Nghiên cứu đánh giá đặc điểm nông sinh học và một số chỉ tiêu chất lượng gạo của các dòng lúa chịu mặn được chọn tạo bằng phương pháp chỉ thị phân tử

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI NGHỆ SINH HỌC KHOA CÔNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: Nghiên cứu, đánh giá đặc điểm nông sinh học và một số chỉ tiêu chất lượng gạo của các dòng lúa chịu mặn được

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI NGHỆ SINH HỌC KHOA CÔNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài: Nghiên cứu, đánh giá đặc điểm nông sinh học và một số chỉ tiêu chất lượng gạo của các dòng lúa chịu mặn được chọn tạo bằng phương pháp chỉ thị phân tử

Giáo viên hướng dẫn: TS Lê Hùng Lĩnh Sinh viên thực hiện : Trần Đình Tài Lớp : K19.12-03

Hà Nội – 2016

Khoa Công ngh ệ sinh h ọ c Vi ệ n đạ i h ọ c M ở Hà N ộ i

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 i

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến TS Lê Hùng Lĩnh (Trưởng bộ môn Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiêp), TS Đinh Xuân Tú đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận này Tôi xin chân thành cảm ơn Tập thể cán bộ Bộ môn Sinh học phân tử (Viện Di truyền Nông nghiệp) nơi tôi thực hiện đề tài đã tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện

đề tài này

Hoàn thành luận án này còn có sự động viên, khuyến khích, giúp đỡ của bạn

bè và gia đình Tất cả sự giúp đỡ và tình cảm quý báu này là nguồn động lực giúp tôi hoàn thành đề tài này

Tôi xin trân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2016

Tác giả đề tài

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 ii

MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết: 1

2 Mục tiêu nghên cứu của đề tài: 3

3 Nội dung nghiên cứu: 3

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp 5

1.1.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới 5

1.1.2 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam 6

1.2 Nghiên cứu di truyền về giống lúa chịu mặn: 10

1.2.1 Cơ chế chống chịu mặn của lúa: 10

1.2.2 Sự thể hiện gen chống chịu mặn 14

1.3 Một số kết quả trong chọn tạo giống lúa chịu mặn 17

1.3.1 Kết quả nghiên cứu, chọn tạo giống lúa chịu mặn trên thế giới 17

1.3.2 Kết quả nghiên cứu, chọn tạo giống lúa chịu mặn ở Việt Nam 19

1.3.2.1 Phân tích bản đồ di truyền QTL tính chống chịu mặn 19

1.3.2.2 Chọn giống chống chịu mặn nhờ marker phân tử (MAS) … 21

PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu 23

2.1.1 Các giống lúa nghiên cứu 23

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu và thời gian tiến hành nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiêm cứu 24

2.2.1 Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng: 24

2.2.2 phương pháp đánh giá chất lượng gạo: 26

2.2.2.1 Phân tích nhiệt độ hóa hồ: (theo TCVN 5715-1993) 26

2.2.2.2 Xác định hàm lượng amyloza: (theo TCVN 5716-1:2008) 27

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 iii

2.2.3.3 Xác định độ bền gel: (theo TCVN 8369:2010) 31

2.2.3.4 Đánh giá chất lượng cơm: (theo 10TCN590-2004) 33

2.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 35

2.3.1 Kỹ thuật SSR 36

2.3.2 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 37

2.3 Phân tích số liệu 38

PHẦN 3: KẾT QUẢ 39

3.1 Kết quả sàng lọc các dòng lúa Bắc Thơm số 7 mang locus Saltol chịu mặn được chọn tạo bằng phương pháp chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) 39

3.1.1 Xác định chỉ thị liên kết chặt với locus Saltol phục vụ công tác chọ lọc các dòng Bắc Thơm số 7 chịu mặn 39

3.1.2 Kết quả tách chiết AND lúa 40

3.1.3 Kết quả đánh giá 5 dòng lúa mang locus Saltol chịu mặn bằng chỉ thị phân tử……… … ………41

3.3 Kết quả đánh giá chất lượng gạo của các dòng BT7-Saltol 50

3.3.1 Kết quả đánh giá nhiệt độ hồ hóa 52

3.3.2 Kết quả đánh giá hàm lượng Amyloza 53

4.3.3 Kết quả đánh giá độ bền gel 55

3.3.5 Kết quả đánh giá chất lượng cơm của các dòng Bắc Thơm 7 – Saltol 59

PHẦN IV KẾT LUẬN 61

4.1 Kết luận 61

4.2 Kiến nghị 61

Tài liệu tham khảo……… 62

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AND : Axit Deoxyribonucleic

Bp : Base pair – Cặp bazơ nitơ

Bộ TNMT : Bộ Tài nguyên Môi trường

MAS : Marker Assisted Selection – chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử

NST : Nhiễm sắc thể

PCR : Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi trùng hợp

QTL/QTLs : Quantitative Trait Loci – Locus kiểm soát tính trạng số lượng TBE : Tris-Boric Acid-EDTA

MABC : Marker Assisted Backcrossing – Chỉ thị phân tử kết hợp với lai

trở lại

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 v

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Mực nước biển dâng (cm) so với thời kỳ 1980-1999 7

Bảng 1.2 Dự báo thiệt hại sản lượng lúa theo kịch bản về nước biển dâng 1m tại ĐBSCL 9

Bảng 3.2.1 Độ phân hủy kiềm của gạo xát 27

Bảng 2.2.2 Dãy dung dịch chuẩn 30

Bảng 2.2.3 - Phân loại độ bền gel của gạo trắng theo chiều dài của gel 31

Bảng 2.2.4 Tỷ lệ thích hợp giữa gạo và nước 34

Bảng 2.3.1 Thành phần phản ứng PCR 36

Bảng 2.3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 37

Bảng 3.1.1 Danh sách các chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí locus gen Saltol 40

Bảng 3.2.1 Chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển của một số dòng BT7–Saltol Vụ Mùa 2015 tại Giao Thủy –Nam Định 47

Bảng 3.2.2 Chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển của một số dòng BT7–Saltol Vụ Mùa 2015 tại Giao Thủy –Nam Định 48

Bảng 3.2.3 Năng suất DNAse-free và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng Bắc Thơm 7 chịu mặn Vụ Mùa 2015 tại Giao Thủy - Nam Định 49

Bảng 3.3.1 Nhiệt độ hồ hóa của các dòng tham gia thí nghiệm 52

Bảng 3.3.2 Hàm lượng amyloza của các mẫu tham gia thí nghiệm 55

Bảng 3.3.3 kết quả đánh giá độ bền gel sau 60 phút của các dòng tham gia thí nghiệm 57

