BÁO CÁO THỰC TẬP VI SINH tại Khoa Xét nghiệm–bệnh viện Da Liễu Trung Ương, 2015

Lê Hạ LongHải cùng toàn thể các anh chị nhân viên đã luôn tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian học tập và làm báo cáo thực tập tại khoa Xét nghiệm, bệnh viện Da LiễuTrung Ương.. Do

BÁO CÁO THỰC TẬP VI SINH

Địa điểm: Khoa Xét nghiệm–bệnh viện Da Liễu Trung Ương

Địa chỉ: 15A Phương Mai- Đống Đa- Hà Nội

Thời gian thực tâp: 23/11 – 20/12

Họ và tên sinh viên: Đặng Minh Khoa

Tổ 36 – Y4K

Hà Nội, tháng 12 năm 2015

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới TS Lê Văn Hưng, ThS Lê Hạ Long

Hải cùng toàn thể các anh chị nhân viên đã luôn tận tình hướng dẫn em trong suốt

thời gian học tập và làm báo cáo thực tập tại khoa Xét nghiệm, bệnh viện Da LiễuTrung Ương

Trong khoảng thời gian thực tập tại khoa,chúng em đã nhận được sự giúp đỡtận tình của lãnh đạo khoa cũng như của các anh chị cả về lý thuyết lẫn kinh nghiệmthực tế, góp phần tạo một môi trường tốt nhất để chúng em học tập

Em xin gửi lời cảm ơn tới trường Đại học Y Hà Nội, Khoa KTYH, Bộ môn Visinh – Ký sinh trùng lâm sàng đã giới thiệu để chúng em được học tập tại khoa Xétnghiệm, Bệnh viện Da Liễu Trung Ương cũng như trau dồi kiến thức cho chúng emtrong suốt quá trình học lý thuyết tại giảng đường Đây là cơ hội quý báu để chúng

em có thể áp dụng những hiểu biết của mình vào thực tế cũng như phục vụ cho côngviệc sau này

Dù rất cố gắng trong quá trình thực tập cũng như viết báo cáo song chắc hẳncòn nhiều thiếu sót và hạn chế Em rất mong nhận được những góp ý, nhận xét củathầy cô, anh chị cùng toàn thể các bạn

