Khảo sát sự sinh trưởng của nấm men cố định trong Gel Alginate

Các công trình nghiên cứu về tế bào cố định bằng phương pháp bẫy thường quan tâm đến việc lựa chọn chất mang,điều kiện cố định tế bào, thời gian sử dụng hạt gel chứa tế bào và khả năng ứ

Trang 1

LÊN MEN ETHANOL:

KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE

Nhiệm vụ luận văn:

chu kì.

nồng độ đường ban đầu đến sự sinh trưởng và khả năng tạo cồn của nấm men cố định.

Trang 2

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Trang 4

MỤC LỤC ii

MỤC LỤC CÁC HÌNH v

MỤC LỤC CÁC BẢNG ix

LỜI MỞ ĐẦU x

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1 SƠ LƯỢC VỀ KĨ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ BÀO 1

1.1 Định nghĩa 1

1.2 Ưu điểm của tế bào cố định so với tế bào tự do 1

1.3 Nhược điểm của tế bào cố định so với tế bào tự do 2

2 CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO 3

2.1 Phương pháp gắn tế bào lên bề mặt chất mang 3

2.2 Phương pháp kết nối tế bào 4

2.3 Phương pháp bẫy 4

3 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRONG GEL ALGINATE 6

3.1 Cơ chế tạo gel alginate 7

3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất của hạt gel 9

4 ỨNG DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG SẢN XUẤT ETHANOL 11

Trang 5

5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng nấm men 13

5.3 Sự sinh trưởng và hoạt tính của nấm men cố định 16

5.4 Khả năng sinh tổng hợp cồn của nấm men cố định 18

5.5 Ảnh hưởng của phương pháp và thiết bị đến quá trình lên men ethanol bằng nấm men cố định 18

5.6 Ảnh hưởng của các yếu tố khác 18

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

1 NGUYÊN LIỆU 20

1.1 Nấm men 20

1.2 Chất mang alginate 20

1.3 Môi trường lên men 21

1.4 Các hóa chất khác 21

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Nội dung nghiên cứu 22

2.2 Cố định tế bào nấm men trong gel alginate bằng phương pháp bẫy 22

2.3 Khảo sát quá trình lên men cồn bằng nấm men cố định theo phương pháp chu kì 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

1 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE 26

1.1 Bố trí thí nghiệm 26

1.2 Nhận xét về sự sinh trưởng của nấm men cố định trong gel alginate 27

1.3 So sánh sự sinh trưởng của nấm men cố định và nấm men tự do (mẫu đối chứng) ở cùng điều kiện nhiệt độ lên men 35

1.4 Hoạt tính của nấm men cố định trong các điều kiện nhiệt độ lên men khác nhau 39

2 ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE 48

Trang 6

(mẫu đối chứng) trên môi trường có pH ban đầu như nhau 55

2.4 Hoạt tính của nấm men cố định trên các môi trường có giá trị pH ban đầu khác nhau 59

3 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ BAN ĐẦU ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE 66

3.2 Sự sinh trưởng của nấm men cố định trên các môi trường có nồng độ chất khô ban đầu khác nhau 66

3.3 So sánh sự sinh trưởng của nấm men cố định và nấm men tự do (mẫu đối chứng) trên môi trường có cùng nồng độ chất khô ban đầu 71

3.4 Hoạt tính của nấm men cố định trên các môi trường có nồng độ chất khô ban đầu khác nhau 74

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 80

1 KẾT LUẬN 80

2 KIẾN NGHỊ 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO 82

Trang 7

Hình 1: Đặc điểm cấu tạo của phân tử alginate 6

Hình 2: Cơ chế tạo gel theo phương pháp khuếch tán 8

Hình 3: Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel bên trong 8

Hình 4: Quá trình lên men cồn 11

Hình 5: Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae tự do 16

Hình 6: Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae trong mạng lưới gel alginate 16

Hình 7: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 1, chu kì I) 28

Hình 8: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 1, chu kì I) 28

Hình 9: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 1, chu kì II) 29

Hình 10: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 1, chu kì II) 29

Hình 19: Mật độ tế bào trong mẫu kiểm chứng (thí nghiệm 2) 36

Hình 20: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào trong bình lên men ở 30 o C theo thời gian (thí nghiệm 1 – 2) 36

Hình 22: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào trong bình lên men ở 35 o C theo thời gian (thí nghiệm 3 – 4) 37

Trang 8

(thí nghiệm 1 - 2) 40

Hình 26: Sự thay đổi nồng độ đường khử trong quá trình lên men ở 30 o C (thí nghiệm 1 - 2) 40

Hình 27: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men ở 35 o C (thí nghiệm 3 - 4) 41

Hình 29: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men ở 40 o C (thí nghiệm 5 - 6) 42

Hình 31: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến nồng độ cồn thu được khi quá trình lên men kết thúc 43

Hình 32: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men ở 30 o C (thí nghiệm 1 - 2) 45

Hình 48: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào trong bình lên men theo thời gian (pH đầu 5,5 - thí nghiệm 7 – 8) 56

Hình 50: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào trong bình lên men theo thời gian (pH đầu 3,5 - thí nghiệm 9 – 10) 57

Trang 9

(pH đầu 5,5 - thí nghiệm 7 - 8) 60

Hình 54: Sự thay đổi nồng độ đường khử trong quá trình lên men (pH đầu 5,5 - thí nghiệm 7 - 8) 60

Hình 55: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men (pH đầu 3,5 - thí nghiệm 9 - 10) 61

Hình 57: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men (pH đầu 2,5 - thí nghiệm 11 - 12) 62

Hình 59: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến nồng độ cồn thu được khi quá trình lên men kết thúc 63

Hình 60: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men (pH đầu 5,5 - thí nghiệm 7 - 8) 64

Hình 72: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào trong bình lên men theo thời gian (nồng độ chất khô ban đầu 20 o Bx - thí nghiệm 13 – 14) 72

Hình 74: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào trong bình lên men theo thời gian (nồng độ chất khô ban đầu 25 o Bx - thí nghiệm 16) 73