Bảng 3.3.4 Chất lượng lúa gạo của dòng Bắc Thơm 7 – Saltol 58

Bảng 3.3.5 Đánh giá chất lượng cơm của các dòng Bắc Thơm 7 – Saltol 59

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Nhiệt độ trung bình toàn cầu từ năm 1880 đến năm 2005 5

Hình 1.3.2.1 Nguồn A từ Tenasai 2 - giống chống chịu mặn, và nguồn B từ CB- giống nhiễm mặn Các đỉnh biểu thị vùng di truyền của giống nhiễm CB, trong khi đó các lõm biểu thị vùng di truyền của giống chống chịu Tenasai 2, giúp gia tăng tính trạng mục tiêu (Lang và ctv 2001b) 20

Hình 1.3.2.2 Bản đồ QTL của những tính trạng mục tiêu liên quan đền hiện tượng chống chịu mặn trên quần thể F8 (RIL) của tổ hợp lai Tenasai 2 / CB (Lang và ctv 2001b) 21

Hình 3.1.1 Các chỉ thị cho đa hình tại vị trí vùng QTL/locus Saltol trên NST1 giữa giống Bắc Thơm 7 và FL478 39

Hình 3.1.2 kết quả tách chiết và tinh sạch AND của năm dòng BT7-Saltol ở quẩn thể BC3F4 41

Hình 3.1.3: kết quả chạy điện di 5 dòng BC3F4 sử dụng chỉ thị RM3412b 42

Hình 3.1.4: kết quả chạy điện di 5 dòng BC3F4 sử dụng chỉ thị RM493 42

Hình 3.2 thử mặn trong môi trường YOSHIDA trong 10 ngày 43

Hình 3.3.1 kết quả nhiệt độ hồ hóa 52

Hình 3.3.2 Đường chuẩn amyloza 54

Hình ảnh kết quả đánh giá độ bền gel của các dòng tham gia thí nghiệm 57

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 i

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết:

Lúa (Oryza sativa L) là một trong những cây lương thực chính đảm bảo an

toàn lương thực, ổn định xã hội ở nhiều quốc gia trên thế giới Ở Châu Á, lúa gạo được coi là cây lương thực quan trọng nhất chiếm diện tích 135 triệu ha trong tổng số 248,4 triệu ha trồng lúa toàn thế giới Ở nước ta, lúa là nguồn lương thực chủ yếu cung cấp cho 90 triệu dân, với diện tích khoảng 7,8 triệu ha cho sản lượng lúa 44.84 triệu tấn, vươn lên là nước xuất khẩu lúa gạo hàng đầu thế giới (năm 2015) Nước ta có hai vùng trồng lúa chính là Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) với diện tích 3,79 triệu ha chiến 50% sản lượng lúa cả nước

và Đồng bằng Sông Hồng (ĐBSH) 1,18 triệu ha chiếm 17% sản lượng (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2009; MPI 2009)

Việt Nam với đường bờ biển dài 3620 km trải dài từ Bắc vào Nam, hàng năm những vùng trồng lúa ven biển chịu ảnh hưởng rất nhiều do sự sâm thực của nước biển Theo thống kê, diện tích đất ngập mặn năm 1992 là 494.000 ha, đến năm 2000 là 606.792 ha Theo Tổng cục thủy lợi do mùa mưa năm 2015 đến muộn và kết thúc sớm, dòng chảy thượng nguồn sông Mê Kông bị thiếu hụt, mực nước thấp nhất trong vòng 90 năm qua xâm nhập mặn đã xuất hiện sớm hơn

so với cùng kỳ năm hàng năm gần hai tháng, ảnh hưởng tới sản xuất nông nghiệp Cụ thể, tình trạng xâm nhập mặn diễn ra như sau:

− Khu vực sông Vàm Cỏ: Đôn mặn lớn nhất đạt 8,12 g/l cao hơn trung bình nhiều năm từ 5,9 – 6,2 g/l, phạm vi xâm nhập mặn vào đất liền của độ mặn 4 g/l (bắt đầu ảnh hưởng tới cây lúa) lớn nhất 90 – 93 km, sâu hơn trung bình nhiều năm 10 – 15 km

− Khu vực cửa sông thuộc sông Tiền: Độ mặn lớn nhất đạt 14,6 – 31,2 g/l, cao hơn trung bình nhiều năm từ 3,2 – 12,4 g/l, phạm vi xâm nhập mặn vào

- Khu vực ven biển tây (trên sông cái lớn): Độ mặn lớn nhất đạt 11,0 – 23,8 g/l, cao hơn trung bình nhiều năm từ 5,1 – 8,4 g/l, phạm vi xâm nhập mặn vào đất liền của độ mặn 4g/l lớn nhất 60 – 65 km, sâu hơn trung bình nhiều năm 5 – 10

km

Đặc biệt, trong điều kiện khí hậu toàn cầu đang thay đổi, hiện tượng bang tan

ở hai cực và hệ lụy của nó là nước biển dâng đe dọa đến các vùng đất canh tác ven biển Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố chính gây khó khăn cho chiến lược lúa gạo và ảnh hưởng xa hơn là mục tiêu đảm bảo an ninh lương thực sẽ khó hoàn thành Do đó, việc hạn chế mức độ gây hại của sự nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu

Để đáp ứng được yêu cầu này, việc chọn tạo các giống lúa chịu mặn là rất cần thiết Trong chọn tạo giống lúa, hướng nghiên cứu khai thác sự đa dạng tự nhiên về nguồn gen giữa các dòng bố mẹ để dùng trong lai tạo là một định hướng có hiệu quả Khai thác sự đa dạng tự nhiên về nguồn gen chịu mặn qua chọ lọc trực tiếp hay chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử Việc sử dụng chỉ thị phân tử có thể giúp xác định nhanh chóng sự có mặt của gen chống chịu mặn, giúp các nhà chọn giống lựa chọn các tổ hợp lai hiệu quả Nhờ đó, quá trình chọ tạo giống chống chịu mặn trở lên nhanh chóng và hiêu quả giảm chi phí

Đối với lúa gạo chất lượng nấu nướng được người tiêu dùng quan tâm nhất Các lại gạo cho phẩm chất tốt phải có đặc điểm: hạt gạo nấu ít trương nở, cơm