Hà Nội, tháng 12 năm 2015

Sinh Viên Đặng Minh Khoa

Mục tiêu học tập 1

Nội dung báo cáo 2

1 Cơ cấu tổ chức, trang thiết bị Khoa xét nghiệm viện Da liễu Trung ương 2

1.1 Lịch sử hình thành và phát triển 2

1.2 Tổ chức 3

1.3 Nhiệm vụ chức năng 5

1.4 Các kỹ thuật xét nghiệm đang được tiến hành 5

1.5 Trang thiết bị của khoa xét nghiệm 6

2 Các loại bệnh phẩm thường gặp tại phòng xét nghiệm tại cơ sở thực hành 7

3 Các qui trình xét nghiệm thường dùng tại cơ sở thực hành 8

3.1 Phòng huyết thanh 8

3.1.1 Các kỹ thuật phát hiện bệnh giang mai 8

3.1.1.1 Test nhanh chẩn đoán giang mai 9

3.1.1.2 Phản ứng RPR ( Rapid Plasma Reagin) 11

3.1.1.3 Phản ứng TPHA(Treponema pallidum Hemagglutination 15

3.1.2 Test nhanh chẩn đoán viêm gan B ( HbsAg) 20

3.1.3 Các kỹ thuật phát hiện HIV 22

3.1.3.1 Test nhanh sàng lọc HIV 22

3.1.3.2 Xét nghiệm khẳng định HIV 23

3.1.4 Các xét nghiệm khác 24

3.2 Phòng vi sinh 24

3.2.1 Xét nghiệm chẩn đoán Chlamydia 25

3.2.3 Nhuộm soi tìm lậu cầu, nấm, vi khuẩn khác 28

3.2.4 Nuôi cấy định danh là làm kháng sinh đồ 30

3.2.5 Các xét nghiệm khác 34

3.3 Phòng nấm – ký sinh trùng 35

3.3.1 Xét nghiệm soi tươi tìm nấm 35

3.3.2 Soi tươi tìm ký sinh trùng 38

3.3.3 Nuôi cấy và định danh nấm – kháng nấm đồ 39

3.4 Phòng hóa sinh – huyết học – sinh học phân tử 40

4 Quy trình tiếp nhận bệnh phẩm và trả kết quả tại viện Da Liễu Trung Ương 40

Tổng kết 41

Mục tiêu học tập

1 Cơ cấu, tổ chức, trang thiết bị phòng xét nghiệm vi – ký sinh lâm sàng tại cơ sở

thực hành

2 Các loại bệnh phẩm thường gặp tại phòng xét nghiệm tại cơ sở thực hành.

3 Các qui trình xét nghiệm thường dùng tại cơ sở thực hành (Đây là nội dung chính

yêu cầu trình bày chi tiết, cụ thể) Bản thân có được tham gia, kiến tập quy trìnhnào? Nội dung học tập được như thế nào?

4 Các qui trình tiếp nhận bệnh phẩm và trả kết quả xét nghiệm tại cơ sở thực hành

5 Tổng kết

Tự nhận xét đánh giá về quá trình thực hành của bản thân Ý kiến đóng góp cho bộmôn về chương trình học (nếu có)

Nội dung báo cáo

1 Cơ cấu tổ chức, trang thiết bị Khoa xét nghiệm viện Da liễu Trung ương

1.1 Lịch sử hình thành và phát triển.

Tiền thân của khoa xét nghiệm ngày nay là phòng huyết thanh được thành lậpnăm 1954 do cố bác sỹ Huỳnh Kham làm trưởng phòng Sau ngày miền Bắc đượcgiải phóng, nhờ sự giúp đỡ của các chuyên gia Y tế Liên Xô và Bungari, các cán bộcủa Khoa Da liễu Bệnh viện Bạch Mai nói chung và phòng huyết thanh nói riêng đãkhám, xét nghiệm và điều trị cho đối tương gái mại dâm do chế độ Pháp thuộc đểlại Đứng trước tình hình bệnh hoa liễu nói chung và bệnh giang mai nói riêng giatăng, năm 1958, cố bác sỹ Vi Phác đã được cử đi học tại Trung Quốc để sản xuấtkháng nguyên citochol phục vụ cho công tác xét nghiệm sàng lọc bệnh giamg mai

Do yêu cầu của công tác xét nghiệm phục vụ bệnh nhân Da liễu ngày một tăngnên từ những năm 1958 – 1962 khoa đã xây dựng thêm nhiều phòng xét nghiệm:sinh hóa – huyết học, nấm, giải phẫu bệnh lý, …… Năm 1968, sau khi hoàn thànhkhóa thực tập tại CHDC Đức, có GS Lê Kinh Duệ trở về nước và thành lập phòngmiễn dịch, phòng miễn dịch được thành lập đã giúp cho cho công tác chẩn đoángiamh mai bằng nhiều phương pháp khác nhau như: FTA-abs, TPI

Năm 1972, sau khia GS Nguyễn Thị Đào tốt nghiệp từ Nga về đã xây dựnghoàn chỉnh phòng xét nghiệm nấm và tiến hành nuôi cấy, định loại các chủng nấmgây bệnh nấm da và nấm sâu

Năm 1974, cố bác sỹ Huỳnh Kham về hưu và cố bác sỹ Vi Phác được cử làm tổtrưởng tổ xét nghiệm