Hình 75: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men

Trang 10

(nồng độ chất khô ban đầu 25 o Bx - thí nghiệm 15 - 16) 76

Hình 78: Sự thay đổi nồng độ đường khử trong quá trình lên men

Hình 79: Ảnh hưởng của nồng độ chất khô ban đầu đến nồng độ cồn thu được

khi quá trình lên men kết thúc 77

Hình 80: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men

Hình 81: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men

Trang 11

Bảng 1: Các ứng dụng của tế bào cố định trong alginate 10

Bảng 2: Ứng dụng nấm men cố định trong sản xuất ethanol 12

Bảng 3: Các giá trị tối ưu đạt được trong nghiên cứu của Roukas T 16

Bảng 4: Bố trí các thí nghiệm 23

Bảng 5: Các phương pháp phân tích 24

Bảng 6: Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 27

Bảng 7: Tốc độ lên men (g/l.h) của nấm men ở các giá trị nhiệt độ lên men khác nhau 43

Bảng 8: Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của giá trị pH ban đầu 48

Bảng 9: Tốc độ lên men (g/l.h) của nấm men ở các giá trị pH ban đầu khác nhau 63

Bảng 10: Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khô ban đầu 66

Bảng 11: Tốc độ lên men (g/l.h) của nấm men trên các môi trường có nồng độ chất khô ban đầu khác nhau 77

Trang 12

Kĩ thuật cố định tế bào bắt đầu được quan tâm nghiên cứu từ thập niên 1970 Từ

đó, các quá trình hóa sinh và sinh học sử dụng tế bào cố định ngày càng trở nên phổbiến Các phương pháp cố định tế bào rất phong phú và đa dạng Trong đó, phươngpháp bẫy được ứng dụng nhiều trong các quá trình lên men công nghiệp do kĩ thuật cốđịnh khá đơn giản và phù hợp với nhiều loài vi sinh vật Các công trình nghiên cứu về

tế bào cố định bằng phương pháp bẫy thường quan tâm đến việc lựa chọn chất mang,điều kiện cố định tế bào, thời gian sử dụng hạt gel chứa tế bào và khả năng ứng dụng

tế bào cố định trong quá trình lên men liên tục Tuy nhiên, chưa có công trình nghiêncứu nào khảo sát về sự sinh trưởng của các tế bào khi được cố định trong mạng lướigel Vấn đề này rất quan trọng vì nó không chỉ ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trìnhlên men mà còn liên quan trực tiếp đến quá trình thu nhận và tinh sạch sản phẩm cũngnhư khả năng tái sử dụng các hạt gel chứa tế bào

Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi thực hiện quá trình lên men cồn sử

dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định trong gel alginate theo phương pháp

chu kì, khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đầu và nồng độ chất khô của môitrường đến sự sinh trưởng và hoạt tính của nấm men cố định

Trang 13

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1 SƠ LƯỢC VỀ KĨ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ BÀO

1.1 Định nghĩa

Tế bào cố định được định nghĩa là tế bào được định vị trong một khu vực khônggian xác định mà vẫn giữ được hoạt tính sinh học Các tế bào cố định có thể được sửdụng trong phương pháp lên men liên tục hoặc trong phương pháp lên men chu kỳ [2,5]

Kĩ thuật cố định tế bào chỉ ra một hướng mới trong việc thực hiện các quá trìnhhóa sinh và sinh học như: sản xuất kháng sinh, enzyme, ethanol, acid và xử lý nướcthải (khử nitrogen và loại kim loại nặng ra khỏi nước thải),… Những tiềm lực của kĩthuật này đang được tiếp tục nghiên cứu [22]

1.2 Ưu điểm của tế bào cố định so với tế bào tự do

Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách tế bào khỏi môi trường lên men, đơn giảnhóa khâu thu nhận sản phẩm trao đổi chất và sinh khối [2]

Có thể tái sử dụng tế bào cho nhiều chu kì liên tiếp [2, 5, 8, 24]

Cho phép tạo ra mật độ nấm men lớn trong thiết bị lên men [2, 8, 22, 24, 45]

Cho phép thực hiện quá trình lên men liên tục với tốc độ dòng nạp liệu và tháosản phẩm khá cao mà tế bào ít bị rửa trôi [8, 22, 45]

Cho phép điều khiển tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật trong các hệ thống hoạt

Trang 14

Có thể sử dụng các kích thước tối ưu của khối tập hợp vi sinh vật để thu đượchoạt tính cao nhất [2].

Hạn chế sự ảnh hưởng của tạp khuẩn lên hoạt tính của tế bào [2]

Tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt

độ hay sự có mặt của các chất ức chế trong môi trường lên men [2, 5, 45] So với cácquá trình hóa học, các quá trình sinh học có ưu điểm là tiết kiệm năng lượng, ít gây ônhiễm môi trường do chúng thường diễn ra ở nhiệt độ tương đối thấp, áp suất thường

và ít tạo sản phẩm phụ Tuy nhiên, các xúc tác sinh học lại rất dễ bị vô hoạt khi môitrường thay đổi: nhiệt độ cao, pH quá acid hay quá kiềm, sự có mặt của dung môi hữucơ,… Vì vậy, cố định chúng là một trong những phương pháp hiệu quả để loại trừ cácbất lợi trên [5]

Như vậy, nếu tế bào cố định được giữ ở trạng thái sống bằng việc cung cấp đủcác chất dinh dưỡng thích hợp và nếu chức năng sinh học của chúng hữu ích (trongđiều kiện lên men thuận tiện), các tế bào cố định này rất tiện lợi Có thể coi các tế bàosống cố định như các chất xúc tác sinh học có khả năng tự gia tăng số lượng và tự táitạo [5, 45, 46] Hoạt tính xúc tác của tế bào sống cố định có thể duy trì trong thời giandài sử dụng để lên men liên tục hoặc lên men theo chu kì

1.3 Nhược điểm của tế bào cố định so với tế bào tự do

Không áp dụng được cho các quá trình lên men mà sản phẩm là sinh khối visinh vật hay sản phẩm trao đổi chất nội bào

Một số chất mang có độ bền cơ học và hóa học thấp, dễ bị biến dạng, hòa tantrong quá trình lên men [45]

Trong trường hợp cố định tế bào trong mạng lưới gel, sự phát triển sinh khối visinh vật cũng có thể phá hủy mạng lưới gel, dẫn đến sự rò rỉ và rửa trôi tế bào ra khỏichất mang Khi đó, việc thu nhận và tinh sạch sản phẩm cũng phức tạp tương tự nhưcác quá trình lên men sử dụng tế bào tự do [5]