2 Mục tiêu nghên cứu của đề tài:

− Sử dụng chỉ thị phân tử để xác định dòng lúa Bắc Thơm số 7 mang gen

chịu mặn Saltol đã được cải tiến bằng phương pháp chỉ thị phân tử và lai trở

lại

− Đánh giá các đặc điểm nông sinh học và chất lượng gạo của các dòng lúa

chịu mặn này so sánh với giống gốc Bắc Thơm số 7

3 Nội dung nghiên cứu:

− Nội dung 1: Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với locus gen Saltol xác định lại các dòng lúa Bắc Thơm số 7 chịu mặn được cải tiến bằng phương pháp chỉ thị phân tử và lai trở lại

− Nội dung 2: Nghiên cứu đánh giá đặc tính nông sinh học các dòng lúa Bắc

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 4

Thơm số 7-Saltol chịu mặn

− Nội dung 3: Nghiên cứu đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng gạo của các

dòng lúa Bắc Thơm số 7-Saltol chịu mặn

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 5

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp

1.1.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế

giới

Biến đổi khí hậu là sự thay đổi của hệ thống khí hậu gồm khí quyển, thủy

quyển, sinh quyển, thạch quyển hiện tại và trong tương lai bởi các nguyên nhân

tự nhiên và nhân tạo trong một giai đoạn nhất định [8] Biến đổi khí hậu là thay đổi hệ thống thời tiết trung bình hay thay đổi sự phân bố các sự kiện thời tiết quanh một mức trung bình Sự biến đổi khí hậu có thể giới hạn trong một vùng nhất định hay có thể xuất hiện trên toàn cầu Trong những năm gần đây, đặc biệt

là trong bối cảnh thế giới công nghiệp hiện nay việc sử dụng nguyên liệu hóa thạch và chặt phá rừng ngày càng tăng đã dẫn tới việc phác thải ra một lượng lớn khí CO2 là nguyên nhân chủ yếu dẫn tới hiện tượng nóng lên toàn cầu, hậu quả nó

là hàng loạt các kiểu thời tiết cức đoan diến ra trên toàn thế giới như hạn hán, lũ lụt và những trận siêu bão mạnh chưa từng thấy Hậu quả nặng nề khác của hiện tượng nóng lên toàn cầu là băng ở hai cực đang tan chảy với tốc độ nhanh chưa từng có khiến mực nước biển tăng, nhấn chìm các vùng đất thấp ven biển và hiện tượng xâm nhập mặn gây ảnh hưởng nặng nề tới việc sản xuất nông nghiệp

Hình 1.1 Nhiệt độ trung bình toàn cầu từ năm 1880 đến năm 2005

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 6

Biến đổi khí hậu có ảnh hưởng lớn tới việc sản xuất lúa gạo vì phần lớn

diện tích trồng lúa tập chung ở những vùng thấp hoặc đồng bằng ở các quốc gia như Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh Những khu vực này lại có nguy cơ bị xâm nhập mặn cao khi nước biển dâng Theo các nhà khoa học, trong vòng 50 năm trở lại đây khí hậu toàn cầu đã có những biến đổi phức tạp, trong đó phải kể đến

sự nóng lên của đại dương thế giới Các số liệu quan trắc cho thấy, mực nước biển trung bình toàn cầu đã dâng lên 1,8mm/năm (Intergorvemental Panel on Climate Change - IPCC, 2007) Ở Châu Á nếu nước biển dâng lên 1m, khoảng 10.000km2 diện tích đất canh tác và nuôi trồng thủy sản trở thành đầm lầy ngập mặn Theo báo cáo của FAO (2010), trên 800 triệu diện tích tưới (khoảng 45 triệu ha) được ước tính bị xâm nhập mặn theo mức độ khác nhau Vấn đề này nghiêm trọng hơn kể từ khí các khu vực này đảm bảo khoảng một phần ba lương thực thế giới Do đó việc việc phát triển một giống lúa chịu mặn để ứng phó với biến đổi khí hậu và nước biển dâng là một vấn đề vô cùng quan trọng và bức thiết trong bối cảnh hiện nay

1.1.2 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam

Việt Nam có đường bờ biển dài hơn 3200km với 28 tỉnh, thành phố giáp biển Do đó việc biến đổi khí hậu đặc biệt là hiện tượng nước biển dâng sẽ làm ngập mặn hầu hết những vùng đất mầu mỡ là nơi sản xuất lúa gạo chủ yếu của Việt Nam, tập chung chủ yếu ở đồng bằng Sông Cửu Long và đồng bằng Sông Hồng Nước biển dâng còn làm ảnh hưởng tới lưu lượng dòng chảy của các con sông, thậm chí ngay cả những nơi xa biển

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 7

Bảng 1.1 Mực nước biển dâng (cm) so với thời kỳ

1980-1999 Kịch

bản 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100

Nguồn: kịch bản BĐKH và nước biển dâng, bộ Tài Nguyên và Môi Trường 2009

Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, khi nước biển dâng, tùy thuộc vào mực độ sẽ

có những phần diện thích canh tác ở Đồng bằng Sông Cửu Long, Đồng bằng Sông Hồng và các đồng bằng duyên hải khác bị ngập Theo kịch bản nước biển dâng của Bộ Tài Nguyên và Môi Trường thì Vào giữa thế kỷ 21 mực nước biển

có thể dâng thêm khoảng 30cm và đến cuối thế kỷ 21 mực nước biển có thể dâng thêm khoảng 75cm so với thời kỳ 1980 - 1999 Nếu mực nước biển dâng cao như

đã nêu, sẽ có khoảng 90% diện tích trồng lúa ĐBSCL bị ngập hoàn toàn (không sản xuất được), các tỉnh có tỷ lệ ngập cao theo thứ tự lần lượt là Bạc Liêu, Bến Tre, Hậu Giang, Sóc Trăng, Trà Vinh và Vĩnh Long Theo nghiên cứu của Phân viện Khí tượng thủy văn và môi trường phía Nam, kết quả quan trắc tại các trạm

ở ĐBSCL cho thấy: từ năm 1960 - 2000, lượng mưa có sự gia tăng khoảng 200 -

400 mm Trong những năm cuối của giai đoạn này tại một số địa phương ở ĐBSCL như Cần Thơ, Phú Quốc lượng mưa đã đặc biệt tăng cao Số cơn bão có ảnh hưởng đến ĐBSCL cũng tăng cao Trên thực tế trong năm 2015 tình trạng xâm nhập mặn đã xảy ra ở nhiều địa phương vùng ĐBSCL như: Bến Tre, Cà Mau, Sóc Trăng, Tiền Giang, Trà Vinh, An Giang Theo Đài Khí tượng-Thủy văn khu vực Nam Bộ, tại các địa phương trên, nhiều nơi nước mặn đã xâm nhập

tự nhiên (1000ha)

