Bài thuyết trình Phát hiện nhanh chóng và chuyên biệt cho loài mới Xanthomonas oryzae pv. oryzae K3a bằng phương pháp PCR dựa vào Marker có nguồn gốc từ phương pháp AFLP.

Phát hiện nhanh chóng và chuyên biệt cho loài mới Xanthomonas oryzae pv. oryzae K3a bằng phương pháp PCR dựa vào Marker có nguồn gốc từ phương pháp AFLP. 1. Bệnh cháy bìa lá lúa (bacterial blight of rice) 2. Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) 3. Phương pháp PCR 4. Phương pháp AFLP Sử dụng 119 chủng vi khuẩn Xanthomonas trong nghiên cứu. a. Nuôi cấy vi khuẩn b. Xây dựng marker nhận biết chuyên biệt cho loài Xoo K3a nhờ phương pháp AFLP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

 - 

• Môn học: Vi sinh nông nghiệp.

• Chủ đề:

PCR-Based Assay for Rapid and Specific Detection

of the New Xanthomonas oryzae pv oryzae K3a

Race Using an AFLP-Derived Marker

J Microbiol Biotechnol (2014),24(6), 732–739.

Eun-Sung Song, Song-Yi Kim, Tae-Hwan Noh, Heejung Cho, Soo-Cheon Chae, and Byoung-Moo Lee

GVHD: Th.S Trương Kim Phượng

I MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

II TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU III.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

IV.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

I MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

• Phát hiện nhanh chóng và chuyên biệt cho

loài mới Xanthomonas oryzae pv oryzae

K3a bằng phương pháp PCR dựa vào

Marker có nguồn gốc từ phương pháp

AFLP.

II TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.Bệnh cháy bìa lá lúa (bacterial blight of rice)

- Bệnh nghiêm trọng nhất trên lúa ở các nước châu Á, có thể gây thiệt hại cao đến 50% khi đồng ruộng bị nhiễm bệnh nghiêm trọng

- Bệnh do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra.

- Cách thức lây truyền: xâm nhập thông qua các lỗ thủy khổng hoặc vết thương của lá.

(Mew TW, Alvarez AM, Leach JE, Swing J 1993 Focus on bacterial blight of rice Plant Dis 77:5-12)

• Triệu chứng: Phiến lá có những đường kẻ dài không đều, có những vết có màu vàng khô

chạy dọc theo hai bìa lá (Agrios, 2005), rìa lá

bị quăn queo và lan ra khắp lá (Shamar, 2006).

Hình 1:

Biểu hiện của

bệnh cháy bìa

lá lúa.

2 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

(Xoo)

- Vi khuẩn Gram (–), hình que ngắn, 2 đầu tròn,

có một đuôi.

- Có vỏ giáp mô bao bọc (capsule) bảo vệ ngay

cả khi ở trong nước.

- Nhiệt độ thích nghi của vi khuẩn từ 26-30°C.

- Nguồn lây nhiễm: Nước kênh rạch, nước ruộng, gốc rạ và rễ lúa.

3 Phương pháp PCR

(Polymerase chain reaction)

Hình 2: Minh họa phương pháp PCR

4 Phương pháp AFLP

( Amplified Fragment Length

Polymorphisms)

- Là sự đa dạng của các đoạn

DNA được nhân lên có định

hướng sau khi bị cắt bởi 2

enzyme giới hạn, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR.

- Hình 3: Quy trình thực hiện

AFLP

Bước 1: Phản ứng cắt

Bước 2: Phản ứng nối

Bước 3: Tiền khuếch đại

Bước 4: Khuếch đại chọn lọc

Bước 5: Điện di

III NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Vật liệu

- Sử dụng 119 chủng vi khuẩn Xanthomonas

trong nghiên cứu.

- Nguồn vật liệu: Korean Agricultural Culture Collection (KACC, Hàn Quốc), the Ministry

of Agriculture, Forestry and Fisheries (MAFF, Nhật Bản), Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM, Bỉ) và Tiến sĩ T H Noh tại National Institute of Crop Science

(RDA, Hàn Quốc).

2 Phương pháp

a Nuôi cấy vi khuẩn

- Chủng Xanthomonas được nuôi cấy trên môi

trường YDC (2% D-glucose, 2% CaCO3, 1% chiết xuất nấm men, và 1,5% agar) ở 28°C/ 48 giờ.

