Nghiên cứu biểu hiện gen GL0067868 mã hoá endo 1 4beta xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn trong tế bào escherichia coliBL21

tiến hành giải mã toàn bộ DNA metagenome của vi khuẩn sống tự do trong ruột mối và khai thác được 587 trình tự mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose trong đó có 27 trình tự mã hóa enzym

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài

Nghiên cứu biểu hiện gen GL0067868 mã hóa endo-1,4-beta-xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn

trong tế bào Escherichia coli BL21

Người hướng dẫn : TS Đỗ Thị Huyền Sinh viên thực hiện: Trần Thị Huyền Lớp: K19-1203

Hà Nội- 2016

ThS Nguyễn Minh Giang - nghiên cứu sinh phòng Kỹ thuật di truyền đã chỉ bảo tận tình về chuyên môn, luôn theo sát thí nghiệm của tôi để có những lời khuyên bổ ích và kịp thời

Trong gần 2 năm học tập và nghiên cứu tại phòng kỹ thuật di truyền, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ, động viên chân thành của tập thể cán

bộ phòng Các thực tập sinh luôn thân thiện, nhiệt tình, tạo nên một môi trường nghiên cứu chủ động, hăng say Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Viện Đại Học Mở Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô giáo thuộc

bộ môn Thực Phẩm đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập vừa qua

Hà nội, tháng 6 năm 2016

Sinh viên

Trần Thị Huyền

MỤC LỤC

Lời Cảm Ơn

MỞ ĐẦU 1

MỤC TIÊU 2

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Endo-1,4-xylanase 3

1.1.1 Phân loại endo-1,4-xylanase 4

1.1.2 Cấu trúc của endo-1,4-xylanase 5

1.1.3 Cơ chế xúc tác của endo-1,4-xylanase 7

1.1.4 Đặc tính của xylanase 8

1.1.4.1 Nhiệt độ hoạt động của endo-1,4-xylanase 8

1.1.4.2 pH hoạt động của xylanase 8

1.1.5 Nguồn xylanase 9

1.1.5.1 Sinh tổng hợp endo-xylanase từ vi khuẩn 9

1.1.5.2 Sinh tổng hợp xylanase từ nấm 9

1.1.6 Ứng dụng của endo-xylanase 10

1.1.6.1 Trong ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi 10

1.1.6.2 Trong công nghệ sản xuất giấy 11

1.1.6.3 Trong sản xuất bánh 12

1.1.6.4 Trong sản xuất hóa chất, nhiên liệu sinh học 12

1.1.6.5 Ứng dụng trong ngành công nghiệp nghiền gỗ và giặt là 12

1.1.6.6 Các ứng dụng khác 13

1.2 Biểu hiện gen 13

1.2.1 Hệ biểu hiện E coli 13

1.2.2 Chủng biểu hiện E coli BL21 15

1.2.3 Vector biểu hiện pET-32a(+) 16

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu 18

2.1.1 Nguồn gen, chủng vi sinh vật và plasmid 18

2.1.2 Hóa chất và enzyme 18

2.1.3 Máy móc và thiết bị 18

2.1.4 Các loại môi trường nuôi cấy 19

2.1.5 Các dung dịch sử dụng 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli DH10B bằng phương pháp

sốc nhiệt 19

2.2.2 Tinh sạch DNA từ gel agarose bằng QIAquick Gel Extraction kit 20

2.2.3 Cắt kiểm tra gen bằng enzyme hạn chế 20

2.2.4 Phản ứng nối ghép gen ngoại lai vào plasmid 20

2.2.5 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli 21

2.2.6 Biểu hiện gen trong tế bào E coli 21

2.2.7 Điện di protein trên gel SDS-PAGE 21

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Chọn dòng vector pUC57 mang gen exl 24

3.1.1 Tách dòng plasmid pUC-exl 25

3.1.2 Cắt kiểm tra gen exl trong pUC-exl bằng NcoI và XhoI 27

3.1.3 Cắt kiểm tra gen exl trong pUC-exl bằng HindIII và XbaI 29

3.1.4 Tinh sạch gen exl bằng KIT QIAquick 30

3.2 Thiết kế vector biểu hiện pET-32a(+) mang gen exl 31

3.2.1 Đưa gen exl vào vector pET-32a(+) 31

3.2.2 Cắt kiểm tra gen exl trong pET-32a(+) bằng enzyme hạn chế 32

3.2.3 Cắt kiểm tra gen exl trong pET-32a(+) bằng enzyme ScaI 33

3.3 Nghiên cứu biểu hiện gen exl trong E coli 35

3.3.1 Biểu hiện gen exl trong E coli 35

3.3.1.1 Biểu hiện vector pET32-exl trong chủng vi khuẩn E coli BL21 35

3.3.2 Lựa chọn điều kiện biểu hiện 37

3.3.2.1 Nhiệt độ biểu hiện 37

3.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG 38

3.4 Kết luận 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

PHỤ LỤC 45

Phụ lục 1: Các môi trường và dung dịch 45

1 Các dung dịch được sử dụng trong tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli 45

2 Các dung dịch dùng trong điện di DNA trên gel agarose 45

3 Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide-SDS 46

4 Mã gen và trình tự gen 47

PHỤ LỤC 2: Quy trình của các phương pháp nghiên cứu 49

1 Quy trình biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli DH10B bằng phương pháp sốc nhiệt 49

1 Quy trình tinh sạch DNA từ gel Agarose bằng kit QIA quick 50

2 Cắt kiểm tra gen bằng enzyme hạn chế 51

3 Phản ứng nối ghép gen ngoại lai vào plasmid 51

4 Quy trình tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli 52

5 Quy trình biểu hiện gen trong tế bào E coli 53

6 Quy trình điện di protein trên gel polyacrylamide-SDS 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Cấu trúc hóa học của xylan 5 3 Hình 2: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ GH10 từ Bacillus

halodurans 14 6 Hình 3: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ GH11 15 7 Hình 4: Bản đồ vector pET-32a(+) 17 Hình 5: Kết quả biến nạp plasmid mang gen pUC57-exl vào tế bào E coli