Một số chất mang và phương pháp cố định có thể làm giảm hoạt tính của tế bào

Chất mang cản trở sự khuếch tán của cơ chất và sản phẩm ra vào khối hạt [45]

Chi phí cho chất mang và quá trình cố định tế bào khá cao nên sẽ ảnh hưởngđến giá thành của sản phẩm [45]

Trang 15

2 CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO

Để sử dụng tốt tế bào cố định, ngoài việc bảo quản và nuôi cấy các dòng tế bào

có hoạt tính và đặc điểm như mong muốn, ta còn phải quan tâm đến việc lựa chọnphương pháp cố định thích hợp cho từng loại tế bào, từng mục đích sử dụng cụ thể.Việc này rất quan trọng vì dù có rất nhiều phương pháp cố định tế bào nhưng không cóphương pháp nào là lý tưởng cho mọi loại tế bào, mọi mục đích sử dụng

Các phương pháp cố định tế bào có thể chia thành ba nhóm:

Phương pháp gắn tế bào lên bề mặt chất mang (carrier – binding)

Phương pháp kết nối tế bào (cross – linking)

Phương pháp bẫy (entrapment)

Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng Khi lựa chọn phươngpháp cố định, ta phải xem xét tới mục đích của việc cố định, đặc tính của tế bào, loạiphản ứng, loại thiết bị phản ứng,… [5]

2.1 Phương pháp gắn tế bào lên bề mặt chất mang

Phương pháp này dựa trên liên kết của tế bào với chất mang không tan trongnước thông qua liên kết đồng hóa trị, liên kết ion, lực hấp phụ vật lý hay các liên kếtsinh học đặc trưng

Các chất mang sử dụng trong phương pháp này rất đa dạng:

Polysaccharide không tan trong nước: Cellulose, dextran, dẫn xuất agarose,…

Protein: Gelatin, albumin,…

Polimer tổng hợp: Dẫn xuất polysterene, nhựa trao đổi ion, polyurethane,…

Vật liệu vô cơ: Gạch, cát, thủy tinh, gốm sứ, magnetite,…

Các chất mang này có thể được biến đổi thành những dẫn xuất thích hợp hay hoạthóa trước khi sử dụng [5]

Trang 16

Trong trường hợp tế bào liên kết với chất mang bằng liên kết ion hoặc lực hấpphụ vật lý, chúng bị rửa trôi ra khỏi chất mang khá dễ dàng.

Khó tìm ra điều kiện tối ưu cho việc cố định tế bào

Hiệu suất gắn tế bào lên chất mang đôi khi khá thấp (40 – 60% so với tổng số tếbào trước khi cố định) [5]

2.2 Phương pháp kết nối tế bào

Phương pháp này không dùng các chất mang mà sử dụng các tác nhân hóa học đểkết nối các tế bào với nhau tạo thành những khối hạt

Các tác nhân thông dụng: Glutaraldehyde (nối các nhóm amino thông qua liênkết base Shiff), diisocyanate (tạo liên kết nhóm urea và amino) [5]

Phương pháp này ít được sử dụng trong sản xuất công nghiệp do chất dinh dưỡngtrong môi trường lên men khó tiếp cận đến các tế bào tại vị trí trung tâm của khối hạt

2.3 Phương pháp bẫy

So với các phương pháp trên, phương pháp bẫy tế bào trong các mạng lướipolymer được sử dụng phổ biến nhất [24]

Phương pháp này có thể phân loại như sau [5]:

Bao tế bào bằng hệ thống lỗ xốp (lattice type): Các tế bào được nhốt trong cấutrúc mạng gel của một số loại polymer

Gói tế bào trong bao vi thể (microcapsule type): Tế bào được nhốt trong cácbao vi thể làm bằng các màng polymer bán thấm

Kiểu liposome: Tế bào được nhốt trong các màng lỏng từ các chất mang tínhlưỡng cực (amphiphatic)

Kiểu membrane: Tế bào được tách khỏi môi trường bằng màng vi lọc hoặcmàng siêu lọc

Phương pháp bẫy được sử dụng rất phổ biến để cố định tế bào vi sinh vật, thựcvật và động vật Trong đó, phương pháp bao tế bào bằng hệ thống lỗ xốp là thôngdụng nhất Các chất mang thường dùng để cố định tế bào theo kiểu này:Polyacrylamide, alginate, carrageenan và một số loại polymer khác [5, 24, 45]

Ưu điểm:

Trang 17

Cấu trúc gel của chất mang bảo vệ tế bào khỏi sự ảnh hưởng của những biến đổibất lợi của môi trường bên ngoài hạt gel

Giữ được khả năng sống cao cho tế bào [45]

Trang 18

3 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRONG GEL ALGINATE

Alginate là một chất đồng trùng hợp của acid D-mannuronic và acid L-guluronic

có nhiều trong thành phần các loài rong biển, đặc biệt là rong nâu [11]

Hình 1: Đặc điểm cấu tạo của phân tử alginate [11].

(a): Các monomer (b): Cấu trúc phân tử (c): Sự phân bố các phân đoạn.

Alginate thường được sử dụng để cố định tế bào vì có những ưu điểm [11]:

Phổ biến trong thiên nhiên

Trang 19

3.1 Cơ chế tạo gel alginate

Có hai phương pháp cơ bản để tạo gel alginate: phương pháp khuếch tán(diffusion gelation) và phương pháp tạo gel bên trong (internal gelation)

3.1.1 Phương pháp khuếch tán

Phương pháp khuếch tán được đặc trưng bằng việc cho các ion liên kết ngang(như ion Ca2+) khuếch tán từ dung dịch lỏng bên ngoài vào giọt dung dịch alginate[11]

Phương pháp khuếch tán được sử dụng rất rộng rãi trong kĩ thuật cố định tế bào

Để cố định tế bào theo phương pháp này, người ta trộn dung dịch alginate trong nướcvới huyền phù tế bào và nhỏ từng giọt hỗn hợp này vào dung dịch calcium chloride đểtạo thành các hạt calcium alginate không tan có chứa tế bào [2, 5]

Kĩ thuật này cho phép tạo gel nhanh, mỗi giọt dung dịch alginate tạo thành mộthạt gel chứa các tế bào vi sinh vật bên trong

