Nghiên cứu đặc điểm và điều kiện lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn streptomyces cavourensis ybq75 nội sinh

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CAVO

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN

STREPTOMYCES CAVOURENSIS YBQ75 NỘI SINH

Giáo viện hướng dẫn 1: NCS ThS Vũ Thị Hạnh Nguyên Giáo viên hướng dẫn 2: TS Phí Quyết Tiến

Họ tên sinh viên: PHÙNG THỊ HƯỜNG Lớp: 1203-K19

Hà Nội - 2016

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN

STREPTOMYCES CAVOURENSIS YBQ75 NỘI SINH

Giáo viện hướng dẫn 1: NCS ThS Vũ Thị Hạnh Nguyên Giáo viên hướng dẫn 2: TS Phí Quyết Tiến

Họ tên sinh viên: PHÙNG THỊ HƯỜNG Lớp: 1203-K19

Hà Nội - 2016

SV: Phùng Thị Hường 1

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng các số liệu và kết quả trong báo cáo này là trung thực

và chưa hề sử dụng trong các bài báo khoa học nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện báo cáo này đã được cảm ơn và ghi rõ nguồn gốc

Hà nội, ngày 20 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Phùng Thị Hường

SV: Phùng Thị Hường 2

LỜI CẢM ƠN

Trước hết , với tất cả tấm lòng, tôi xin chân thành cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Phí Quyết Tiến và NCS ThS Vũ Thị Hạnh Nguyên đã tận tình hướng dẫn

và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Đồng thời tôi cũng cảm ơn các cán bộ phòng công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, những người đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình trong quá trình thực hiện luận văn của mình

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực tập

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè những người đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quí báu đó!

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2016 Sinh viên

Phùng Thị Hường

SV: Phùng Thị Hường 3

DANH MỤC BẢNG

PHẦN I: MỞ ĐẦU 9 Bảng 2.1: Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu 14 Bảng 3.1 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 4.1: Đặc điểm hình thái của chủng S cavourensis YBQ75 trên các môi

trường nuôi cấy khác nhau 29 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ muối, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng của chủng S cavourensisYBQ75 30 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn

của chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 35

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của

chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 36

SV: Phùng Thị Hường 4

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Ảnh quét hiển vi điện tử của bề mặt lá dưa chuột sau 8 ngày gây

nhiễm với Streptomyces sp MBCu-56 (A) Hệ sợi trên bề mặt lá (B) Hệ sợi của

xạ khuẩn xâm nhập và phát triển trên, dưới bề mặt của lớp biểu bì 13Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc (A) trên môi trường YIM38 và hình ảnh bề mặt chuỗi bào tử dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 2.500 lần (B) và

20.000 lần (C) của chủng chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 30

Hình 4.2: Khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn MRSA và MRSE của

chủng S.cavourensis YBQ75 trên các môi trường khác nhau 32

Hình 4.3: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh chất kháng khuẩn

của chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 33

Hình 4.4: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của

chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 34

Hình 4.5: Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng

khuẩn của chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 36

Hình 4.5: Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng

khuẩn của chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh đối với MRSA, MRSE 37

Hình 4.6: Ảnh hưởng của độ thông khí đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng YBQ75 nội sinh 38Hình 4.8: Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của

chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 39

Hình 4.9: Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng VSV kiểm định

MRSA, MRSE của chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh 40

SV: Phùng Thị Hường 5

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

aureus (MRSA) ATCC 25923

epidermidis (MRSE) ATCC

35984

SV: Phùng Thị Hường 6

MỤC LỤC L ỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN 2

DANH MỤC BẢNG 3

DANH MỤC HÌNH 4

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 5

1.1 Đặt vấn đề: 9

1.2 Mục đích và yêu cầu của nghiên cứu 10

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

2.1 Xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu 11

2.1.1 X ạ khuẩn nội sinh và mối tương quan giữa xạ khuẩn với cây chủ 11

2.1.2 Kh ả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh 14

2.1.2 Ti ềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh 14

2.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 16

2.2.1 Đặc điểm hình thái và sự phân bố trong tự nhiên 16

2.2.3 Các y ếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn 18

2.2.3 Một số nghiên cứu về chi Streptomyces 19

2.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh 20

2.3.1 Tình hình nghiên c ứu trên thế giới 20

2.3.2 Tình hình nghiên c ứu ở Việt Nam 21

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Vật liệu 23

3.1.1 Ch ủng giống vi sinh vật 23

SV: Phùng Thị Hường 7

3.1.2 Hóa ch ất 23

3.1.3 Thi ết bị 23

3.1.4 Môi tr ường 23

3.2 Phương pháp nghiên cứu 24

3.2.1 Nghiên c ứu đặc điểm sinh học của chủng S.cavourensis YBQ75 24

3.2.2 B ảo quản giống 25

3.2.4 L ựa chọn môi trường lên men 26

3.2.5 Xác định thành phần môi trường lên men 27

3.2.6 Ảnh hưởng của điều kiện lên men: 27

3.2.7 Đông thái của quá trình lên men: 28

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn S cavourensis YBQ75 nội sinh 29