DH10B 25 Hình 6: Điện di đồ kiểm tra các dòng DNA plasmid từ tế bào E coli DH10B

tái tổ hợp được biến nạp với pUC-exl 27 Hình 7: vị trí cắt của NcoI và XhoI trên vector pUC57-exl 28 Hình 8: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pUC-exl bẳng

enzyme NcoI và XhoI 28 Hình 9: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm cắt pUC-exl bằng enzyme XbaI và

HindIII 29 Hình 10: Sản phẩm tinh sạch gen exl bằng KIT QIAquick 30 Hình 11: Phân tích sản phẩm tách chiết DNA plasmid pET32-exl 32 Hình 12: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm cắt pET32- exl bằng NcoI và XhoI

trên gel agarose 0,8% 33 Hình 13: Điểm cắt của ScaI trên vector pET32-exl 34 Hình 14: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm cắt pET32-exl bằng ScaI trên gel

agarose 0,8% 34 Hình 15: Điện di đồ kiểm tra protein tổng số của thể biến nạp E coli

BL21(DE 3 ) mang vector pET32-exl được nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6% 36

Hình 16: Điện di kiểm tra protein pha tan (T), không tan (KT) và protein tổng

số (TS) từ chủng E coli BL21(DE3) mang pET32-exl được nuôi cấy

ở các nhiệt độ khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6% 38 Hình 17: Điện di đồ kiểm tra protein pha tan của E coli BL21 mang gen exl

được nuôi cấy ở các nồng độ chất cảm ứng khác nhau 39

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic acid

RNA Ribonucleic acid

mRNA Messenger ribonucleic acid

EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

PCR Polymerase chain reaction

SDS Sodium dodecyl sulphate

TAE Tris acetate EDTA

MỞ ĐẦU

Theo Tổng cục Thống kê Việt Nam, sản lượng lúa nước ta trung bình đạt

60 triệu tấn/năm, và hàng năm nước ta có khoảng 30-40 triệu tấn rơm rạ1 Số rơm

rạ này được sử dụng một phần rất nhỏ làm phân bón sinh học, sản xuất nấm ăn, còn chủ yếu bị đốt bỏ ngay trên cánh đồng gây lãng phí và ảnh hưởng đến môi trường

Trong những năm gần đây, nguồn rơm rạ đã được thế giới nghiên cứu và chuyển hóa thành nhiều chất có giá trị trong y dược và nông nghiệp Đặc biệt, trong công nghiệp năng lượng, rơm rạ có thể được dùng để sản xuất năng lượng sinh học xanh thay thế nguồn than đá đang ngày càng cạn kiệt Việc chuyển hóa này không những mang lại những sản phẩm mới có giá trị mà còn bảo vệ môi trường sống, giảm phát thải khí nhà kính gây biến đổi khí hậu toàn cầu và tạo ra nguồn kinh tế tại chỗ cho nông dân

Tuy nhiên, để chuyển hóa hiệu quả nguồn sinh khối lignocellulose, yêu cầu cấp thiết hiện nay là tìm ra nguồn enzyme có hoạt tính cao và có tốc độ phản ứng nhanh để làm giảm chi phí trong quá trình chế biến sản phẩm Một trong những enzyme chìa khóa sử dụng trong quá trình chuyển hóa lignocellulose thành đường là xylan beta 1,4-xylanase còn gọi tắt là endo-xylanase

Enzyme endo-xylanase (EC 3.2.1.8) đóng vai trò quan trọng trong phân cắt xylan (thành phần chính trong lignocellulose từ rơm rạ) thành đường xylose2

Vì vậy, việc tìm kiếm ra các enzyme có đặc điểm mới, có hoạt tính cao đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm Ngoài ra, endo-xylanase còn là enzyme thương mại quan trọng được sử dụng trong những lĩnh vực truyền thống như thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và ngành công nghiệp giấy Trong những năm gần đây, để tìm kiếm nguồn gen mới mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose, phòng Kỹ thuật di truyền, viện Công nghệ sinh học đã

tiến hành giải mã toàn bộ DNA metagenome của vi khuẩn sống tự do trong ruột mối và khai thác được 587 trình tự mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose trong đó có 27 trình tự mã hóa enzyme endo-1,4-beta-xylanase Bằng các công

cụ tin sinh học, trình tự mang mã số GL0067868 đã được ước đoán có thể sinh enzyme có hoạt tính tốt Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài: „Nghiên cứu biểu hiện gen GL0067868 có nguồn gốc từ vi khuẩn ruột mối

mã hóa endo-1,4- beta-xylanase trong tế bào Escherichia coli BL21‟ để tiến tới

tinh chế và xác định đặc điểm của enzyme

MỤC TIÊU

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu biểu hiện gen GL0067868 có nguồn gốc

từ vi khuẩn ruột mối mã hóa endo-1,4-xylanase trong Escherichia coli BL21

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Endo-1,4-xylanase

Năm 1955, xylanase ban đầu được gọi là pentosanase3 Năm 1961, chúng

đã được công nhận bởi Hội hóa sinh và Sinh học phân tử thế giới (the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) với enzyme có mã

số EC 3.2.1.8 Tên chính thức của chúng là endo- β -1,4-xylanase, nhưng thường được sử dụng với những tên khác như xylanase, endoxylanase, 1, 4-β-D-xylan-xylanohydrolase, endo-1, 4-β-D-xylanase , β-1, 4-xylanase và β-xylanase4

Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase

Hình 1 Cấu trúc hóa học của xylan 5

Xylan là thành phần chính cấu tạo nên hemicellulose của thành tế bào thực vật và là một trong số hợp chất polysaccharide quan trọng nhất trong tự nhiên5 Xylan chủ yếu tìm thấy trong cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật và tạo thành pha giữa giữa lignin và các hợp chất polysaccharide khác Xylan cũng là một trong những polysaccharid phổ biển nhất trong các loài thực vật thông thường, chiếm 30% tổng trọng lượng khô trong sinh khối thực vật nhiệt đới Với cây gỗ mềm ở vùng ôn đới, xylan ít phổ biến hơn và chiếm khoảng 8% tổng trọng lượng khô 6

Xylan đa dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử Xylan là polymer không

đồng nhất, mạch thẳng, gồm các đơn phân D-xylose được liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glycoside Trong tự nhiên, chúng được thay thế một phần bằng acetyl 4- 0-methyl-d-glucuronosyl và arabinofuranosyl tạo thành cấu trúc polymer không đồng nhất

Enzyme thủy phân của hemicellulose thành đường đơn cần những tác động của nhiều enzym, trong đó endo-xylanase (EC 3.2.1.8) và β-xylosidase (EC 3.2.1.37) (xylanases chung) đóng một vai trò quan trọng 7

Endo-1,4-xylanase hay endo-1,4-β-xylanase là glycosidase (hydrolase O-glycoside) có khả năng thủy phân ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glycozit bên trong mạch của xylan ở những mức độ khác nhau tạo ra các oligosaccharide Sau

đó exo-β-1,4-D-xylosidase (β -1,4-D-xylan xylohydrolase EC 3.2.1.37) thủy phân các oligosaccharide thành các monomer Các nhóm có mặt bên trong xylan được giải phóng bởi α-L-arabionofuranosidase, α -D-glucuronidase, galactosidase và acetyl xylan esterase

Xylanase được tách chiết từ vi khuẩn, nấm chẳng hạn như: Trichoderma,

Bacillus 8 , Cryptococcus, Aspergillus 9 , Penicillium, Aureobasidium, Fusarium, Chaetomium, Phanerochaete, Rhizomucor, Humicola, Talaromyces…

1.1.1 Phân loại endo-1,4-xylanase

Wong và các cộng sự phân loại xylanase thành hai nhóm dựa vào đặc tính

lý hóa của chúng như là khối lượng phân tử và điểm đẳng điện và trên các đặc tính xúc tác khác nhau của chúng Endo-xylanase có khối lượng phân tử cao với giá trị pI thấp thuộc về glycanase họ 10 (trước đây gọi là họ “F”), trong khi đó các endo-xylanase có khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao được phân loại thành glyanase họ 11 (trước đây là họ G) 10

Biely và các cộng sự sau khi mở rộng phạm vi nghiên cứu trên sự khác biệt trong các đặc tính xúc tác giữa các họ xylanase kết luận rằng endo-xylanase của

họ 10 khác với các thành viên của họ 11 là khả năng có thể tấn công các liên kết

glycozit cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu không khử Trong khi xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh, endo-xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế Theo đó các endo-xylanase của họ 10 có nhiều các hoạt động xúc tác tương ứng với β-xylosidase Các endo-xylanase của họ 10 giải phóng các xylopyranosyl ở đầu tận cùng gắn với một gốc xylopyranosyl thay thế, nhưng chúng cũng thể hiện hoạt độ aryl-β-D-xylosidase 11

endo-Sapag và các cộng sự đã ứng dụng một phương pháp mới mà không liên quan tới phân tích trình tự trước đó cho việc phân loại xylanase họ 11, để chia xylanase thành 6 nhóm chính Nhóm I, II và III chứa chủ yếu các enzyme của nấm Các enzyme nhóm I và II thường là các enzyme có khối lượng khoảng 20 kDa được sinh tổng hợp từ các họ Ascomyceta và Basidiomyceta Các enzyme nhóm I có giá trị pI bazơ trong khi đó nhóm II có giá trị pI ở phía axit Các enzyme của nhóm III chủ yếu được tạo ra bởi các nấm yếm khí Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba nhóm là A, B và C Nhóm A là các xylanase được sinh tổng hợp bởi họ Actinomycetaceae và Acillaceae, hoàn toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương Nhóm B và C thì chứa các enzyme chủ yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram dương, những loài thường sống trong dạ

cỏ12

1.1.2 Cấu trúc của endo-1,4-xylanase

Cấu trúc bậc ba của endoxylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt

các enzyme, từ cả vi khuẩn và nấm mốc Endo-xylanase 1BCX từ Bacillus

circulans có nét đặc trưng của họ 11 Nếp gấp vùng xúc tác là do hai nếp gấp β

tạo thành (A và B) chủ yếu là bởi các mặt β đối song và một chuỗi xoắn α ngắn

và tương tự như một phần bàn tay phải được đóng lại Sự khác nhau trong hoạt động xúc tác của các endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho là do sự khác nhau trong cấu trúc bậc ba của chúng Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chủ yếu

được sắp xếp từ các mảnh β Cấu trúc toàn thể của domain xúc tác của xylanase

họ 10 như là một cái thùng hình trụ được tạo thành từ 8 mảnh β Vị trí liên kết cơ chất của endo-xylanase họ 10 ở khe xúc tác không sâu như với endo-xylanase họ

