Nghiên cứu các điều kiện tinh sạch và đánh giá một số tính chất của protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng serratia marcescens DT3

Chúng có khả năng sinh ra các chất có hoạt tính kháng nấm đã được sử dụng trong kiểm soát nhiều bệnh hại cây trồng khác nhau.. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng của Serrat

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-***** -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG

Tôi xin cảm ơn ThS Lê Thanh Hoàng đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong

quá trình hoàn thành luận văn và cùng tập thể các anh, các chị làm việc tại phòng Công nghệ sinh học enzyme đã nhiệt tình giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt luận văn này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học

Mở Hà Nội đã quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè luôn động viên giúp đỡ tôi trong thời suốt thời gian học tập

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

Trần Thị Thoan

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương về vi khuẩn Serratia 3

1.2 Bệnh cây trồng do nấm Fusarium và Rhizoctonia gây ra 4

1.2.1 Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium và Rhizoctonia hại cây trồng 4

1.2.2 Tình hình bệnh hại cây trồng do nấm Fusarium và nấm Rhizoctonia gây ra tại Việt Nam 8

1.2.3 Biện pháp phòng trừ bệnh nấm hại cây trồng 9

1.3 Tình hình nghiên cứu về chủng Serratia marcescens 14

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 Vật liệu và hóa chất 17

2.1.1 Chủng giống 17

2.1.2 Hóa chất 17

2.1.3 Các loại đệm và dung dịch 17

2.1.5 Thiết bị thí nghiệm 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật 20

2.2.2 Xác định hoạt tính kháng nấm 20

2.2.3 Phương pháp kết tủa phân đoạn 21

2.2.4 Sắc kí trao đổi ion 22

2.2.5 Xác định hàm lượng protein 24

2.2.6 Điện di protein trên gel polyacrylamide ( SDS-PAGE ) 24

2.2.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm 25

2.2.8 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng nấm 26

2.2.9 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 26

2.2.10 Xác định khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm 26

2.2.11 Xử lý số liệu 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Hoạt tính kháng nấm của dịch chiết ngoại bào chủng Serratia marcescens DT3 27

3.2 Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm 30

3.2.1 Tủa protein bằng muối amonium sulfate 30

3.2.2 Tinh sạch protein bằng sắc ký trao đổi ion DEAE 33

3.2.3 Đánh giá một số hoạt tính kháng nấm của protein tinh sạch 35

3.3 Đánh giá tính chất của protein tinh sạch 36

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm 36

3.3.2 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng nấm 37

3.3.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein tinh sạch 39

3.3.4 Xác định khả năng ức chế nẩy mầm của bào tử nấm 41

KẾT LUẬN 43

KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC

Fusarium oxysporum

Kilo Dalton Luria and Bertani Potato Dextrose Agar Matker

Optical density Polyacrylamide gel electrophoresis Protein

Rhizoctonia solani

Sodium dodecyl sulfate

Serratia marcescens

Trung bình N,N,N’,N’,- Tetramethyl ethylene diamine Thí nghiệm

Volume/volume (thể tích/thể tích) Weight/volume (khối lượng/thể tích)

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 17

Bảng 2.2 Dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 18

Bảng 2.3 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 19

Bảng 2.4 Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 19

Bảng 2.5 Thành phần gel polyacrylamide 12,5% 25

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của dịch chiết ngoại bào S marcescens DT3 nuôi trong môi trường LB lên sinh trưởng của nấm F oxysporum 28

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của dịch chiết ngoại bào S marcescens DT3 lên sinh trưởng của nấm R.solani 29

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ tủa muối amonium sulfate lên sinh trưởng của nấm F oxysporum 31

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ tủa muối amonium sulfate lên sinh trưởng của nấm R solani 31

Bảng 3.5 Tóm tắt quá trình tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng S marcescens DT 3 qua các bước tinh sạch 34

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ tối thiểu của protein tinh sạch từ chủng

S marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm F oxysporum 39

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ tối thiểu của protein tinh sạch từ chủng

S marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm R solani 40

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình ảnh chủng S marcescens DT3 trên môi trường LB đặc 4 Hình 1.2 Hình ảnh nấm F oxysporum trên đĩa thạch PDA 5 Hình 1.3 Hình ảnh nấm R solani trên đĩa thạch PDA 6 Hình 2.1 Quy trình tinh sạch protein kháng nấm từ chủng S marcescens DT3

23

Hình 2.2 Đường chuẩn protein sử dụng BSA làm chuẩn 24

Hình 3.1 Hoạt tính kháng nấm của dịch chiết ngoại bào S marcescens DT3

đối với nấm F.oxysporum sau 5 ngày 28

Hình 3.2 Hoạt tính kháng nấm của dịch chiết ngoại bào S marcescens DT3

đối với nấm R solani sau 3 ngày 29

Hình 3.3 Hoạt tính ức chế nấm của nồng độ tủa muối amonium sulfate đối

với nấm F oxysporum sau 5 ngày 31

Hình 3.4 Hoạt tính ức chế nấm của nồng độ tủa muối amonium sulfate đối

với nấm R solani sau 3 ngày 32

Hình 3.5 Hoạt tính kháng nấm của các nồng độ tủa muối amonium sulfate

20 - 80% đối với nấm F oxysporum (A) và nấm R solani (B) 32

Hình 3.6 (A) Sắc kí đồ các phân đoạn protein sau khi qua cột trao đổi ion

DEAE – cellulose; (B) Điện di đồ các phân đoạn protein tinh sạch qua cột trao đổi ion DEAE – cellulose (LC: dịch protein trước khi lên cột; 7-12: protein từ các phân đoạn 7- 12 sau khi qua cột DEAE- sepharose; M: chỉ thị phân tử) 34

Hình 3.7Hoạt tính kháng nấm F oxysporum (A)và R solani (B) của các

phân đoạn protein tinh sạch từ chủng S.marcescens DT3 (Đ/C (-): đệm

potasium phosphate 20 mM pH 6,8; Đ/C (+): dịch lên cột; 7 - 14: protein tinh sạch từ các phân đoạn 7 – 14 35

