có thể khẳng định hiệu quả cải thiện tốc độ tăng trư ng và tỉ lệ sống là do probiotic hay do dinh dưỡng

Nấm men được biết đến trong dinh dưỡng động v t b i vì ch ng đ ng vai trò như một ngu n sản xuất polyamin, có thể nâng cao khả năng hoạt động của hệ thống ruột trư ng thành (Peulen et al., 2000) Gần đây, một số chủng nấm men rất có hiệu quả khi b sung vào khẩu phần ăn của cá đang biến thái Tovar-Ramirez et al (2002,

2004 đã nghiên cứu về enzym đường ruột được tiết ra từ cá vượt chẽm bột châu Âu

(Dicentrarchus labrax hi cho ăn hẩu phần g m hỗn hợp nhiều dòng nấm men khác nhau của Saccharomyces cerevisiae và Debaryomyces hansenii Sự tăng trư ng

và tỉ lệ sống của ấu trùng ăn hẩu phần ăn hỗn hợp này cao hơn so với lô đối chứng Các tác giả này còn cho là hiệu quả phụ thuộc vào liều lượng của nấm men đối với hành vi ấu trùng, có thể được giải thích là do số lượng polyamine được tiết ra b i nấm men trong khoang ruột của ấu trùng Tuy nhiên, họ không chứng minh được hiệu quả probiotic của nấm men là do sự kích thích của enzym tiêu hóa của v t chủ hay hiệu quả kích thích miễn dịch Tương tự, Wache et al 2006 đã iểm tra hiệu

quả của hai chủng nấm men S.cerevisiae và một chủng D.hansenii như là ngu n thực phẩm b sung cho cá bột h i cầu vòng (Onchorynchus mykiss) Các chủng

S.cerevisiae var.boulardii và D.hansenii dường như ích thích sự trư ng thành của

hệ thống tiêu hóa của cá bột h i cầu vòng thông qua việc gia tăng hàm lượng enzym

tiêu hóa theo một cơ chế mà đến nay vẫn chưa được biết đến Ấu trùng của Artemia

vô trùng được nuôi trong dung dịch có chứa mười chủng vi khuẩn (chết hoặc sống)

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 26 MSSV:207111033

kết hợp với bốn loại thức ăn tự nhiên vô trùng khác nhau (hai dòng nấm men bánh

mì S.cerevisiae và hai dòng vi tảo Dunaliella tertiolecta), khác nhau về giá trị dinh

dưỡng của chúng (Marques et al, 2005) Khi kết hợp loại thức ăn tự nhiên có chất lượng trung bình hay ém như nấm men ) và vi khuẩn đã chết, chỉ có 5.9% t ng khối lượng sinh khối được sử dụng gây ảnh hư ng mạnh mẽ lên tỉ lệ sống của

Artemia Những ảnh hư ng này bị giảm th m chí mất đi hi ngu n thức ăn c chất

lượng cao được sử dụng, có thể là nhờ việc cải thiện tình trạng dinh dưỡng và sức

khỏe nói chung của Artermia Thêm vào đ , một vài nghiên cứu trên vi khuẩn probiotic (ví dụ như GR8, dòng vi huẩn Cytophaga sp được b sung vào khi còn sống đã cải thiện một cách hiệu quả sự phát triển của Artermia, cao hơn nhiều so với

b sung khi chết, không phụ thuộc vào loại thức ăn chính Điều này cho thấy sự tương tác dương tính giữa v t chủ và vi sinh v t hông liên quan đến giá trị dinh

dưỡng của vi khuẩn hay của các loài ăn lọc như Artemia Những thí nghiệm đã được

miêu tả, đặc biệt là với các động v t vô trùng, cho thấy rằng sự chăm s c tốt nhất cần phải được thực hiện trong điều kiện thí nghiệm được bố trí để có thể làm phân biệt hiệu quả dinh dưỡng thuần túy của sinh khối vi khuẩn hi được b sung so với mối tương tác dương tính giữa v t chủ và vi sinh v t