11 Điều này cùng với tính linh động hình thể lớn hơn của các enzyme lớn hơn

so với của những enzyme nhỏ hơn có thể giải thích nguyên nhân của tính đặc trưng cơ chất thấp hơn của endo-xylanase họ 10 13

Hình 2: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ GH10 từ Bacillus

halodurans14

Vùng xúc tác của xylanase họ F11 có cấu trúc từ các mảnh nếp gấp β tạo thành một vùng lõm hai lớp xung quanh vị trí xúc tác Vùng lõm này được so sánh với lòng bàn tay và các ngón tay trong khi cái vòng giống như ngón cái của tay phải Cái vòng (loop) nhô ra thành vùng lõm và giới hạn trong một phân tử isoleusin

Hình 3: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ GH11 15

Xylanase có thể liên kết với từ ba đến năm vòng xylopyranose ở gần vị trí

xúc tác Meagher và các cộng sự nhận thấy rằng Xyn 2 của Trichoderma reesei

có thể liên kết với năm vòng xylopyranose16, trong khi đó thì Xyn 1 chỉ có thể liên kết với 3 vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác Các vị trí cho các gốc xylopyranose liên kết được xác định bởi sự có mặt của tyrosine chứ không phải bởi tryptophan10

1.1.3 Cơ chế xúc tác của endo-1,4-xylanase

Cơ chế hoạt động của xylanase bao gồm các bước sau:

Bước 1: Enzyme xylanase nhận mặt xylan và liên kết với nó bằng cách thay đổi cấu hình ở phần cánh trái cuộn xoắn lại 3 lần

Bước 2: Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc tác, liên kết glycoside bị kéo căng và bị bẻ gãy và tạo thành dạng trung gian đồng hóa trị enzyme - cơ chất

Bước 3: Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động Phân

tử nước này tách thành ion H+ và OH- Ion H+ gắn vào gốc glycosyl vừa được tách ra trong khi ion OH- gắn vào đầu khử của mạch xylan vừa tạo ra theo cơ chế thủy phân glycosyl, nhờ đó sản phẩm được giải phóng, đồng thời enzyme tiếp tục xúc tác cho phản ứng khác

Đầu tiên cơ chất xylan xoắn ốc được đặt vào vị trí đối diện với khe giữa Tyr 65 và Tyr 69 Axit glutamic 172 là chất xúc tác axit/bazơ và axit Glu 78

là chất cho điện tử (nucleophile) Cơ chất bám vào vị trí Glutamic 78 tạo thành dạng sản phẩm trung gian và được giữ vững trong suốt quá trình phản ứng chuyển glycosylate Một phân tử nước thay thế vị trí của chất cho điện tử (nucleophile) Có sự phân tách và phân tán các đường (xylobiose) cho phép enzyme di chuyển đến một vị trí mới trên cơ chất 14

1.1.4 Đặc tính của xylanase

1.1.4.1 Nhiệt độ hoạt động của endo-1,4-xylanase

Mỗi enzyme đều có một khoảng nhiệt độ hoạt động nhất định Trong khoảng đó sẽ có một điểm nhiệt độ mà enzyme hoạt động mạnh nhất, gọi là nhiệt

độ tối ưu Thông thường nhiệt độ tối ưu của enzyme này không cố định mà phụ thuộc vào trình tự và cấu trúc enzyme

Nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme endo-xylanase có nguồn gốc từ vi

khuẩn (Bacillus) thường là 50oC Ở nhiệt độ cao hơn 50oC khả năng thủy phân của enzyme bị giảm đi17

1.1.4.2 pH hoạt động của xylanase

Cũng giống như nhiệt độ, mỗi enzyme đều có khoảng pH hoạt động thích hợp và một điểm pH hoạt động tối ưu pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến hoạt độ enzyme vì nó ảnh hưởng đến độ bền và mức độ ion hóa cơ chất của enzyme

Enzyme endo-xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn (Bacillus) có vùng pH

hoạt động tối ưu ở gần các giá trị pH trung tính, khác với các endo-xylanase có

nguồn gốc từ nấm (Aspergillus), thường có pH tối thích cho hoạt động ở vùng

axit (pH 5,0)17

1.1.5 Nguồn xylanase

Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu bởi các vi sinh vật nhiều loại vi khuẩn và nấm được công bố là có khả năng sản xuất xylanase Tuy nhiên, có nhiều nghiên cứu về xylanase có nguồn gốc từ thực vật, ví dụ, sự sinh tổng hợp endo-xylanase trong quả lê Nhật Bản trong suốt giai đoạn chín của quả 2, trong lúa mạch18, lúa mì và cả một số loài động vật thân mềm 19

1.1.5.1 Sinh tổng hợp endo-xylanase từ vi khuẩn

Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nhiều các enzyme sử dụng cho các quá trình công nghiệp trong đó có endo-xylanase vì đặc tính bền nhiệt của nó