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm F oxysporum (A)

và nấm R solani (B) Đ/C (+): mẫu không xử lý nhiệt; Đ/C (-): đệm potasium

phosphate 20 mM pH 6,8; 5-30 mẫu xử lý nhiệt độ 100oC trong các khoảng

thời gian 5 phút, 10 phút, 15 phút và 30 phút 37

B 38

Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng nấm F oxysporum (A) và

nấm R solani (B) Đ/C (+): Dịch lên cột; Đ/C (-): đệm potasium phosphate 20

mM pH 6,8; M3: dịch protein tinh sạch ủ trong đệm acetate (pH 3); M7: dịch

protein tinh sạch ủ trong đệm phosphate (pH 7); M9: dịch protein tinh sạch ủ

trong đệm Tris-HCl (pH 9) 38

Hình 3.10Ức chế nồng độ tối thiểu của protein tinh sạch từ chủng S

marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm của nấm F oxysporum 40

Hình 3.11Ức chế nồng độ tối thiểu của protein tinh sạch từ chủng

S marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm của nấm R solani 41

Hình 3.12 Khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm F.oxysporum của

protein tinh sạch từ chủng S marcescens DT3 quan sát trên kính hiển vi

quang học Bào từ nấm F oxysporum sau 4 giờ (A, D), 24 giờ ( B, E) và 28

giờ (C, F); bào tử nấm được ủ với protein tinh sạch sau 4 giờ (D), 24 giờ (E)

và 28 giờ (F) 42

1

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, bệnh hại cây trồng gây ra những thiệt hại nghiêm trọng cho nền nông nghiệp thế giới, làm giảm thu nhập của nhiều nông dân qua việc làm giảm năng suất và chất lượng nông sản Đặc biệt, một

số bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 83%, trong đó bệnh do nấm Fusarium

và Rhizoctonia chiếm tỷ trọng tương đối lớn Nấm bệnh Fusarium và Rhizoctonia gây bệnh trên nhiều loại cây ngũ cốc, cây ăn quả và cây công

nghiệp như lúa, ngô, cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu, bông Chúng có khả năng tồn tại trong đất trong một thời gian dài, phát sinh và gây hại ngay từ giai đoạn cây non và kéo dài đến cho tới khi thu hoạch nếu không áp dụng các biện pháp phòng trừ triệt để Nấm gây ra các triệu chứng thối đen rễ, lở cổ rễ, thối gốc thân, thối thân, khô vằn, thối lá

Biện pháp phòng trừ các bệnh hại cây trồng theo xu hướng chủ yếu hiện nay

là chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật gây ra bệnh hại cây Tuy nhiên, thuốc phòng trừ các bệnh hại cây trồng có nguồn gốc hóa học vẫn được dùng phổ biến nhất cho đến nay bởi nó tác dụng rộng, hiệu quả và tác dụng nhanh nhưng thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như hiệu quả càng ngày càng kém và gây ô nhiễm môi trường Vì vậy, các chế phẩm sinh học đang được sử dụng rộng rãi nhằm tạo ra một nền nông nghiệp hữu cơ

an toàn và bền vững

Serratia là một trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi, thuộc họ

Enterobacteraceae Chúng có khả năng sinh ra các chất có hoạt tính kháng nấm đã được sử dụng trong kiểm soát nhiều bệnh hại cây trồng khác nhau

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng của Serratia để phòng trừ

nấm và bảo vệ cây trồng nhưng kết quả đạt được trong nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm vẫn còn hạn chế Bởi chi phí thuốc bảo vệ thực vật trên thế giới chỉ chiếm 1,9% tổng giá trị của các loại thuốc bảo vệ thực vật Chính

vì vậy, việc nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học diệt nấm là cần thiết

2

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài:‘‘ Nghiên cứu các điều kiện tinh sạch và đánh giá một số tính chất của protein có hoạt tính

kháng nấm từ chủng Serratia marcescens DT3’’ nhằm thực hiện các nội

dung nghiên cứu:

1. Nghiên cứu các điều kiện tinh sạch protein từ chủng Serratia marcescens DT3 có hoạt tính kháng nấm

2. Đánh giá tính chất của protein tinh sạch từ chủng Serratia marcescens

DT3

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đại cương về vi khuẩn Serratia

Serratia là loài vi khuẩn gram âmthuộc chi Klebsielleae trong họ

Enterobacteriaceae,có thể tìm thấy trong đất, nước, thực vật và cả động

vật.Serratia có khả năng tiết ra một lượng lớn protease ngoại bào vào môi trường xung quanh Ngoài ra,Serratia (S marcescens )còn sản xuất ra một số

enzyme ngoại bào khác như chitinase (Monreal and Reese 1969), nuclease (Ball et al 1987), lipase (Akatsuka et al 1994), hemolysin (Braun and

Schmitz 1980), bacteriocins (Traub 1980) Chi Serratia hiện có mười bốn loài

được công nhận Điển hình là S.marcescen loài gây bệnh chính của Serratia,

chúng gây bệnh cho con người, động vật, côn trùng.S.marcescensđược phát

hiện vào năm 1819 tại Ý, trước đây nó được biết với nhiều cái tên khác như

Chromobacterium prodigiosum Năm 1823 đã đặt tên mới cho chủng này là S.marcescens Các chủng vi khuẩnS.marcescens phân bố trong đất, nước, thực

vật Chúng phát triển ở nhiệt độ từ 5-40°C, pH từ 5-9

Chủng S marcescens có màng cấu trúc tế bào đặc trưng của vi khuẩn Gram

âm, di động, sinh bào tử Thành tế bào mỏng làm bằng một lớp duy nhất là peptidoglycan được bao bọc bởi một lớp màng bên ngoài Các màng bên ngoài có lipopolysaccharide, là một loại đặc biệt của phospholipid gồm các acid béo được gắn vào một dimer phosphate glucosamine Mộtglucosamine gắn liền với một polysaccharide cốt lõi mà mở rộng đến các polysaccharide

O Các màng ngoài cũng là một phương tiện để điều tiết sự hấp thu chất dinh

dưỡng và loại trừ các độc tố.Mặc dù,S.marcescens đã được phân loại như một tác nhân gây bệnh, nhưngbên cạnh đó thì một số chủng S marcescens lại

được sử dụng trong các nghiên cứu về y học, quân sự, nông nghiệp…[35]

Chủng S marcescens DT3 được phân lập từ mẫu đất ở Việt Nam

nhiều cây trồng, cây ăn qu

các bộ phận của cây dư

toàn thế giới F.oxysporum

xuất ba loại bào tử vô tính: b

DT3 trên môi trường LB

ng do nấm Fusarium và Rhizoctonia gây ra

m sinh học của nấm Fusarium và Rhizoctonia hạ

ớn nhất trong Tuberculariaceae, phổ biến trong t

ìm thấy trong đất, chúng sống hoại sinh hoặc ký sinh tr

ng, cây ăn quả và rau Nấm trong chi này thường xâm nh

ưới mặt đất và chúng có thể gây ra một loộng đối với cây chủ Chúng có thể xuất hiệtrong không khí hay truyền qua đường nước, thậm trí chúng còn ti

