KHẢO SÁT độ ổn ĐỊNH CỦA KIT THỬ RPM để ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU

Chúng tôi thực hiện đề tài với mục tiêu khảo sát độ ổn địnhcủa kit thử red pyrogallol – molybdat để định lượng protein niệu với quy trình đãđược tối ưu hoá.. Đối tươ

TRẦN THỊ HÀ

KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KIT THỬ RED PYROGALLOL-MOLYBDAT ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh

2014

TRẦN THỊ HÀ

KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KIT THỬ RED PYROGALLOL-MOLYBDAT ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Giảng viên hướng dẫn: ThS NGUYỄN THỊ MINH THUẬN

Thành phố Hồ Chí Minh

2014

KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KIT THỬ RED PYROGALLOL

MOLYBDAT ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU

Sinh viên thực hiện: Trần Thị Hà

Thầy hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Minh Thuận Đặt vấn đề

Cũng như các thành phẩm thuốc, các sản phẩm thuốc thử sử dụng trong sinh hóacũng cần đảm bảo hiệu quả và chất lượng từ khi sản xuất đến khi hết hạn dùng Bởivậy nhà sản xuất phải nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm để xác định tuổi thọ củachế phẩm và đưa ra hạn Chúng tôi thực hiện đề tài với mục tiêu khảo sát độ ổn địnhcủa kit thử red pyrogallol – molybdat để định lượng protein niệu với quy trình đãđược tối ưu hoá

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Pha chế 3 lô thuốc thử red pyrogallol molybdat và tiến hành định lượng protein niệubằng phương pháp đo quang theo quy trình đã được tối ưu hóa Thẩm định quy trìnhnày Sau đó khảo sát độ ổn định của 3 lô thuốc thử red pyrogallol molybdat đượcsản xuất theo công thức được tối ưu hóa bằng các phương pháp dài hạn, lão hóa cấptốc và gây stress Dựa vào số liệu tiến hành độ ổn định để tính tuổi thọ của của 3 lôtheo phương pháp Van’t Hoff và tính tuổi thọ trung bình của thuốc thử

EXAMINE THE STABILITY OF THE PYROGALLOL RED MOLYBDATE

TEST KIT FOR QUANTITATIVE PROTEINURIA

Tran Thi Ha Supervisor: MA Nguyen Thi Minh Thuan Abstract

Introduction and objectives: Like other drug products, reagents products use in

biochemistry should also ensure efficiency and quality from production to the enduse So manufacturers have to study the stability of preparations to determine thelongevity of medication and take out of life shelf We take this subject with the aim

of examining the stability of pyrogallol red test kit-molybdates proteinuria toquantify the processes optimized

Matherials and method: Three batches of reagent red pyrogallol molybdate were

mixed Proteinuria was determined by a spectrophotometry method using RPMreagent with the process optimized This process was evaluated Then, 3 batches ofred pyrogallol molybdate reagents produced according to the formula which isoptimized were examined the stability by using the long term, accelerate and causestress method Based on demographic to calculate the longevity of 3 batchesaccording to Van't Hoff approach and calculated the average life expectancy of areagent

Results: Optimal quantitative process achieves the required of validation criteria.

The lifespan of reagent is calculated by the Van't Hoff method is 30 months

Conclusion: We determined the longevity of red pyrogallol molybdat reagent which

is mixed was 30 months

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến cô ThS Nguyễn Thị Minh Thuậnđã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ, vạch ra những hướng đi cũng như hướng giải quyếtnhững khó khăn trong suốt thời gian em thực hiện đề tài để em có thể hoàn thành tốtkhóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn cô PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ đã dành thời gian góp ýphản biện giúp cho đề tài khóa luận của em được hoàn chỉnh hơn

Em xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Trần Thanh Nhãn đã hướng dẫn và truyềnđạt những kinh nghiệm quý giá cho khóa luận của em được hoàn thành tốt và đúngthời hạn

Em xin chân thành cảm ơn các anh chị ở Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thành phốHồ Chí Minh và công ty dược phẩm OPC đã giúp đỡ em trong việc gửi mẫu và lấymẫu trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn các thầy cô, các anh chị trong bộ môn Hóa Sinh và các bạn đã nhiệttình giúp đỡ trong thời gian thực hiện khóa luận

Trần Thị Hà

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC PHỤ LỤC x

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ PROTEIN NIỆU 3

2.2 PHÂN LOẠI PROTEIN NIỆU 3

2.2.1 Protein niệu do cầu thận 3

2.2.2 Protein niệu do ống thận 4

2.3 CÁC BỆNH LÝ LIÊN QUAN ĐẾN PROTEIN NIỆU 4

2.3.1 Protein niệu sinh lý 4

2.3.2 Protein niệu bệnh lý 4

2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU 5

2.4.1 Phương pháp đo độ hấp thu tử ngoại 5

2.4.2 Phương pháp huỳnh quang 6

2.4.3 Phương pháp đo độ đục 7

2.4.4 Phương pháp đo màu 7

2.5 ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 11

2.5.1 Tính đặc hiệu 11

2.5.2 Tính tuyến tính 11

2.5.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 12

2.5.4 Độ chính xác 12

2.5.5 Độ đúng 13

2.6 ĐỘ ỔN ĐỊNH 13

2.6.1 Đại cương về độ ổn định 13

2.7 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TUỔI THỌ VÀ HẠN DÙNG CỦA THUỐC 18

2.7.1 Phương pháp dài hạn 18

2.7.2 Phương pháp lão hóa cấp tốc 19

2.8 TÍNH CHẤT CỦA THUỐC THỬ RPM TRONG NGHIÊN CỨU 19

2.8.1 Tính chất lý hóa của RP 19

2.8.2 Tính chất lý hóa của natri molybdat 20

2.8.3 Tính chất thuốc thử RPM 20

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 21

3.2 NGUYÊN LIỆU 21

3.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ 21

3.2.2 Hóa chất dung môi 21

3.2.3 Chất chuẩn 22

3.3 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 22

3.3.1 Chuẩn bị các thuốc thử 22

3.3.2 Thẩm định quy trình định lượng protein niệu bằng phương pháp RPM trên máy UV – Vis Spectro UV 2505 23

3.3.3 Khảo sát độ ổn định của thuốc thử RPM đã được thiết kế và tối ưu hóa dưới tác động của nhiệt độ 27

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31

4.1 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP RPM 31

4.1.1 Khảo sát tính đặc hiệu 31

4.1.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 32

4.1.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 33

4.1.4 Độ chính xác 34

4.1.5 Độ đúng 38

4.1.6 Ứng dụng quy trình đã được thẩm định trên một vài mẫu nước tiểu của người tình nguyện 40

