NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH INDOL ACETIC ACID (IAA) TẠI XÃ CƯM’LAN, HUYỆN EASOUP, TỈNH ĐĂK LĂK

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN CAO BÌNH NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH INDOL ACETIC ACID IAA TẠI XÃ CƯM’LAN, HUYỆN EASOUP, TỈNH ĐĂK LĂK

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN



CAO BÌNH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN

CÓ KHẢ NĂNG SINH INDOL ACETIC ACID (IAA) TẠI

XÃ CƯM’LAN, HUYỆN EASOUP, TỈNH ĐĂK LĂK

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN



CAO BÌNH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN

CÓ KHẢ NĂNG SINH INDOL ACETIC ACID (IAA) TẠI

XÃ CƯM’LAN, HUYỆN EASOUP, TỈNH ĐĂK LĂK

CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người HDKH: TS Võ Thị Phương Khanh

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

BMT, ngày 28/11/2010

Người cam ñoan

Cao Bình

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc ñến:

TS Võ Thị Phương Khanh, người ñã dạy dỗ, gần gũi, tận tình hướng dẫn, tạo mọi ñiều kiện thuận lợi, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường cũng như thời gian thực hiện ñề tài

Ban giám hiệu cùng toàn thể quý phòng ban ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Quý thầy cô trong trường, các thầy cô trong khoa Khoa học tự nhiên và công nghệ, ñặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Sinh ñã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt ba năm học tập và rèn luyện dưới mái trường Đại học Tây Nguyên

Các thầy cô giáo, cán bộ, nhân viên quản lý phòng thí nghiệm ñã tạo ñiều kiện tốt nhất ñể cho tôi hoàn thành ñề tài của mình

Cuối cùng, cho phép tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc ñến gia ñình, bạn bè gần xa, ñặc biệt

là các bạn học viên lớp Sinh học thực nghiệm K2 ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài

Xin chân thành cảm ơn!

BMT, ngày 28/11/2010

Học viên

Cao Bình

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU……….1

1.1 Đặt vấn ñề……… ….1

1.2 Mục tiêu của ñề tài……… 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn……….2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học……… ….2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn……… ….2

1.4 Giới hạn của ñề tài 2

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 3

1.1 Đại cương về các chủng vi khuẩn sinh ……… ….3

1.1.1 Vi khuẩn Azotobacter sp……… ….4

1.1.2 Bradyrhizobium……….….5

1.1.3 Azospirillum……….6

1.1.4 Vi khuẩn Rhizobium sp……….7

1.2 Sự hình thành và vai trò của IAA……… ….8

1.2.1 Sơ ñồ cấu tạo của IAA……….9

1.2.2 Sự phân bố của IAA……….9

1.2.3 Sinh tổng hợp IAA……….9

1.3 Tình hình nghiên cứu… ……… 11

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước… ……….…11

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới…… 12

PHẦN II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… ……… 14

2.1 Nội dung nghiên cứu…… ……… 14

2.2 Vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu…… ……… 14

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu……… 14

2.2.2 Địa ñiểm nghiên cứu……… …… 14

2.2.3 Thời gian nghiên cứu……… 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu……….…14

2.3.1 Phương pháp thu mẫu……… …… 14

2.3.2 Phương pháp phân lập………15

2.3.3 Phương pháp mô tả ñặc ñiểm hình thái khuẩn lạc và tế bào các vi khuẩn sinh IAA phân lập……… ……….…15

2.3.4 Phương pháp ñánh giá khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn phân lập……….15

2.3.5 Phương pháp ñánh giá khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trong các môi trường nuôi cấy khác nhau.……… 17

2.3.6 Phương pháp ñánh giá khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trong các môi trường có nồng ñộ Tryptophan khác nhau……17

2.3.7 Phương pháp ñánh giá khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn theo thời gian nuôi cấy.………… ………18

2.3.8 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của dung dịch nuôi cấy vi khuẩn 2.3.9 sinh IAA tuyển chọn ñến quá trình nẩy mầm của hạt ñậu tương 18

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 19

3.1 Mô tả ñặc ñiểm hình thái khuẩn lạc và tế bào các vi khuẩn sinh IAA phân lập tại Easup – Đăk Lăk……… …19

3.2 Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn phân lập………… …27

3.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố ñến khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn……….….…30

3.3.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy……… …31

3.3.2.Ảnh hưởng của nồng ñộ tryptophan……….….34

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ……….….36

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch nuôi cấy vi khuẩn sinh IAA ñến quá trình nảy mầm của hạt ñậu tương……… … 38

3.4.1 Ảnh hưởng ñến sự nảy mầm hạt ñậu tương……… 39

3.4.2 Ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng rễ mầm ñậu tương……… 40