ả năng hối sinh Nấm Fusarium là một trong nh

êm trọng ở cây trồng trên thế giới Đ

phân tán rộng nhất của các loài Fusarium được t oxysporum không có giai đoạn sinh học điển h

vô tính: bào tử nhỏ, bào tử đính lớn và bào t

ản xuất nhiều nhất, nó có hình bầu dục,hình elip ho

ản xuất trên sợi nấm trên bề mặt.Bào tử đính l

u hoặc cạnh cong,được tìm thấy trên khối bào t

ị ệnh.Bào tử hậu được hình thành đơn lẻ hay theo c

ìm thấy trong các cụm hoặc chuỗi ngắn Nó là bào t

ợc sản xuất trên một sợi nấm hoặc bảo tử đính l

ủng S marcescens ờng LB đặc

ào tử phân trên

ẻ hay theo cặp Nó là bào tử

ử đính lớn.Bào tử

5

hậu không giống như các bào tử khác có thể tồn tại trong đất một thời gian dài [4,22]

Hình 1.2 Hình ảnh nấm F oxysporum trên đĩa thạch PDA

ChủngF oxysporum là một mầm bệnh nấm dễ lây nhiễm gây bệnh héo trên

một phạm vi rộng của các loài thực vật Nó tồn tại trong đất như sợi nấm và các loại bào tử, nhưng thường tồn tại trong đất ở dạng bào tử hậu Lây lan mầm bệnh theo hai cách cơ bản, lây lan khoảng cách ngắn qua bắn nước, bằng thiết bị trồng trọt còn khoảng cách dài qua cấy ghép và hạt giống bị

nhiễm bệnh F oxysporum sẽ gây hại cho cây khỏe mạnh bằng cách lây nhiễm

sợi nấm hoặc nảy mầm bào tử xâm nhập qua các mô gốc của cây trồng qua những vết thương ở gốc rễ Các sợi nấm sẽ phát triển trong tế bào thông qua

vỏ gốc và xylem Một khi trong xylem, sợi nấm sẽ phát triển trong mạch xylem và sản xuất ra bào tử nhỏ Bào tử nhỏ này có thể nhập vào dòng nhựa

và được vận chuyển lên Trường hợp dòng chảy nhựa cây dừng, bào tử nhỏ nảy mầm Cuối cùng các bào tử nhỏ và sợi nấm làm tắc nghẽn các mạch dẫn của cây ngăn chặn cây trồng lấy và chuyển hóa các chất dinh dưỡng Cuối cùng cây trồng thoát hơi nước nhiều hơn nó có thể vận chuyển,đóng lỗkhí,lá héo và cây chết.Sau khi cây chết nấm xâm nhập vào tất cả các mô,hình thành bào tử và tiếp tục lây nhiễm sang các cây lân cận[20]

6

Nấm Rhizoctonia là một nhóm nấm lớn, đa dạng và phức tạp, phân bố khá rộng và được chia thành nhiều nhóm nấm khác nhau Rhizoctonia họ nấm

điển hình gây hại cho cây trồng Đặc biệt, nấmR solani gây bệnh phổ biến

trên thực vật và phân bố trên toàn thế giới.R solaniđược phát hiện cách đây

hơn 100 năm, chúng tồn tại ở dạng sợi sinh trưởng trên cây và thường được

tìm thấy trong đất.Nấm R solani có dạng sợi dài, tạo hạch và không sinh bào

tử Sợi nấm trong mô tế bào khi còn non không có màu, khi trưởng thành có màu nâu vàng nhạt Sợi nấm đa bào, phân nhánh tương đối thẳng góc với sợi nấm chính Chỗ phân nhánh hơi thắt nhỏ lại Sợi nấm trưởng thành có đường kính từ 8 – 12µm Nấm tạo hạch trên cây kí chủ, hạch không đều, có hình tròn dẹt ở phía dưới, khi còn non có màu trắng, khi già có màu nâu đậm Bề mặt của hạch thô và có nhiều lổ nhỏ li ti Hạch nấm có thể ít hay nhiều, nhỏ hay lớn tùy thuộc vào các dòng nấm khác nhau Bào tử hậu của nấm rất ít khi gặp,

chỉ phát sinh khi có độ ẩm khá cao Nấm R solani sinh sản hữu tính tạo đảm

đơn bào tử Ở nước ta, nấm R solani sinh trưởng và phát triển chủ yếu dưới dạng sợi và hạch nấm, chưa thấy dạng sinh sản hữu tính[39]

Hình 1.3 Hình ảnh nấm R solani trên đĩa thạch PDA

Nấm R solani là nấm đa thực bán kí sinh điển hình, có phổ kí chủ rộng

Nấm này có thể xâm nhiễm và gây bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau

Có khoảng 200 loài thực vật bao gồm cây lương thực, cây hoa màu, cây công

nghiệp và các loại cỏ khác nhau bị nấm này gây hại Nấm R solani xuất hiện

7

khắp nơi trên thế giới và gây thiệt hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau Nó

là nguồn gây bệnh hoại sinh, tồn tại và sinh sống trong đất,tấn công các thực vật cư trú ở đó.Tác nhân gây bệnh này được biết là gây thiệt hại nghiêm trọng cho cây trồng bằng cách tấn công chủ yếu là rễ và thân cây của cây trồng Mặc dù, nó có một loạt các cây trồng làm ký chủ nhưng mục tiêu chính của

chúng lại là các loại cây thân cỏ Chủng nấm R.solani sẽ được coi là một loại

nấm đảm nếu giai đoạn sinh sản hữu tính dồi dào [20]