4.2 ĐỘ ỔN ĐỊNH 41

4.2.1 Phương pháp dài hạn ở 5 ± 3 oC 41

4.2.2 Áp dụng phương pháp Van’t Hoff tính tuổi thọ bộ kit 42

4.3 SO SÁNH HIỆU QUẢ KINH TẾ CỦA BỘ KIT THỬ VỚI MỘT VÀI CHẾ

PHẨM TRÊN THỊ TRƯỜNG 48

4.4 BÀN LUẬN 49

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

5.1 KẾT LUẬN 50

5.2 ĐỀ NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Phản ứng biuret 8

Hình 2.2 Phản ứng BCA với Cu+ 9

Hình 2.3 Phản ứng của Coomassie Brilliant Blue G – 250 10

Hình 2.4 Phản ứng kết hợp của red pyrogallol với molybdat 11

Hình 2.5 Công thức cấu tạo red pyrogallol 19

Hình 2.6 Công thức cấu tạo natri molybdat 20

Hình 4.1 Phổ UV – Vis của mẫu trắng 31

Hình 4.2 Phổ UV – Vis của dung dịch protein chuẩn 100 mg/dL với thuốc thử RPM 32

Hình 4.3 Phổ UV – Vis của dung dịch protein thử 100 mg/dL với thuốc thử RPM32 Hình 4.4 Đường tuyến tính của nồng độ protein trong nước tiểu và độ hấp thu 33

Hình 4.5 So sánh sự thay đổi màu của thuốc thử RPM và phức hợp protein với thuốc thử ở thời điểm ban đầu và ngày lấy mẫu 61 45

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Vùng khí hậu theo WHO 14

Bảng 2.2 Điều kiện tiến hành độ ổn định dài hạn 16

Bảng 2.3 Điều kiện tiến hành độ ổn định cấp tốc 17

Bảng 3.1 Quy trình định lượng thực nghiệm 24

Bảng 3.2 Cách pha các dung dịch protein có nồng độ từ 2 – 350 mg/dL 25

Bảng 3.3 Thời gian lấy mẫu thử nghiệm 28

Bảng 4.1 Nồng độ và độ hấp thu của dung dịch protein niệu 32

Bảng 4.2 Kết quả đo độ hấp thu 10 lần mẫu trắng 34

Bảng 4.3 Kết quả khảo sát độ chính xác trong ngày 35

Bảng 4.4 Kết quả khảo sát độ chính xác khác ngày 37

Bảng 4.5 Kết quả khảo sát độ đúng trong ngày 38

Bảng 4.6 Kết quả khảo sát độ đúng khác ngày 39

Bảng 4.7 Kết quả định lượng protein niệu của người tình nguyện khỏe mạnh và người bệnh 40

Bảng 4.8 Kết quả định lượng dung dịch protein với thuốc thử RPM được bảo quản ở 5 ± 3oC 41

Bảng 4.9 Kết quả định lượng dung dịch protein với thuốc thử RPM được bảo quản ở nhiệt độ 25 ± 2 oC/ RH = 60 ± 5% 42

Bảng 4.10 Kết quả xác định độ ổn định theo nguyên tắc Van’t Hoff (trong điều kiện 25 ± 2 oC/ RH = 60 ± 5%) của lô 1 43

Bảng 4.11 Kết quả xác định độ ổn định theo nguyên tắc Van’t Hoff (trong điều kiện 25 ± 2 oC/ RH = 60 ± 5%) của lô 2 43

Bảng 4.12 Kết quả xác định độ ổn định theo nguyên tắc Van’t Hoff (trong điều kiện 25 oC ± 2/ RH = 60 ± 5%) của lô 3 44

Bảng 4.13 Kết quả tuổi thọ bộ kit thử RPM theo nguyên tắc Van’t Hoff ở 3 lô được bảo quản ở điều kiện 25 oC ± 2/ RH = 60 ± 5% 44

Bảng 4.14 Kết quả định lượng dung dịch protein với thuốc thử RPM được bảo quản ở nhiệt độ 40 ± 2 oC/ RH = 75 ± 5% 46

Bảng 4.15 Kết quả xác định độ ổn định theo nguyên tắc Van’t Hoff (trong điều kiện 40 ± 2 oC/ RH = 75 ± 5%) của lô 1 46

Bảng 4.16 Kết quả xác định độ ổn định theo nguyên tắc Van’t Hoff (trong điều kiện 40 ± 2 oC/ RH = 75 ± 5%) của lô 2 47 Bảng 4.17 Kết quả xác định độ ổn định theo nguyên tắc Van’t Hoff (trong điều

Bảng 4.18 Kết quả tuổi thọ bộ kit RPM theo nguyên tắc Van’t Hoff ở 3 lô được bảoquản ở điều kiện 40 oC ± 2/ RH = 75 ± 5% 48Bảng 4.19 Tuổi thọ của bộ kit theo phương pháp Van’Hoff 48Bảng 4.20 Bảng giá tham khảo một số bộ kit định lượng protein trên thị trường 49

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Kết quả phân tích thống kê tính tuyến tính của quy trình tối ưu PL-1Phụ lục 2 Phân tích độ chính xác trong ngày của quy trình định lượng protein niệubằng thuốc thử RPM PL-2Phụ lục 3 Phân tích độ chính xác khác ngày của quy trình định lượng protein niệubằng thuốc thử RPM PL-4