Chi Bacillus và Streptomyces là hai chi sản sinh enzyme xylanase khá phổ biến

đã được công bố và sử dụng rộng rãi Xylanase của các họ vi khuẩn thường hoạt động tối ưu ở pH từ 5,0 đến 8,0; ở nhiệt độ 50o

số các xylanase từ nấm là hoạt động hiệu quả nhất ở nhiệt độ 35 - 50oC, pH 3,0 - 5,5 và bền ở dải pH từ 4,0 - 8,0 Trong số các chi nấm sợi thì các chi Aspergillus

và Trichoderma là hai chi sinh enzyme xylanase được nghiên cứu nhiều nhất Đặc biệt Aspergillus là một chi nấm sợi có ý nghĩa công nghiệp cao do có khả

năng sinh nhiều loại enzyme thủy phân ngoại bào Chính vì khả năng sinh đồng thời nhiều loại enzyme thủy phân ngoại bào nên đa số các loài của các chi nấm này đều có khả năng sinh ra nhiều enzyme xylanase trên các cơ chất tự nhiên, phế phụ phẩm nông nghiệp chứa lignocellulose như bã dầu cọ, lõi ngô, vỏ lúa mì,… Khả năng sinh enzyme xylanase trên phế phụ phẩm nông nghiệp của một

số chủng Aspergillus Christov và cộng sự khi cấy các chủng A foetidus, A oryzae, A niger và A phoenicis trên môi trường chứa lõi ngô đã thu được hàm lượng xylanase tương ứng là 82,3 IU/g; 547,4 IU/g; 99,9 IU/g và 225,6 IU/g Khả năng sinh enzyme xylanase từ nấm cao hơn rất nhiều so với khả năng sinh enzyme xylanase từ vi khuẩn Để sản xuất enzyme xylanase từ nấm người ta có thể sử dụng các phương pháp truyền thống để nâng cao hoạt tính của enzyme như chọn lọc chủng đầu dòng, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy, gây đột biến bằng tác nhân vật lý, hóa học để có thể thu được chủng mong muốn21

ăn lên men, tham gia quá trình xử lý rác thải nông, công nghiệp

1.1.6.1 Trong ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi

Enzyme được nghiên cứu bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi từ những năm

1990 và ngày càng được phổ biến rộng rãi Hiện nay, mỗi năm người ta sản xuất khoảng 30 triệu tấn thức ăn gia súc có bổ sung chế phẩm enzyme, chiếm khoảng 5% trong tổng số 600 triệu tấn thức ăn gia súc được sản xuất Nhiều nghiên cứu

đã chứng minh rằng hạt ngũ cốc kém chất lượng có chứa số lượng lớn các chất

kháng dinh dưỡng Vì vậy bổ sung các enzyme vào những thức ăn này cho hiệu quả rất rõ ràng

 Sự có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi làm giảm độ nhớt trong đường tiêu hóa, giảm rối loạn tiêu hóa, tăng cường hấp thu thức ăn, nhờ vậy cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, giúp phân thải ra khô hơn

 Tỷ lệ chuyển hóa thức ăn (FCR) là tỷ số của trọng lượng thức ăn tiêu thụ với trọng lượng thu được của động vật FCR thấp tức là khả năng tiêu hóa thức ăn tốt Để giảm FCR của các loại thức ăn ngũ cốc, endo-xylanase từ Axitothermus cellulolyticus đã được sử dụng trong các chế phẩm thức ăn chăn nuôi Enzyme này hoạt động ở độ pH thấp (3,6-4,2) và nhiệt độ cao (70-80°C) Khi gia cầm được nuôi bằng ngũ cốc có bổ sung các chế phẩm enzyme thì FCR đã giảm, cho thấy khả năng tiêu hóa tốt hơn của thức ăn chăn nuôi 7

 Hạt giống của hạt cải dầu sau khi khai thác dầu được sử dụng làm thức ăn gia súc Các endo-xylanase từ Neocallimastix patriciarum là một protein hợp nhất với oleosin protein màng ngoài của hạt cải dầu đã được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để tăng cường khả năng tiêu hóa của nó trong dạ cỏ của bò do đó làm giảm FCR 22

 Một công thức có chứa cả xylan và Lactobacillus đã được rải trên sản phẩm ủ

chua Xylanase trong công thức chọn lọc depolymer hóa hemicellulose sản xuất

xylose, được lên men acid lactic bởi Lactobacillus do đó làm tăng sự ổn định,

khả năng tiêu hóa và các giá trị dinh dưỡng của thức ăn lên men cho sự tiêu hóa của gia súc 7

1.1.6.2 Trong công nghệ sản xuất giấy

Trong quá trình sản xuất giấy cần loại bỏ lignin khỏi bột giấy Lignin nằm trong tổ hợp lignocellulose bao gồm: lignin, cellulose và hemicellulose Để tách được lignin từ tổ hợp này, phương pháp truyền thống thường dùng là bổ sung nước Clo hoặc Clo dioxide Tuy nhiên phương pháp này thường tốn kém và gây

ô nhiễm môi trường do thành phần của Clo trong nước thải Vì vậy, hiện nay người ta thường dùng hemicellulase để xử lý bột giấy Xử lý bột giấy bằng chế phẩm xylanase sẽ tạo ra một loại bột tăng khả năng phân tơ chổi hóa và hoàn thiện tính chất của bột

1.1.6.4 Trong sản xuất hóa chất, nhiên liệu sinh học

Xylanase có vai trò chính trong quá trình đường hóa tạo ra xylose và từ nguồn đường đơn này, các chủng vi sinh vật có thể chuyển hóa chúng thành các hóa chất, nhiên liệu sinh học có giá trị ví dụ xylitol là sản phẩm của quá trình hydro hóa xylose

1.1.6.5 Ứng dụng trong ngành công nghiệp nghiền gỗ và giặt là

 Việc bổ sung thêm xylanase từ S roseiscleroticus NRRL-11019 làm mất sắc

tố của chromophore trong nghiền gỗ, hạn chế việc phải sử dụng các hóa chất độc hại

 Xylanase đã được pha trộn với các chất tẩy rửa để loại bỏ hiệu quả các vết bẩn Họ endo-xylanase GH11 được sử dụng nhiều trong công nghiệp hóa chất tảy rửa