Nấm R solani sống tốt trên cả 3 loại đất: thịt pha cát, đất thịt mùn và đất sét pha cát R solani có khả năng gây bệnh trên rất nhiều loại cây khác nhau như:

lúa, ngô, các cây họ đậu, lục bình, cà chua, bông…Theo Gangopadyay và

Chaksabarti (1982) thì nấm R.solani là loại đa kí chủ gây hại trên hầu hết các

cây trồng thuộc 32 họ và trên 20 loại cỏ thuộc 11 họ thực vật khác nhau Nấm này còn gây bệnh chết rạp cây con và lở cổ rễ trên cà phê, chè, thối cổ rễ ở cây chuối, đậu phộng, gây cháy lá trên dưa chuột và bầu bí, gây lở cổ rễ bông vải, héo vàng khoai tây, còn trên cây cà chua, đậu đỗ gây bệnh hại vào thời kỳ cây con ở rễ, cổ rễ, gây úng nước cây chuyển sang màu nâu đen,cây đổ rạp gọi là bệnh lở cổ rễ.Trên cây ngô gây bệnh hại trên bẹ, phiến lá,thân và bắp ngô tạo ra nhiều viết thương lớn loang lổ, đốm vằn da hổ, hình dạng bất kỳ như đám mây Vết bệnh lan từ phía dưới gốc lên bắp,cờ, làm cây tàn lụi,bắp thối gây tổn thất lớn trên các giống ngô mới [8]

Nấm R.solani tồn tại trong đất trong nhiều năm trong các hình thức hạch nấm Hạch nấm của Rhizoctonia có lớp bên ngoài dày làm tăng khả năng

sống sót và chúng hoạt động như cấu trúc ngủ đông cho tác nhân gây bệnh Nấm được lây nhiễm vào cây trồng bởi các kích thích hóa học được phát ra bởi sự phát triển cây trồng hoặc dư lượng thực vật phân hủy Quá trình xâm nhập của mầm bệnh có thể xảy ra thông qua sự xâm nhập trực tiếp của các lớp biểu bì bằng các con đường qua các lỗ hở tự nhiên của cây Sợi nấm sẽ tiếp xúc với cây và gắn với cây thông qua tăng trưởng, chúng bắt đầu sản xuất một cấu trúc thâm nhập vào tế bào của cây và sử dụng chất dinh dưỡng từ tế bào

8

của cây, mầm bệnh cũng có thể sản xuất các enzyme phân hủy thành tế bào thực vật và tiếp tục phát triển bên trong các mô chết Mầm bệnh mới được sản xuất trên hoặc trong các mô thực vật và được lặp đi lặp lại một chu kỳ mới khi các nguồn lây bệnh mới trở nên có sẵn [16,19]

1.2.2 Tình hình bệnh hại cây trồng do nấm Fusarium và nấm Rhizoctonia

gây ra tại Việt Nam

Ở nước ta, điều kiện khí hậu và tập quán canh tác rất tốt nên thích hợp cho

nấm F.oxysporum và R.solanitồn lưu, phát triển và gây bệnh Bệnh nấm F.oxysporum và R.solani là một trong những bệnh quan trọng gây hại đồng

thời nhiều loại cây trồng như cà chua, khoai tây,ngô, đậu tương, cây ăn quả,sầu riêng Hàng năm sản lượng nông nghiệp thất thu do bệnh này tới hàng chục tỉ đồng Ước tính rằng, năm 2010 thiệt hại về bệnh thực vật bao gồm cả chi phí kiểm soát lên tới 701,2 triệu đô la Hai trong các cây quan trọng bị hai nấm trên gây hại mà có ý nghĩa kinh tế và sản lượng nông nghiệp cao là cây ngô và cây đậu tương Đây là hai cây lương thực và cây công nghiệp ngắn ngày quan trọng Mang lại hiệu quả kinh tế cao trên thế giới và ở Việt Nam

nhưng lại bị bệnh do nấm F.oxysporum và R.solani gây hại nặng ở miền bắc

Việt Nam Để sản phẩm an toàn cần có các biện pháp sinh học canh tác để

hạn chế bệnh do nấmF.oxysporum vàR.solani gây hại ngoài đồng và truyền

qua hạt đậu tương và ngô Các bệnh héo trên cây trồng là vấn đề quan trọng

ở Việt Nam, chủ yếu là do nấm F oxysporum gây ra, nó cũng có thể gây thối ở dưa hấu và củ khoai tây đã bị sâu hoặc bị dụng cụ gặt hái làm tổn thương [9]

Bệnh đốm cháy lá do nấm R.solani Kuxhn gây ra xuất hiện từ khi cây

bông mới mọc và bệnh tiếp tục phát triển mạnh mẽ về cuối vụ, gây hại nặng

cho cây bông ở vùng Đồng Nai Ngoài cây bông nấm R.solani Kuxhn còn

gây hại trên cây đậu xanh, cây ngô,cây cối xay Nguyễn Kim Vân đã tìm thấy

7 bệnh phổ biến trên cây cải bắp do nấm R.solani gây hại nghiêm trọng với tỉ

9

lệ bệnh từ 26% đến 50% bệnh hại rất nặng ở giai đoạn bắp cuối đến thu hoạch [5]

Đỗ Tấn Dũng nghiên cứu cho thấy bệnh lở cổ rễ do nấm R.solani gây ra là

bệnh hại phổ biến trên nhiều loại cây trồng thuộc họ cà, họ đậu, họ bầu bí Mức độ nhiễm bệnh trên các cây kí chủ cà chua, lạc, đậu tương, cũng khác

nhau Phạm vi ký chủ của nấm R solani vùng Hà Nội năm 2005 -2006 gồm

các cây cà chua, khoai tây, lạc đậu tương, đậu đũa, dưa chuột [2]

Bệnh lở cổ rễ hại bông ở vùng duyên hải miền Trung chủ yếu là do nấm

R.solani gây ra Ngoài ra, còn có một số tác nhân khác như F oxysporum nhưng ở mức thấp Bệnh lở cổ rễ do nấm R.solani gây hại từ khi hạt nảy mầm

cho đến giai đoạn 25 ngày tuổi, đặc biệt gây hại khi cây bông được 2-3 lá thật, cây bông càng lớn thì càng ít bị ảnh hưởng Nấm gây bệnh chủ yếu tồn tại trong đất còn đối với nguồn nước tưới và hạt giống thì chưa phát hiện ra [8]

1.2.3 Biện pháp phòng trừ bệnh nấm hại cây trồng

Biện pháp phòng trừ bằng thuốc hóa học

Hiện nay, biện pháp phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng phổ biến vẫn là sử dụng các loại thuốc hóa học với ưu điểm dễ sản xuất ở quy mô lớn, giá thành

rẻ phổ tác dụng rộng với động lực mạnh và hiệu quả tác dụng nhanh Tuy nhiên, chúng càng ngày càng bộc lộ nhiều nhược điểm như nhanh bị ức chế bởi côn trùng, gây ô nhiễm đất, nguồn nước và không khí, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người Việc sử dụng tràn lan các loại thuốc bảo vệ thực vật đã làm loài gây hại biến đổi nhanh chóng dẫn đến hiệu quả của việc sử dụng thuốc ngày càng thấp và chi phí ngày càng cao Ước tính có khoảng 520 loài

vi sinh vật gây bệnh cây và 273 loài cỏ dại đã ức chế lại thuốc [43]