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cũng như các thành phẩm thuốc, các sản phẩm thuốc thử sử dụng trong sinh hóacũng cần đảm bảo hiệu quả và chất lượng từ khi sản xuất đến khi hết hạn dùng Bởivậy ở bất kì nước nào, khi nghiên cứu đưa ra thị trường một chế phẩm thuốc haythuốc thử, bên cạnh các nghiên cứu công thức, hiệu quả, tác dụng… nhà sản xuấtphải nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm để xác định tuổi thọ của chế phẩm và đưa

ra hạn dùng Phương pháp nghiên cứu đã được lý thuyết hóa theo các quy địnhchung nhất Có thể nghiên cứu độ ổn định theo phương pháp bảo quản dài hạn ởđiều kiện bảo quản tự nhiên hay bảo quản ngắn hạn ở điều kiện lão hóa cấp tốc hoặc

cả hai

Theo quy chế đăng kí lưu hành thuốc của Bộ y tế Việt Nam, một trong những điềukiện để chế phẩm được lưu hành là phải có đề cương và kết quả nghiên cứu độ ổnđịnh của chế phẩm, tuổi thọ của chế phẩm phải lớn hơn hạn dùng [4]

Protein niệu là một trong những xét nghiệm thường quy đóng vai trò quan trọngtrong chẩn đoán và điều trị các bệnh liên quan đến thận, tim và chức năng tuyếngiáp Thuốc thử red pylogallol – molybdat (RPM) được sử dụng rộng rãi trên thếgiới và Việt Nam trong xác định protein niệu Nhưng ở nước ta hiện nay chưa có cơsở nào sản xuất thuốc thử này Trong các nghiên cứu trước đây, Phùng Thị HoàngNhi đã thực hiện đề tài “Thiết kế và tối ưu hóa quy trình định lượng protein niệubằng phương pháp red pyrogallol molybdat” Tuy nhiên đề tài mới chỉ xây dựngđược công thức thuốc thử và quy trình tiến hành định lượng protein niệu tối ưu màchưa tiến hành khảo sát độ ổn định của thuốc thử

Vì vậy nhằm hướng đến mục tiêu sản xuất rộng rãi bộ kit thử RPM để phục vụ côngtác nghiên cứu và sử dụng trong xét nghiệm, chúng tôi tiếp tục thực hiện đề tài

“Khảo sát độ ổn định của kit thử red pyrogallol – molybdat để định lượng proteinniệu” với quy trình đã được tối ưu hóa bằng phần mềm INForm v4.0, 2010(Intelligensys Ltd) [9] Mục tiêu của đề tài là:

1 Khảo sát độ ổn định của kit thử RPM đã tối ưu hóa bằng các phương pháp tựnhiên và lão hóa cấp tốc.

2 Xác định tuổi thọ và hạn dùng của bộ kit thử RPM

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ PROTEIN NIỆU

Trong nước tiểu bình thường chỉ có một ít protein huyết tương có kích thước nhỏqua được cầu thận nhưng lại được tái hấp thu hoàn toàn hoặc gần hoàn toàn khi quaống thận Vì thế với các phương pháp xét nghiệm thông thường xem như âm tínhkhông có protein, với các phương pháp có độ nhạy cao có thể đo được lượngprotein trong nước tiểu 24 giờ có khoảng 30 mg trong đó 30% albumin và 70% làglobulin Thực tế thì trong nước tiểu có khoảng 50 – 150 mg protein/ 24 giờ [ 8],[10]

Lượng protein đào thải hằng ngày phụ thuộc vào tuổi, giới tính, tư thế đứng lâu,hoạt động của cơ, chế độ ăn [3]

2.2 PHÂN LOẠI PROTEIN NIỆU

Phân tích protein niệu bằng điện di, người ta phân biệt được hai loại protein niệunguồn gốc cầu thận và nguồn gốc ống thận [10]

2.2.1 Protein niệu do cầu thận

Thường do tăng tốc độ lọc qua cầu thận hoặc do tăng độ khuếch tán khi nồng độprotein trong máu cao [10] Khi lượng protein trên 3500 mg trong nước tiểu mỗingày thì gọi là hội chứng thận hư [3]

Protein niệu do độ lọc cầu thận tăng khi nước tiểu có albumin huyết tương (như:hemoglobin, chuỗi nhẹ của globin trong u tủy…) Trường hợp này thường do tổnthương cầu thận làm tăng độ thẩm thấu của thận, gặp ở các bệnh lý như viêm cầuthận, viêm thận nhiễm mỡ [10]

Protein niệu do độ khuếch tán tăng là khi nước tiểu có albumin và các protein cókích thước lớn hơn albumin Thường gặp trong trường hợp nồng độ protein ở máucầu thận tăng hoặc khi có sự ứ đọng lưu lượng cầu thận tiếp giáp với màng lọc như

2.2.2 Protein niệu do ống thận

Trường hợp này ít gặp hơn, trong nước tiểu xuất hiện các protein có trọng lượngphân tử nhỏ hơn albumin (đặc biệt là α1 và β2 microglobulin) Nguyên nhân là do rốiloạn tái hấp thu protein đã được lọc bình thường bởi cầu thận Thường gặp trongcác trường hợp tổn thương bẩm sinh ống thận ở trẻ em, ngộ độc bởi kim loại nặng.Ngoài ra, cũng có thể gặp protein niệu do viêm hoặc tổn thương đoạn dưới củađường tiết niệu, bàng quang hay niệu quản, gọi là protein niệu sau thận[10]

Tỷ lệ albumin/ globulin trong protein niệu từ 5 – 10 Tỷ lệ này tăng trong viêm thậnmạn tính, viêm thận cấp tính, thận hư… do albumin thoát ra ngoài nước tiểu quánhiều, giảm trong viêm thận cấp tính nặng, thoái hóa thận do globulin ra ngoài nướctiểu quá nhiều [8]

2.3 CÁC BỆNH LÝ LIÊN QUAN ĐẾN PROTEIN NIỆU

Khi chẩn đoán các bệnh liên quan đến thận, cầu thận cần phân biệt rõ về mặt triệuchứng học Nếu tình trạng protein niệu xảy ra liên tục (hay thường xuyên) thì có thểlà do các bệnh lý về thận gây ra Nếu tình trạng protein niệu xảy ra không liên tục(gián đoạn) thì có thể là do rối loạn chức năng, trường hợp này thường do gắng sức,lao động nặng, đứng lâu hay do vận mạch, rét, cảm động [10]

2.3.1 Protein niệu sinh lý

Protein xuất hiện ít (<150 mg/ 24h) và không thường xuyên trong các trường hợp: Ở trẻ sơ sinh khi thận chưa hoạt động tốt, thường sau 4 – 10 ngày thì hết; sau bữa ănnhiều chất đạm; do tư thế đứng và gắng sức hay gặp ở trẻ và thanh thiếu niên, ít gặpở người lớn tuổi [8]

2.3.2. Protein niệu bệnh lý

Khi điện di protein niệu, người ta phân biệt được 4 loại protein niệu bệnh lý [10]:

 Protein niệu toàn phần: Có mặt tất cả các thành phần protein huyết thanh, gặptrong viêm cầu thận nặng

 Protein niệu chọn lọc: Chủ yếu có albumin huyết thanh và β – globulin, gặptrong hội chứng thận có tổn thương nhỏ ở cầu thận.