Một tính chất quan trọng khác của phương pháp khuếch tán là hạt gel tạo thành

có sự phân bố alginate không đồng đều, nồng độ alginate cao ở bề mặt hạt và giảm dầnvào tâm hạt Nồng độ alginate trên bề mặt có thể cao gấp năm lần nồng độ của dungdịch alginate ban đầu và nồng độ tại vùng tâm là bằng không Sự không đồng nhất nàyphụ thuộc vào phân tử lượng của alginate, nồng độ các ion tạo gel và không tạo geltrong dung dịch [2, 11]

3.1.2 Phương pháp tạo gel bên trong

Phương pháp này tạo gel bằng cách đặt một nguồn các ion liên kết ngang ở dạng

vô hoạt vào dung dịch alginate và các ion được giải phóng dần dần để kết hợp vớialginate Sự giải phóng các ion liên kết ngang được kiểm soát bằng cách thay đổi pHhoặc sử dụng các muối ít tan (có độ hòa tan giới hạn) Đối với ion calcium, người tadùng các muối CaCO3, CaSO4 hoặc các phức của calcium với EDTA, citrate… [11]

So với phương pháp khuếch tán, phương pháp tạo gel bên trong tạo nên nhữnghạt gel có tính đồng nhất cao hơn do quá trình tạo gel xảy ra chậm hơn [2, 11]

Trang 20

Alginate

Na-Na- Alginate

Hình 3: Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel bên trong [11]

GDL: D-glucono--lactone

Trang 21

3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất của hạt gel

Alginate có một tính chất đặc biệt là có thể tạo gel ở nhiệt độ thường và hạt geltạo thành rất bền nhiệt Hạt gel có thể được xử lý ở nhiệt độ cao mà không bị tan chảy.Nhưng điều đó không có nghĩa là quá trình tạo gel ít phụ thuộc vào nhiệt độ Ngượclại, nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tạo gel Trên thực tế, nhiệt độ có thể đượcdùng để điều chỉnh quá trình tạo gel Tính chất của hạt gel cũng thay đổi khi chúngđược tạo ra ở các nhiệt độ khác nhau [2, 11]

Ngoài ra, quá trình tạo gel alginate còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác: nguồngốc, cấu tạo hóa học và nồng độ dung dịch alginate, nồng độ ion tạo gel, tỉ lệ giữa iontạo gel và không tạo gel, pH, sự có mặt của các tác nhân tạo phức (complexing agent)như phosphate, citrate [2, 11]

Nhiều nghiên cứu cho thấy khi nồng độ alginate càng cao thì sự co rút của hạt gelcàng ít, mạng lưới gel sẽ nhiều hơn, hạt gel xốp và giữ nước nhiều hơn [2]

Theo A Martinsen, các tính chất vật lý của hạt gel cũng phụ thuộc rất nhiều vàothành phần cấu tạo, cấu trúc chuỗi và kích thước phân tử alginate Hạt gel có độ bền cơcao nhất, độ co rút thấp nhất, có độ ổn định tốt nhất đối với các cation đơn trị và có độxốp tốt nhất khi alginate có hàm lượng acid L-guluronic chiếm hơn 70% và độ dàitrung bình của phân đoạn G cao hơn 15 gốc guluronic [29]

Cũng theo A Martinsen, đối với alginate có phân tử lượng lớn hơn 2,4.105, độbền hạt gel không phụ thuộc vào phân tử lượng nữa [29] Có thể giải thích điều nàynhư sau: Mạch phân tử alginate ngắn sẽ tạo thành các mắt lưới nhỏ Alginate có mạchphân tử dài hơn sẽ chứa nhiều gốc guluronic hơn và các mắt lưới tạo thành cũng cókích thước lớn hơn Khi kích thước mắt lưới đạt một giá trị nhất định thì dù có tăng độdài mạch phân tử thì cũng không làm thay đổi đáng kể kích thước của các mắt lưới [2].Nghiên cứu của Martinsen và cộng sự [30] cho thấy:

Tốc độ khuếch tán của serum albumin ra khỏi hạt gel calcium alginate phụthuộc vào nồng độ và thành phần uronic acid của alginate (tỉ lệ ManA/GulA), điềukiện tạo hạt gel, pH, nhiệt độ

Hệ số khuếch tán giảm khi tăng nồng độ alginate, tăng tỉ lệ ManA/GulA vàgiảm pH Sự khuếch tán ra khỏi hạt gel có nồng độ alginate phân bố đều thì nhanh hơntrường hợp hạt gel có alginate tập trung nhiều trên bề mặt

Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình khuếch tán theo định luật Arrhenius với nănglượng hoạt hóa 23kJ/mol

Trang 22

Gel calcium alginate dễ bị phá vỡ bởi lực cơ học và dần dần bị hòa tan khi có mặtcác tác nhân “bắt” ion calcium như ion phosphate hay citrate Vì thế, tế bào có thể bịrửa trôi, nhưng tế bào cũng có thể được giải phóng khỏi sự cố định nhờ sự hòa tan này.Điều này cho phép ta nghiên cứu các tính chất đặc trưng của tế bào cố định trong gelalginate (về khả năng sống và phát triển,…) Có thể dùng một số ion kim loại hóa trịcao (nhôm, strontium) để thay thế ion calcium Các hạt gel calcium alginate có thểđược xử lý bằng các loại nhựa cation để làm tăng khả năng chống lại sự hòa tan bởicác tác nhân “bắt” ion calcium [5].