Một số loại thuốc bảo vệ thực vật có thời gian phân hủy lâu,sau khi được

sử dụng sẽ thẩm thấu một phần nào đó vào các mạch nước ngầm Các chất này khi đã ngấm vào đất thì gây nguy cơ ngộ độc thuốc diệt công trùng rất cao Thuốc bảo vệ thực vật tổng hợp có độc lực mạnh,phổ tác dụng rộng.Chúng không chỉ tiêu diệt các đối tượng gây hại mà còn tiêu diệt cả

10

những loài có ích như động vật ăn côn trùng Các loài kí sinh côn trùng hại cây trồng,tiêu diệt ong mật và côn trùng thụ phấn cho cây làm cho nhiều cây trồng thụ phấn nhờ côn trùng giảm năng suất và chất lượng [39]

Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật làm cho thực vật bị nhiễm độc, gây ngộ độc cấp tính hoặc mãn tính cho người sử dụng [49].Trên thế giới hàng năm có khoảng 26 triệu trường hợp bị ngộ độc thuốc bảo vệ thực vật,750 nghìn trường hợp ngộ độc mãn tính,3 triệu trường hợp phải nhập viện và 200 nghìn trường hợp tử vong [19] Ở Việt Nam khoảng 15 đến 20 triệu người thường xuyên phơi nhiễm với thuốc bảo vệ thực vật.Theo báo cáo của cục y tế dự phòngvà môi trường -Bộ y tế năm 2009 đã có 4515 trường hợp bị nhiễm độc thuốc bảo vệ thực vật trong đó có 138 trường hợp tử vong.Con số trên chỉ là kết quả thống kê các trường hợp đã nhập viện [1,49]

Biện pháp phòng trừ bằng thuốc có nguồn gốc sinh học

Ở Việt Nam hiện nay đã và đang hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học mà thay vào đó là sử dụng thuốc có nguồn gốc sinh học để nhằm phát triển nền nông nghiệp hữu cơ an toàn và bền vững.Các chế phẩm sinh học tác dụng có chọn lọc mỗi chế phẩm chỉ tác dụng lên một hay một số đối tượng nhất định, không hoặc chỉ gây ảnh hưởng đến một số ít loài ăn sâu bọ,các loài

kí sinh sâu bọ và các loài sinh vật có ích khác Do vậy, hệ sinh thái được phun các chế phẩm sinh học này không bị xáo trộn,đảm bảo sự ổn định bền vững của vùng đất trồng trọt.Chế phẩm khi phát tán sang các vùng lân cận cũng không gây ảnh hưởng tiêu cực đến cây trồng ở đó

Các chế phẩm chứa yếu tố tiêu diệt nấm bệnh là vi sinh có khả năng duy trì hiệu quả kéo dài,chúng không chỉ tiêu diệt nấm đang phá hoại mà còn tồn tại trong đất từ thế hệ này sang thế hệ khác.Do có tác dụng chọn lọc lên đối tượng gây hại,các chế phẩm sinh học sẽ không được sử dụng tràn lan, vì vậy nguy cơ ức chế thuốc của nấm bệnh sẽ được giảm thiểu Mỗi chế phẩm được

sử dụng trong thời gian lâu hơn làm giảm chi phí nghiên cứu sản xuất các loại chế phẩm mới thay thế Các chế phẩm sinh học có thành phần chính là các cơ

11

thể sống hoặc có nguồn gốc từ cơ thể sống,chúng dễ bị phân hủy thành các chất không độc sau một thời gian sử dụng, không làm ô nhiễm đất, nước và không khí.Vì các chế phẩm này đã được chọn lọc để tác dụng đến từng loại côn trùng nhất định,trong trường hợp các cơ thể sống từ các chế phẩm còn tồn tại được trên các nông sản cũng không gây ảnh hưởng lên sức khỏe con người,nếu phát tán vào các thủy vực các chế phẩm này ít ảnh hưởng xấu đến các vi sinh vật đó và do đó không làm giảm giá trị khai thác nguồn lợi thủy sản cũng như sự cân bằng của hệ sinh thái.Mặc dù, có một số nhược điểm như giá thành sản xuất cao,hoạt lực không mạnh bằng hóa chất tổng hợp,hiệu lực tác dụng chậm nhưng với những ưu điểm vượt trội so với hóa chất tổng hợp

về độ thân thiện với môi trường,hệ sinh thái cũng như sức khỏe con người,các chế phẩm sinh học ngày càng nhận được nhiều sự quan tâm trong nghiên cứu

và sản xuất để sử dụng trong nông nghiệp

Trên thực tế đã có nhiều chế phẩm từ các hoạt chất vi sinh vật đã được thương

mại hóa.Ballad là một chế phẩm từ chủng B pumilus(strainQST 2808)

AgraQuest www.agraquest.com, sản phẩm mới năm 2005 Có thể sử dụng

cho khoai tây, đậu tương,ngũ cốc B.pumilus sinh tổng hợp một chất đường

amino chống nấm và ngăn chặn sự hình thành của các tế bào mới và làm rối loạn trao đổi chất tế bào dẫn đến phá hủy tế bào và diệt thể gây bệnh cây trồng Ballad cũng tạo ra rào cản vi khuẩn trên bề mặt lá,ngăn thể gây bệnh như nấm gây rỉ sắt và mốc sương từ khi hình thành trên thực vật.Thuốc này có phổ sử dụng rộng được ghi vào danh sách chất kiểm soát gỉ sắt, mốc sương,mốc lông tơ và bệnh bạc lá

Chế phẩm antiforhis là sản phẩm lên men xốp thanh trùng trên nền giá thể dinh dưỡng của một hỗn hợp các chủng vi khuẩn chọn lọc thuộc các nhóm

pseudomonas sinh huỳnh quang Bacillus.Ngoài khả năng đối kháng mạnh và phân hủy sợi nấm bệnh cây F oxysporum, R solani cũng như một số nấm

bệnh cây khác có nguồn gốc từ trong đất gây bệnh thối rễ,lở cổ rễ.Tuy nhiên sản phẩm này mới dừng lại ở mức độ sử dụng tế bào vi sinh vật sống làm tác