4.1.1 Đặc điểm hình thái và bề mặt chuỗi bào tử của xạ khuẩn S cavourensis YBQ75 n ội sinh 29

4.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối, pH, nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng x ạ khuẩn S cavourensis YBQ75 30

4.2 Lựa chọn môi trường lên men 31

4.3 Ảnh hường của thành phần môi trường đề khả năng sinh chất kháng khuẩn của chủng YBQ75 nội sinh 32

4.3.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 32

4.4 Nghiên cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ75 nội sinh trên môi trường thay thế 34

4.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi 34

4.3.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu 35

4.3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống 36

SV: Phùng Thị Hường 9

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề:

Vi khuẩn gây bệnh có khả năng kháng thuốc là vấn đề vô cùng nghiêm trọng

và tạo mối quan tâm lớn của cộng đồng Vì vậy, việc nghiên cứu, lựa chọn các tác nhân kháng khuẩn mới từ tự nhiên, an toàn là ưu tiên hàng đầu của các inhà khoa học và các công ty dược phẩm trên thế giới Nhiều nghiên cứu chứng minh thực vật

là một nguồn tự nhiên quan trọng trong điều trị các bệnh gây ra bởi vi sinh vật và

hỗ trợ điều trị chống ung thư Chẳng hạn, cây quế (Cinamomumsp.) chứa dược chất

trong tinh dầu của lá, vỏ cây và quả với 90% là cinnamaldehyde có hoạt tính kháng

khuẩn cao đối với vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-) (Staphylococcus,

Micrococcus, Bacillus, Enterobacter) Carvacrol trong tinh dầu bạc hà phá hủy màng ngoài của tế bào vi khuẩn Gram (-) làm tăng tính lưu động của màng tế bào,

dẫn đến sự thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào Húng quế (Ocimum basilicum)

cũng được sử dụng như một phương thuốc để điều trị nhiều loại bệnh như sốt, tiêu hóa kém, buồn nôn, đau bụng, dạ dày-ruột, bệnh lậu, bệnh lỵ, tiêu chảy mãn tính Ngoài giá trị khoa học do thành phần của cây mang lại, cây dược liệu còn là môi trường cho các xạ khuẩn nội sinh (sống trong các loại mô thực vật) có khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh, chất chống ung thư Theo nghiên cứu của Bérdy, 2005 ước tính khoảng 70% các kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng trong y học lâm sàng hiện nay được sản sinh bởi xạ khuẩn Gần đây, một số nghiên cứu tại Đại học Vân Nam, Trung Quốc cho thấy các hợp chất chuyển hóa thứ cấp do các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu sinh ra rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như các chất chất kháng vi sinh vật, kháng ung thư, chống ô xi hóa, chống sốt rét và kiểm soát sinh học Các hoạt tính kháng sinh

và kháng ung thư của cây dược liệu đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới và đang được quan tâm tại Việt Nam Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nhiều báo cáo đề cập đến đặc tính xạ khuẩn nội sinh trên thực vật nói chung và cây dược liệu tự nhiên nói riêng tại Việt Nam Đặc biệt, chưa có nhóm nghiên cứu nào công bố đa dạng và khai thác đặc tính của xạ khuẩn nội sinh trên cây Quế Vì vậy, nghiên cứu các

SV: Phùng Thị Hường 10

chủng xạ khuẩn nội sinh có hoạt tính sinh học trên cây quế hứa hẹn tiềm năng khai thác trong y học, nông nghiệp, và các ngành công nghiệp khác Xuất phát từ những định hướng và lợi ích to lớn có thể đạt được chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài:

"Nghiên cứu đặc điểm và điều kiện lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn

của chủng xạ khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ75 nội sinh"