β-Dòng mnn9 mang thể đột biến vô hại đã làm giảm n ng độ mannoprotein gắn

trên màng tế bào và làm nâng cao n ng độ của chitin và glucan (Magnelli et al.,

2002) Dòng nấm men này có thể giúp Artemia chống lại dòng vi khuẩn cơ hội (Vibrio proteolyticus) và dòng vi khuẩn gây bệnh bắt buộc (V campbellii) Các nhà

khoa học này cho rằng sự thay đ i thành phần màng tế bào (m t độ β-glucan cao đã

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 27 MSSV:207111033

giúp Artemia chống lại cả hai chủng Vibrio chứ không phải nhờ giá trị dinh dưỡng tốt hơn của dòng mnn9 Các nghiên cứu theo hướng này có thể b sung dữ liệu về

miễn dịch để bắt đầu làm rõ các cơ chế có liên quan

e Cải thiện chất lượng nước ao nuôi

Các chế phẩm probiotic cũng c tác dụng cải thiện môi trường nước ao nuôi

tr ng thủy sản Verchuere et al., 2000 Trong nhiều nghiên cứu, chất lượng môi trường nước ao nuôi được cải thiện hi b sung probiotic, đặc biệt là hi b sung chế

phẩm c chứa các chủng Bacillus sp vì Bacillus là vi huẩn gram dương rất hiệu quả

trong việc biến đ i các chất hữu cơ thành CO2 so với vi huẩn gram âm Verchuere

et al., 2000) ơn nữa, các chế phẩm probiotic cũng c hả năng tạo nên sự cân bằng giữa 3/NO2/NO3 trong nước với sự hiện diện của các vi huẩn nitrate h a

như Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp Trong điều iện môi trường nước ao nuôi

c n ng độ 3 cao, Nitrosomonas sp sẽ chuyển đ i 3 thành NO2 , sau đ

Nitrobacter sp sẽ chuyển đ i O2 thành NO3 , là hợp chất hông gây độc cho v t

nuôi (Sahu et al., 2008 Các chủng vi huẩn nitrate h a sẽ tiết ra polymer cho phép

ch ng gắn ết trên bề mặt và hình thành nên biofilm Và chính biofilm này đã làm

giảm đến 50% tỷ lệ ammonia và nitrite trong môi trường ao nuôi Sahu et a.l, 2008)

goài các vi huẩn nitrate h a, các chủng vi huẩn phân hủy sulfur, methane cũng

x tác dụng cải thiện môi trường nước ao nuôi tr ng thủy sản (Sahu et al., 2008)

f Can thiệp vào hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh

Trong th p ỷ gần đây, cụm từ “quorum sensing”được nhắc đến như một quá trình thông tin giữa tế bào với tế bào vi huẩn Các phân tử dấu hiệu quorum sensing như A L -acyl homoserin lactone c liên quan đến quá trình điều hòa các nhân tố gây độc nhiều vi huẩn gây bệnh Sự phá vỡ hệ thống quorum sensing được xem là một liệu pháp chống lại sự xâm nhiễm mới trong nuôi tr ng thủy sản Furanone bị

halogen h a được tạo ra b i tảo biển đỏ Delisea pulchra được xem là một chất ức

chế quorum sensing đầy hứa hẹn Khi b sung hợp chất này với n ng độ đầy đủ bảo

vệ Branchionus, Artemia hông bị ảnh hư ng b i Vibrio (Tinh et al, 2007)

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 28 MSSV:207111033

2.6 Bẻ gãy quá trình quorum sensing – cách tiếp cận mới trong việc kiểm sóat hệ vi sinh trong nuôi trồng thủy sản

2.6.1 Định nghĩa quá trình quorum sensing

Vi khuẩn có thể giao tiếp với nhau sử dụng các phân tử tín hiệu hóa học Chúng tiết ra, tiếp nh n và phản ứng đối với sự tích lũy của những phân tử tín hiệu này Việc phát hiện các phân tử tín hiệu trong môi trường cho phép vi khuẩn phân biệt giữa các quần thể vi khuẩn m t độ thấp và m t độ cao, và kiểm sóat việc biểu thị gen đối với sự thay đ i về m t độ tế bào Quá trình này gọi là “quorum sensing”, cho phép một quần thể vi khuẩn kiểm sóat có phối hợp sự biểu thị gen của cả quần xã Nhiều kiểu hình vi khuẩn được điều khiển b i quorum sensing, bao g m sự cộng sinh, độc lực, sự sản xuất kháng sinh, sự tạo thành màng sinh học v.v… Schauder & Bassler, 2001)