Năm 1975, sau khi giải phóng hoàn toàn miền Nam, các bệnh hoa liễu lan trànkhắp nơi Phòng xét nghiệm vi sinh được thành lập để phục vụ cho công tác xétnghiệm phát hiện bệnh lậu, hạ cam, … và đặc biệt là xét nghiệm tìm vi khuẩn phongphục vụ công tác chẩn đoán và điều trị bệnh phong

Các phòng xét nghiệm ngoài việc phục vụ tốt cho công tác xét nghiệm bệnhnhân nội trú, ngoại trú của khoa Da liễu Bệnh viện Bạch Mai mà còn chi viện cán

bộ cho công tác khám, xét nghiệm phát hiện các bệnh hoa liễu cho các tỉnh miềnNam, và sau đó là công tác xét nghiệm vi khuẩn phong

Năm 1985, cố Bác sỹ Vi Phác được cử đi chuyên gia ở Algeria, cố bác sỹNguyễn Nguyên được cử làm tổ trưởng tổ xét nghiệm Trong giai đoạn 1985 – 1988

tổ xét nghiệm cùng với phòng chỉ đạo chuyên khoa thực hiện công tác khám, xétnghiệm phát hiện bệnh nhân phong phục vụ cho công tác đa hóa trị liệu, thanh toánbệnh phong từng vùng

Năm 1988, cố bác sỹ Nguyễn Nguyên qua đời và TS Lê Thị Phương được cửlàm tổ trưởng tổ xét nghiệm, nay là Khoa xét nghiệm Viện Da liễu

Năm 1993, phòng xét nghiệm HIV được thành lập để phục vụ công tác pháthiện căn bệnh thế kỷ ở đối tượng mắc bệnh lây truyền qua đường tình dục và cácđối tượng khác Năm 1996, phòng đã phát hiện được ca nhiễm HIV đầu tiên và kể

từ đó đến nay, số lượng bệnh nhân nhiễm HIV được phát hiện hàng năm ngày càngtăng Để phát triển Khoa xét nghiệm ngày càng hiện đại, ứng dụng được các kỹthuật mới, Ban lãnh đạo Viện đã chú trọng đầu tư trang thiết bị hiện đại và công tácđào tạo nhân lực Năm 2003, phòng xét nghiệm sinh học phân tử được thành lập và

đã ứng dụng kỹ thuật hiện đại vào chẩn đoán bệnh phong, bênh lao và các bệnh lâytruyền qua đường tình dục như lậu, chlamydia, herpes sinh dục, sùi mào gà,…

Khoa xét nghiệm gồm 19 cán bộ nhân viên, trong đó có 5 cán bộ thuộc biên chế

Bộ môn Da liễu Trường Đại học Y Hà Nội Khoa gồm có: 1 tiến sỹ, 3 thạc sỹ, 3 bác

sỹ, 3 cử nhân, 6 kỹ thuật viên, 3 nhân viên khác Lãnh đạo khoa gồm 1 trưởng khoa

và 2 phó trưởng khoa

Mỗi nhóm do 1 tiến sỹ, thạc sỹ hoặc bác sỹ làm nhóm trưởng

Khoa xét nghiệm có 2 y công phục vụ công tác hấp rửa dụng cụ, vệ sinh cácphòng xét nghiệm cũng như ngoại cảnh; và 1 nhân viên tiếp đón bệnh nhân, hẹn vàtrả kết quả

Phòng Giải phẫu bệnh

Phòng Nấm – vi sinh

Phòn

g y công

Quản lý chất lượng

Sinh hóa – Huyết học – Sinh học phân tử

Nhóm Huyết thanh

1.3 Nhiệm vụ chức năng

Thực hiện các xét nghiệm cho bệnh nhân nội trú, ngoại trú của Viện Da liễu,một số bệnh nhân thuộc các Khoa, phòng trong bệnh Viện Bạch Mai và bệnh nhânthuộc các trung tâm Da liễu tuyến tỉnh, thành phố gửi về

Tham gia công tác chỉ đạo tuyến về bệnh phong và các bệnh nhiễm trùng lâytruyền qua đường tình dục