1.2 Mục đích và yêu cầu của nghiên cứu

Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces cavourensis

YBQ75 nội sinh có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao Lựa chọn môi trường

và điều kiện thích hợp cho lên men lên men xạ khuẩn nội sinh Streptomyces

cavourensis YBQ75 được phân lập từ cây Quế ở Yên Bái có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất

SV: Phùng Thị Hường 11

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu

2.1.1 Xạ khuẩn nội sinhvà mối tương quan giữa xạ khuẩn với cây chủ

Hiện nay trên thế giới có nhiều nghiên cứu đã được công bố chứng minh mối quan hệ giữa thực vật và vi sinh vật (VSV), trong đó VSV đóng vai trò như tác nhân kiểm soát sinh học, tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng, phân giải photpho khó hòa tan, cố định nito tự do và tăng độ phì nhiêu cho đất [11] Kể từ

khi Smith phân lập thành công chủng xạ khuẩn Micromonospora sp trong cà chua

có khả năng ức chế nấm Fusarium oxysporum trong mô tế bào cà chua không

nhiễm bệnh đã có nhiều định nghĩa về VSV nội sinh Hiện nay, định nghĩa của Bacon và White (2000): VSV nội sinh là những VSV sinh trưởng trong tế bào mô thực vật mà không gây ra hiệu ứng xấu nào tới cây chủ đã được các nhà vi sinh vật học thừa nhận [10] Theo tài liệu, định nghĩa này hàm chứa một ý rất quan trọng: VSV nội sinh không những không gây ảnh hưởng mà còn tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất [14]

Trong đó, xạ khuẩn được chú ý hơn cả bởi khả năng sinh sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học như kháng sinh nhằm ức chế VSV gây bệnh Song song với tác dụng dược phẩm thu nhận từ xạ khuẩn nội cộng sinh như nguồn thuốc kháng sinh mới, một vài nhà sinh vật học đã nghiên cứu khả năng kiểm soát sinh học của xạ khuẩn nội sinh trong suốt hai thập kỷ qua Xạ khuẩn đã được chứng minh khả năng tăng cường, thúc đẩy tăng trưởng của cây chủ, cũng như giảm nguy

cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cường ái lực với các điều kiện sống khác nhau Những hiểu biết về sinh lý và mối tương tác phân tử giữa xạ khuẩn và thực vật là chìa khóa

để sử dụng những đặc tính có lợi của xạ khuẩn nội sinh trong kích thích sinh trưởng

SV: Phùng Thị Hường 12

học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong mọi lĩnh vực của đời sống Các hợp chất có hoạt tính sinh học được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV, kháng khối u, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng [47] Chính

vì thế, nghiên cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu tự nhiên đang là hướng nghiên cứu đầy triển vọng của các nhà khoa học trên thế giới

Nhiều loài xạ khuẩn nội sinh, đặc biệt là những loài được phân lập từ cây dược liệu có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại VSV gây bệnh như vi khuẩn, nấm và virus Cho đến nay, rất nhiều loại thuốc kháng sinh mới đã được phát hiện như: munumbicins AD, celastramycins AB, kakadumycins và demethylnovobiocins Chất 6-Prenylindole được tách chiết từ dịch lên men chủng

Streptomyces sp TP-A0595 có hoạt tính kháng nấm gây bệnh thối cổ rễ (Fusarium

oxysporum) Những nghiên cứu trước đó, chất 6-Prenylindole được biết đến thu

nhận chủ yêu từ lá và thân cây rêu tản (Hepatopsidae) Đây là một ví dụ điển hình

về mối tương quan giữa thực vật và xạ khuẩn nội cộng sinh.Streptomyces sp Tc022

được phân lập từ rễ cây Alpinia galanga có hoạt tính ức chế mạnh Colletotrichum

musae và Candida albicans Khi tách chiết từ môi trường nuôi cấy, chủng

Streptomyces sp Tc022 thu được hợp chất có thành phần chính là actinomycin D chất có hoạt tính kháng nấm rất mạnh

Khi nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh, câu hỏi được đặt ra là làm sao xạ khuẩn

có thể xâm nhập vào cây chủ? Và làm thế nào xạ khuẩn có thể sinh trưởng trong các bộ phận của cây và mô tế bào? Để làm sáng tỏ câu hỏi trên, các nhà khoa học

đã gây nhiễm chủng Streptomyces scabies trên bề mặt củ khoai tây Sau 4-6 ngày,

chủng Streptomyces scabies hình thành mạng lưới phủ trên bề mặt củ khoai tây và

xâm nhập vào củ thông qua lỗ trên bề mặt vỏ non hay vết thương khi khoai tây đang trong giai đoạn phát triển Nối tiếp thí nghiệm trên, tiến hành lây nhiễm chủng