Trong thế giới vi khuẩn t n tại cả hai lọai ngôn ngữ quorum sensing, ngôn ngữ ph biến và ngôn ngữ đặc hiệu, cho phép vi khuẩn giao tiếp trong cùng một lòai

và giữa các lòai Quá trình quorum sensing vi khuẩn Gram âm được điều khiển b i phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL) (Fuqua et al., 2001) Ở vi khuẩn Gram dương, quá trình quorum sensing được điều khiển b i các phân tử oligopeptide

có chiều dài 5 đến 17 amino acid (Meritt et al., 2003)

Phân tử A L đựợc chứng minh có liên quan đến các quá trình quorum sensing các vi khuẩn gây bệnh Gram âm người và thực v t, ví dụ như

Pseudomonas aeruginosa (Rumbaugh et al., 2000), Erwinia carotovora, Agrobacterium tumefaciens Whitehead et al., 2001 , cũng như Vibrio harveyi

(Manefield et al., 2000) và những vi khuẩn gây bệnh khác trên cá (Bruhn et al., 2005)

2.6.2 Sự phân hủy sinh học quá trình quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh

Khả năng phân hủy phân tử A L dường như phân bố rộng rãi trong vương quốc vi khuẩn Những enzyme có thể ức chế phân tử A L đã được khám phá các lòai vi khuẩn thuộc nhóm ß-Proteobacteria (Zhang et al., 2002), α-Proteobacteria (Uroz et

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 29 MSSV:207111033

al., 2003) và γ-Proteobacteria Uroz et al., 2003 cũng như một số lòai thuộc nhóm

vi khuẩn Gram dương Dong et al., 2002 hững lòai vi khuẩn này có thể khóa hệ thống quorum sensing của những lòai vi khuẩn cạnh tranh để đạt được ưu thế chọn lọc Ví dụ như, đ là trường hợp của những vi khuẩn sinh sống gần các vi khuẩn điều khiển quá trình tiết ra chất kháng sinh thông qua quorum sensing (Pierson et al., 1998) Quá trình ức chế th t sự các hợp chất tín hiệu có thể được xúc tác b i hai lọai enzyme: AHL lactonase và AHL acylase Bên cạnh đ , enzyme acylase của các sinh

v t b c cao cũng c thể ức chế các phân tử AHL (Xu et al., 2003)(Xu et al., 2003)

a Enzyme AHL lactonase

Dong và cộng sự (2000) sàng lọc hơn 500 chủng vi khuẩn thu từ thực địa và phòng thí nghiệm về họat tính ức chế phân tử AHL Trong số này, 24 chủng cho các họat độ enzyme khác nhau trong việc lọai bỏ phân tử AHL Enzyme chịu trách nhiệm cho việc ức chế A L AiiA được phân l p từ chủng vi khuẩn có họat tính cao

nhất, chủng Bacillus 240B1 Enzyme dạng tinh khiết n ng độ 50 mg/l, làm giảm

n ng độ của N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone từ 20 µM xuống khỏang 5

µM sau 10 phút Khi chạy quang ph ion h a phun điện tử của sản phẩm thủy phân cho thấy enzyme AiiA làm m vòng lactone để tạo thành N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine (Dong et al., 2001) Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy các gen mã

hóa enzyme lactonase phân bố rộng rãi nhiều lòai Bacillus (Dong et al., 2004)

Những enzyme đ ng dạng này cho thấy 90% tương đ ng về trình tự mức độ acid amin

Bằng chứng đầu tiên cho thấy sự ức chế bằng enzyme đối với phân tử AHL có thể được sử dụng như một biện pháp kiểm sóat sinh học được báo cáo trong nghiên cứu của Dong và cộng sự (2000) Trong nghiên cứu này, sự thể hiện của enzyme

AiiA vi khuẩn Erwinia carotovora làm giảm việc tiết ra enzyme phân hủy thành tế

bào b i vi khuẩn gây bệnh xuống chỉ còn 10% và hầu như ức chế được các triệu chứng bệnh thối củ những thực v t mẫn cảm Trong một nghiên cứu in vivo tiếp theo, Molina và cộng sự (2003) thử nghiệm hiệu quả của việc sử dụng một chủng