3.4.3 Ảnh hưởng ñến sinh trưởng của thân mầm……… 42

3.4.4 Ảnh hưởng ñến trọng lượng khô của rễ ñậu tương ……… 43

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… …… 45

4.1 Kết luậ……… 45

4.2 Kiến nghị……… 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 47

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Chữ viết ñầy ñủ

DANH MỤC HÌNH

Trang Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc và tế bào các chủng vi khuẩn sinh IAA phân lập ñược trên ñất trồng và nốt sần ñậu tương……… ….21 Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc và tế bào các chủng vi khuẩn sinh IAA phân lập ñược trên ñất trồng và nốt sần ñậu phộng……… ………23 Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc và tế bào các chủng vi khuẩn sinh IAA phân lập ñược trên ñất trồng và nốt sần ñậu cô ve………24 Hình 3.4: Hình thái khuẩn lạc và tế bào các chủng vi khuẩn sinh IAA phân lập ñược trên ñất trồng ngô……… ………26

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 3.1 Đặc ñiểm khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn phân lập từ ñất trồng

và nốt sần cây ñậu tương…….….……… ……… 20 Bảng 3.2 Đặc ñiểm khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn phân lập từ ñất trồng và nốt

sần cây ñậu phộng …… ……… ……….22 Bảng 3.3 Đặc ñiểm khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn phân lập từ ñất trồng và nốt

sần cây ñậu cô ve …….……….……… 24 Bảng 3.4 Đặc ñiểm khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn phân lập từ ñất trồng ngô… 27 Bảng 3.5: Khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn phân lập……….28 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến khả năng sinh IAA của

các chủng vi khuẩn tuyển chọn ……… … 32 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng ñộ tryptophan ñến khả năng sinh IAA của

các chủng vi khuẩn……… 35 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của thời gian ñến khả năng sinh IAA của các chủng vi

khuẩn tuyển chọn….……… ……… ………37 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của dung dịch nuôi cấy vi khuẩn sinh IAA ñến sự nảy

mầm của hạt ñậu tương 39 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của dung dịch vi khuẩn sinh IAA ñến sinh trưởng của

rễ ñậu tương……… 41 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của dung dịch nuôi cấy vi khuẩn sinh IAA ñến sinh

trưởng của thân mầm ñậu tương ……… ……42 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của dung dịch nuôi cấy vi khuẩn sinh IAA ñến trọng

lượng của rễ ñậu tương ……….…… 43

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Trang Biểu ñồ 3.1: Khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn trên môi trường

YMA…… 29 Biểu ñồ 3.2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến khả năng sinh IAA của

các chủng vi khuẩn tuyển chọn…….……… ….32 Biểu ñồ 3.3: Ảnh hưởng của nồng ñộ tryptophan ñến khả năng sinh IAA của

các chủng vi khuẩn………….……… ……….35 Biểu ñồ 3.4: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy của các chủng vi khuẩn ñến

khả năng sinh IAA………….……… ………37

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn ñề

Đăk Lăk là một tỉnh có tiềm năng phát triển nông nghiệp với tổng diện tích

tự nhiên 1.308.500 ha, trong ñó ñất nông nghiệp chiếm 436.000 ha (chiếm 33% tổng diện tích ) và thích hợp cho nhiều loại cây trồng Trong những năm qua dưới tác ñộng của thời tiết, khí hậu, canh tác làm cho ñất bị rửa trôi và xói mòn rất lớn Trình ñộ dân trí, khoa học kỹ thuật và ñiều kiện kinh tế của người dân tham gia canh tác còn thấp Một số nơi kỹ thuật canh tác chủ yếu dựa vào ñộ phì sẵn có của ñất hoặc lạm dụng quá mức việc sử dụng phân bón hoá học làm ñất xấu ñi, mất cân ñối các chất dinh dưỡng, bị chai cứng và làm giảm hệ vi sinh vật có ích Đây là các nguyên nhân chính làm năng suất cây trồng giảm, nguy cơ dịch bệnh cao dẫn ñến ñất mất khả năng canh tác [3]

Một trong những giải pháp ñang ñược áp dụng hiện nay ñể cải tạo ñất là sử dụng phân bón có chứa vi sinh vật Nhóm vi sinh vật trong phân bón có tác dụng cải thiện ñộ phì, cân bằng dinh dưỡng trong ñất, cải thiện dung tích hấp thu, cải thiện các tính chất lý, hoá của ñất và ñặc biệt làm hạn chế ô nhiễm môi trường ñất cũng như môi trường nước do quá trình rửa trôi [3]