12

nhân ức chế sinh trưởng của nấm bệnh có nguồn gốc từ trong đất.Sản phẩm này có thời gian hữu hiệu ngắn,không quá 12 tháng và chỉ có tác dụng phòng trừ những nấm bệnh cây có nguồn gốc từ trong đất.Mặc dù tác dụng phòng trừ nấm bệnh cây có nguồn gốc từ không khí của các sản phẩm vừa nêu chưa được đề cập tới,nhưng chắc chắn hiệu quả của chúng sẽ không cao,vì sự tồn tại trên bề mặt lá,hoa,quả của tế bào sống gặp ít điều kiện thuận lợi hơn so với điều kiện vùng rễ cây trồng ( tác động trực tiếp của ánh sáng mặt trời, độ ẩm,gió lớn)

Năm 2010, Nhóm nghiên cứu của Viện Công nghệ sinh học đã nghiên cứu thành công chế phẩm BCF từ các dịch chiết ngoại bào từ 3 chủng

Bacillus,Burkholderia và Pseudomonas có khả năng ức chế đến 90% Sự sinh trưởng và phát triển và phát triển của chủng nấm F oxysporum, R solani[3]

Biện pháp khác

Việc áp dụng 2 biện pháp trên có thể kết hợp với một số biện pháp trong quá trình sản xuất như biện pháp canh tác: áp dụng biện pháp luân canh cây trồng, các kỹ thuật trồng trọt.Hoặc sử dụng các sản phẩm phân bón công nghệ sinh học cho cây trồng Sau hơn nửa thế kỉ, chúng ta sử dụng rộng rãi đến mức lạm dụng phân bón hóa học,hầu hết các nước trên thế giới đã nhận ra mặt trái của nó.Môi trường bị ô nhiễm trầm trọng, đất bị thoái hóa, trai cứng,ngộ độc nhất là những cây trồng lâu năm sinh trưởng kém,nông sản chứa nhiều độc tố.Phân bón hữu cơ sinh học là loại phân bón có nguồn gốc hữu cơ được sản xuất bằng công nghệ sinh học (như lên men,vi sinh ) và phối trộn thêm một số hoạt chất khác làm tăng độ hữu hiệu của phân,khi bón vào đất sẽ tạo môi trường cho các quá trình sinh học trong đất diễn ra thuận lợi góp phần làm tăng năng suất chất lượng cây trồng

Từ lâu phân ủ (compost) đã được nông dân hầu khắp các nước trên thế giới sử dụng cho sản xuất nông lâm nghiệp nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng và cải tạo độ phì nhiêu của đất.Từ chỗ Compost chỉ sản xuất bằng phương pháp thủ công truyền thống tự cung tự cấp chưa thành sản phẩm cung

13

ứng bán trên thị trường Đến nay nhiều nước như Nhật Bản, Hàn Quốc,Đài loan, compost đã được sản suất theo quy mô công nghiệp và chở thành sản phẩm hàng hóa trên thị trường.Xu hướng chung hiện nay là tạo ra sản phẩm hữu cơ giàu dinh dưỡng, có bổ sung các vi sinh vật hữu ích, chức năng phù hợp với từng loại cây trồng Như vậy, phân bón hữu cơ vi sinh vật chức năng (HCVSVCN) là phân bón hữu cơ sinh học có bổ sung tổ hợp các vi khuẩn có khả năng cố định nitơ và chuyển hóa lân khó tan

Trong những năm gần đây,việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học phân bón hữu cơ vi sinh đã phát triển rất nhanh để thay thế cho phân vô cơ hóa học gây thoái hóa đất trồng.Các nước cũng rất chú trọng đến việc nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm sinh học phòng trừ dịch hại dạng bón phối hợp với phân bón để thay thế dần và đi đến loại bỏ hoàn toàn thuốc trừ dịch hại hóa học độc hại gây ô nhiễm môi trường.Những nghiên cứu này đã tập chung vào một số các loài vi sinh vật có tính kháng vi sinh vật gây hại như:

Các chủng P.fluorescens là vi sinh vật có tính đối kháng có khả năng sinh

tổng hợp các chất ức chế,có thể ức chế tới 72% sự phát triển của hệ sợi nấm

Phytophthora capsici gây bệnh thối cổ rễ cây hồ tiêu [38]

Theo Amaret (2002) việc phối hợp sử dụng nấm Metarhizium, chế phẩm Neem với phân bón hữu cơ vi sinh cho hiệu quả từ rệp sáp hại gốc tới 60%,trừ

tuyến trùng hại rễ đạt hiệu quả 70-80% trên các cây trồng cạn.Việc sử dụng chế phẩm như vậy không chỉ có hiệu quả cao trong hạn chế dịch hại mà còn giúp cây trồng phát triển khỏe hơn, sinh trưởng tốt hơn và đề kháng nấm hơn Tuy nhiên, các loại thuốc bảo vệ thực vật sinh học dạng bón phối hợp với phân bón hữu cơ vi sinh chỉ có hiệu quả cao khi không có tác động ức chế lẫn nhau giữa các tác nhân vi sinh vật có trong các chế phẩm.Vì vậy, cần phải có

sự nghiên cứu nhằm xác định khả năng tương tác giữa các vi sinh vật hữu hiệu theo tường loại tổ hợp nhất định

14

Bên cạnh đó, việc kết hợp với biện pháp cơ học và lí học: xử lí đất, phơi đất,xử lý hạt giống và đất bằng nhiệt,nhổ bỏ cây bệnh, Áp dụng quản lý dịch hại tổng hợp nhằm đem lại hiệu quả phòng trừ bệnh hại tốt nhất

1.3 Tình hình nghiên cứu về chủng Serratia marcescens

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, mỗi năm thiệt hại hàng trăm triệu dollar bởi bệnh nấm gây thiệt hại mặc dù đã sử dụng thuốc sát trùng Vấn đề về môi trường và sự phát triển ức chế thuốc ở các nấm bệnh đã làm giảm hiệu quả của các loại thuốc diệt nấm Vì vậy, các chất ức chế nấm do các vi sinh vật đất sản sinh ra là một nguồn thuốc sinh học mới, an toàn đầy tiềm năng Kiểm soát sinh học (nghĩa là sử dụng các vi sinh vật tự nhiên hoặc các sản phẩm của chúng để hạn chế sự tấn công và gây hại bởi các mầm bệnh thực vật) hiện đang được quan tâm rất nhiều [11]