1.1.6.6 Các ứng dụng khác

Xylanase được ứng dụng rộng rãi trong việc làm mềm rau quả, gạn lọc chất

xơ trong công nghiệp nước hoa quả và rượu vang, hóa lỏng chất nhầy trong quá trình tạo cà phê lỏng, tách chiết hương liệu và chất màu, dầu thực vật và tinh bột Ngoài ra xylanase còn được dùng trong các nghiên cứu khoa học

1.2 Biểu hiện gen

1.2.1 Hệ biểu hiện E coli

E coli là vi khuẩn gram âm, kị khí tùy tiện và không sinh bào tử Chúng có

bộ máy di truyền đơn giản với chỉ một nhiễm sắc thể đơn kích thước khoảng 5 x

106 bp (chỉ bằng 1/600 hệ gen người) Có các ưu điểm nổi bật thao tác trên vật liệu di truyền dễ, có thể biểu hiện các protein ngoại lai lên đến mức 50% protein tổng của tế bào, biểu hiện nhanh ở một mức độ cao khi tốc độ tăng trưởng của tế bào đạt cao và mật độ tế bào đủ lớn, môi trường nuôi cấy đơn giản và rẻ tiền Thêm vào đó có nhiều chủng đột biến nhờ đó có thể cái tiến việc biểu hiện protein tái tổ hợp và được sử dụng như một vật chủ hữu hiệu trong công nghệ tách dòng24

Tuy nhiên vẫn có vài trở ngại khi sử dụng E coli làm hệ biểu hiện như một

số protein quan tâm được tạo ra trong E coli không chứa methionine hoặc

formyl methionine ở tận cùng đầu N làm mất đi các tính chất quan trọng của phân tử protein Mặt khác một số protein có nguồn gốc từ Eucaryote không thể

biểu hiện tốt trong E coli25

Vector dùng để biểu hiện gen ở E coli được thiết kế đầy đủ, bao gồm các

nhân tố di truyền được sắp xếp hợp lý nhằm điều khiểu tối ưu cả quá trình phiên

mã, dịch mã và tổng hợp protein ngoại lai Ngoài ra vector còn chứa gen mã hóa cho protein vốn có chức năng là dấu hiệu chọn lọc thường là gen kháng chất kháng sinh Thêm nữa một trình tự không thể thiếu đối với plasmid tự sao chép

là tâm sao chép vì nó quyết định số lượng bản copy của plasmid trong một tế

bào Để tạo điều kiện thuận lợi cho việc đưa các đoạn vào vector biểu hiện theo đúng chiều của promoter, trên vector luôn phải chứa vùng đa nối mang các trình

tự của enzyme hạn chế

 Promoter:

Vùng khởi đầu phiên mã là vùng có trình tự DNA đặc biệt được nhận biết bởi RNA polymerase Có nhiều loại promoter khác nhau được sử dụng biểu hiện

gen ở E coli Nhìn chung, để biểu hiện gen cao, promoter phải có các đặc điểm:

- Phải là promoter mạnh, có khả năng tạo protein ngoại lai lớn hơn 10-30% protein tổng số của tế bào

- Chỉ hoạt động ở mức độ thấp khi không có cảm ứng

- Được cảm ứng theo cách đơn giản nhưng có hiệu quả cao nhằm tạo lượng lớn protein mong muốn26

Hiện nay promoter được sử dụng rộng rãi nhất là promoter bacteriophage

T7, chúng có khả năng hoạt động rất mạnh trong tế bào E coli khi có mặt T7

RNA polymerase Đây là một enzyme hoạt động rất mạnh, có tốc độ kéo dài

chuỗi nhanh gấp 5 lần so với các RNA polymerase khác có nguồn gốc từ E coli

 Vùng kết thúc phiên mã:

Khi enzyme di chuyển đến cuối gen, gặp tín hiệu kết thúc thì quá trình phiên mã dừng lại, phân tử ARN được giải phóng

 Trình tự peptide tín hiệu:

Một số protein ngoại lai được tổng hợp nhờ E coli cần thiết phải được tiết

ra khoang chu chất Để tiết được ra khỏi màng trong tế bào, các chuỗi polypeptide cần phải có trình tự peptide tín hiệu nằm ở đầu tận cùng N Chuỗi này gồm 3 vùng: vùng tận cùng đầu N, vùng tận cùng đầu C và vùng kị nước

Do vậy trên vector biểu hiện người ta thường thiết kế sẵn chuỗi peptide tín hiệu nằm ngay sau vùng RBS (vị trí bám của riboxom)27

 Tâm sao chép (Ori)

Tâm sao chép là vị trí đặc hiệu để khởi đầu cho sự sao chép DNA Nó cũng quyết định số lượng bản sao của plasmid trong tế bào

 Dấu chuẩn chọn lọc:

Để tiện cho việc nhận ra các tế bào có mang plasmid, thông thường người

ta sử dụng môi trường nuôi cấy mà ở đó chỉ có tế bào có tính trạng nhất định mới

có thể sinh trưởng được Hiện nay việc đưa các đoạn gen kháng kháng sinh vào plasmid đang là cách phổ biến để phân biệt các tế bào mang plasmid vad tế bào không mang plasmid

 Vùng đa nối:

Vùng đa nối bao gồm các trình tự enzyme hạn chế thông thường giúp cho quá trình đưa đoạn gen ngoại lai vào vector biểu hiện trở nên dễ dàng Hầu hết các trình tự enzyme hạn chế đều được đặt theo khung đọc và nằm sau đoạn peptide tín hiệu