S ipomoeae trên rễ khoai tây đã cho kết quả tương tự Từ kết quả nghiên cứu trên các nhà vi sinh vật học đã khẳng định rằng hầu hết xạ khuẩn hình thành hệ sợi phát

tế bào Trong nghiên cứu của mình, Shimizu và cộng sự đã ủ Streptomyces sp

MBCu-56 trên lá dưa chuột, theo dõi sự phát triển Ban đầu, khuẩn ty phát triển mạnh trên bề mặt lá và hình thành khối hệ sợi dày đặc nhất là ở nhánh phân chia các tế bào biểu bì Một số sợi đã xâm nhập lớp biểu bì và phát triển sang các tế bào biểu bì khác (Hình 2.1) Tuy nhiên, quan sát của họ không đủ để chứng minh sự

tăng trưởng ở nội bào trong lớp biểu bì [30]

Năm 2005, Suzuki và cộng sự đã chứng minh quá trình xâm nhập vào mô lá

cây đỗ quyên của chủng S galbus MBR-5 và xác nhận rằng hệ sợi của chủng xâm

nhiễm vào mô tế bào lá đã bị tổn thương thông qua các lỗ không khí Ngoài ra, chủng MBR-5 được chứng minh là có khả năng sinh các enzyme thủy phân cellulase, xylanase và pectinase Hỗn hợp enzyme từ khuẩn ty tăng cường khả năng bám dính [46]

Hình 2.1: Ảnh quét hiển vi điện tử của bề mặt lá dưa chuột sau 8 ngày gây nhiễm với

Streptomyces sp MBCu-56 (A) Hệ sợi trên bề mặt lá (B) Hệ sợi của xạ khuẩn xâm nhập và phát triển trên, dưới bề mặt của lớp biểu bì

B

A

SV: Phùng Thị Hường 14

2.1.2 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh

Nhiều loại xạ khuẩn nội sinh có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại VSV gây bệnh như Vi khuẩn, Virus và nấm đặc biệt là xạ khuẩn được phân lập từ các cây dược liệu.Vì vậy, xạ khuẩn nội cộng sinh có tiềm năng lớn trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh mới

Phần lớn các chất kháng sinh được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ xạ khuẩn Cho đến nay có rất nhiều kháng sinh mới được phát hiện như Munumbicin A-D [50] , Kakadumycin K [51], Lansai B and C, Antimycin A18, 6-prenylindole (Bảng 2.1)

Bảng 2.1: Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu

Streptomyces

sp.NRRL 30562

Hoa mộc lan (Kenndia

nigriscans) Munumbicin A-D

Kháng sinh

Steptomyces

sp.TP-A0556 Hẹ (Allium tuberosum) 6- Prenylindole

Kháng nấm

Hai chất cedarmycin A và B được tách chiết từ dịch lên men Streptomyces

sp TP-A0456 cũng đã được tìm thấy trong dịch chiết từ cây tuyết tùng

Cedarmycin A có hoạt tính kháng với nấm Candida glabrata với giá trị MIC đạt

0,4 mg/ml Những nghiên cứu trên chứng minh và khẳng định xạ khuẩn nội sinh là nguồn kháng sinh đầy hứa hẹn kháng lại VSV gây bệnh

2.1.2.Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh

*Kháng ung thư và kháng viêm

Trong nhưng năm gần đây nhu cầu tìm kiếm nhứng chất có hoạt tính kháng

và ức chế tế bào ung thư từ các chủng xạ khuẩn nội sinh đang là hướng đi mới của các nhà khoa học Đã có nhiều công trình khắng định xạ khuẩn nội sinh có mối

SV: Phùng Thị Hường 15

quan hệ phức tạp và chặt chẽ với cây chủ [43] Một giả thuyết được đưa ra răng gen

mã hóa cho chất có hoạt tính sinh học được sinh ra từ quá trình trao đổi giữ VSV và thực vật được thông qua hệ thống chuyển gen ngang (horizontal gene transfer, HGT) Do đó có thể sản xuất các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật nhờ quá trình nuôi cấy VSV, ví dụ như chất kháng tế bào ung thư Kitasatospora [34] Đây là báo cáo đầu tiên về nghiên cứu tách chiết và sản xuất kháng sinh kháng tế bào ung thư

từ xạ khuẩn nội sinh

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy tỷ lệ phát hiện ra các kháng sinh mới trên xạ khuẩn nội sinh cao hơn rất nhiều so với xạ khuẩn được phân lập từ đất hoặc

bề mặt thực vật Chẳng hạn như chất kháng u mạnh maytansinoid được tìm thấy ở

nhóm thực vật bậc cao như Celastraceae, Rhamnaceae và Euphorbiaceae cũng như một số loài rêu cũng như xạ khuẩn đặc biệt là Actinosynnema pretiosum [19, 23,