Đất tự nhiên

bị ngập (1000 ha)

Ước tính đất

NN bị ngập (1000 ha)

Năng suất lúa TB (tấn/ha/vụ)

Số vụ/

năm

Sản lượng

bị mất (1000 tấn)

Giá trị

bị mất (1000 tỷ đồng)*

Bến tre 231,5 113,1 81,7 4,06 2,0 663,7 2.522,0 Long An 449,2 216,9 160,0 4,08 2,0 1.305,3 4.960,3 Trà Vinh 222,6 102,1 83,5 4,43 2,0 739,9 2.811,7 Sóc

Giang 236,7 78,3 60,1 4,90 2,0 588,5 2.236,3 Kiên

Giang 626,9 175,7 112,8 4,61 2,0 1.040,5 3.953,7 Cần Thơ 298,6 75,8 64,6 5,18 2,0 669,6 2.544,5

Cộng 2.996,8 1.147,4 848,1 44,79 2,0 7.597,4 28.870,2

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 10

Ghi chú: (*) Giá lúa được tính là 3.800 đ/kg tại thời điểm tháng 12/2009 Nguồn: Tính toán dựa theo nguồn số liệu của Jeremy Carew-Ried- Trung tâm Quốc tế về quản lý môi trường (ICEM), 2007 và Bộ TN&MT, 2009

Các vùng lúa nhiễm mặn ở vùng ĐBSH thuộc các tỉnh như Thái Bình, Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hóa,… Một số vùng ven biển thuộc Hải Phòng bị nhiễm mặn khoảng 20.000ha ở hai dạng nhiễm mặn tiềm tàng và nhiễm mặn xâm nhiễm từ 0,3-0,5%, chủ yếu tập chung tại các huyện Kiến Thủy, Tiên Lãng, Thủy Nguyên, Vĩnh bảo,… Tỉnh Thái Bình có khoảng 18.000ha nhiễm mặn chủ yếu ở các huyện Thái Thụy, Tiền Hải, Kiến Xương,… Tỉnh Nam Định

có khoảng 10.000ha chủ yếu ở các huyện như Nghĩa Hưng, Xuân Trường, Giao Thủy,… Tỉnh Thanh Hóa có khoảng 22.000ha đất nhiễm mặn chủ yếu ở các huyện như Hậu Lộc, Nga Sơn, Hà Chung,…

Dọc theo các tỉnh miền Trung đất cũng bị nhiễm mặn như Hà Tình có khoảng 17.919ha Quảng Bình có hơn 9.300ha và Ninh Thuận có gần 2.300ha đất

bị nhiễm mặn

1.2 Nghiên cứu di truyền về giống lúa chịu mặn:

1.2.1 Cơ chế chống chịu mặn của lúa:

Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa được biết thông qua nhiều công trình nghiên cứu rất nổi tiếng (Akbar và ctv 1972, Korkor và Abdel-Aal 1974, Maas

và Hoffman 1977, Mori và ctv 1987) Mặn ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng của cây lúa dưới những mức độ thiệt hại khác nhau ở từng giai đoạn sinh trưởng phát triển khác nhau (Maas và Hoffman 1977) Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng tính chống chịu mặn xảy ra ở giai đoạn hạt nẩy mầm, sau đó trở nên rất mẫn cảm trong giai đoạn mạ (tuổi lá 2-3), rồi trở nên chống chịu trong giai đoạn tăng trưởng, kế đến trong thời kỳ thụ phấn và cuối cùng thể hiện phản ứng chống chịu trong thời kỳ hạt chín (Pearson và ctv 1966, IRRI 1967) Tuy nhiên,

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 11

một vài nghiên cứu ghi nhận ở giai đoạn lúa chổ, nó không mẫn cảm với mặn (Kaddah và ctv 1975) Do đó, người ta phải chia ra nhiều giai đoạn để nghiên cứu một cách đầy đủ cơ chế chống chịu mặn của cây trồng

Nghiên cứu di truyền số lượng cho thấy cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn (Mishra và ctv 1990, Gregorio và Senadhira 1993, Lee 1995) Trong giai đoạn mạ của cây lúa, các tính trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na và K ở trong chồi, trọng lượng khô của chồi và rễ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa giống kháng và giống nhiễm, tính trạng này chủ yếu được điều khiển do hoạt động của nhóm gen cộng tính Hệ số di truyền tính chống chịu thông qua các tính trạng như vậy rất thấp (Teng 1994) Trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa, tính trạng chiều cao cây, năng suất trong điều kiện xử lý mặn được điều khiển bởi nhóm gen cộng tính (Moeljopawiro và Ikehashi 1981, Akbar và ctv 1986, Mishra và ctv 1990) Trong phân tích di truyền số lượng thông qua lai diallel 6x6, năng suất lúa thể hiện tính hoạt động của nhóm gen cộng tính không có ý nghĩa trong điều kiện bình thường, nhưng trở nên có ý nghĩa trong điều kiện xử

lý mặn (Narayanan và ctv 1990) Năng suất lúa bị giảm là do ảnh hưởng của mặn Một giống lúa có ưu thế hoạt động gen cộng tính đối với năng suất sẽ là điều kiện thuận lợi cho chọn lọc giống trong môi trường mặn Trong phân tích di truyền số lượng thông qua lai diallel 9x9, tính trạng chống chịu mặn được xem xét qua tỉ lệ thấp của Na / K ở trong chồi, tính trạng này được kiểm soát bởi hoạt động của cả hai nhóm gen cộng tính và không cộng tính Tính trạng Na / K thấp còn thể hiện ảnh hưởng siêu trội và được điều khiển bởi ít nhất hai nhóm gen trội Ảnh hưởng của môi trường rất có ý nghĩa và hệ số di truyền thấp (19,18%) (Gregorio và Senadhira 1993) Từ đó, số lượng lai phải thật lớn, và việc tuyển

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 12

chọn nên được thực hiện ở các thế hệ sau cùng, dưới điều kiện mặn được kiểm soát chặt chẽ, giảm thiểu thấp nhất ảnh hưởng biến động của môi trường