1.2.2 Chủng biểu hiện E coli BL21

Trong quá trình biểu hiện gen ngoại lai thường xảy ra hiện tượng các protein tái tổ hợp bị các protease nội bào phân giải Để hạn chế hiện tượng này người ta đã tạo ra các chủng biểu hiện mang các gen đột biến làm mất khả năng

tổng hợp protease Chủng biểu hiện E coli BL21 là một chủng chứa đột biến

Lon protease (một protease nội bào) và ompT protease (một protease ngoại bào) nên hạn chế sự thủy phân protein

Bên cạnh đó, chủng biểu hiện E coli BL21 mang gen mã hóa T7 ARN polymerase Đây là gen có nguồn gốc từ bacteriophage T7 đưa vào hệ gen E coli

BL21 và được điều khiển bởi promoter lacUV5 cảm ứng IPTG Sự có mặt của enzyme này giúp tổng hợp số lượng lớn protein ngoại lai Hơn nữa hoạt động của T7 ARN còn bị kiểm soát bởi lacUV5 Promoter này chỉ hoạt động khi có mặt chất cảm ứng IPTG Nhờ đó chúng ta có thể kiểm soát sự biểu hiện gen ngoại lai theo mong muốn

Chính nhờ những cải biến này mà E coli BL21 đã trở thành vật chủ hữu hiệu trong việc biểu hiện gen ngoại lai Kiểu gen của E coli BL21: F-ompT

hsdSB (rBmB-) gal dcm

1.2.3 Vector biểu hiện pET-32a(+)

Hệ vector biểu hiện pET được sử dụng rộng rãi trong biểu hiện gen ngoại

lai trên tế bào E coli Studier và các cộng sự đã thiết kế vector pET được điều

khiển phiên mã bằng promoter mạnh có nguồn gốc từ phage T7 và gen ngoại lai được biểu hiện dưới sự phiên mã của T7 ARN polymerase28

Hiện nay, đã có hơn 70 loại vector pET được thiết kế và sử dụng để biểu hiện trong các loại tế

bào E coli khác nhau

Trong đề tài này, với mục tiêu là biểu hiện gen mã hóa

endo-1,4-β-xylanase trong tế bào vi khuẩn E coli, chúng tôi đã lựa chọn vector pET-32a(+)

do hãng Novagen cung cấp Vector có chiều dài 5900 bp, được sử dụng chủ yếu cho việc biểu hiện, tinh sạch gen tái tổ hợp cũng như tăng khả năng tan protein

đích trong E coli Plasmid này có thể tái bản độc lập với tế bào chủ nhờ tâm sao

chép có nguồn gốc từ vector pBR322

Đặc điêm nổi bật của vector pET-32a(+) so với các hệ biểu hiện khác đó là:

- Gen ngoại lai được điều khiển bởi promoter T7, là một promoter mạnh có tính đặc hiệu cao

- Phiên mã được điều khiển bởi lac operator, có cơ chế cảm ứng IPTG

- Phía sau vùng đa nối có đoạn trình tự mã hóa cho 6 axit amin Histidin tích điện

âm được gọi là đôi His-tag Đuôi này giúp protein tái tổ hợp được giữ lại khi chúng được đưa qua cột sắc ký ái lực do lực hút tĩnh điện giữ phần điện tích âm của đuôi His-tag với điện tích dương của các cation có trong cột tinh sạch Các protein này sẽ được tách qua cột khi cho dung dịch đệm có pH thích hợp

- Trên vector này có sẵn các điểm cắt XhoI, NcoI, XbaI nên sử dụng vector này

là một điều rất thuận lợi

- Thioredoxin: giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân cắt bởi protease và hình thành cấu trúc bậc 3 chính xác hơn

Hình 4: Bản đồ vector pET-32a(+)

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguồn gen, chủng vi sinh vật và plasmid

 Nguồn gen: Plasmid pUC57 là nguồn mang gen do phòng Kỹ thuật di truyền –

viện Công nghệ sinh học thiết kế

- Mã gen và trình tự gen: Mục 4, phụ lục 1

 Chủng vi sinh vật

- Chủng E coli DH10B (Invitrogen) kiểu gen: F– mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara leu)

7697 galU galK rpsL nupG λ– được sử dụng trong thí nghiệm để tách dòng gen

- Chủng E coli BL 21 (DE3) (Invitrogen) kiểu gen: F– ompT gal dcm lon hsdS B (r B–

mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) được sử dụng trong thí nghiệm để biểu hiện gen

 Enzyme

Các enzyme cắt hạn chế NcoI, XhoI và HindIII (Biolab, Mỹ); XbaI;

T4-DNA ligase; Taq-T4-DNA polymerase được mua của Fermentas

2.1.3 Máy móc và thiết bị

Máy ly tâm Eppendorf, máy ly tâm lạnh (Sorvall RC5B, Mỹ), máy điện di DNA trên gel agarose (Mupid, Nhật), máy PCR (MJ Research, Mỹ), máy điện di

protein trên gel polyacrylamide (Bio-Rab, Mỹ), máy soi DNA trên gel agarose (Bio-Rab, Mỹ), máy Speed-Vac, tủ cấy vô trùng, máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ), máy biến tính protein

2.1.4 Các loại môi trường nuôi cấy

- Môi trường Luria Bertani (LB) lỏng: Cao nấm men (0,5%), bacto trypton (1%), NaCl (1%)

- Môi trường LB-Amp lỏng: Môi trường LB lỏng bổ sung ampicillin đến nồng

độ cuối cùng là 100 µg/ml

- Môi trường LB đặc: Môi trường LB lỏng có bổ sung thêm 1,5% agar

- Môi trường chọn lọc LB-Amp đặc: Môi trường LB đặc bổ sung ampicillin đến nồng độ cuối cùng là 100 µg/ml