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy chủng vi khuẩn Serratia đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế bệnh cây trồng Các chủng Serratia sinh

tổng hợp nhiều loại chất kháng nấm và protein khác nhau như: chlorinated macrolide, haterumalide, NA, and NE pyrrolnitrin, chitinase, β-1,3 glucanase

Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng cho rằng các chủng vi khuẩn S marcescens đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế các bệnh ở cây trồng

Năm 1996 Kalbe và các cộng sự đã công bố tìm thấy các hoạt chất kháng nấm

phytopathogenic từ các chủng Serratia được phân lập từ rễ của cây cái dầu

[27] Năm 2001 Someya và cộng sự đã tách chiết được chitinase và prodigiosin có khả năng chống lại các bệnh mốc xám và các bệnh héo do nấm

Fusarium gây ra ở các cây Anh thảo từ chủng S marcescens B2 [42].Năm

2002 Kamensky và các cộng sự đã công bố việc sử dụng S plymuthica được

phân lập từ đất xung quanh rễ cây dưa để kháng nấm phytopathogenic trong ống nghiệm [28] Năm 2004 Givi và cộng sự đã tách chiết được prodigiosin

từ chủng S marcescens có khả năng kháng một số nấm [21]

15

Năm 2007 Liu và cộng sự đã tách chiết được pyrrolnitrin từ chủng S.plymuthica có khả năng chống lại các bệnh héo do nấm Verticillium gây ra

[31] Năm 2010 Liu và cộng sự đã tìm thấy chất có khả năng kháng một số

loại nấm như Botrytis cinerea, Cryphonectria paracitica, R cerealis và Valsa sordida từ chủng Serratia sp.G3 [32].Năm 2013 Wang và cộng sự đã công bố việc sử dụng chủng S marcescens được phân lập từ vỏ lạc để sản xuất ra các chất có hoạt tính ức chế sự tăng trưởng của sợi nấm A.paraciticus và aflatoxin

[46] Cũng năm này, Okay và cộng sự đã nghiên cứu tách chiết được

chitinase từ chủng S.marcescens MO-1 có khả năng ức chế sự sinh trưởng bào

tử của một số loại nấm như A niger,Rhizopus oryzae, F.oxysporun [36]

Năm 2014 Nalini và cộng sự đã tách chiết được rhamnolipidtừ chủng

S.rubidaea SNAU02 có khả năng kháng một số loại nấm [35].Năm 2015

Gutiserrezvà cộng sự đã tách chiết được chinitase và prodigiosin từ chủng

S.marcescens CFFSUR -B2 có khả năng chống lại nấm Mycosphaerella fijienis gây bệnh đen ở chuối [24]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Việc nghiên cứu các protein có hoạt tính kháng nấm ở cây trồng đã và đang được quan tâm ở Việt Nam Một số cơ sở nghiên cứu trong nước như Viện Công nghệ sinh học và Viện Sinh học nhiệt đới (Viện Hàn lâm khoa học

và công nghệ Việt Nam ), Viện bảo vệ thực vật và Viện Thổ nhưỡng và nông hóa (Bộ NN& PTNT), Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Đại Học

Cần Thơ Và các công bố cho thấy một số nhóm vi sinh vật như Trichoderma, Pseudomoas,Bacillus đã được phân lập, tuyển chọn và đánh giá là những tác

nhân tiềm năng cho phát triển các chế phẩm sinh học đề phòng chống các nấm bệnh cây [3,6]

Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu thành công về ứng dụng của vi sinh vật đối với ức chế nấm bệnh ở cây trồng Năm 2005 Lê Thị Hồng Minh

và cộng sự đã công bố: Tách dòng và giải trình tự đoạn gene phLD mã hóa

cho 2,4-diacetylphoroglucinol từ S marcescens kháng F oxysporum [6] Năm

16

2015,Vũ Trọng Lượng và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính kháng nấm của

chủngS.marcescens M6 phân lập ở mẫu đất, trong khi dịch chiết ức chế ngoại

bào chỉ ức chế nấm được 20-30% khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm

F.oxysporum vàR.solani, còn hoạt chất prodigiosin tinh sạch tách ra từ chủng

này đã ức chế lên đến hơn 75% ở nồng độ hoạt chất đạt 40 µg/m [7].Trần Thị Thùy Linh và cộng sự (2015)bước đầu đã khảo sát tìm được các môi trường

làm tăng sinh tổng hợp các hoạt chất ngoại bào từ chủng S marcescens DT3

[9]

17

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1Vật liệu và hóa chất

2.1.1 Chủng giống

Chủng vi khuẩn S.marcescens DT3 do phòng Công nghệ sinh học Enzyme,

Viện Công nghệ sinh học cung cấp

Chủng nấm bệnh F.oxysporum và R solani từ bộ sưu tập giống của phòng

bệnh cây,Viện bảo vệ thực vật, Từ Liêm, Hà Nội cung cấp

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết Một số hóa chất chính được liệt kê ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Tên hóa chất và enzyme Hãng sản xuất

Fermentas Việt Nam Trung Quốc Merck ( Đức)

2.1.3 Các loại đệm và dung dịch

Các loại dung dịch và đệm dùng cho thí nghiệm được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn có thành phần, nồng độ được tóm tắt trong bảng 2.2

0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic

30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acid acetic

20 mM tris HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,8 0,05% brommophenol blue; 50% glycerol; 0,313 M tris HCl, pH 6,8; 10% SDS; 10% β-mercaptoethanol

2.1.4 Môi trường

Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm đều được pha theo các quy trình

và công thức chuẩn, có thành phần và nồng độ như trong bảng 2.3

19

Bảng 2.3 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

Tên môi trường Thành phần

và công nghệ Việt Nam (Bảng 2.4)

Bảng 2.4 Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Tên thiết bị Xuất xứ ( hãng, nước sản xuất)

Máy Votex OSI

Máy lắc rung Provocell

Máy li tâm lạnh Hettich Mikro 22R

Máy li tâm lạnh CF16 RXII

Máy nuôi lắc Certomat HK

Máy quang phổ UV 2500

Nồi khử trùng ES -315

Vision (Hàn Quốc) Trung tâm chuyển giao công nghệ (Việt Nam)

Sartorius (Đức) Metrohm (Thụy Sĩ) Esco (Mỹ)

Tony (Nhật) Hitachi (Nhật) Sartorius (Đức) Hettich (Đức) Labomed (Mỹ) Rotolab (Đức) Tosiba (Nhật)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật

Chủng giống vi khuẩn S marcescens DT3 từ tủ lạnh -84°C được hoạt hóa trên

môi trường LB agar ở 28°C từ 3-5 ngày Sau đó lấy một khuẩn lạc riêng rẽ nuôi vào bình 50 ml chứa 10 ml môi trường LB trong 12 giờ Chủng giống này được nuôi chuyển vào bình lên men lớn, với các bình 1000 ml chứa 250

ml môi trườngLBvới tỉ lệ 3-5% (v/v), chủng giống được nuôi ở 28°C, 200

rpm trong 28 giờ Như vậy, chủng S marcescensDT3 được nuôi trong môi

trường LB có thành phần như sau 1% pepton, 1% NaCl, 0,5% cao nấm men [27,41]

2.2.2 Xác định hoạt tính kháng nấm

Thử nghiệm khả năng ức chế sinh trưởng

Khả năng ức chế sinh trưởng nấm của dịch lọc tế bào được xác định theo

phương pháp của Huber và công sự (1987) [25] Dịch nuôi cấy chủng S marcescen DT3 được ly tâm loại bỏ tế bào ở 12000 vòng/phút trong 15 phút,

tiếp đó loại tế bào còn sót lại, được loại sạch bằng cách lọc qua màng lọc vi khuẩn Satorrius với kích thước lỗ 0,20 µm Dịch lọc tế bào được bổ sung vào

20 ml môi trường PDA ở 55°C, trộn đều và đổ vào mỗi đĩa Petri Cuối cùng một khoanh nấm bệnh cây 4 ngày tuổi được đặt ngay chính giữa mặt đĩa môi trường và ủ ở 30°C Sau 3-5 ngày kiểm tra sự sinh trưởng bằng cách đo đường kính tản nấm với thước kẻ có phân độ mm Thí nghiệm đối chứng được tiến hành song song Hoạt tính ức chế tương đối sinh trưởng nấm của dịch lọc tế bào được tính theo công thức sau đây:

21

ܫ = ௌĐ಴ିௌೄ೅

ௌĐ೎ × 100

I là phần trăm ức chế sinh trưởng nấm;

S ĐC là diện tích tản nấm trên môi trường PDA không chứa dịch lọc tế bào;

S ST là diện tích tản nấm trên môi trường PDA chứ dịch lọc tế bào

Thử nghiệm khoanh giấy lọc

Lấy 10 ml môi trường PDA ở 50°C có bổ sung 0,1% ampicillin đổ vào đĩa petri để ráo mặt thạch, đặt nấm thử nghiệm vào giữa đĩa Sau đó đặt các khoanh giấy lọc có đường kính 0,5 cm vào đĩa thạch Tiếp theo hút 20 µl protein tinh sạch nhỏ vào các khoanh giấy lọc, đặt đĩa vào tủ nuôi 30°C ủ trong 3 ngày đến 5 ngày kiểm tra, mẫu đối chứng âm là đệm potasium

photphate 20 mM, pH 6,8

Thử nghiệm giếng thạch

Lấy 15 ml môi trường PDA ở 50oC có bổ sung 0,1% ampicillin đổ vào đĩa petri để ráo mặt thạch Sau đó, bào tử nấm được hòa tan vào 0,2% (w/v) Tween 20, trải đều100 µlvào đĩa Đục lỗ thạch, bổ sung 50-100µl protein tinh sạch, để vào tủ lạnh sau 2-3 giờ để vào tủ ấm 30oC sau 3-5 ngày kiểm tra vòng vô khuẩn quanh giếng

2.2.3 Phương pháp kết tủa phân đoạn

Cơ sở của phương pháp này là dựa vào sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein ở nồng độ muối xác định (tính theo % nồng độ bão hòa) để loại bỏ bước đầu protein tạp trong dịch protein thô ban đầu Các loại muối

có thể được dùng là muối (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4,…nhưng đa số thường dùng là muối (NH4)2SO4 Bởi vì, chi phí cho loại muối này thấp mà lại hơn hẳn so với các muối khác và (NH4)2SO4 có độ hòa tan lớn (bão hòa

767 g/l ở 25°C)

22

Hàm lượng muối amonium sulfate ở nồng độ 20 - 80% được lấy theo nghiên cứu của Green và Hughes Các bước tủa và ly tâm được thực hiện ở 4°C [23]

Tiến hành tủa 20%: Lấy 100 ml dịch chiết ngoài bào chủng S marcescens

DT3 và 11,4 g muối amonium sulfate Cho muối amonium sulfate từ từ vào dịch chiết ngoại bào để muối tan đều trong dịch chiết ngoại bào Sau đó, dịch được để qua đêm, rồi li tâm thu tủa, tủa được hòa tan vào đệm potassium phosphate 20 mM, pH 6,8 và được thẩm tích để loại muối Sau khi thẩm tích xong, dịch đem đi thử hoạt tính kháng nấm Tủa ở các nồng độ 30 - 80% cũng được tiến hành tương tự Sau khi thực hiện xong các phân đoạn tủa muối, tiến hành thử hoạt tính kháng nấm để chọn ra phân đoạn tủa muối có hoạt tính kháng nấm tốt để tiếp tục đưa lên cột DEAE- cellulose để tinh sạch

2.2.4 Sắc kí trao đổi ion

Sắc kí trao đổi ion DEAE – cenllulose: dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổianion giữa protein trong hỗn hợp và các nhóm trao đổi (dimethylaminorthyl tích điện dương) của chất giá, khi hỗn hợp protein qua cột, các protein âm gắn vào cột, sau đó được đẩy khỏi cột bằng dung dịch muối có chứa ion có ái lực mạnh hơn đối với nhóm trao đổi ion của chất giá

Tiến hành: Gel DEAE – cellulose đã được hoạt hóa sẵn được nhồi vào cột có

kích thước (1,6 x 25) cm, rửa và cân bằng cột đệm potasium phosphate 10

mM pH 6,8 Hút 5 ml dịch protein đã tủa muối đưa lên cột và dịch được đẩy

ra bằng đệm potasium phosphate 20 mM; pH 6,8 có chứa 1M NaCl, với tốc

độ dòng chảy 25ml/giờ Thu 25 phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml và các phân đoạn này được xác định hàm lượng protein theo phương pháp của Braford Sau đó, lựa chọn những phân đoạn có hoạt tính protein cao để xác định hoạt tính kháng nấm