 Globulin niệu chọn lọc: Chủ yếu có α1 và β – globulin Tỷ lệ albumin huyếtthanh thấp do nguồn gốc ống thận, gặp trong viêm ống thận kẽ cấp, viêm ốngthận bẩm sinh, bệnh Wilson, galactose niệu

 Protein niệu Bence – Jones có β, γ– globulin với sự hiện diện của albumin huyếtthanh hoặc không, còn gọi là protein nhiệt tan (chỉ tủa ở 60 – 70 oC) gặp trongđau tủy xương

2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU

2.4.1 Phương pháp đo độ hấp thu tử ngoại

Có hai phương pháp đo độ hấp thu tử ngoại là đo độ hấp thu ở bước sóng 205 nm vàở bước sóng 280 nm

2.4.1.1 Đo độ hấp thu ở bước sóng 205 nm

Nguyên tắc: Liên kết peptid hấp thụ ánh sáng ở bước sóng tối đa dưới 210 nm Tuynhiên, đỉnh hấp thu rộng của liên kết peptid cho phép đo ở các bước sóng dài hơn,có thể có nhiều lợi thế thực tế về thiết bị và sự chính xác của phép đo Do sự tácđộng từ các dung môi và các thành phần của đệm sinh học, độ hấp thu thường được

đo ở bước sóng từ 214 – 220 nm [22], [24]

Ưu điểm: Dễ thực hiện, nhạy hơn và ít biến đổi hơn phép đo ở 280 nm do trongphân tử protein có một lượng lớn liên kết peptid Định lượng các dung dịch phaloãng Có thể sử dụng để đo lường liên tục trong sắc ký cột hoặc để phân tích cácchuỗi acid amin chứa rất ít acid amin thơm [22], [24]

Nhược điểm: Độ chính xác không cao, bị ảnh hưởng bởi các chất can thiệp như chấttẩy rửa, acid nucleic, các giọt mỡ [22], [24]

2.4.1.2 Đo độ hấp thu ở bước sóng 280 nm

Protein thể hiện phổ hấp thu tử ngoại đặc trưng khoảng 280 nm vượt trội từ acidamin thơm tyrosin và tryptophan [22], [24] Đo độ hấp thu mẫu thử ở bước sóngnày và so với đường chuẩn để tính nồng độ protein.

Ưu điểm: Nhanh, đơn giản [22]

Nhược điểm: Độ chính xác không cao, kém nhạy, nếu chuỗi ban đầu chứa ít hoặckhông chứa những acid amin tyrosin và tryptophan thì phương pháp này sẽ cho kếtquả không đúng và cần dung dịch chuẩn có thành phần acid amin tương tự mẫu thử

Dễ bị các yếu tố khác tác động (trilon X-100, acid nucleic, các giọt mỡ)[22], [24]

2.4.2 Phương pháp huỳnh quang

Nguyên tắc: Nồng độ protein được xác định dựa trên sự phát huỳnh quang của cácacid amin thơm như tryptophan, tyrosin, phenylalanin Các acid amin này tạo huỳnhquang với thuốc thử trong môi trường kiềm pH từ 8,0 – 10,5 Bước sóng kích thíchlà 340 nm và bước sóng phát xạ từ 440 – 455 nm Sự phát quang của mẫu thử được

đo và tính toán dựa trên đường chuẩn được hình thành từ các mẫu chuẩn protein[22], [24]

Ưu điểm: Cải thiện độ nhạy, khoảng tuyến tính so với phương pháp đo độ hấp thu[24]

Nhược điểm:

 Có sự khác biệt giữa các loại protein tùy thuộc số lượng các acid amin Bị tácđộng bởi các glycin và amin có chứa đệm, các ion amoni, và thiol phổ biến trongnhiều hệ đệm sinh học [24]

 Thường đo huỳnh quang của tryptophan vì tỷ lệ phát xạ của phenylalanin làkhông đáng kể, còn tyrosin cũng không còn phát xạ nếu ở dạng ion hay ở gần mộtnhóm amin, carboxyl hay L- tryptophan

2.4.3 Phương pháp đo độ đục

Nguyên tắc chung: Protein bị kết tủa bởi các tác nhân hóa học, sau đó đem đo độđục trên máy đo quang

2.4.3.1 Phương pháp dùng acid sulfosalicylic

Nguyên tắc: Acid sulfosalicylic kết hợp với protein tạo thành tủa Đo độ đục củadung dịch ở bước sóng 600 nm [2], [16]

Ưu điểm: Đặc hiệu, nhạy với albumin hơn các protein khác

Nhược điểm: Độ chính xác không cao, bị cản trở bởi một số chất khác trong nướctiểu

2.4.3.2 Phương pháp dùng acid tricloracetic

Nguyên tắc: Acid tricloracetic gây kết tủa protein Dung dịch thu được đem đo độđục ở bước sóng 420 nm [16]

Ưu điểm: Ít bị ảnh hưởng bởi các chất trong nước tiểu hơn phương pháp acidsulfosalicylic

Nhược điểm: Bị ảnh hưởng bởi các thuốc, phải bảo quản nước tiểu luôn luôn ở 20 –

25 oC

2.4.3.3 Phương pháp dùng benzethonium clorid

Nguyên tắc: Benzethonium clorid tạo tủa với protein trong môi trường kiềm Đo độđục ở bước sóng 505 nm [16]

Ưu điểm: Độ đục ổn định, ít bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ hơn hai phản ứng trên

Nhược điểm: Tạo độ đục khác nhau đối với các protein khác nhau

2.4.4 Phương pháp đo màu

2.4.4.1 Phương pháp biuret

Nguyên tắc: Phản ứng biuret dựa trên sự hình thành phức hợp của các ion Cu2+ vớicác protein trong môi trường kiềm (pH ≥ 12) Thêm đồng sulphat vào dung dịchprotein trong dung dịch kiềm mạnh, hình thành phức hợp giữa các ion Cu2+ và cácliên kết peptid tạo ra dung dịch có màu tím, đem đo quang ở bước sóng 545 nm [1],[19], [27]

Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện

Nhược điểm: Kém nhạy so với các phản ứng màu khác, bị ảnh hưởng bởi các thànhphần dung dịch (đệm tris, ion amoni, sucrose, dextran và glycerol)

2.4.4.2 Phương pháp Lowry

Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng biuret, gồm 2 giai đoạn [15], [22], [24], [27]:

 Giai đoạn 1: Phản ứng Biuret: Phản ứng biến đổi Cu2+ thành Cu+ bằngprotein trong môi trường kiềm có chứa tartrat ở nhiệt độ phòng

 Giai đoạn 2: Phản ứng của các acid amin tyrosin, tryptophan (chủ yếu),cystein, cystin, histidin (ít) với thuốc thử Folin – Ciocalteau (hỗn hợpphosphomolybdat và phosphotungstat) Thuốc thử này bị khử thànhheteropolymolybdenum có màu xanh Đo quang ở bước sóng 650 – 750 nm, hấp thucực đại ở bước sóng 750 nm [15], [22], [24], [27]

Ưu điểm: Đơn giản, nhạy, chính xác

Nhược điểm: Phụ thuộc thành phần acid amin trong protein, dễ bị tác động bởi cácchất khác như acid mạnh, amoni sulfat, chất tẩy rửa, ion kali, natri phosphat …[21],[26]

2.4.4.3 Phương pháp Bicinchoninic Acid (BCA)

Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng biuret, gồm 2 giai đoạn:

Hình 2.1 Phản ứng biuret

 Giai đoạn 1: Phản ứng Biuret: Cu2+ phản ứng với các acid amin cystein,cystin, tryptophan, tyrosin và các liên kết peptid tạo thành Cu+.

 Giai đoạn 2: BCA tạo phức chelat với Cu+ tạo thành sản phẩm màu tím đậm

Đo độ hấp thu ở bước sóng 540 – 590 nm, hấp thu cực đại ở 562 nm [22], [24],

[27]

Hình 2.2 Phản ứng BCA với Cu+

Ưu điểm: Tăng độ nhạy cảm và khoảng tuyến tính so với phương pháp Lowry.Nhược điểm: Bị tác động bởi nhiều chất cũng có khả năng tạo phức với Cu+(EDTA, đường khử…)

2.4.4.4 Phương pháp Bradford

Nguyên tắc: Dựa trên sự thay đổi màu sắc của thuốc nhuộm Coomassie BrilliantBlue G – 250 khi tạo phức với protein trong môi trường acid dẫn đến sự thay đổibước sóng hấp thu cực đại Khi chưa kết hợp với protein, thuốc nhuộm tồn tại ởdạng cation có màu nâu xanh lá hấp thu cực đại ở 465 nm Khi đã tạo phức vớiprotein sẽ chuyển thành dạng anion có màu xanh dương hấp thu cực đại ở 595 nm[14], [22], [27]

Hình 2.3 Phản ứng của Coomassie Brilliant Blue G – 250

Ưu điểm: Đơn giản, tiện lợi, nhanh (thời gian màu hình thành khoảng 2 phút), chínhxác, ít bị ảnh hưởng bởi các chất cản trở, nhạy hơn những phương pháp trên nhiều[17] [21], [26], [30]

Nhược điểm: Màu thuốc thử dính cốc, còn bị tác động bởi một số chất (chất tẩy rửa,tris 100 …) [17] [21], [26], [30]

2.4.4.5 Phương pháp Red Pyrogallol – Molybdat

Nguyên tắc: Thuốc nhuộm red pyrogallol kết hợp với molybdat tạo thành phức hợpmàu đỏ có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 470 nm trong môi trường acid [20] Khicho phức hợp này phản ứng với nhóm acid amin trong phân tử protein sẽ tạo thànhphức hợp màu tím, có bước sóng hấp thu cực đại từ 578 – 612 nm, thường được đoở bước sóng 600 nm Độ hấp thu này tỉ lệ thuận với nồng độ protein [12], [23], [25],[26], [28] [33]

Hình 2.4 Phản ứng kết hợp của red pyrogallol với molybdat

Ưu điểm: Đơn giản, nhanh, chính xác, nhạy, khoảng tuyến tính rộng [12]

Nhược điểm: Bị ảnh hưởng bởi nhóm aminoglycosid Tùy thuộc nồng độ thuốcnhuộm trong thuốc thử, bị ảnh hưởng bởi loại protein [27]

2.5 ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

2.5.1 Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu hay tính chọn lọc của một quy trình định lượng là khả năng cho phépxác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự cómặt của các chất khác có trong mẫu thử [6], [32]

2.5.2 Tính tuyến tính

Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phươngpháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo đượcvà nồng độ [6], [32]

Để xây dựng đường tuyến tính, sử dụng dãy nồng độ thường gồm từ 6 đến 8 mẫu,trong đó có mẫu ở nồng độ giới hạn định lượng dưới (LLOQ) Để đường chuẩn có ýnghĩa thì ít nhất 4 trong 6 mẫu định lượng có độ lệch thực nghiệm ≤ 20% (đối vớimẫu ở nồng độ LLOQ) hoặc ≤ 15% (đối với các mẫu có nồng độ lớn hơn LLOQ)[6]

Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng hệ số tương quan R hay giá trị bình phươngcủa hệ số tương quan R2 Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đườngbiểu diễn là một đoạn thẳng tuân theo phương trình [6]: y = bx + b0

2.5.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

2.5.3.1 Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn phát hiện của một quy trình là lượng thấp nhất của chất cần phân tích trongmẫu mà còn có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết phải chính xác hàmlượng [6], [32]

2.5.3.2 Giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn định lượng của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất cầnphân tích có trong mẫu thử còn có thể xác định với độ đúng, độ chính xác thích hợp[6]

2.5.4 Độ chính xác

Độ chính xác là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng biệt so với giá trị trungbình thu được Để xác định độ chính xác, thường sử dụng ba mức nồng độ khácnhau của mẫu thử là thấp (trong giới hạn không quá 3 lần giới hạn định lượng dướiLLOQ), trung bình (khoảng giữa của khoảng tuyến tính) và cao (gần đường biêntrên của khoảng tuyến tính) Mỗi nồng độ tiến hành với ít nhất 5 mẫu thử Độ chínhxác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) hay hệ số phân tán (CV%)và phải nằm trong khoảng 15% hoặc trong khoảng 20% đối với giá trị ở giới hạnđịnh lượng dưới [32]

Trong phân tích sinh học, độ chính xác được phân biệt thành độ chính xác cùngngày (tương đương độ lặp lại trong phân tích hóa học) và độ chính xác khác ngày(tương đương độ chính xác trung gian) [6], [32]

Độ đúng không nhất thiết phải là 100% nhưng phải ổn định và chính xác trong giớihạn cho phép Độ lệch thực nghiệm giữa giá trị trung bình đo được và giá trị thựcnên nằm trong khoảng 15% hoặc 20% đối với giá trị ở giới hạn định lượng dưới[32].