- Các dòng Escherichia coli tăng trưởng ở

37°C/24 h trong môi trường Luria-bertani (LB)

có chứa 200μg/ml Ampicillin g/ml Ampicillin

b Xây dựng marker

nhận biết chuyên biệt

cho loài Xoo K3a nhờ

phương pháp AFLP

- Hình 4: Quy trình xây

dựng marker nhận biết

chuyên biệt loài Xoo K3a

 Dựa vào trình tự có được

từ phương pháp AFLP, bộ mồi K3aF và K3aR được thiết kế để nhận biết

chuyên biệt cho loài Xoo K3a

- Bảng 2: Oligonucleotide adapters và primers sử dụng cho phương pháp AFLP

c Thiết kế mồi và PCR đặc hiệu

- Chu trình nhiệt phản ứng:

96 o C

5m

96 0 C 5s

15s

72 0 C 30s

25x

72 0 C 5m

60 0 C

∞

d Thử nghiệm PCR để xác định tác nhân gây bệnh trên ruộng lúa

• Những lá của giống lúa IR24 50 ngày tuổi được làm nhiễm nhân tạo bằng cách cắt đỉnh lá, ngâm vào

dịch vi khuẩn Xoo chủng HB0100 với mật độ 109 tế bào/ 1ml, trồng trong nhà kính với nhiệt độ 25-300C, với độ ẩm tương đối 60%

• Mẫu lá được thu nhận với kích thước từ 1-8 cm từ vị trí tổn thương vào ngày thứ 1, 2, 3, 4, 5 ngày

• Mỗi mẫu được ngâm trong 200μg/ml Ampicillin l nước cất trong 20 phút Lấy 10 μg/ml Ampicillin l dịch tiết làm mẫu cho thử nghiệm PCR

1 Nhận biết chuyên biệt loài Xoo K3a nhờ marker

có nguồn gốc từ AFLP

- Bộ mồi K3aF và K3aR khuếch đại được sản phẩm

có kích thước 1.024 bp  Nhận biết chuyên biệt loài Xoo K3a

- Kết quả: Bộ mồi đã nhận biết chuyên biệt được 13 mẫu thuộc loài Xoo K3a trong 119 mẫu thuộc chủng

Xanthomonas.

IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

- Bảng 1: Danh sách dòng vi khuẩn sử dụng trong bài

- Hình 5: Điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR

khuếch đại dòng Xoo sử dụng bộ mồi chuyên biệt K3aF và K3aR

- Hình 6: Điện di trên gel agarose của sản phẩm PCR

khuếch đại từ loài Xoo K3a và chủng Xanthomonads

khác, sử dụng bộ mồi chuyên biệt K3aF và K3aR

+ Lane 1 – 13: loài Xoo K3a ( thứ tự 73 – 85 ở bảng 1)

+ Lane 14 – 39: dòng Xanthomonads khác ( thứ tự 94 – 119 trong bảng 1)

2 Phương pháp PCR xác định loài Xoo K3a gây bệnh trên ruộng lúa

- Hình 7: Phương pháp PCR phát hiện loài Xoo

K3a trên lá lúa

(A) Lá lúa sau 5 ngày tiêm

nhiễm nhân tạo vi khuẩn Xoo

HB01001

(B) Phương pháp PCR phát hiện

tác nhân từ những vị trí khác

nhau của mẫu lá lúa (A)

Lane M: Thang kích thước phân

- Hình 8: Phương pháp PCR phát hiện tác nhân trên lá

lúa từ 0 -5 ngày sau khi tiêm nhiễm nhân tạo Xoo

sau 0 -5 ngày tiêm

nhiễm nhân tạo Xoo

HB01001

6 Nguyễn Anh Khuyến 1253010136

7 Lâm Thị Thanh Tâm1253010325

8 Nguyễn Quỳnh Anh 1253012008

9 Nguyễn Trần Hải Nam 1253012208

10.Trương Thị Xuân Diểm1253010048

11.Lương Thị Bích Thuận 1253010378

12 Phan Trần Anh Tuấn 0853011035

NHÓM THỰC HIỆN – NHÓM 3

Xin cảm ơn cô và các

bạn đã lắng nghe