2.1.5 Các dung dịch sử dụng

- Các dung dịch được sử dụng trong tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli

(mục 1, phụ lục 1)

- Các dung dịch dùng trong điện di gel agarose (mục 2, phụ lục 1)

- Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide-SDS (mục 3, phụ lục 1)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli DH10B bằng phương pháp

sốc nhiệt

 Nguyên lý:

Sốc nhiệt là phương pháp thường dùng để biến nạp ADN plasmid vào tế

bào E coli Trong quá trình sinh trưởng, màng tế bào của vi khuẩn E coli có

hàng trăm lỗ gọi là lỗ dính bám Màng tế bào vi khuẩn được tạo thành bởi các phân tử phospholipid có các gốc phosphate tích điện âm Mặc dù, bình thường các lỗ dính bám đủ lớn để ADN có thể đi qua, nhưng các gốc phosphate tích điện

âm trên phân tử ADN và các gốc phosphate của màng tế bào vi khuẩn cùng tích điện tích âm đẩy nhau ra nên phân tử ADN xoắn kép không thể đến gần màng tế

bào vi khuẩn Theo lý thuyết, các ion Ca2+ từ CaCl2 có thể tương tác với các điện tích âm, dẫn đến các lỗ dính bám trở nên tích điện Khi ở điều kiện nhiệt độ thấp, màng lipid sẽ bị đóng băng Khi nhiệt độ tăng nhanh hoặc sốc nhiệt sẽ làm mất cân bằng nhiệt ở 2 bên màng vi khuẩn và tạo thành một đường đi và ADN có thể

di chuyển nhanh qua lỗ dính bám

 Quy trình được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit tinh sạch DNA Qiagene – QIAquick Gel Extraction kit30: Mục 2, phụ lục 2

2.2.3 Cắt kiểm tra gen bằng enzyme hạn chế

 Quy trình được thực hiện theo Sambrook và cộng sự (2001)31

ra khỏi phần dung dịch chứa DNA plasmid bằng cách ly tâm ở tốc độ lớn DNA plasmid được tủa lại bằng ethanol Lượng ARN còn tồn tại trong dung dịch chứa DNA plasmid được loại bỏ bằng cách bổ sung RNase

 Quy trình được thực hiện theo Sambrook và cộng sự (1989)31

: Mục 5, phụ lục 2

2.2.6 Biểu hiện gen trong tế bào E coli

 Nguyên lý:

Chủng E coli mang gen tái tổ hợp được nhân lên trong môi trường LBA

lỏng Khi tế bào chuyển sang pha sinh trưởng log, sự có mặt của chất cảm ứng IPTG sẽ kích thích promoter T7 hoạt động mạnh Kết quả tạo ra sản phẩm protein ngoại lai

 Quy trình31

: Mục 6, phụ lục 2

2.2.7 Điện di protein trên gel SDS-PAGE

 Nguyên lý:

Dưới tác dụng của một điện trường, các phân tử điện tích di chuyển với tốc

độ khác nhau qua mạng lưới gel tùy thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thước của phân tử

Trong phương pháp điện di biến tính trên gel polyacrylamide - SDS, các chuỗi polypeptide được bao bọc xung quanh bởi một chất tích điện âm là SDS có

khả năng gây biến tính protein Chính vì vậy, protein sẽ trở thành dạng thẳng và

có số điện tích âm tùy thuộc số lượng các gốc acid amin của chúng

 Quy trình32

: Mục 7, phụ lục 2

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Enzyme endo-1,4-β-xylanase là một enzyme thương mại quan trọng Nó được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp truyền thống Trong suốt thập

kỷ qua, endo-xylanase đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học với định hướng chuyển hóa sinh khối thực vật thành các chất có giá trị trong y dược và nông nghiệp Tuy nhiên, hiện nay giá thành sản xuất nhiên liệu sinh học từ phế phẩm phụ nông nghiệp, chưa cạnh tranh được trên thị trường Một trong những nguyên nhân dẫn tới giá thành sản xuất cao đó là enzyme endo-1,4-xylanase dùng để chuyển hóa lignocellulose chưa đáp ứng được yêu cầu như tốc độ chuyển hóa sinh khối chậm, hoạt tính còn thấp

Từ năm 2012 đến nay, bằng kỹ thuật Metagenomics, nhóm nghiên cứu thuộc phòng Kỹ thuật di truyền đã khai thác được 27 trình tự mã hóa endo-xylanase sinh ra từ vi sinh vật trong ruột mối Bằng các mẫu dò (probe) thiết kế

từ các trình tự enzyme đã nghiên cứu có hoạt tính tốt, nhóm nghiên cứu đã chọn

ra gen mang ký hiệu GL0067868 Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến

hành nghiên cứu biểu hiện gen trong chủng E coli với mong muốn thu được

enzyme tinh khiết cho việc nghiên cứu đánh giá đặc tính enzyme

Trong khóa luận này, chúng tôi đã tiến hành các nội dung nghiên cứu sau:

 Chọn dòng vector pUC57 mang gen exl

- Tách chiết plasmid pUC-exl

- Tách dòng gen pUC-exl

- Cắt kiểm tra gen exl trong pUC-exl bằng NcoI và XhoI

- Cắt kiểm tra gen exl trong pUC-exl bằng HindIII

- Cắt kiểm tra gen exl trong pUC-exl bằng XbaI

- Tinh sạch gen exl bằng KIT QIAquick

 Thiết kế vector biểu hiện pET-32a(+) mang gen exl

- Nối ghép gen exl vào vector pET-32a(+)