45] đáng chú ý là chất ansamycin có thêm nhóm chức chlorine mới còn được gọi là

Naphthomycin K, được tìm thấy từ Streptomyces sp CS nội sinh trong cây thuốc

Maytenus hookeri [27]

*Kích thích sinh trưởng:

Hiện nay xạ khuẩn nội sinh được quan tâm đặc biệt vì chúng có nhiều đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật bao gồm: kiểm soát sinh học, sản xuất chất kích thích tăng trưởng thực vật như auxin, xytokinin và giberelin, sản xuất siderophore

để liên kết ba với Fe từ môi trường nhằm cải thiện hấp thụ chất dinh dưỡng, cung cấp chất dinh dưỡng như N, P, khoáng chất hoặc ức chế sản xuất ethylene nhờ 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) [44]

Năm 2006, Meguro và cộng sự đã công bố chủng Streptomyces sp MBR52

làm tăng khối lượng và chiều dài của rễ cây Khi nuôi cấy mô cây Đỗ quyên được

xử lý bằng Streptomyces sp MBR52 trong bình tam giác, chủng này đã xâm nhập

vào các cây con và phát triên trong cây con ngay cả khi đã trồng cây con đó ra đất,

sự phát triển của bộ rễ rất nhanh chóng đối với cây được nuôi cấy trong môi trường

có bổ sung thêm Streptomyces sp MBR52 so với cây được nuôi với môi trường

thường Điều này cho thấy chủng này sản sinh ra một số loại hoocmon tăng trưởng thực vật [31]

SV: Phùng Thị Hường 16

*Kiểm soát sinh học :

Nhiều năm gần đây xạ khuẩn nội sinh được các nhà khoa học chú ý tới bởi đặc tính kiểm soát sinh học đối với cây mang mầm bệnh do đặc tính cư trú và hoạt tính kháng nấm của chúng trong các cây chủ Xạ khuẩn nội sinh chiếm hữu các cơ quan bên trong cây chủ để lấy chất dinh dưỡng và sự bảo vệ từ cây chủ, tuy nhiên

để đổi lại chúng sản sinh ra một loạt các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học Chúng kích thích sự phát triển và tăng trưởng của cây bằng cách cố định N hoặc sản xuất phytohormones hay kiểm soát sinh học

Ngoài ra các chủng xạ khuẩn giúp tăng cường hệ thống miễn dịch (ISR) đối

với thực vật nhờ kích thích các thụ thể tế bào chẳng hạn như chủng Streptomyces

galbus R-5 không chỉ sinh cellulase mà còn sản xuất actinomycin X2 và fungichromin để tạo ra sức đề kháng trong cây đỗ quyên con, đồng thời tăng cường sản xuất jasmonate kích thích hệ thống miễn dịch [40]

Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội sinh với cây chủ và các sản phẩm sinh học tự nhiên tạo ra cơ hội tìm và điều chế được các loại thuốc mới có tính đặc hiệu và tiềm năng, ứng dụng trong bảo vệ thực vật, tăng năng suất cây trồng và kiểm soát sinh học

2.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

2.2.1 Đặc điểm hình thái và sự phân bố trong tự nhiên

Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc nhóm prokaryota, thuộc giới monera trong hệ thống năm giới của Whittaken, hay hệ thống phân loại chia

sinh giới thành 7 giới [6, 7, 8]

Xạ khuẩn có cấu tạo như nấm mốc, nhưng kích thước tương tự như vi khuẩn Nhân của xạ khuẩn cùng loại với nhân của vi khuẩn Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenluloza hay kitin Tế bào phân chia theo kiểu phân bào vô sắc, đó chính là tính chất đặc trưng của vi khuẩn [6] Thời gian nhân đôi tế bào ở xạ khuẩn trong môi trường lỏng khoảng 90 phút Xạ khuẩn phát triển theo kiểu mọc chồi phân nhánh (khoảng 30µm phân một nhánh) Cấu trúc khuẩn lạc được phân biệt ở hướng sinh trưởng trong và ngoài môi trường thạch, tạo thành khuẩn ty cơ chất (KTCC)