Hệ vi sinh vật tham gia trong thành phần phân vi sinh bao gồm các nhóm vi sinh vật phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp như cellulose, lignin, chitosan; nhóm vi sinh vật phân giải phosphat khó tan, nhóm vi sinh vật cố ñịnh ñạm Các nhóm vi sinh vật này ñều có mặt trong ñất cũng như trong các vật liệu Theo nghiên cứu của các nhà khoa học, trong ñất còn có một nhóm các vi sinh vật còn có khả năng sản sinh chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng, ñó là khả năng sinh tổng

hợp IAA (indol acetic acid) Những vi khuẩn thuộc chi Rhizobium, Azotobacter,

Azospirillum, Bradyrhizobium, Pseudomonas, Bacillus có khả năng này

[1,2,11,24]

Để ñảm bảo sự phát triển nền canh tác nông nghiệp bền vững tại Tây Nguyên, việc khai thác, sử dụng và bảo tồn các chủng vi sinh vật có giá trị cho ñất

và cây trồng là việc làm hết sức cần thiết Trên cơ sở thực tế ñó, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu ñề tài “ Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh IAA trong

ñất tại xã CưM’Lan, huyện EaSoup, tỉnh Đắk Lắk”

1.2 Mục tiêu của ñề tài

Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng tạo IAA trong ñất tại

xã CưM’Lan, huyện Easoup, tỉnh Đăk Lăk

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Thu thập các chủng vi khuẩn trong môi trường ở ñịa phương có khả năng tạo IAA - chất kích thích sinh trưởng của thực vật, ñể bảo tồn sự ña dạng sinh học của

vi khuẩn có giá trị trong môi trường

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tuyển chọn và ñánh giá khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn trong ñất

là bước ñầu trong công việc làm phong phú các ñối tượng vi sinh vật có lợi cho cây trồng Từ ñó góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất trong nông nghiệp, góp phần giảm lượng phân bón hoá học, giảm lượng chất kích thích sinh trưởng trong ñất, góp phần bảo vệ môi trường

1.4 Giới hạn của ñề tài

Là học viên lần ñầu tham gia nghiên cứu khoa học, thời gian thực hiện ñề tài

có hạn nên chúng tôi chỉ nghiên cứu những mục tiêu ñã ñề ra Trong quá trình nghiên cứu không thể tránh khỏi những thiếu sót, kính mong quý thầy cô và các bạn ñóng góp ý kiến ñể ñề tài ñược hoàn thiện hơn

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương về các chủng vi khuẩn sinh IAA

Từ cổ xưa, mặc dầu chư nhận thức ñược sự tồn tại của vi sinh vật, nhưng loài người ñã biết khá nhiều về tác dụng do vi sinh vật gây nên Trong sản xuất và trong ñời sống, con người ñã tích lũy ñược nhiều kinh nghiệm về các biện pháp lợi dụng các vi sinh vật có ích và phòng tránh các vi sinh vật có hại

Vi sinh vật sống ở khắp mọi nơi trên Trái Đất, từ ñỉnh núi cao ñến tận ñáy biển sâu, trong không khí, trong ñất , trong hầm mỏ, trong sông ngòi, ao hồ, trên da, trong thực phẩm, vật liệu

Vi sinh vật là những sinh vật có cấu tạo ñơn giản, kích thước rất nhỏ bé mắt thường khó có thể quan sát ñược, tuy nhiên số lượng của chúng thì vô cùng lớn Vi khuẩn là một nhóm sinh vật có số lượng lớn trong thế giới vi sinh vật Phần lớn chúng sử dụng nguồn dinh dưỡng ñạm từ môi trường ñất hay xác bã thực vật và ñặc biệt có một số loài vi khuẩn có khả năng sử dụng nitơ từ không khí Những sinh vật này có vai trò vô cùng quan trọng ñối với sản xuất nông nghiệp và con người Nhờ

có chúng, thực vật trên hành tinh có thêm nguồn dinh dưỡng ñạm cho hoạt ñộng sinh trưởng và phát triển (Hoàng Lương Việt 1978) Ngoài ra, theo nghiên cứu của các nhà khoa học, có một số vi sinh vật còn có khả năng sinh tổng hợp IAA là chất sinh trưởng ở thực vật Những vi khuẩn này ña số ñều là những vi khuẩn cố ñịnh ñạm Đó là vi khuẩn thuộc chi Rhizobium, Azotobacter, Azospirillum,Bradyrhizobium, Pseudomonas, Bacillus [1,2,11,24 ]

1.1.1 Vi khuẩn Azotobacter sp

Azotobacter là vi khuẩn gram âm, hiếu khí sống tự do trong ñất, không sinh

bào tử, có khả năng cố ñịnh nitơ phân tử Một số chủng thuộc chi này có khả năng sinh tổng hợp nên IAA, chất kích thích sinh trưởng ở thực vật [5, 28, 27]