Xác định gen chống chịu mặn là trọng tâm quan trọng trong chọn giống lúa,

nó có những khó khăn nhất định mà nhà chọn giống phải đối mặt như: nguồn gen chịu mặn khan hiếm, tính trạng chịu mặn là tính trạng di truyền số lượng QTL (Quantitative trait loci), cơ chế chống chịu mặn phức tạp và rất khó để đánh giá chính xác những tính trạng sinh lý liên quan đến khả năng chịu mặn Có một

số phương pháp chọn giống chịu mặn được các nhà chọn giống thường xuyên áp dụng như cải tạo các giống lúa địa phương có khả năng chống chịu mặn bằng cách gây đột biến hay lai tạo rồi chọn lọc theo phương pháp truyền thống Sử dụng công nghệ sinh học bằng cách tạo mô sẹo (callus) từ phôi hay nuôi cấy bao phấn, sàng lọc và tái sinh cây trong môi trường bổ xung hàm lượng NaCl với nồng độ khác nhau, hay chuyển gen chịu mặn vào giống có tiềm năng, năng xuất nhưng mẫn cảm với mặn Biện pháp chọn tạo giống lúa chống chịu mặn nhờ chỉ thị phân tử (MAS, MABC) chỉ ra là phương pháp hiệu quả, chính xác đã được các nhà chọn giống sử dụng trong những năm gần đây trên thế giới

Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh, yếu tố di truyền tính chống chịu mặn biến động khác nhau giữa các giống lúa Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu mặn có hiệu quả, cần nghiên cứu sâu cơ chế di truyền tính chống chịu mặn,

từ đó loại bỏ ở ngay từ những thế hệ đầu, những dòng không đáp ứng được yêu cầu của người chọn giống Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn

Bằng những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn tại giai đoạn mạ của cây lúa trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn tương đối cao (EC= 12dSm-1) trong môi trường kiểm soát các yếu tố ngoại cảnh, người ta thấy, tính

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 13

trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na, K ở trong chồi, khối lượng khô của chồi và

rễ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa giống chống chịu mặn và giống nhiễm mặn Tính trạng này được điều khiển do hoạt động của nhóm gen cộng tính Hệ số di truyền tính chống chịu mặn thông qua các tính trạng này rất thấp Trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa, tính trạng chiều cao cây, năng xuất trong điều kiện mặn được điều khiển bằng gen cộng tính

Do ảnh hưởng lớn từ môi trường bên ngoài, sự thể hiện di truyền là rất thấp trong các tính trạng Phương pháp chọn giống chống chịu mặn có thể dùng phương pháp trồng dồn có cải tiến hoặc có thể dùng phương pháp chọn lọc cá thể (single seed descent) sẽ là thích hợp trong chọn giống chịu mặn Bằng phương pháp lai diallel đầy đủ Gregorio và Senadhina (1993) cho rằng, có thể tìm ra một số cặp lai tốt phục vụ cho chương trình ưu thế lai Nghiên cứu về di truyền số lượng tính chống chịu mặn thông qua lai diallel 6x6, năng suất thể hiện hoạt động nhóm gen cộng tính không có ý nghĩa trong điều kiện bình thường, nhưng trở lên có ý nghĩa trong điều kiện xử lý mặn Năng suất lúa bị giảm là do ảnh hưởng của mặn Trong một số giống lúa, ưu thế hoạt động của gen cộng tinh đối với năng suất là điều kiện thuận lợi cho chọn chọn lọc giống trong môi trường mặn

Nghiên cứu về các thông số di truyền Mishra và ctv (1996) cho rằng, chiều dài bông và khối lượng 1000 hạt chịu tác động rất ít bởi các yếu tố môi trường, nếu như chọn giống chống chịu mặn dựa vào hai tính trạng này là không có hiệu quả Khối lượng bông, số hạt chắc trên bông, chiều cao cây có hệ số path rất cao trong môi trường mặn Chính ba tính trạng này đóng góp phần lớn trong việc tăng năng suất lúa trong môi trường mặn, nhất là khống lượng bông và số hạt chắc trên bông Narayanan và ctv (1990) cho rằng, số hạt chắc trên bông, chiều

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 14

dài bông là tính trạng chính đóng góp vào năng suất của các giống lúa trong những vùng đất bị nhiễm mặn

1.2.2 Sự thể hiện gen chống chịu mặn

Trong nông nghiệp, thiệt hại do mặn, lạnh và khô hạn có ảnh hưởng nghiêm

trọng nhất đối với năng suất cây trồng (Boyer 1982) Đặc biệt thiệt hại do mặn

có thể làm thay đổi hoạt động sinh trưởng, phát triển, năng suất và làm chết cây Nhiều nghiên cứu mong muốn tìm ra cơ chế chống chịu mặn một cách rõ ràng,

để xây dựng một chương trình cải tiến giốngchống chịu có hiệu qủa chọn lọc cao Trong lĩnh vực nghiên cứu sinh lý thực vật, hàng loạt ảnh hưởng stress do mặn cho thấy rằng thực vật tự bảo vệ mình khỏi những thiệt hại do mặn gây ra theo mô hình phản ứng oxygen (Kawasaki và ctv 2001), tránh thiếu hụt nước, tăng cường hấp thụ ion trong chu trình quang hợp (Noctor và Foyer 1998, Dat và ctv 2000) Sự thể hiện gen chống chịu mặn xét về lĩnh vực sinh học phân tử là một khám phá vô cùng thú vị Tín hiệu được truyền vào tế bào, các gen có chức năng chuyên môn được khởi động và hàng loạt các qúa trình chuyển mã,

Giải mã xẩy ra

Kawasaki và ctv (2001) đã sử dụng phương tiện microarray để theo dõi sự thể hiện của phân tử transcript và từng qúa trình thể hiện gen điều khiển tính chống chịu mặn trong cây lúa Trên cơ sở thư viện cDNA ly trích từ rễ lúa và bộ marker EST (expressed sequence tags) của genome cây lúa chống chịu mặn nổi tiếng Pokkali, người ta đã áp dụng kỹ thuật microarray để kiểm soát những transcript trong việc so sánh với nghiệm thức không xử lý mặn, thời gian thay đổi từ 15 phút đến 1 tuần lễ trong điều kiện gây mặn nhân tạo Vật liệu được sử dụng là giống lúa Pokkali (chuẩn kháng) và giống lúa IR29 (chuẩn nhiễm) Nhóm tác giả này tập trung xem xét phản ứng đối với stress do mặn trong quần

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 15

Quân thể lai có 1728 transcript dẫn suất từ rễ lúa của cây bị xử lý mặn (NaCl ở nồng độ 150mM) Kết qủa này cho thấy một tiến trình điều tiết gen chức năng với nhiều mức độ khác nhau của transcript Trong giai đoạn đầu tiên, đáp ứng của IR29 chậm hơn Pokkali Sau 3-6 giờ xử lý mặn, mức độ phong phú của transcript thay đổi nhanh trong Pokkali, nhưng IR29 có một sự suy giảm trong vòng 3 giờ đầu tiên, dẫn đến cái chết

của giống nhiễm mặn này ngay sau đó

Hoạt động quang hợp, sự lưu thông qua khí khổng, và hô hấp được ghi nhận sau khi xử lý 150mM NaCl Quang hợp giảm trong vòng 20 phút và ổn định ở phút thứ 30 (Hoạt động quang hợp được đo theo giá trị µmol photons / m2 / giây, hoạt động này chỉ còn khoảng 1/10 so với bình thường) trong giống chuẩn kháng Pokkali Trong điều kiện xử lý mặn lâu hơn, Pokkali tiếp tục phát triển với tốc