Tham gia trong nhóm nghiên cứu giám sát sự kháng thuốc của lậu cầu khu vựcĿông nam châu ÿ thuộc Tổ chức Y tế thế giới (WHO)

Tham gia giảng dạy cho các đối tượng là các bác sỹ chuyên khoa định hướng,chuyên khoa I (Da liễu), cao học Vi sinh, cao học Da liễu thuộc Học viện Quân Y

và Bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Hà Nội, cao học chuyên khoa Răng HàmMặt

Tham gia đào tạo bác sỹ, kỹ thuật viên xét nghiệm chuyên ngành Da liễu chocác Bệnh viện Da liễu, trung tâm Da liễu, trung tâm phòng chống các bệnh xã hội,trung tâm Y tế dự phòng các tỉnh gửi về

1.4 Các kỹ thuật xét nghiệm đang được tiến hành

o Soi trực tiếp và làm phong phú ký sinh trùng đường ruột

o Chẩn đoán nhiễm Chlamydia bằng miễn dịch sắc ký và ELISA

o Chẩn đoán huyết thanh bệnh Herpes bằng kỹ thuật ELISA

 Nhóm nấm – ký sinh trùng:

o Soi tươi và nuôi cấy nấm da, nấm sâu và nấm hệ thống + Soi tươi và nuôicấy nấm âm đạo + Soi tươi Trichomonas + Định loại nấm.

 Nhóm Mô bệnh học; Sinh hóa - huyết học - dị ứng và Sinh học phân tử:

o Sinh thiết da, đọc kết quả giải phẫu bệnh lý

o Chẩn đoán tế bào học của Tzanck.n

o Các xét nghiệm sinh hóa và huyết học cơ bản

o Chẩn đoán tế bào Hargraves

o Một số xét nghiệm dị ứng: phản ứng Mantoux, test áp, phản ứng Boyden

và khuyếch tán trên thạch

o Xét nghiệm PCR để chẩn đoán bệnh phong và các bệnh lây truyền quađường tình dục

 Nhóm huyết thanh:

o Phản ứng RPR, TPHA phát hiện bệnh giang mai

o Soi trực tiếp xoắn khuẩn giang mai

o Chẩn đoán huyết thanh nhiễm HIV

o Phát hiện kháng thể kháng ADN

o Phát hiện kháng nguyên HbsAg trong bệnh viêm gan B

1.5 Trang thiết bị của khoa xét nghiệm

Khoa có đầy đủ các trang thiết bị phục vụ cho công việc hiện nay:

 Máy hóa sinh tự động, máy công thức máu, máy đông máu, máy chạy điệngiải

 Máy PCR, Realtime PCR, máy Votex, máy ly tâm

 Tủ lạnh(2 – 8 °C), tủ âm sâu ( - 30 °C và – 80 °C)

 Bể ấm tách huyết thanh, máy lắc trong phản ứng RPR

 Hốt vô trùng để nuôi cấy vi khuẩn, tủ ấm thường và tủ ấm CO2

 Dụng cụ lấy bệnh phẩm đặc biệt như mỏ vịt, ăng cấy

 Băng dính, dao cạo để lấy bệnh phẩm nấm

 Ngoài ra còn có các dụng cụ không thể thiếu như pipet tự động, pipet thủytinh, kính hiển vi, lam kính, đèn cồn,

2 Các loại bệnh phẩm thường gặp tại phòng xét nghiệm tại cơ sở thực hành

Mỗi phòng trong khoa lại có những bệnh phẩm riêng đặc thù với chứa năngcủa từng phòng:

 Phòng sinh học phân tử: bệnh phẩm thường là dịch tiết, mảnh sinhthiết,

 Phòng sinh hóa huyết học và phòng huyết thanh: máu tĩnh mạch sau đótách huyết thanh để làm các xét nghiệm tiếp theo Riêng phòng huyếtthanh có thể là dịch tiết nơi tổn thương như trong chẩn đoán giang mai