Bảng 1: Các ứng dụng của tế bào cố định trong alginate [5]

Streptomyces tendae Nikkomycin

Zymononas mobilis Ethanol

Bacillus subtilis Proinsulin

Escherichia coli -lactamase Nấm men

Saccharomyces cerevisiae Ethanol

Trigonopsis variabilis -Keto acid Nấm mốc

Aspergillus niger Citric acid

Gluconic acid

Curvularia lunata Hydrocortisone

Penicillium chrysogenum Penicillin G

Tế bào thực vật

Catharanthus roseus Ajmalicine isomers

Digitalis lanata Digoxin

Lavandula vera Blue pigments

Tế bào động vật

Hybridoma cell 4H11 Monoclonal IgA

Trang 23

4 ỨNG DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG SẢN XUẤT ETHANOL

Quá trình lên men rượu bắt đầu bằng chu trình đường phân, phân giải phân tửglucose tạo thành 2 phân tử acid pyruvic và 2 phân tử ATP Trong phản ứng tiếp theo,

2 phân tử acid pyruvic chuyển hóa thành 2 phân tử acetaldehyde và 2 phân tử CO2.Sau đó, 2 phân tử acetaldehyde bị khử bằng 2 phân tử NADH để tạo thành 2 phân tửethanol

Thực chất, lên men ethanol là một quá trình tạo năng lượng thấp vì phần lớn nănglượng chứa trong phân tử đường ban đầu được giữ lại trong sản phẩm cuối là ethanol.Ethanol và CO2 mà vi sinh vật tạo ra là những chất thải đối với vi sinh vật nhưng lạihữu ích cho con người [47]

Hình 4: Quá trình lên men cồn

Trang 24

Người ta đã nghiên cứu và ứng dụng nhiều loại vi sinh vật cố định trên nhiều loạichất mang để lên men cồn từ nhiều môi trường khác nhau.

Bảng 2: Ứng dụng nấm men cố định trong sản xuất ethanol

Loài VSV Chất mang Môi trường TLTK

Carob pod extract [40]

Glucose, nước nho,

Mảnh táo Glucose, nước nho [55]

Gỗ, tre, mía, maize

Trang 25

5 LÊN MEN CỒN BẰNG NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae CỐ ĐỊNH

TRONG GEL ALGINATE

5.1 Đặc điểm nấm men Saccharomyces cerevisiae

5.1.1.Cấu tạo tế bào nấm men

Nấm men Saccharomyces cerevisiae là vi sinh vật đơn bào thuộc nhóm

Eucaryote Chúng có hình cầu, sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi Tế bàonấm men cấu tạo rất phức tạp gồm: màng tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, nhân,không bào, các hạt dự trữ (glycogen, voluten,…), ribosome (nơi tổng hợp protein) và

ty thể (nơi xảy ra quá trình tổng hợp năng lượng) [2]

5.1.2 Thành phần hóa học của tế bào nấm men

Thành phần hóa học của tế bào nấm men phụ thuộc vào chủng giống, môitrường, trạng thái sinh lý cũng như điều kiện nuôi cấy Nấm men ép chứa trung bình75% nước và 25% chất khô Chất khô của nấm men gồm: 30-50% protein, 24-40%glucide, 2-5% lipid, 5-11% khoáng [2]

5.1.3 Tổng hợp năng lượng ở nấm men

Saccharomyces cerevisiae là vi sinh vật kỵ khí tùy tiện (facultative anaerobes).

Chúng có thể sinh trưởng ở môi trường có cũng như không có oxygen phân tử Trong

đó, sự sinh trưởng trong môi trường có oxygen phân tử nhanh và mạnh hơn

Khi có oxygen, Saccharomyces cerevisiae tổng hợp năng lượng theo con đường

hô hấp hiếu khí, chuyển đường glucose thành nước và CO2, phát triển sinh khối mạnhmẽ

Khi không có oxygen, Saccharomyces cerevisiae tổng hợp năng lượng bằng quá

trình lên men ethanol Năng lượng tạo ra rất thấp, chỉ đủ để nấm men duy trì sự sống,phát triển sinh khối rất yếu [47]

5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng nấm men

5.2.1 Nhiệt độ

Mỗi vi sinh đều có một nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển, tùy vào nhiệt độ này màngười ta chia vi sinh vật thành nhiều loại: ưa lạnh, ưa ấm, ưa nóng [1]

Nấm men Saccharomyces cerevisiae có nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng

28-32oC Nếu tiến hành lên men ở nhiệt độ thấp (20-22oC) thì thời gian lên men kéo dàinhưng sự phát triển của tạp khuẩn được hạn chế [2]

Trang 26

Ở nhiệt độ cao (33-35oC), hoạt tính của nấm men sẽ giảm, các vi sinh vật tạpnhiễm sẽ phát triển mạnh hơn Ở 30oC, nấm men dại phát triển nhanh hơn

Saccharomyces hai lần Ở 35-38oC, chúng phát triển nhanh gấp 6 đến 8 lần Mặt khác,nhiệt độ lên men cao sẽ làm tăng sự tạo thành các sản phẩm phụ (ester, aldehyde, acid,

…) và tăng sự tổn thất ethanol theo CO2 Ở 40oC, nấm men Saccharomyces ngừng

phát triển [2]

5.2.2 Giá trị pH

Nồng độ ion H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấmmen Nó làm thay đổi điện tích các chất tham gia cấu tạo màng tế bào, ảnh hưởng đếnquá trình vận chuyển cơ chất qua màng tế bào Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốttrong một trạng thái ion nhất định, trạng thái này lại phụ thuộc vào pH môi trường

Đối với nấm men Saccharomyces, giá trị pH tối ưu cho sự tổng hợp ethanol là

4,5 - 5,0 Giá trị pH tăng làm giảm hiệu suất lên men vì khả năng bị nhiễm khuẩn và sựtổng hợp glycerin tăng

Khi pH thấp (<4,2), nấm men Saccharomyces phát triển chậm hơn so với ở pH

tối ưu nhưng tạp khuẩn cũng khó phát triển Do đó, ta nên tiến hành lên men ở giá trị

pH thấp để hạn chế tạp khuẩn Khi nấm men đã phát triển nhiều và mạnh, ta tăng pHđến giá trị tối ưu cho nấm men phát triển nhanh hơn Lúc này, tạp khuẩn cũng có điềukiện phát triển hơn nhưng nấm men đã đủ mạnh để lấn át tạp khuẩn [2]

5.2.3 Nồng độ chất khô ban đầu trong dịch lên men

Thông thường, khi nồng độ chất khô ban đầu quá cao thì hiệu suất lên men khôngcao Khi nồng độ đường trong dung dịch đạt đến 30 - 35% thì quá trình lên men hầunhư bị ngừng lại Người ta thấy rằng nấm men có thể lên men được dung dịch đường

có nồng độ 25 - 30% dù tốc độ lên men rất chậm Môi trường có nồng độ đường 10 –18% là thích hợp nhất cho quá trình lên men Dung dịch có nồng độ đường cao sẽ gây

ra áp suất thẩm thẩu lớn làm mất trạng thái cân bằng sinh lí bình thường của nấm men,thời gian lên men sẽ kéo dài, nấm men sử dụng đường không triệt để Nồng độ đườngcao cũng có nghĩa là lượng rượu tạo thành nhiều, nồng độ rượu cao cũng gây ức chếhoạt động của nấm men Ngược lại, môi trường lên men có nồng độ đường quá thấp sẽkhông thuận lợi về kinh tế (tăng chi phí năng lượng, thiết bị,…) [2]

5.2.4 Nồng độ ethanol

Rượu được tích tụ dần trong suốt quá trình lên men Khi nồng độ rượu quá cao,

nó trở thành chất độc đối với nấm men, kìm hãm khả năng sinh sản cũng như lên mencủa nấm men

Ở nồng độ rượu 2 - 5%, sự phát triển của nấm men bị kìm hãm

Trang 27

Ở nồng độ rượu 5 - 6%, nấm men ngừng sinh sản nhưng vẫn có thể tiếp tục lênmen [2].