Vi khuẩn Azotobacter

Tế bào Azotobacter có hình cầu hoặc hình que Khi còn non, tế bào thường

có hình que, chúng sinh sản theo hình thức giản ñơn, di ñộng nhờ tiêm mao Bên cạnh các tiêm mao khá dài khi quan sát dưới kính hiển vi ñiện tử còn thấy rõ những sợi khuẩn mao nhỏ bé

Về già, tế bào Azotobacter mất khả năng di ñộng, kích thước thu nhỏ dạng

hình cầu ñược bao bọc bởi một lớp màng nhầy khá dày và tạo thành nang xác Khi gặp ñiều kiện thuận lợi nang xác sẽ nứt ra và tạo thành các tế bào vi khuẩn mới

Khuẩn lạc của Azotobacter dạng hình cầu lồi, nhầy, nhẵn, có khi nhăn nheo

Khi già có màu vàng lục, hồng, nâu ñen, ñây cũng là một tiêu chuẩn phân loại loài

Azotobacter sp

Azotobacter sp cần pH thích hợp vào khoảng 7.0 – 8.2, chúng ít tồn tại trong

môi trường ñất chua có pH < 5.6 – 5,8 [2]

trưởng tương ñối chậm ở 250C và hầu như không phát triển ở cận 200C và cận 400C Chúng phát triển tối ưu ở nhiệt ñộ 300C [17]

Trong ñất, Azotobacter sp tập trung ở vùng gần rễ cây có tác dụng làm tăng cường thức ăn Nitơ cho cây trồng Đồng thời tác dụng của Azotobacter sp ñối với

cây trồng còn ñược chứng minh ở khả năng kích thích sinh trưởng của chúng như

tác dụng kích thích sự nảy mầm và sinh trưởng của mầm hạt Azotobacter sp có khả

năng tiết vào môi trường các vitamin, axit amin cũng như các chất kích thích sinh trưởng thực vật (axit indol axetic, gibberelic) [20, 28]

1.1.2 Bradyrhizobium

Bradyrhizobium là vi khuẩn có khả năng cố ñịnh nitơ cộng sinh ở cây họ ñậu,

còn ñược gọi là vi khuẩn nốt sần [27]

Trên môi trường ñặc, khuẩn lạc của chúng có dạng trơn bóng, nhầy, không màu, ñường kính khuẩn lạc không quá 1mm [4]

Bradyrhizobium là vi khuẩn hiếu khí, tuy nhiên chúng có thể phát triển ñược

ngay cả trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0.01 atm Chúng phát triển thích hợp ở pH = 6.5 – 7.5 Sự sinh trưởng của chúng bị cản trở khi pH hạ thấp ñến 4.5 – 5.0 hoặc nâng lên ñến 8.0 Nhiệt ñộ phát triển thích hợp ñối với vi khuẩn là 24- 260C, ở nhiệt ñộ 370C sự phát triển của chúng bị cản trở một cách rõ rệt [4]

Ngoài khả năng cố ñịnh nitơ nhóm vi khuẩn này còn có khả năng sinh tổng hợp IAA, thúc ñẩy cây sinh trưởng bởi quá trình kích thích gia tăng ñột biến các rễ thứ cấp, hình thái lông rễ, kéo dài rễ [17, 23, 14]

1.1.3 Azospirillum

Azospirillum brasilense ATCC 29145 nuôi cấy trên môi trường agar

MPSS ở 300C trong 24 giờ ở ñộ phóng ñại 15000 lần (Krieg, 1984)

Azospirillum là vi khuẩn có dạng phẩy, xoắn, sống tự do, có khả năng cố ñịnh

nitơ phân tử, ñược phát hiện từ năm 1974 [23]

Những vi khuẩn thuộc giống Azospirillum là những vi sinh vật cố ñịnh ñạm

sống tự do hoặc kết hợp với rễ của cây ngũ cốc và một số loại cỏ [27] Chúng là những vi khuẩn Gram âm, hơi cong như hình dấu phẩy (vibrio) hoặc là xoắn khuẩn, ñường kính 1 µm và dài 2,1-3,8 µm, chuyển ñộng trong môi trường lỏng bởi 1 tiên mao dài ở ñầu (polar flagellum) Trong môi trường ñặc, ở 300C nhiều tiên mao bên (lateral flagella) ngắn hơn cũng ñược thành lập Những hạt Poly-β-hydroxybutyrate (PHB) có màu hồng lấp ñầy hầu hết những tế bào vi khuẩn và khuẩn lạc [27, 28]

Sự tăng sinh Azospirillum xảy ra dưới cả 2 ñiều kiện hiếu khí và kỵ khí,

nhưng thích hợp hơn là ñiều kiện vi hiếu khí với sự hiện diện hoặc không có hợp