 Phòng vi sinh: bệnh phẩm chủ yếu là dịch tiết đường sinh dục, có thể làdịch tiết vị trí tổn thương Ngoài ra còn có bệnh phẩm rạch da để chẩnđoán bệnh phong

 Phòng nấm: chủ yếu là bệnh phẩm cạo da, da đầu, tóc, móng,bệnh phẩmcạo lưỡi

3 Các qui trình xét nghiệm thường dùng tại cơ sở thực hành.

3.1 Phòng huyết thanh

Phòng huyết thanh là một trong những phòng quan trọng bậc nhất của khoa khitại đây thực hiện một loạt những xét nghiệm dùng để chẩn đoán, khẳng định và theodõi bệnh đặc biệt các bệnh lây truyền qua đường tình dục như HIV, giang mai, viêmgan B Ngoài ra, phòng còn làm một số xét nghiệm như tìm kháng thể kháng nhânANA, kháng thể tự miễn ds DNA hay gặp trong bệnh Lupus ban đỏ hệ thống

Sơ đồ phòng huyết thanh.

3.1.1 Các kỹ thuật phát hiện bệnh giang mai.

Bệnh giang mai là bệnh nhiễm khuẩn kinh điển, tiến triển qua 3 giai đoạn vớicác triệu chứng lâm sàng như: săng, đào ban, mảng niêm mạc, sẩn , nhưng cũng

có thể không có biểu hiện lâm sàng gọi là giang mai kín

Bệnh do xoắn khuẩn Treponema Pallidum gây nên, đường lây chính của bệnh

là quan hệ tình dục và mẹ truyền sang con

Để chẩn đoán bệnh giang mai phải dựa vào tiền sử quan hệ tình dục , biểu hiệnlâm sàng và kết quả xét nghiệm Trên thực tế nhiều bệnh nhân không có biểu hiệnlâm sàng, tiền sử tình dục không rõ ràng do vậy kết quả xét nghiệm là yếu tố quyếtđịnh chẩn đoán

R

á

c

Bể ấmtáchhuyếtthanh

Bàn làmxétnghiệm

Tủlạnhlưuhóachất

Bàn sổsách lưuthông tin

Máy tínhkết nốimạngbệnhviện

Các xét nghiệm phát hiện bệnh giang mai bao gồm xét nghiệm tìm xoắn khuẩntại tổn thương, đây là xét nghiệm có tính đặc hiệu cao đòi hỏi người làm phải cókinh nghiệm, có kính hiển vi nền đen hoặc phương pháp nhuộm riêng nên phươngpháp này khó thực hiện ở tuyến dưới , vì vậy chẩn đoán giang mai phải dựa vào cácphản ứng huyết thanh.

Các phản ứng huyết thanh phát hiện bệnh Giang mai có chung nguyên lý làdùng kháng nguyên đã biết để phát hiện kháng thể có trong huyết thanh hoặc huyếttương của người bệnh

3.1.1.1 Test nhanh chẩn đoán giang mai

 Mục đích : phát hiện kháng thể kháng giang mai có mặt trong huyết thanhbệnh nhân

 Nguyên lý : Dựa vào nguyên lý sắc ký miễn dịch 1 chiều, kháng nguyên gắnmàu được gắn trong giếng phản ứng, khi nhỏ huyết thanh bệnh nhân vào đó,nếu có kháng thể sẽ xảy ra phản ứng KT – KN màu và di chuyển ngược lêntheo nguyên lý sắc ký Phức hợp này sẽ bị giữ lại ở vạch T vì tại đây đã đượcgắn sẵn KN giang mai Tại vạch C đã gắn sẵn kháng thể kháng giang mainên luôn luôn xảy ra phức hợp KT – KN màu