SV: Phùng Thị Hường 17

và khuẩn ty khí sinh (KTKS) KTCC cắm sâu vào môi trường để lấy thức ăn còn KTKS phát triển ra ngoài không khí và phần cuối của khuẩn ty biến thành cuống sinh bào tử Đường kính của khuẩn ty thay đổi trong khoảng từ 0,2÷1,0 µm đến 2÷3 µm KTCC có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố: có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan ra trong dung môi hữu cơ Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đoạn phát triển khoảng 11 µm/h, nhân của tế bào xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài khuẩn ty [17]

Bào tử xạ khuẩn có dạng hình cầu hay hình bầu dục, hình que, hình trụ hay hình tròn… Kết cấu bề mặt ngoài của bào tử (trơn, thô nhám, nhăn nheo, có mấu lồi hoặc có gai) thường tương đối ổn định.Bào tử của xạ khuẩn chứa acid picolinic, canci và magiê Dựa vào hình thái, kích thước, cuống sinh bào tử và bào tử ở nhiều chi xạ khuẩn có thể phân loại được xạ khuẩn Cuống sinh bào tử thường có dạng thẳng hay hơi cong (RF), dạng xoắn thật hay dạng lò xo (S) và chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản hình móc câu (RA) Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường

có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que với mép nhẵn hoặc xù xì, ở một số loài, bào tử còn hình thành ở các mấu lồi với các dạng khác nhau Việc hình thành cuống bào tử diễn ra mạnh mẽ hơn khi môi trường có chứa một số nguyên tố vi lượng [17] Phần lớn xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí và ưa ấm, xạ khuẩn ưa nhiệt thường

ít gặp hơn Xạ khuẩn phát triển tốt ở môi trường trung tính và hơi kiềm Xạ khuẩn thường được tìm thấy nhiều trong đất, trong nước ao hồ, một phần trong bùn và trong chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các vi khuẩn khác và nấm mốc không phát triển được Xạ khuẩn sinh kháng sinh có thể tìm thấy trong tất cả các loại đất từ miền Bắc đến miền Nam bán cầu và số lượng ở miền Nam bán cầu bao giờ cũng cao hơn ở Bắc bán cầu.Sự phân bố của xạ khuẩn trong đất phụ thuộc vào điều kiện địa lý, khả năng bao phủ của thực vật, dinh dưỡng của đất Xạ khuẩn phân bố trong đất giàu chất dinh dưỡng hữu cơ cao hơn so với vùng đất sa mạc, khô nóng, nghèo chất dinh dưỡng [6, 7, 8]

sự tổng hợp kháng sinh [18]

a) Nguồn cacbon: Nguồn cacbon thường sử dụng là các nguồn đường đơn như

glucose, fructose…, các loại đường kép như maltose, lactose, saccharose, ngoài ra có thể sử dụng tinh bột, rỉ đường Trong đó nguồn đường glucose là nguồn cacbon dễ sử dụng nhất, tuy nhiên nếu sử dụng nhiều nguồn đường này thì hiệu suất của quá trình lên men sẽ giảm đi Nguyên nhân là do glucose làm tăng lượng acid hữu cơ trong môi trường, đồng thời làm tăng các chất hữu cơ và acid nucleic trong khuẩn ty dẫn đến thay đổi hoạt tính các enzym phân giải glucose…Tuy nhiên, có thể khắc phục được hiện tượng này bằng cách chia nhỏ tổng lượng glucose và bổ sung một cách định kì vào môi

trường lên men để không xảy ra sự tích luỹ các chất trao đổi ức chế [20]

b) Nguồn nitơ: Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn đòi hỏi

cung cấp đầy đủ nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp thường sử dụng là cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tương…, còn

nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là các muối amon, muối nitrat [20]

c) Khoáng chất: Vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng rất cần chất

khoáng trong quá trình trao đổi chất của chúng Một lượng nhỏ các nguyên

tố vi lượng cũng có ảnh hưởng nhất định đến sự hình thành CKS của xạ khuẩn Sự có mặt của một số muối khoáng như Na, Fe, Al, Bo, K, Cr, Cu,