2.6 ĐỘ ỔN ĐỊNH

2.6.1 Đại cương về độ ổn định

2.6.1.1 Một số khái niệm

 Độ ổn định của thuốc là khả năng của thuốc (nguyên liệu hay thành phẩm)giữ nguyên các đặc tính vốn có về vật lý, hóa học, vi sinh học, các đặc tính trị liệuvà độc tính trong một khoảng thời gian nhất định được bảo quản trong đồ bao góichuyên dụng trong một điều kiện bảo quản nhất định [7], [34]

 Tuổi thọ của thuốc là khoảng thời gian mà thuốc còn đáp ứng các yêu cầuchất lượng như đã quy định trong điều kiện bảo quản đúng [7]

Hiện nay, hạn dùng là khoảng thời gian mà [7]:

 Thuốc vẫn được ổn định khi được bảo quản trong những điều kiện qui định

 Thuốc vẫn còn giữ được 90% hàm lượng hoạt chất ghi trên nhãn (trừ một sốtrường hợp đặc biệt)

 Tạp phân hủy chưa vượt quá giới hạn cho phép

Hạn dùng = tuổi thọ + thời điểm xuất xưởng

 Vùng khí hậu: theo WHO, thế giới được chia thành 4 vùng khí hậu như bảng 2.1 [34]

Bảng 2.1 Vùng khí hậu theo WHO Vùng khí hậu Tính chất Điều kiện bảo quản Nước tiêu biểu

Theo sự phân chia này, Việt Nam thuộc vùng khí hậu IV.

2.6.1.2 Mục tiêu nghiên cứu độ ổn định

Độ ổn định là một yếu tố quan trọng của chất lượng, độ an toàn và hiệu lực của chếphẩm Chế phẩm sau khi sản xuất và trước khi đến tay người tiêu dùng phải trải quamột quá trình từ khâu tồn trữ, vận chuyển Độ ổn định là một yêu cầu chung của chếphẩm có chất lượng [7]

Thuốc phải ổn định trong thời gian dự kiến Độ ổn định của thuốc được đặc trưngbằng hạn dùng Vì vậy nghiên cứu độ ổn định để xác định tuổi thọ, từ đó có thể xácđịnh hạn dùng của chế phẩm Đây là một nghiên cứu bắt buộc trước khi làm hồ sơđăng ký xin phép lưu hành ngoài thị trường Do vậy thuốc trước khi đưa vào sảnxuất rộng rãi cần phải nghiên cứu độ ổn định để tránh:

 Sự giảm hàm lượng thuốc trong quá trình sản xuất, tồn trữ dẫn đến giảm tácdụng trị liệu dưới mức quy định so với hàm lượng ghi trên nhãn

 Sự xuất hiện các tạp chất do thuốc bị phân hủy trong quá trình bảo quản, vậnchuyển [7]

2.6.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định

Độ ổn định của chế phẩm chịu ảnh hưởng của 2 yếu tố chủ yếu là:

 Yếu tố nội tại: phụ thuộc bản chất của chế phẩm

 Yếu tố ngoại cảnh: bao gói, môi trường…

 Yếu tố nội tại

Bao gồm:

 Cấu trúc hóa học của dược chất và nguyên phụ liệu

 Nồng độ, hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm

 Độ tinh khiết của nguyên liệu

 Yếu tố ngoại cảnh

Bao gồm:

 Nhiệt độ: Ảnh hưởng đến tốc độ của phản ứng phân hủy chế phẩm.

 Ánh sáng: Làm phân hủy hoặc chuyển dạng đồng phân

 Độ ẩm: Độ ẩm cao thúc đẩy phản ứng phân hủy do thủy phân, làm thay đổitính chất lý học của chế phẩm

 Đồ bao gói: pH, độ kín…

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa có tính chất cơ bản là nóng ẩm Nhiệt độ vàđộ ẩm cao ở Việt Nam tạo rất nhiều trở ngại trong công tác bảo quản thuốc Vì vậymỗi chế phẩm phải có điều kiện bảo quản và đồ bao gói nhất định

2.6.2 Nghiên cứu độ ổn định

Bao gồm một loạt các thử nghiệm để đảm bảo độ ổn định của một thành phẩmthuốc, đó là khả năng duy trì các tiêu chuẩn chất lượng của thành phẩm được đónggói trong bao bì thích hợp và bảo quản ở điều kiện đã thiết lập trong một khoảngthời gian xác định [7]

2.6.2.1 Lựa chọn lô thử

Để sử dụng cho thử nghiệm nghiên cứu độ ổn định, cần chuẩn bị ba lô chế phẩmcùng công thức pha chế, cùng dạng bào chế đựng trong bao bì sẽ sử dụng khi đưachế phẩm ra thị trường Hai trong ba lô phải đủ cho quá trình thử nghiệm, lô còn lạicó thể ít hơn Nếu có thể, ba lô đem thử nên được sản xuất từ ba lô nguyên liệu khácnhau [13], [18], [34]

2.6.2.2 Các phương pháp nghiên cứu độ ổn định

Các tài liệu đề cập tới ba phương pháp: phương pháp thử dài hạn, phương pháp lãohóa cấp tốc, phương pháp sử dụng điều kiện khắc nghiệt (gây stress) [ 13], [18],[34]

 Phương pháp dài hạn

Là phương pháp nghiên cứu độ ổn định trong điều kiện bảo quản được ghi trên nhãn

sản phẩm trong suốt thời gian dự kiến tuổi thọ của thuốc trong điều kiện bảo quảnphù hợp [7], [13], [18], [34].