độ quang hợp thấp, 7 ngày sau khi xử lý mặn, tổng lượng chất khô tăng gấp đôi Pokkali duy trì lượng nước trong chồi trong 6 ngày bị stress Ngược lại, IR29 thể hiện phản ứng chậm hơn đối với stress, và tất cả cây lúa bị chết khô trong vòng

24 giờ Điều này cho thấy tính chống chịu của Pokkali là một cơ chế thể hiện nhanh sau khi có tín hiệu mặn, giúp nó chống chịu thiệt hại do mặn tốt hơn giống nhiễm IR29 (Kawasaki và ctv 2001)

Sự biểu hiện của lúa khi gặp điều kiện bất lợi mặn là:

• Ruộng sinh trưởng loang lổ

Triệu chứng sinh lý và hóa lý

Phản ứng với chịu mặn, một số lớn những thay đổi sinh lý và hóa lý đem vào thử nghiệm trong môi trường bất thuận, nhưng chỉ một số ít những thay đổi sinh

lý sinh hóa này có ý nghĩa và có đóng góp lớn vào cơ chế chịu mặn của giống Những thay đổi điều khiển cân bằng dung dịch, nước và phân bố chúng trong toàn bộ cây và các mô trong cây Trên cơ sở nghiên cứu ở hầu hết các cây trồng

và các giống cho thấy biểu hiện sinh lý và hóa sinh dưới điều kiện mặn cao hơn như sau:

• Vận chuyển Na+ cao đến đỉnh sinh trưởng

• Ưu thế tích lũy Na cao ở các lá già

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 17

• Tăng dung dịch hữu cơ không độc tương ứng

• Tăng mức Polyamine levels

• Tăng mực của các loại hóa khí Reactive Oxygen Species (ROS)

• Đóng nhanh khí khổng khi có biểu hiện bất thuận mặn

Tiến hành các thí nghệm thanh lọc mặn ta nhanh chóng thấy được sự biểu hiện của gen Saltol giữa các giống đối chứng nhiễm với đối chứng kháng dựa

trên cơ sở các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và hóa sinh nêu trên

1.3 Một số kết quả trong chọn tạo giống lúa chịu mặn

1.3.1 Kết quả nghiên cứu, chọn tạo giống lúa chịu mặn trên thế giới

Để khắc phục vấn đề đất nhiễm mặn trên Thế giới có hai cách tiếp cận chính là:

- Cải tạo môi trường đất mặn

- Lựa chọn cây trồng phù hợp hoặc cải tiến đặc tính di truyền để chống chịu với điều kiện mặn

Cách tiếp cận thứ nhất liên quan đến khoa học cải tạo đất và cần nhiều nguồn lực thường với quy mô nhỏ

Cách tiếp cận thứ hai chọn lọc giống cây trồng có khả năng chịu mặn hoặc thay đổi cấu trúc gen của cây trồng để có thể thích ứng với vùng trồng nhiễm mặn Đây là khả năng có triển vọng, ít tốn kém và là biện pháp được chấp nhận

về mặn kinh tế và xã hội Biện pháp này nhằm vào khả năng cho cây trồng chịu đựng áp lực mặn đến mức độ tối đa để quản lý tài nguyên một cách tối ưu Đây

là căn cứ để phát triển những giống cây trồng hoàn toàn thích hợp và có khả năng chịu đựng độ mặn cao, phát triển tốt trong những vùng đất chịu mặn

Việc chọn tạo giống lúa chịu mặn là một giải pháp hợp lý nhất vì tí tốn kém Một số giống chịu mặn đã được chọn tạo và canh tác hiệu quả ở một số nước

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 18

trên thế giới Nhiều nguồn giống lúa địa phương như Nona Bokra, Bura Rata chống chịu mặn tốt tương đương với giống Pokkali đã được xác định

Các quốc gia trên thế giới đang tiến hành chọn tạo, canh tác có hiệu quả một

số giống lúa chịu mặn Nhiều nguồn giống lúa địa phương như Nona Broka, Burarata chống chịu với điều kiện mặn tương đương với giống Pokkali đã được xác định

Những năm cuối thế kỷ 20, các nhà chọn tạo giống đã sử dụng những biến đổi

di truyền để tạo ra những giống lúa có tiềm năng về năng suất, chất lượng gạo tốt, kháng một số loại sâu bệnh thường gặp và chống chịu với những điều kiện thời tiết bất lợi như hạn hán, ngập úng, mặn Trong chiến lược chọn tạo giống lúa chịu mặn, Viện nghiên cứu lúa quốc tê (IRRI) từ năm 1977-1980 đã tiến hành chọn được những dòng lúa chịu mặn tốt như IR42, IR4432-28-5, IR4595-4-

1, IR463-22-2, IR9884-54-3 Năng suất đạt 3,6 tấn/ha trung bình cho tất cả 25 thí nghiệm những giống lúa cải tiến này cho năng suất cao hơn những giống lúa cổ truyền 2 tấn/ha

Cho tới nay có rất nhiều nghiên cứu đánh giá và xác định về tính chịu mặn của các giống lúa bản địa và giống lúa cải tiến (Gregorio và cs, 2002; Ismail và

cs 2007; Modammadi-Nejad và cs, 2010; Negrao và cs 2011) Một số giống lúa địa phương có nguồn gốc từ các vùng duyên hải Đông Á có tính kháng mặn cao như giống Nona Bokra (Ấn Độ), Pokkali (Sri Lanka), Getu (Ấn Độ), Seetha (Thái Lan),… các giống lúa thể hiện tính kháng mặn đều thuộc nhóm Indica Hơn nữa theo cập nhật mới nhất, một số dòng lúa thuộc nhóm Indica có nguồn gốc từ Saudi Arabia, Hawashi thể hiện tính chịu mặn cao hơn cả các giống lúa pokkali và Nona Bokra (Gregorio 2010)