SV: Phùng Thị Hường 19

Mn, Zn trong môi trường lên men sẽ tác dụng khác nhau đến khả năng sinh kháng sinh của vi sinh vật Có thể sự có mặt của nguyên tố này sẽ làm giảm tác dụng kìm hãm hoặc làm tăng tác dụng kích thích của nguyên tố kia Một

số muối khoáng như Ca2+, Cu2+… được cho là có ảnh hưởng tới khả sinh ra một vài loại kháng sinh trong đó có vancomyxin Các khoáng chất này có tác động lên hoạt động của các enzym trong sinh tổng hợp kháng sinh [21]

* Điều kiện nuôi cấy

a) Nhiệt độ: phần lớn xạ khuẩn sinh trưởng tốt ở 28-30°C Nhiệt độ tối ưu cho

tổng hợp chất kháng sinh nằm trong khoảng từ 18-28°C

b) Độ thông khí: xạ khuẩn có nhu cầu oxy cao hơn so với các vi sinh vật khác,

nhất là trong giai đoạn nhân giống Do đó, nồng độ oxi trong môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất của quá trình lên men [22]

c) Độ pH: pH thích hợp cho tổng hợp kháng sinh thường là trung tính Đối với chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces thì pH thích hợp là 6,5-8,0 Môi

trường kiềm hay axit đều ảnh hưởng đến quá trình này

d) Nhân giống: sinh tổng hợp chất kháng sinh không chỉ phụ thuộc vào điều

kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượng giống Môi trường nhân giống giàu chất dinh dưỡng hơn môi trường lên men sẽ cho hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao Lượng giống, tuổi giống cũng có ảnh hưởng không nhỏ đến khả năng sinh tổng hợp và thời gian sinh tổng hợp, thông thường lượng giống bổ sung vào môi trường lên men từ 2-10 % [18, 25] Ngoài ra, sự sinh tổng hợp chất kháng sinh từ vi sinh vật còn chịu ảnh hưởng của cơ chế điều hoà ngược Chất kháng sinh do chúng sinh ra tích luỹ trong môi trường đến một nồng độ nhất định nào đấy sẽ ức chế sự sinh trưởng và phát triển của chúng dẫn đến làm giảm hiệu suất sinh kháng sinh [21]

2.2.3 Một số nghiên cứu về chi Streptomyces

Streptomyces là chi lớn nhất của ngành Actinobacteria và là một chi thuộc nhánh Streptomycetaceae Có hơn 500 loài vi khuẩn Streptomyces đã được mô tả Giống như hầu hết các Actinobacteria khác, Streptomyces là vi khuẩn Gram dương,

SV: Phùng Thị Hường 20

có bộ gen với tỉ lệ GC% cao Vi khuẩn này được tìm thấy chủ yếu trong đất và

thảm thực vật mục nát Streptomyces sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, là kết quả từ sản sinh geosmin trong quá trình chuyển hóa các chất Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi và được biết đến nhiều nhất là chi của họ xạ khuẩn (Actinomyces)

Streptomyces thường sống ở đất có vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan trọng Chủng vi sinh này sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh trên thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế

Streptomyces có cấu trúc giống nấm và một số người lầm tưởng Streptomyces

là nấm Nhánh của chúng có sự sắp xếp của các tế bào hình sợi thành một mạng lưới gọi là sợi nấm Chúng có thể chuyển hóa các hợp chất khác nhau bao gồm: đường, rượu, acid amin, và các hợp chất thơm bằng cách sản xuất các enzyme thủy phân ngoại bào Do gen của chúng lớn nên trao đổi chất của chúng cũng đa dạng, trong đó có hàng trăm nhân tố phiên mã kiểm soát biểu hiện gene, cho phép chúng đáp ứng nhu cầu cụ thể

2.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Sự đa dạng của xạ khuẩn sinh trong cơ thể thực vật rất phong phú hứa hẹn tiềm năng ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực Tuy nhiên, so với sự đa dạng của thế giới thực vật, số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cơ thể thực vật vẫn còn rất hạn chế,

vì vậy cơ hội để phân lập được các loài xạ khuẩn mới hay kháng sinh mới trong các

cây dược liệu hứa hẹn tiềm năng khai thác trong y dược học là rất lớn

Trong hơn 10 năm (2001-2012), nhóm các nhà khoa học thuộc Viện Vi Sinh vật học Vân Nam, Trung Quốc đã không ngừng nghiên cứu, cải tiến, tối ưu hóa các điều kiện phân lập và đã phân lập thành công, đưa vào bảo tàng giống hơn 5.000 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ hơn 100 loài thực vật [37] Zhao và cộng sự (2005) đã phân lập được 560 chủng xạ khuẩn từ 26 cây dược liệu khác nhau tại vùng cao nguyên Panxi, Trung Quốc Các chủng xạ khuẩn thuộc nhiều chi khác nhau như: Streptomyces, Micromonospora, Oerskovia, Nonomuraes,