5.2.5 Oxygen phân tử

Trong quá trình lên men, ngoài sản phẩm chủ yếu là ethanol và CO2, nấm mencòn tổng hợp các sản phẩm phụ (rượu cao phân tử, glycerin, ester, aldehyde…) Trongđiều kiện yếm khí, quá trình sinh tổng hợp ethanol xảy ra mạnh mẽ, sự phát triển sinhkhối của tế bào nấm men yếu đi vì khi đó năng lượng được tạo thành từ quá trình lênmen chỉ đủ để duy trì hoạt động sống của nấm men Khi cung cấp oxygen phân tử thìtốc độ sinh tổng hợp ethanol sẽ yếu đi vì nấm men sẽ thu năng lượng cần thiết cho sựphát triển của chúng bằng con đường hô hấp hiếu khí [2]

5.2.6 Môi trường lên men

Môi trường để nuôi cấy nấm men là hỗn hợp các chất dinh dưỡng cần thiết cho

sự sống của nấm men Môi trường cần đạt các yêu cầu cơ bản: chứa đầy đủ các nguồndinh dưỡng và yếu tố sinh trưởng cần thiết, có pH và độ nhớt thích hợp, hoàn toàn vôkhuẩn

Do các yêu cầu trên, khi tiến hành sản xuất cồn từ ngũ cốc, khoai, tinh bột haycác phế liệu, ta cần nghiên cứu bổ sung các chất dinh dưỡng và yếu tố sinh trưởng cầnthiết, quan trọng nhất là nguồn nitrogen [2]

Trang 28

5.3 Sự sinh trưởng và hoạt tính của nấm men cố định

Hình 5: Tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae tự do

Hình 6: Tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae trong mạng

lưới gel alginate

Sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên sự sinh trưởng của nấm men

Saccharomyces cerevisiae thay đổi khi chúng được cố định vào các chất mang.

Roukas T nghiên cứu động học của quá trình lên men ethanol từ dịch chiết carob

bằng tế bào Saccharomyces cerevisiae cố định trong Ca-alginate [39] và thu được kết

quả:

Các giá trị tối ưu về nồng độ ethanol, tốc độ sinh tổng hợp ethanol, hiệu suất tạoethanol đạt được trong khoảng pH 3,5-6,5, khoảng nhiệt độ 30-35oC

Bảng 3: Các giá trị tối ưu đạt được trong nghiên cứu của Roukas T.

Yếu tố Giá trị cực đại Nồng độ đường

ban đầu (g/l)

Hiệu suất tạo ethanol (g ethanol/g glucose) 0,44 100

Giá trị lớn nhất của hằng số tốc độ sinh tổng hợp cồn, hằng số tốc độ hấp thuđường được ghi nhận ở pH 6,5, nhiệt độ 40oC và nồng độ đường ban đầu 100 g/l

Các thông số động học khác như nồng độ sinh khối, hiệu suất tạo sinh khối, vàhằng số tốc độ sinh trưởng đạt cực đại ở pH 5,5, nhiệt độ 30oC, nồng độ đường banđầu 150 g/l

Trang 29

Theo E Bardi, A A Koutinas và M Kanellaki [6], nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định trong gluten có thể lên men theo chu kì ở nhiệt độ rất thấp (0 – 5oC)

mà hoàn toàn không bị mất hoạt tính

Như vậy, khi đã được cố định trong các chất mang, khoảng nhiệt độ, pH và nồng

độ chất khô tối ưu cho sự phát triển của Saccharomyces cerevisiae rộng hơn so với tế

bào tự do Điều đó cũng làm tăng tỉ lệ sống sót của nấm men và kéo dài thời gian sửdụng nấm men

Khi nghiên cứu lên men cồn bằng nấm men cố định với cơ chất là glucose, nuôicấy tĩnh nhiều chu kì, Youssef K A và cộng sự nhận thấy tỉ lệ tế bào sống sau khi lênmen cao gấp 3 lần so với thí nghiệm tương tự sử dụng tế bào tự do [56]

Tuy nhiên, thời gian sử dụng nấm men cố định có thể dao động trong một khoảngrất rộng Nhiều nhà nghiên cứu đã khảo sát thông số này và thu được những kết quả rấtkhác nhau:

Youssef K A và cộng sự dùng nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định

trong gel Ca-alginate để chuyển hóa glucose thành ethanol và nhận thấy: sau 16 ngày,chỉ 50% số tế bào còn sống, sau 48 ngày chỉ còn 6% và tới ngày thứ 52 thì không còn

tế bào nào sống sót [56]

Theo Roukas T., khi nuôi cấy bán liên tục trong dịch chiết carob, tế bào nấm

men Saccharomyces cerevisiae cố định trong gel Ca-alginate giữ được khả năng lên

men ethanol trong 10 ngày [38] Nhưng khi nuôi cấy gián đoạn lặp lại nhiều chu kỳ, tế

bào Saccharomyces cerevisiae cố định trong Ca-alginate chỉ giữ được khả năng lên

men cồn trong 5 ngày [39]

Yekta Goksungur, Nese Zorlu tiến hành lên men mật rỉ bằng nấm men

Saccharomyces cerevisiae cố định trong alginate theo phương pháp liên tục với tốc độ

pha loãng 0,22 h-1 Kết quả cho thấy hệ thống có thể hoạt động trong suốt 25 ngày mànấm men không bị mất hoạt tính [15]

Theo McGhee J E., nấm men Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-2034 cố

định trong calcium alginate có thể lên men cồn tới 90 ngày [22]

Theo Nigam J N., nấm men cố định trong k-carrageenan có thể sử dụng để lênmen cồn liên tục trong hơn 87 ngày mà không mất hoạt tính [33]

Sự khác biệt này có thể giải thích bằng sự thay đổi chất mang, môi trường,

phương pháp lên men và các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae khác nhau.