Kết quả của nghiên cứu này được căn cứ để xác định hạn dùng của thuốc và quyđịnh về điều kiện bảo quản thích hợp với tính chất lý hóa của sản phẩm [7]

Mỗi quốc gia hay khu vực có những quy định riêng phù hợp với điều kiện khí hậunhưng nhìn chung thì điều kiện tiến hành thử nghiệm này như bảng 2.2 [7], [13],[18], [34]

Bảng 2.2 Điều kiện tiến hành độ ổn định dài hạn

Thời gian tiến hành thử nghiệm tối thiểu để số liệu có ý nghĩa là 12 tháng, tốt nhấtnên tiến hành đến khi có sự thay đổi đáng kể về chất lượng của chế phẩm

Tần số lấy mẫu đối với các chế phẩm có thời hạn sử dụng được đề xuất trên 12tháng là mỗi 3 tháng trong năm đầu tiên, mỗi 6 tháng trong năm tiếp theo và mỗi 12tháng trong suốt thời hạn còn lại sử dụng được đề xuất [13], [18]

 Phương pháp lão hóa cấp tốc

Lý do: Nếu theo dõi sự giảm hàm lượng theo thời gian ở nhiệt độ bảo quản ghi trênnhãn thì cần phải theo dõi trong một khoảng thời gian khá lâu hàng năm, tối thiểucũng 12 tháng, không đáp ứng được về mặt thời gian để đưa vào sản xuất nên cầnmột phương pháp nhanh chóng hơn để xác định tuổi thọ của chế phẩm [7]

Thử nghiệm lão hóa cấp tốc được thiết kế để tăng tốc độ thoái hóa hoặc thay đổi vậtlý của sản phẩm bằng cách sử dụng chủ yếu điều kiện nhiệt độ và độ ẩm tăng cao[7], [13], [18], [34]

Dữ liệu thu được từ nghiên cứu này được sử dụng để đánh giá tác động của việc vậnchuyển trong thời gian ngắn trong những điều kiện vượt ra ngoài điều kiện bảo quảnghi trên nhãn [7].Kết quả nghiên cứu lão hóa cấp tốc có thể được dùng để tiên đoán

tuổi thọ của chế phẩm trong điều kiện bình thường hoặc độ ổn định của chế phẩmtrong khoảng ngắn hạn khi điều kiện bảo quản vượt quá giới hạn qui định.

Điều kiện tiến hành thử nghiệm lão hóa cấp tốc được trình bày trong bảng 2.3 [7],[13], [18], [34]

Bảng 2.3 Điều kiện tiến hành độ ổn định cấp tốc

Thời gian tiến hành thử nghiệm tối thiểu để số liệu có ý nghĩa là 6 tháng, tốt nhấtnên tiến hành đến khi có sự thay đổi đáng kể về chất lượng của chế phẩm

Tần số lấy mẫu ít nhất phải có 3 lần lấy mẫu vào 3 thời điểm 0, 3, 6 tháng Nếu tốcđộ thoái hóa quá nhanh có thể tăng tần xuất lấy mẫu để tăng tính chính xác của thửnghiệm [7], [13], [18], [34]

 Phương pháp lão hóa gây stress

Nghiên cứu được thực hiện để đánh giá tác động của các điều kiện khắc nghiệt trênsản phẩm Các thử nghiệm này bao gồm thử nghiệm nhiệt độ (tăng trên 10 oC so vớinhiệt độ thử nghiệm lão hóa cấp tốc), độ ẩm, chất oxi hóa, ánh sáng và một số thửnghiệm cụ thể cho từng loại chế phẩm [7], [18]

Tần số lấy mẫu điều chỉnh theo sản phẩm Giai đoạn đầu nên đánh giá thườngxuyên để điều chỉnh cho phù hợp

2.6.2.3 Các tiêu chuẩn chất lượng để kết thúc thử nghiệm

Để kết thúc thử nghiệm độ ổn định của chế phẩm, dựa vào sự thay đổi đáng kể vềchất lượng bao gồm [13]:

 Hàm lượng hoạt chất thay đổi 5% so với giá trị ban đầu

 Bất kỳ tạp chất liên quan nào vượt quá giới hạn cho phép

 Các chỉ tiêu như hình thức, màu sắc, đặc tính chức năng không đạt

2.7 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TUỔI THỌ VÀ HẠN DÙNG CỦA THUỐC

2.7.1 Phương pháp dài hạn

Sau khi xác định hàm lượng thuốc sau những khoảng thời gian bảo quản nhất định,tính tuổi thọ của chế phẩm theo hai cách [7]:

 Xây dựng đường biểu diễn ln[Dt] = f(t), sau đó ngoại suy t90 từ đồ thị hàmlượng theo thời gian (phương pháp hồi quy tuyến tính):

Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng đơn giản: y = a0 + ax

Trong đó:

y: Hàm lượng còn lại

x: Thời gian bảo quản

 Tính K từ công thức ln([Dt]/[Do]) = -Kt rồi tính t90 theo công thức t90 = 0,1053KTrong đó:

D0: Hàm lượng thời điểm ban đầu

Dt: Hàm lượng thời điểm t

t: Thời gian bảo quản

t90: Thời gian hàm lượng còn lại 90%

2.7.2 Phương pháp lão hóa cấp tốc

Áp dụng phương pháp Van’t Hoff để tính tuổi thọ của thuốc thử

Khi tăng nhiệt độ 10 oK thì tốc độ phản ứng hóa học có thể tăng 2 lần với điều kiệnkhoảng chênh nhiệt độ này không lớn [7]

Tuổi thọ của chế phẩm = k x tuổi thọ ở điều kiện già hóa

Trong đó k là hệ số Van’t Hoff

2.8 TÍNH CHẤT CỦA THUỐC THỬ RPM TRONG NGHIÊN CỨU

Thuốc thử RPM đã được thiết kế và tối ưu hóa chứa 5 thành phần trong công thứcgồm RP, Natri molybdat, natri oxalat, natri benzoat và acid succinic Hai thành phầnchính là RP và natri molybdat