Giếng nhỏ huyết thanh Vạch phản ứng T Vạch chứng C

 Quy trình xét nghiệm:

o Dụng cụ, hóa chất:

 Ống lấy máu chứa chất chống đông hoặc không

 Kim lấy máu, dây garo, bông cồn

 Giá đựng ống máu, bể ấm tách huyết thanh

 Pipet vi lượng, máy ly tâm

 Hóa chất sinh phẩm hãng SD – Bioline gồm thanh thử và dungdịch Buffer

o Tiến hành:

 Sau khi lấy máu tĩnh mạch cho vào ống nghiệm, để vào bể ấm

để tách huyết thanh tự nhiên hoặc ly tâm

 Lấy bộ kit thử gồm que thử và dung môi mẫu đặt lên mặtphẳng khô, thoáng

 Ghi thông tin bệnh nhân lên que thử

 Dùng pipet hút 10µl huyết thanh nhỏ vào vùng phản ứng

 Nhỏ thêm 3 – 4 giọt dung môi vào đó

 Đọc kết quả từ 10 – 20 phút

 Đọc kết quả:

o Sau khi nhỏ huyết thanh, chờ đủ thời gian rồi đọc kết quả

o Phản ứng dương tính là phản ứng xuất hiện cả 2 vạch T và C

o Phản ứng âm tính là phản ứng chỉ có 1 vạch C

o Phản ứng không xuất hiện vạch C là kit thử bị hỏng, phải làm lại

Test nhanh giang mai: dương tính (vị trí 3) và âm tính ( vị trí 1, 2, 4)

3.1.1.2 Phản ứng RPR ( Rapid Plasma Reagin)

 Mục đích: phát hiện kháng thể kháng giang mai có mặt trong huyết thanhbệnh nhân

 Nguyên lý:kháng nguyên có tên là Cardiolipin đã gắn than hoạt khi cho tiếpxúc với huyết thanh người bị bệnh giang mai sẽ có hiện tượng ngưng kết, lênbông

 Quy trình:

o Dụng cụ, hóa chất:

 Sinh phẩm (01 hộp sinh phẩm của hãng Biomerier):

- 05 lọ kháng nguyên RPR mỗi lọ 2ml

- 02 lọ huyết thanh chứng dương

- 02 lọ huyết thanh chứng âm

o Bảo quản hoá chất:

 Bảo quản kháng nguyên ở 2-8oC trong lọ thuỷ tinh, không đểkháng nguyên trong lọ nhựa

 Trước khi làm phản ứng: để hoá chất ở nhiệt độ phòng cho tớikhi hết lạnh.

o Bảo quản bệnh phẩm:

 Huyết tương , huyết thanh để ở nhiệt độ phòng nếu làm trongngày

 Nếu không làm ngay:

- Bảo quản ở 2 – 8oC trong 7 ngày

- Bảo quản ở – 20oC nếu lâu hơn

o Chuẩn bị chất thử:

 Kháng nguyên:

- Để ở nhiệt độ phòng và lắc trước khi dùng

- Chuyển kháng nguyên từ lọ thuỷ tinh sang lọ nhựa

- Sau mỗi ngày làm xong phản ứng: chuyển khángnguyên từ lọ nhựa vào lọ thuỷ tinh để bảo quản, lọ nhựađược rửa sạch bằng nước cất để khô

o Cách làm phản ứng:

 Lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống thuỷ tinh (hoặc ống nhựa)không chống đông (hoặc có chất chống đông)

 Để co cục máu tự nhiên hoặc ly tâm để lấy huyết thanh

 Huyết thanh, huyết tương dùng làm phản ứng phải trong,không nhiễm trùng, không vỡ hồng cầu

 Phản ứng RPR định tính:

 Nhỏ 0,05ml huyết thanh (hoặc huyết tương) vào 1 vòng tròn trên bìa phảnứng (để giọt rơi tự do)