Trang 30

Nhìn chung, trong cùng điều kiện lên men, nấm men cố định cho nồng độ ethanolcuối cao hơn nấm men tự do [20, 38].

Nấm men Saccharomyces cerevisiae CCT 3174 cố định trong chrysotile cho

hiệu suất tạo cồn cao hơn nấm men cố định 26% [20]

Tốc độ lên men cồn bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae ATCC 24553 cố

định trong k-carrageenan cao hơn nấm men tự do 11,5 lần [30]

Theo Pauline M Doran và James E Bailey quá trình lên men cồn sử dụng nấmmen cố định trong gelatin có hằng số tốc độ sinh tổng hợp ethanol cao hơn khi nấmmen tự do 40-50%, tốc độ sử dụng glucose của nấm men cố định gấp 2 lần nấm men

tự do [36]

Trong nghiên cứu của N Kiran Sree và cộng sự [23], nấm men cố định tronggel alginate được so sánh với nấm men tự do khi nuôi cấy bán liên tục Kết quả chothấy: Lượng cồn do nấm men cố định tạo thành trong 48h đầu tiên là 44g/l trong khinấm men tự do tạo thành lượng cồn 72g/l Tuy nhiên, sau 4 chu kỳ nuôi cấy bán liêntục, lượng cồn do nấm men tự do tạo thành giảm từ 72g/l xuống còn 25g/l Còn lượngcồn do nấm men cố định tạo thành lại tăng từ 44g/l lên 72g/l

5.5 Ảnh hưởng của phương pháp và thiết bị đến quá trình lên men ethanol bằng nấm men cố định

Phương pháp lên men, cấu tạo và kích thước thiết bị đều ảnh hưởng đến quá trìnhlên men cồn bằng nấm men cố định vì các yếu tố này ảnh hưởng đến quá trình truyềnkhối [53]

Theo McGhee J E., trong hầu hết các trường hợp, phương pháp nuôi cấy liên tụccho hiệu suất tạo ethanol cao hơn phương pháp nuôi cấy tĩnh [22]

Hình dạng thiết bị và cách sắp xếp các hạt gel cũng ảnh hưởng đến độ bền củahạt trong suốt quá trình lên men Peter S T Cheetham cho rằng các hạt gel sắp xếpthành các cột thì tốt nhất cho việc lên men Các cột hạt này có khả năng chống nén ép

và mài mòn trong suốt quá trình lên men liên tục với tốc độ dòng chảy lớn [9]

5.6 Ảnh hưởng của các yếu tố khác

Ngoài các yếu tố đã kể trên, quá trình lên men cồn bằng nấm men cố định cònchịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác

“Tuổi đời” của tế bào nấm men

Trang 31

McGhee J E và cộng sự nuôi cấy nấm men cố định 24, 48, 72, 96 giờ tuổitrong thiết bị lên men liên tục và lên men tĩnh và nhận thấy hiệu suất tạo ethanol lớnnhất (0,511g ethanol/g glucose) đạt được sau 6 ngày nuôi cấy liên tục nấm men

Saccharomyces cerevisiae 96 giờ tuổi cố định và tiếp tục như vậy tới ngày thứ 91 Họ

cho rằng chủng nấm men này có “tuổi đời” càng cao thì lên men càng hiệu quả [22]

Youssef K A và cộng sự sử dụng nấm men có độ tuổi khác nhau cố định tronggel alginate để chuyển hóa glucose thành ethanol và thấy rằng nấm men 48 giờ tuổi lênmen hiệu quả nhất [56]

Lượng giống cấy ban đầu

Theo Youssef K A., khi tăng số lượng giống cấy thì thời gian để đạt hiệu suấtcồn cực đại giảm Tuy nhiên, tỷ lệ tế bào sống sót giảm khi tăng số lượng giống cấyban đầu [56]

Trang 32

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 NGUYÊN LIỆU

1.1 Nấm men

Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng nấm men loài Saccharomyces cerevisiae do Phòng thí nghiệm Vi sinh - Bộ môn Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại

học Bách Khoa cung cấp Nấm men lên men rượu cần có các đặc tính sau:

Phát triển nhanh trong dịch đường lên men

Lên men nhanh chóng và hoàn toàn các loại đường có thể lên men có trong môitrường

Có thể lên men ở nhiệt độ tương đối cao

Có khả năng chịu được độ cồn cao trong quá trình lên men

Có thể lên men trong môi trường có độ acid cao

Trang 33

1.3 Môi trường lên men

Chúng tôi sử dụng môi trường tổng hợp để thực hiện quá trình lên men Ưu điểmcủa môi trường tổng hợp là pha chế nhanh, dễ dàng, thành phần hóa học của môitrường ổn định Điều này giúp làm giảm sai số khi thực hiện các thí nghiệm trong suốtthời gian thực hiện đề tài

Thành phần môi trường lên men:

Trang 34

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành quá trình lên men cồn bằng nấm men cố định theo phươngpháp chu kì, khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men, pH ban đầu của môi trường vànồng độ chất khô ban đầu đến sự sinh trưởng và khả năng tạo cồn của nấm men cốđịnh

2.2 Cố định tế bào nấm men trong gel alginate bằng phương pháp bẫy

Chuẩn bị các hóa chất:

Dung dịch alginate 3%

Dung dịch CaCl2 2%

Nước sạch

Môi trường lên men

Tất cả các hóa chất trên được hấp tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút Sau đó làmnguội và giữ ở 15 – 20oC

Quá trình thực hiện:

Cấy chuyền và giữ giống nấm men Saccharomyces cerevisiae trên thạch

nghiêng

Nhân giống cấp 1 trong 10ml dịch lên men trong 24 giờ

Nhân giống cấp 2 trong 100ml dịch lên men trong 24 giờ

Ly tâm tách sinh khối nấm men với điều kiện: 6000 vòng/phút, 15 phút, 4oC

Pha huyền phù nấm men trong nước vô khuẩn có mật độ 50 triệu tế bào/ml

Trộn đều huyền phù nấm men và dung dịch alginate 3% với tỉ lệ thể tích 1:1

Dùng ống tiêm nhỏ từng giọt hỗn hợp alginate - nấm men vào dung dịch CaCl2

2% Ống tiêm có đường kính lỗ ra khoảng 3 – 4 mm, lỗ ra đặt cách mặt thoáng dungdịch CaCl2 5cm Dung dịch CaCl2 được khuấy đảo liên tục trên bàn khuấy từ với tốc

độ 100 - 200 vòng/phút Mỗi giọt hỗn hợp alginate - nấm men rơi xuống dung dịch sẽtạo thành một hạt nấm men cố định

Ngâm hạt trong dung dịch CaCl2 2% trong 2 giờ

Rửa hạt bằng nước vô khuẩn 2 – 3 lần cho sạch dung dịch CaCl2 bám trên hạt

Trang 35

Như vậy, ta đã có các hạt nấm men cố định để tiến hành lên men Trong nghiêncứu này, chúng tôi dùng hạt nấm men cố định ngay sau khi cố định xong

2.3 Khảo sát quá trình lên men cồn bằng nấm men cố định theo phương pháp chu kì

Hạt gel được đưa vào môi trường để lên men chu kì I, tỉ lệ giống cấy là 5 triệu tếbào sống/ml Khi chu kì I kết thúc, vớt hạt ra khỏi dịch lên men, ngâm hạt trong dungdịch CaCl2 1% trong 15 phút Sau đó, rửa hạt bằng nước vô khuẩn rồi đưa hạt vào môitrường mới để lên men chu kì II Tỉ lệ giống cấy ở chu kì II cũng là 5 triệu tế bào sống/

ml

Chúng tôi tiến hành thí nghiệm ở các điều kiện nhiệt độ lên men, pH ban đầu vànồng độ chất khô ban đầu của dịch đường khác nhau Ở mỗi điều kiện, chúng tôi tiếnhành song song thí nghiệm với nấm men cố định và thí nghiệm với nấm men tự do

Bảng 4: Bố trí các thí nghiệm

TN số Kiểu nấm men Nhiệt độ

lên men ( o C) pH ban đầu

Nồng độ chất khô ban đầu ( o Brix)

Trang 36

Trong thời gian tiến hành thí nghiệm, chúng tôi lấy mẫu 2 lần mỗi ngày để theodõi sự thay đổi của các chỉ số hóa lý của canh trường và sự sinh trưởng của nấm men.

Giá trị pH của canh trường Dùng pH kế.

Nồng độ đường khử trong canh

Quá trình lên men sử dụng nấm men cố định được xem là kết thúc khi nồng độđường khử trong canh trường giảm không quá 0,15g sau mỗi giờ lên men

Tốc độ lên men của nấm men được tính bằng số gam đường khử trong 1 lít canhtrường được nấm men sử dụng trong 1 giờ lên men

Công thức tính:

T

B A

v   (g/l.h)

Trong đó,

v: Tốc độ lên men (g/l.h)

A: Nồng độ đường khử ban đầu của môi trường, (g/l)

B: Nồng độ đường khử của môi trường khi quá trình lên men kết thúc, (g/l)

T: Thời gian lên men, (h)

Đối với các mẫu thí nghiệm sử dụng nấm men tự do (mẫu kiểm chứng), do nồng

độ đường khử giảm chậm hơn nhiều so với thí nghiệm sử dụng nấm men cố định nên

Trang 37

chúng tôi không thể xác định thời điểm kết thúc quá trình lên men tương tự như trên.Tốc độ lên men cũng được tính theo công thức trên với quy ước:

A: Nồng độ đường khử ban đầu của môi trường, (g/l)

B: Nồng độ đường khử của môi trường trong mẫu phân tích cuối cùng, (g/l)

T: Thời gian từ lúc cấy giống nấm men vào môi trường đến thời điểm lấy mẫuphân tích cuối cùng, (h)

Trang 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Nấm men cố định trong gel alginate có rất nhiều ưu điểm so với nấm men tự do.Tuy nhiên, để áp dụng được vào sản xuất ở quy mô công nghiệp thì chúng ta phảinghiên cứu và khảo sát nhiều vấn đề Một trong những vấn đề đó là ảnh hưởng củathành phần môi trường và điều kiện lên men đến sự sinh trưởng và hoạt tính của nấmmen cố định Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát sự sinh trưởng của nấm men

Saccharomyces cerevisiae cố định trong gel alginate được sử dụng trong quá trình lên

men ethanol ở những điều kiện nhiệt độ, pH ban đầu và nồng độ chất khô khác nhau

1 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE

1.1 Bố trí thí nghiệm

Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, chúng tôi tiến hành 3 thí nghiệm với nấmmen cố định và 3 thí nghiệm với nấm men tự do để kiểm chứng Trong các thí nghiệm,chúng tôi sử dụng cùng môi trường có pH ban đầu 4,5, nồng độ chất khô ban đầu

15oBx Nhiệt độ lên men được thay đổi như trong bảng 6

Trang 39

Bảng 6: Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

TN số Kiểu nấm men Nhiệt độ lên men ( o C)

Nấm men cố định được sử dụng để thực hiện 2 chu kì lên men, còn nấm men tự

do chỉ được sử dụng để thực hiện 1 chu kì lên men như trong công nghiệp sản xuất cồnhiện nay

Sự sinh trưởng của nấm men cố định được đánh giá thông qua:

Mật độ tế bào và tỉ lệ tế bào chết trong hạt ở cả hai chu kì I và II

Mật độ tế bào và tỉ lệ tế bào chết ngoài hạt ở hai chu kì I và II

Sự sinh trưởng của nấm men tự do được đánh giá thông qua mật độ tế bào và tỉ lệ

tế bào chết trong dịch lên men của các mẫu kiểm chứng

Ngoài ra chúng tôi cũng khảo sát sự thay đổi nồng độ chất khô, nồng độ đườngkhử, pH trong quá trình lên men và hàm lượng ethanol thu được khi quá trình lên menkết thúc

1.2 Nhận xét về sự sinh trưởng của nấm men cố định trong gel alginate

Định dạng
Số trang	97
Dung lượng	1,39 MB