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 19

1.3.2 Kết quả nghiên cứu, chọn tạo giống lúa chịu mặn ở Việt Nam

1.3.2.1 Phân tích bản đồ di truyền QTL tính chống chịu mặn

Quần thể cận giao tái tổ hợp bao gồm 108 dòng từ tổ hợp lai Tenasai 2 / CB

đã được sử dụng trong phân tích bản đồ QTL tính chống chịu mặn của cây lúa Tenasai 2 là giống cho gen chống chịu mặn của Trung Quốc và CB là giống nhiễm có nguồn gốc từ Mỹ Những tính trạng được quan sát trong điều kiện mặn

12 dS/m là : số ngày cây mạ sống sót (SD), trọng lượng khô của rễ, trọng lượng khô của chồi, hàm lượng Na+, K+ và tỉ số Na+/K+ trong chồi Marker phân tử được sử dụng trong phân tích bản đồ di truyền là RFLP và microsatellite với 108 marker, phủ trên 12 nhiễm sắc thể của cây lúa Bản đồ được phủ với tổng số 2.340,5 cM, trung bình 21,68 cM / quãng giữa marker và loci Những marker phân tử liên kết với loci thể hiện tính chống chịu mặn phần lớn định vị trên nhiễm thể số 1, 2, 3, 9, 11 và 12 Bản đồ di truyền QTL được phân tích để xác định ảnh hưởng giữa QTL và các tính trạng liên quan đến khả năng chịu mặn của cây lúa Những xét nghiệm được áp dụng bổ sung trong phân tích QTL là phép thử chi bình phương, phân tích từng marker riêng (SMA), phân tích mapping từng quãng (IM) Kết quả giữa các phương pháp này cho những giá trị thống nhất để kết luận Tính trạng có liên quan đến khả năng chống chịu mặn: SD do bốn QTL điều khiển, trọng lượng khô của chồi do một QTL, trọng lượng khô của

rễ do hai QTL, sự hấp thu Na+ do một QTL, sự hấp thu K+ do một QTL, và tỉ số Na+/K+ do bốn QTL Thông qua phân tích QTL, sự biến thiên kiểu hình của SD thay đổi từ 5,2 đến 11,6%, của những tính trạng còn lại là 4,80 đến 14,38% Những QTL điều khiển chung tính trạng RD và trọng lượng khô của rễ, RD và Na+/K+ định vị trên nhiễm thể 3, và 9 Những QTL điều khiển chung tính trạng Na+/K+ và K+ định vị trên nhiễm thể số 12 Kết qủa này đã giải thích hiện

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 20

tượng biến thiên vượt trội của con lai so với bố mẹ đối với các tính trạng có liên quan đến khả năng chịu mặn (Lang và ctv 2000)

QTL đối với tính trạng trọng lượng rễ (RW) liên kết với những marker định

vị trên nhiễm thể số 3 và 9, trùng với tính trạng SD, nhưng chỉ có một marker R3156 được chỉ định chung cho cả hai tính trạng RW và SD Hàm lượng Na và

K bị ảnh hưởng bởi các loci định vị trên nhiễm thể số 6, 7 và 12, cùng thể hiện trên nhiễm thể số 1 và 2

Hình 1.3.2.1 Nguồn A từ Tenasai 2 - giống chống chịu mặn, và nguồn B từ CB- giống nhiễm mặn Các đỉnh biểu thị vùng di truyền của giống nhiễm

CB, trong khi đó các lõm biểu thị vùng di truyền của giống chống chịu Tenasai 2, giúp gia tăng tính trạng mục tiêu (Lang và ctv 2001b)

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 21

Hình 1.3.2.2 Bản đồ QTL của những tính trạng mục tiêu liên quan đền hiện tượng chống chịu mặn trên quần thể F8 (RIL) của tổ hợp lai Tenasai 2/ CB

(Lang và ctv 2001b) 1.3.2.2 Chọn giống chống chịu mặn nhờ marker phân tử (MAS)

Từ kết quả này, chương trình cải tiến giống lúa chống chịu mặn tại Viện Lúa

ĐBSCL đã được thực hiện theo hướng xác định một locus chính có quan hệ với tính chống chịu mặn ở cả hai giai đoạn tăng trưởng và phát dục, trên cơ sở lý thuyết "chọn giống nhờ marker phân tử" (MAS) Quần thể F2 của IR28 / Đốc

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 22

Phụng đã được thử nghiệm, sau đó chúng tôi chọn ra 257 con lai ở F3 để tách chiết DNA và ứng dụng microsatellite marker để tìm kiếm thể đa hình trong quần thể phân ly này Cây mạ của từng cá thể được trồng trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida (Yoshida và ctv 1976) để đánh giá kiểu hình Điều chỉnh nồng

độ mặn với độ dẫn điện EC=6 dS/m Ba ngày sau đó, nồng độ mặn được gia tăng lên 12dS/m bằng cách cho thêm NaCl vào dung dịch dinh dưỡng Dung dịch này được thay đổi định kỳ sau 8 ngày, và duy trì pH luôn luôn là 5,0 trong ban ngày Cây lúa thường chống chịu được trong thời gian nẩy mầm, nhưng sẽ trở nên nhạy cảm với mặn vào giai đoạn mạ có 3 lá, rồi trở nên chống chịu trong giai đoạn tăng trưởng, sau đó lại mẫn cảm trong lúc thụ phấn và thụ tinh (IRRI 1967)

Có một vài nghiên cứu khác cho rằng lúa không nhạy cảm với mặn trong lúc trỗ bông (Kaddah và ctv 1975) Vì vậy, muốn biết phản ứng của cây lúa đối với stress do mặn gây ra một cách đầy đủ, chúng ta phải xem xét chúng ở mọi giai đoạn sinh trưởng khác nhau Điểm chống chịu mặn thể hiện khác nhau ở giai đoạn tăng trưởng và giai đoạn phát dục Ghi nhận có sự phân ly vượt trội của con lai so với bố mẹ về tính cống chịu mặn Điều này chứng tỏ hoạt động của một bộ alen đồng nhất trên các loci khác nhau để điều khiển tính chống chịu (Zhu et al.1999)

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 23

PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Các giống lúa nghiên cứu

− Giống lúa cho gen: FL478 là giống lúa chịu mặn nhập từ Viện lúa Quốc tế IRRI Có thời gian sinh trưởng 105-110 ngày, chiều cao 95-104 cm, năng suất

trung bình có khả năng chịu mặn tốt từ 10 đến 15 ngày

− Giống lúa nhận gen: Bắc Thơm 7 (BT7) là giống lúa được trồng phổ biến

ở các tỉnh phía Bắc (Nam Định, Thái Bình,…) Bắc Thơm 7 (BT7) có thời gian sinh trưởng trà khoảng 109 ngày (vụ mùa), chiều cao cây 103,6-110 cm, phiến lá cứng, rộng, gọn khóm, nàu xanh vàng, hạt nhỏ và có màu nâu đỏ đẻ

nhánh trung bình, năng suất trung bình, gạo thơm, có tính ổn định

− Năm dòng BT7-Saltol ở quẩn thể BT7/FL478(BC3F4) kế thừa của các

nghiên cứu từ trước

− Hai chỉ thị phân tử RM3412b và RM493 liên kết với locus gen Saltol

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu và thời gian tiến hành nghiên cứu