Bacillus phân hủy AHL trong việc kiểm sóat sinh học đối với bệnh thực v t Chủng

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 30 MSSV:207111033

Bacillus này có thể làm giảm bệnh thối củ gây ra b i E carotovora xuống còn 15%

và bệnh mụn cây cà chua gây ra b i Agrobacterium tumefaciens xuống còn 10% Việc phân hủy phân tử AHL b i chủng Bacillus mang lại một sự bảo vệ hiệu quả

tương đương hoặc tốt hơn so với việc sản xuất kháng sinh b i một chủng kiểm sóat

sinh học Pseudomonas chlororaphis ơn nữa, việc phân hủy các phân tử AHL

không chỉ có tác dụng phòng bệnh mà còn có tác dụng trị bệnh Gần đây, những kết

quả tương tự đã đạt được với chủng Bacillus thuringiensis (Dong et al., 2004)

b Enzyme AHL acylase

Cùng một thời điểm khi Dong và cộng sự (2000) phát hiện chủng Bacillus có

khả năng phân hủy AHL, Leadbetter và Greenberg (2000) phân l p được một chủng

vi khuẩn có thể sử dụng phân tử AHL như là ngu n cacbon và nitơ Chủng vi khuẩn

này có tên là V paradoxus VAI-C, được nuôi cấy làm giàu trong một môi trường có

chứa 500 mg/l N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone như là ngu n cacbon và nitơ duy nhất Trong các thí nghiệm sử dụng A L được dán nhãn phóng xạ, các nhà

nghiên cứu đã suy ra rằng V paradoxus cắt đứt phân tử AHL bằng một enzyme AHL

acylase, giải phóng ra homoserine lactone và một acid béo Sau đ , acid béo được sử dụng như ngu n cacbon thông qua đường dẫn ß-oxidation Cần có thêm nhiều nghiên cứu trong tương lai để làm sáng tỏ bằng cách nào vi khuẩn đã lấy được nitrogen từ homoserine lactone Gần đây, Flagan et al 2003 phân l p một chủng vi khuẩn

Arthrobacter sp VAI-A, có khả năng phân hủy và sử dụng các sản phẩm phân hủy

chứa nitrogen của phân tử tín hiệu A L Điều đáng quan tâm, là tốc độ tăng trư ng

phụ thuộc n ng độ A L và năng suất của hỗn hợp hai chủng Arthrobacter sp và V

paradoxus VAI-C thì cao hơn so với các chủng này nuôi riêng lẻ Điều này cho thấy

rằng một cộng đ ng nhiều lòai vi khuẩn có thể có một ảnh hư ng hiệp trợ trong quá trình chuyển đ i và khóang hóa tín hiệu quorum sensing

Gần đây, Lin và cộng sự (2003) phân l p một chủng vi khuẩn ức chế AHL,

Ralstonia sp XJI2B từ một màng sinh học đa lòai Enzyme chịu trách nhiệm trong

việc ức chế A L AiiD được tinh chế và sau đ được ủ với phân tử oxohexanoyl)-L-homoserine lactone Việc chạy quang ph ion h a phun điện tử đối

N-(3-SVTH: Trần Trọng Nguyễn 31 MSSV:207111033

với sản phẩm thủy phân cho thấy rằng enzyme AiiD thủy phân liên kết amid của

phân tử AHL Sự thể hiện của enzyme AiiD vi khuẩn P aeruginosa tái t hợp

PAO1 ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và làm giảm tỉ lệ chết của giun

tròn Caenorhabditis elegans xuống còn 15%, so với chủng vi khuẩn không tái t

hợp

2.6.3 Những triển vọng của việc bẻ gãy quá trình quorum sensing

Những kết quả đạt được bằng cách sử dụng những kỹ thu t bẻ gãy hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh cho thấy rằng đây là một biện pháp đầy hứa hẹn thay thế cho việc sử dụng kháng sinh trong việc chống lại sự nhiễm khuẩn Cách tiếp c n mới này cũng c thể có giá trị trong nuôi tr ng thủy sản, khi mà mối liên hệ giữa quorum sensing và sự thể hiện yếu tố độc lực một số vi khuẩn gây bệnh động v t thủy sản đã được chứng minh Tuy nhiên, vẫn còn thiếu những số liệu về ảnh hư ng của quorum sensing đến độc lực của các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản Nghiên cứu cơ bản trong lĩnh vực quorum sensing chắc chắn sẽ cung cấp những

sự hiểu biết chính xác hơn về cơ chế mà sự biểu hiện của các gen điều khiển b i quorum sensing được kích họat hay bị ức chế Cho đến hiện nay, đa số các nghiên cứu đã được tiến hành đối với hệ thống quorum sensing do AHL làm trung gian của các vi khuẩn gây bệnh gram âm trên người và thực v t Tuy v y, có thể mong đợi những kỹ thu t bẻ gãy hệ thống quorum sensing của những vi khuẩn gây bệnh khác

sẽ được phát triển trong tương lai

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 32 MSSV:207111033

CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu

- Thời gian thực hiện : 05/04/2010 – 28/06/2010

- Địa điểm thu mẫu : Các ao nuôi cá tra giống và thương phẩm thuộc tỉnh Tiền Giang, Đ ng Tháp, Vĩnh Long