2.8.1 Tính chất lý hóa của RP

 Tên khoa học: Pyrogallol red

 Công thức phân tử: C19H12O8S

 Phân tử lượng: 400,36

 Công thức cấu tạo:

Hình 2.5 Công thức cấu tạo red pyrogallol

 Tính chất: Chất rắn, bột màu đỏ sẫm, khó tan trong nước, tan tốt trongmetanol, nhạy cảm với nhiệt độ, ánh sáng và các tác nhân oxi hóa

2.8.2 Tính chất lý hóa của natri molybdat

 Tên khoa học: Natri molybdat dihydrat

 Công thức phân tử: Na2MoO4.2H2O

 Phân tử lượng: 241,95

 Công thức cấu tạo:

Hình 2.6 Công thức cấu tạo natri molybdat

 Tính chất: Chất rắn, bột kết tinh trắng, tan trong nước [29] Nhạy cảm vớicác tác nhân oxi hóa và các kim loại kiềm [17]

2.8.3 Tính chất thuốc thử RPM

Dung dịch màu đỏ trong nước cất, kém bền với nhiệt nên phải bảo quản trong điềukiện trong tủ lạnh từ 2 – 8 oC Nhạy cảm với ánh sáng, bền với các tác nhân oxi hóavà vi khuẩn Hấp thu cực đại ở bước sóng 470 nm

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Ba lô kít thử RPM để định lượng protein niệu:

Lô 1: 90 kit thử RPM, sản xuất ngày 22 tháng 04 năm 2014

Lô 2: 90 kit thử RPM, sản xuất ngày 22 tháng 04 năm 2014

Lô 3: 90 kit thử RPM, sản xuất ngày 22 tháng 04 năm 2014

3.2 NGUYÊN LIỆU

3.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ

 Máy quang phổ UV-Vis Spectro UV 2505 (Mỹ)

 Tủ vi khí hậu Shellab HC9-2, Sheldon manufacturing, INC (Mỹ)

 Tủ lạnh Daewoo VR-140 (Hàn Quốc)

 Cân phân tích độ nhạy 0,0001 g: Sartorius AG Goettinggen CP224S (Đức)

 Máy đo pH Neomet 200L (Hàn Quốc)

 Máy ly tâm HERMLE Z206A (Đức)

 Bình định mức 50mL, 100mL, 250 mL, 500mL, 1000mL, 2000mL

 Becher

 Pipet chính xác 2mL, 5mL, 10mL, 20mL, 25mL

 Micropipette 10 – 100 µL, 100 – 1000 µL

 Lọ đựng mẫu: lọ nhựa trắng đục thể tích 10 mL

3.2.2 Hóa chất dung môi

 Red Pyrogallol (RP) (Merck)

 Natri molybdat (Trung Quốc)

 Metanol (Merck)

 Acid succinic (Trung Quốc)

 Natri oxalat (Trung Quốc)

 Natri Benzoat (Trung Quốc).

 Dung dịch protein nồng độ 6 g/dL của hãng ELITech: Số lô 14-0014, hạn dùngđến 2015

 Nước cất 2 lần

3.2.3 Chất chuẩn

Dung dịch protein chuẩn nồng độ 100 mg/dL của hãng Biolabo: Số lô 97016 hạndùng đến 2014

3.3 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

3.3.1 Chuẩn bị các thuốc thử

3.3.1.1 Pha dung dịch mẹ RP

Cân chính xác 80 mg RP cho vào bình định mức 100 mL, thêm 20 mL metanol vàolắc kỹ cho đến khi tan hết RP, sau đó bổ sung nước cất hai lần đến vạch, được dungdịch mẹ có nồng độ 2 mmol/L Dùng dung dịch này để pha thuốc thử RPM

3.3.1.2 Pha dung dịch mẹ natri molybdat

Cân chính xác 0,1210 g natri molybdat dihydrat cho vào bình định mức 50mL, thêmnước cất, lắc kỹ cho tan hết và bổ sung nước cất vừa đủ thể tích, được dung dịch mẹcó nồng độ 10 mmol/L

3.3.1.3 Pha dung dịch mẹ acid succinic

Cân chính xác 11,8 g acid succinic cho vào bình định mức 500 mL, thêm nước cấtvào lắc kỹ cho tan hoàn toàn, bổ sung nước cất đến vạch Dung dịch mẹ có hàmlượng 200 mmol/L

3.3.1.4 Pha dung dịch natri oxalat

Cân chính xác 0,67 g natri oxalat cho vào bình định mức 50 mL Thêm 20 mL nướccất vào, đem siêu âm cho tan hết và bổ sung nước đủ thể tích Dung dịch mẹ cónồng độ 100 mmol/L

3.3.1.5 Pha dung dịch mẹ natri benzoat

Cân chính xác 0,7205 g natri benzoat cho vào bình định mức 50 mL Thêm nướccất, lắc kỹ cho tan hết và bổ sung nước cất đủ thể tích Dung dịch mẹ có nồng độ

100 mmol/L

3.3.1.6 Pha thuốc thử RPM theo công thức tối ưu hóa

Trộn đều một lượng chính xác 250 mL acid succinic 200 mmol/L, 5,2 mL natrioxalat 100 mmol/L, 17,35 mL natri benzoat 100 mmol/L trong becher 500 mL Tiếptheo thêm chính xác 20 mL RP 2 mmol/L và 2 mL natri molybdat 10 mmol/L.Khuấy đều và điều chỉnh pH của thuốc thử bằng dung dịch HCl 1 mol/L đến pH2,7 Sau đó chuyển hổn hợp thuốc thử vào bình định mức 500 mL và bổ sung nướccất vừa đủ thể tích Như vậy thuốc thử RPM thu được chứa RP 0,08 mmol/L, natrimolybdat 0,04 mmol/L, acid succinic 50 mmol/L, natri oxalat 1,04 mmol/L và natribenzoat 3,47 mmol/L ở pH 2,7 Thuốc thử sau khi pha xong đựng trong lọ thủy tinhmàu nâu đậy nút kín Sau đó chia thuốc thử ra các lọ nhỏ thể tích 5 mL

3.3.2 Thẩm định quy trình định lượng protein niệu bằng phương pháp RPM trên máy UV – Vis Spectro UV 2505

3.3.2.1 Quy trình định lượng tối ưu

Cho vào 3 ống trắng, chuẩn, thử lần lượt các thành phần như bảng 3.1