− Đề tài nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện tại Viện Di truyền Nông nghiệp bao gồm các thí nghiệm đánh giá trong phòng thí nghiệm

− Địa điểm đồng ruộng: huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định

− Thời gian nghiên cứu từ 6/2015 – 5/2016

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 24

2.2 Phương pháp nghiêm cứu

2.2.1 Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng:

* Phương pháp thử mặn nhân tạo

Bảng 2.2.1 Môi trường dinh dưỡng YOSHIDA

Theo phương pháp của Phạm Chí Thành (1986), các thí nghiệm một nhân

tố được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên đầy đủ (RCB), mỗi thí nghiệm với

3 lần nhắc lại

* Các chỉ tiêu theo dõi về khả năng sinh trưởng, phát triển của các

giống trên đồng ruộng: Theo phương pháp của IRRI (1980)

− Giai đoạn mạ:

+ Ngày gieo, ngày cấy

+ Số lá, màu sắc lá, số dảnh, chiều cao cây mạ trước khi cấy

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 25

+ Quan sát đặc điêm cây mạ, đánh giá sức sống của cây mà trước khi cấy (theo thang điểm)

− Giai đoạn trỗ đến thu hoạch:

+ Giai đoạn từ cấy đến hồi xanh (70% số cây trong khóm hồi xanh)

+ Thời gian bắt đầu để nhanh (10% số nhánh đẻ)

+ Ngày đẻ nhánh rộ (khi có 75% số nhánh trong tổng số nhánh điều tra)

− Giai đoạn trỗ đến thu hoạch:

+ Ngày bắt đầu trỗ ( khi có 10% số nhánh trỗ/khóm)

+ Ngày trỗ hoàn toàn (khi có 80% số nhánh trỗ/khóm)

+ Ngày chín, ngày chín hoàn toàn

− Thời gian sinh trưởng (ngày)

+ Giai đoạn từ cấy đến đẻ nhánh

+ Giai đoạn từ đẻ nhánh đến trỗ

+Giai đoạn từ trỗ đến trỗ hoàn toàn

− Các chỉ tiêu về sinh trưởng: cứ 1 tuần theo dõi 1 lần, theo dõi 10 cây/1 ô thí nghiệm bao gồm chỉ tiêu đẻ nhánh và chiều cao cây

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 26

2.2.2 Phương pháp đánh giá chất lượng gạo:

2.2.2.1 Phân tích nhiệt độ hóa hồ: (theo TCVN 5715-1993)

Dùng dung dịch kali hydroxyt 1,7% phân hủy 6 hạt gạo xát nguyên ở nhiệt độ

300C trong 23 giờ Dựa vào hình dáng và mức độ bị phân hủy của các hạt gạo sau khi ủ ấm để xác định độ phân hủy kiềm bằng cách so sánh mẫu gạo thí nghiệm với mẫu chuẩn và thang điểm chuẩn, từ đó qui ra nhiệt độ hóa hồ của mẫu

Dụng cụ và hóa chất:

− Đĩa petri

− Tủ tấm có khả năng duy trì nhiệt độ ở 300C

− Pipet, dung dịch 10ml

− Kali hydroxyt, dung dịch 1,7%

Thang điểm chuẩn:

Hình dạng và mức độ bị kiềm phân hủy của hạt gạo được đánh giá bằng mắt sau khi ủ ấm dựa trên thang điểm sau:

Điểm 1: Hạt gạo không bị phân hủy

Điểm 2: Hạt gạo bị trương lên

Điểm 3: Hạt gạo bị trương lên, vành keo không hoàn thiện và hẹp

Điểm 4: Hạt gạo bị trương lên vành keo hoàn chỉnh và rộng

Điểm 5: Hạt gạo bị nứt ra hoặc vỡ thành những mẩu nhỏ, vành keo hoàn chỉnh

và rộng

Điểm 6: Hạt gạo bị phân tán, hòa tan với vành keo

Điểm 7: Hạt gạo bị phân tán và trộn lẫn hoàn toàn

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 27

Bảng 2.2.2.1 Độ phân hủy kiềm của gạo xát

2.2.2.2 Xác định hàm lượng amyloza: (theo TCVN 5716-1:2008)

5 Axit axetic, dung dịch 1 mol/l

6 Dung dịch iôt: Cân 2,000 g kali iodua, chính xác đến 5 mg, trong bình cân có nắp đậy kín Thêm nước vừa đủ để tạo thành dung dịch bão hòa Thêm 0,200 g iôt, chính xác đến 1 mg Khi lượng iôt đã tan hết, chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml thêm nước đến vạch và trộn

7 Huyền phù amyloza khoai tây chuẩn, không chứa amylopectin, 1 g/l

Tr ầ n Đ ình Tài - K19 1203 28

8 Huyền phù amylopectin chuẩn từ gạo nếp 1 g/l

Dụng cụ

1 Máy khuấy trộn phòng thử nghiệm

2 Máy nghiền, có khả năng nghiền gạo xát thành bột lọt qua được rây có kích thước lỗ từ 150 µm đến 180 µm (100 mesh đến 80 mesh) Nên sử dụng máy nghiền xyclon có lưới sàng 0,5 mm

3 Rây, kích thước từ 150 µm đến 180 µm (100 mesh đến 80 mesh)

4 Máy đo quang phổ, có cuvet thích hợp, với chiều dài đường quang 1 cm, có khả năng đo độ hấp thụ ở bước sóng 720 nm

5 Thiết bị chiết, có khả năng chiết đối lưu các mẫu với metanol ở tốc độ 5 giọt đến 6 giọt mỗi giây

Huyền phù amyloza chuẩn

Nghiền10 g gạo xát trong máy nghiền thành bột mịn Khử chất béo của bột bằng cách cho đối lưu với metanol khoảng 4-6 giờ với tốc độ chiết 5-6 giọt.giây Sau đó kiểm tra độ sạch bằng chuẩn độ điện thế Amyloza tinh khiết phải liên kết

từ 19-20% khối lượng của nó với iôt Sau đó giàn mỏng amyloza đa khử béo lên