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Sinh Học Thực Nghiệm – Viện Nghiên Cứu

Nuôi Tr ng Thủy Sản II

3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các quần thể vi sinh v t thu nh p được từ hệ vi sinh v t trong hệ tiêu hóa của cá tra khỏe mạnh, hệ sinh v t trong môi trường nước và bùn trong ao nuôi cá Tra từ các vùng nuôi: Đ ng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang Hệ vi sinh v t giàu vi khuẩn lactic acid của thực phẩm lên men truyền thống và sữa T ng cộng có 50 mẫu nguyên liệu, sau quá trình sàng lọc qua môi trường chuyên biệt cho vi khuẩn lactic, kết quả thu được 64 khuẩn lạc

Bảng 3.2.1.1 Danh sách mẫu dùng phân l p vi huẩn lactic

STT

G.TG: nước ao cá giống tiền giang

YA: yourgut, DC: dưa cải, RG: rau giá

CF: cà pháo

KC: kim chi

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 36 MSSV:207111033

Bảng 3.2.1.2 Danh sách các chủng vi huẩn mua từ ngân hàng vi sinh v t Trường

Đại ọc Quốc Gia à ội, Viện Vi Sinh và Công ghệ Sinh ọc

STT

Tên loài Môi trường nuôi Ký hiệu chủng

6 Saccharomyces cerevisiae TSA or TSB +

glucose

VTCC-Y-0011

b Hỗn hợp 2 loại phân tử quorum sensing (AHL) (phân tử tín hiệu quorum

sensing vi khuẩn Gram âm)

+ N-butyryl homoserine lactone;

+ N-hexanoyl homoserine lactone

c Vi khuẩn gây bệnh gan th n mủ trên các cá tra do vi khuẩn Edwardsiella

- Cân điện tử SHIMADZU AY220

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA® RH basic KT/C

- Tủ lạnh sâu -80oC

- Tủ lạnh thường

- MRSA: Lactobacillus MRS Agar made in India

- MRS: Lactobacillus MRS Broth made in India

- BHIA: Brain Heart Infusion Agar

- BHI: Brain Heart Infusion Broth

Bảng 3.2.2.1 Thành phần môi trường B IA Brain eart Infusion Agar

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 38 MSSV:207111033

Bảng 3.2.2.2 Thành phần môi trường B I Brain eart Infusion Broth

STT Đơn vị

- Pha môi trường BHIA (0.52g/ml)

- Chuẩn bị đĩa petri

- Hấp tiệt trùng dụng cụ chứa môi trường và đĩa petri 121oC trong 20 phút

- Lau c n quanh mặt trong của tủ cấy vô trùng

- Thắp đèn c n để tránh nhiễm vi khuẩn vào đĩa môi trường

- Đợi khi nhiệt độ bình môi trường nguội đến 60oC r i cho vào tủ cấy vô trùng cùng với đĩa petri để chuẩn bị đ đĩa Không đ đĩa hi môi trường n ng hơn

60oC để tránh hơi nước đọng trên nắp đĩa và mặt thạch

- Sát trùng tay bằng c n trước hi đ đĩa

- Quay tròn bình để trộn đều môi trường, tránh lắc mạnh sinh bọt khí

- Thao tác đ môi trường ra đĩa:

SVTH: Trần Trọng Nguyễn 40 MSSV:207111033

Hình 3.2.3.1 Cách đ đĩa thạch

- Đ khoảng 20ml môi trường vào đĩa thạch

- Nếu thấy có bọt khí trên mặt thạch thì dùng que cấy nung đỏ trên ngọn lử đèn c n châm vỡ bọt khí Thao tác này cần thực hiện khi thạch còn n ng, chưa đông

- Để yên cho thạch đông, tránh làm rung đĩa petri để bề mặt thạch được phẳng,

đ ng đều

- Để cho đĩa thạch đông chắc trong đĩa và nguội đến nhiệt độ phòng

- Gói giấy báo, ghi tên môi trường và ngày đ đĩa bên ngoài r i cho vào tủ lạnh hoặc có thể dùng ngay để cấy vi khuẩn