 Huyết thanh chứng dương và chứng âm đồng thời thực hiện

 Dùng que dẹt dàn đều huyết thanh trong giới hạn vòng tròn

 Lắc nhẹ giọt kháng nguyên rồi nhỏ 1 giọt kháng nguyên vào vòng tròn đã

có huyết thanh (không khuấy trộn)

 Lắc tốc độ 100 vòng/phút trong 8 phút

 Phản ứng RPR định lượng:

 Thực hiện phản ứng bằng huyết thanh được pha loãng dần tới độ phaloãng lớn nhất còn cho kết quả dương tính Pha loãng huyết thanh tiếnhành với lượng gấp đôi:1/2, 1/4, 1/8, 1/16

 Nhỏ 0,05ml NaCl 90/00 vào mỗi vòng tròn trên bìa phản ứng, nhỏ 0,05mlhuyết thanh bệnh nhân vào vòng tròn 1, trộn đều rồi chuyển sang vòngtròn 2, trộn đều rồi chuyển tiếp tới các vòng tròn sau

 Dàn huyết thanh ra hết vòng tròn bìa phản ứng

 Nhỏ 1 giọt kháng nguyên lên mỗi vòng tròn có chứa huyết thanh đã phaloãng

 Lắc 100 vòng/phút trong 8 phút

 Đọc kết quả:

o Đọc kết quả ngay sau khi lắc xong

o Đọc bằng mắt thường ở nơi đủ ánh sáng

o Kết quả âm tính khi thấy:

 Đám than hoạt mịn tập trung ở giữa vòng tròn

 Ưu điểm và ứng dụng:

o Dùng để sàng lọc phát hiện Giang mai

o Độ nhậy cao, độ đặc hiệu ngang với VDRL và BW

o Đơn giản, dễ thực hiện

o Làm cả định tính và định lượng dùng để theo dõi kết quả điều trị

QUY TRÌNH THỰC HIỆN KỸ THUẬT RPR

ĐỊNH TÍNH

1 - Đi găng vô trùng

2 - Ghi mã số hoặc tên tuổi bệnh nhân lên ống

3 - Lấy máu tĩnh mạch

4 - Ly tâm hoặc để ống máu ở nhiệt độ phòng chờ tách huyết thanh

5 - Nhỏ 0,05ml huyết thanh (hoặc huyết tương) bệnh nhân vào vòng

- Dàn huyết thanh ra hết vòng tròn bìa phản ứng

8 - Lấy kháng nguyên sang lọ nhựa, bỏ giọt kháng nguyên đầu tiên

8 - Nhỏ mỗi vòng tròn có huyết thanh 01 giọt kháng nguyên

Phản ứng RPR trên bìa cứng

3.1.1.3 Phản ứng TPHA(Treponema pallidum Hemagglutination)

Phản ứng TPHA do Tara Rathlev đề xuất năm 1965, kháng nguyên được sửdụng là xoắn khuẩn Giang mai đã được đánh tơi bằng siêu âm rồi gắn lên bề mặt tếbào (là hồng cầu cừu,hồng cầu gà, hồng cầu chim ) kháng thể được phát hiện làkháng thể kháng xoắn khuẩn

 Sinh phẩm: (01 hộp của hãng Biorad)

- 01 lọ dung dịch pha loãng huyết thanh

- 01 lọ tế bào không gắn kháng nguyên

- 01 lọ tế bào có gắn kháng nguyên

- 01 lọ huyết thanh chứngdương

- 01 lọ huyết thanh chứng âm

o Bảo quản hoá chất:

 Bảo quản hoá chất 4oC

 Trước khi làm phản ứng: để hoá chất ở nhiệt độ phòng cho tớikhi hết lạnh

 Lắc nhẹ nhàng khi dùng để tránh làm biến dạng tế bào

o Bảo quản bệnh phẩm:

 Huyết thanh để ở nhiệt độ phòng nếu làm trong ngày

 Nếu không làm ngay:

+ Bảo quản ở 2 – 8oC trong 7 ngày

+ Bảo quản ở – 20oC nếu lâu hơn

o Chuẩn bị chất thử:

 Chuyển sinh phẩm từ nơi bảo quản ra nhiệt độ phòng và để ởnhiệt độ phòng khoảng 15 – 20 phút

 Lắc nhẹ 2 lọ tế bào có gắn và không gắn kháng nguyên.

o Cách làm phản ứng:

 Lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống thuỷ tinh (hoặc ống nhựa)không chống đông

 Để co cục máu tự nhiên hoặc ly tâm để lấy huyết thanh

 Huyết thanh phải trong, không nhiễm trùng, không vỡ hồngcầu

 Pha loãng huyết thanh 1/20:

 Nhỏ 190µl dung dịch pha loãng huyết thanh vào giếng số 1

 Nhỏ 10µl huyết thanh vào giếng số 1, trộn đều

 Huyết thanh chứng dương và chứng âm thực hiện đồng thời

 Phản ứng TPHA định tính:

 Lấy mỗi 25µl huyết thanh pha loãng 1/20 nhỏ vào giếng thứ 2 và thứ3

 Nhỏ 75µl tế bào gắn kháng nguyên vào giếng 2

 Nhỏ 75µl tế bào không gắn kháng nguyên vào giếng 3

 Trộn đều và lắc nhẹ

 Độ pha loãng cuối cùng sau khi thêm dung dịch tế bào vào là 1/80

 Ủ ở nhiệt độ phòng, đặt khay nhựa trên mặt phẳng không có rungđộng tối thiểu là 45 phút

 Đọc giếng nhỏ tế bào không gắn kháng nguyên trước: giếng này âmtính biểu hiện: tế bào lắng tạo thành nút nhỏ ở đáy giếng

 Đọc giếng nhỏ tế bào có gắn kháng nguyên:

- Âm tính: khi thấy tế bào lắng tạo thành nút nhỏ ở đáy giếng.

- Dương tính mạnh: tế bào ngưng kết dàn mỏng toàn bộ đáygiếng

 Các kết quả dương tính từ hiệu giá 80 mới biểu thị sự có mặt củakháng thể Giang mai

 Các mẫu huyết thanh dương tính hoặc nghi ngờ hoặc không xác địnhthì phải làm phản ứng định lượng

 Ưu điểm và ứng dụng:

o Độ nhạy và độ đặc hiệu cao:

 Phát hiện các trường hợp Giang mai không phản ứng với cáckháng nguyên không đặc hiệu

 Xác định lại những kết quả dương tính của các phản ứngkhông đặc hiệu

o Nhậy cảm và đặc hiệu ngang với FTA

o Nhận định kết quả dễ dàng bằng mắt thường

o Có thể thực hiện ở mọi tuyến cơ sở

.

Gương đọc và kết quả phản ứng TPHA

QUY TRÌNH THỰC HIỆN PHẢN ỨNG TPHA

ĐỊNH TÍNH

1 - Đi găng vô trùng

2 - Ghi mã số hoặc tên tuổi bệnh nhân lên ống

3 - Lấy máu tĩnh mạch

4 - Ly tâm hoặc chờ tự tách huyết thanh

5 - Để sinh phẩm ở nhiệt độ phòng cho hết lạnh

6 - Pha loãng huyết thanh bệnh nhân 1/20

7 - Pha loãng huyết thanh chứng 1/20

8 - Nhỏ huyết thanh đã pha loãng 1/20 sang giếng 2 và 3, mỗi giếng

25µl

9 - Nhỏ 75µl tế bào có gắn kháng nguyên vào giếng 2

10 - Nhỏ 75µl tế bào không gắn kháng nguyên vào giếng 3

11 - Đậy phiến nhựa và lắc nhẹ

12 - Đặt phiến trên mặt phẳng không rung động