SV: Phùng Thị Hường 21

Promicromonospora, Rhodococcus Trong đó, 60 chủng có hoạt tính kháng ít nhất một loại vi sinh vật kiểm định (chiếm 10,7%) Theo thống kê có 15 chủng có khả

năng kháng mạnh với S aureus, 38 chủng kháng ít nhất 5 loại vi sinh vật gây bệnh

và tất cả các chủng có hoạt tính đều thuộc chi Streptomyces Và tỷ lệ xạ khuẩn mang gen pks-I, pks-II, nrps chiếm tỷ lệ cao, đạt lần lượt 53%; 82%; 53%

Li và cộng sự (2008) áp dụng phương pháp xử lý nhiệt khô và xử lý mẫu thực vật với nitơ đông khô trước khi phân lập đã phân lập được từ cây dược liệu có tên thanh hao hoa vàng 228 chủng xạ khuẩn Trong đó, 10 chủng có tiềm năng cho ứng

cử loài mới, 31 chủng có hoạt tính phổ rộng kháng khuẩn, 7 chủng có hoạt tính amylase mạnh, 10 chủng có hoạt tính protease mạnh, 1 chủng có hoạt tính lipase mạnh và 19 chủng có hoạt tính ức chế sự phát triển của cỏ dại Cũng trên đối tượng này, nhóm nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp xử lý bề mặt mẫu khác nhau cũng như sử dụng các loại môi trường khác nhau để phân lập được 312 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh tại Vân Nam, Trung Quốc Trong đó, 48 chủng thể hiện hoạt tính kháng đối với các vi khuẩn kiểm định

Tại rừng nhiệt đới Xishuangbama của trung quốc đã có 2174 xạ khuẩn nội sinh được phân lập từ những cây dược liệu bằng các phương pháp phân lập khác nhau dựa trên quá trình xử lỹ mẫu, môi trường phân lập Các chủng này đại diện cho 10 bộ phụ khác nhau và 32 chi, đã phát hiện ít nhất 19 loài mới [37] Trong đó,

một chi mới và hai loài mới được phân lập trên cây dó bầu (Maytenus

austroyunnanesis)

Cũng từ những chủng xạ khuẩn được phân lập trên các cây dược liệu tại vùng Vân Nam, Trung Quốc nói trên, rất nhiều hợp chất mới đã được phát hiện như: 9-hydroxybafilomycin D, 29-hydroxybafilomycin D, bafilomycin D, bafilomycin E, bafilomycin A1, bafilomycin B1, bafilomycin B2, bafilomycin C1, bafilomycin C2, bafilomycin C1 amide, bafilomycin C2 amide; caryolane-1,7α-diol, 1,6,11-eudesmanetriol, 11-eudesmene-1,6-diol, 7,4 dihydroxy-8-(hydroxymethyl)-1 methoxy-isoflavones, Tripstretine… [9]

2.3.2.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

SV: Phùng Thị Hường 22

Nhóm nghiên cứu TS Cao Ngọc Điệp đã phân lập 191 chủng vi khuẩn nội

sinh, trong đó 27 chủng thuộc các chi Burkholderia, Enterobacter, Bacillus có khả

năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) tốt từ 54 mẫu

cây lúa (Oryza sativa L.) trồng ở 7 huyện và thành phố Tuy Hòa, Phú Yên Đây là

nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn nội sinh tại Việt Nam [5]

Dương Minh Lam và cộng sự (2014) đã phân lập 52 chủng xạ khuẩn nội sinh

trên cây bần chua (Sonneratia caseolaris), cây bần (Sonneratia paracaseolaris) và cây cóc trắng (Lumnitzera racemosa) tại tỉnh Nam Định, Việt Nam Ba mươi tám chủng ức chế với Aspergillus niger và 40 chủng ức chế Candida albicans [11]

Tại thời điểm trên, Quách Ngọc Tùng và cộng sự tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phân lập, đánh giá đa dạng di truyền và sàng lọc xạ khuẩn nội sinh phân lập trên cây quế tại tỉnh Hòa Bình Các chủng thể hiện hoạt tính kháng mạnh với 9 loại vi sinh vật kiểm định ở

mức độ khác nhau; 13 chủng mang gen pks-I, 12 chủng mang gen pks-II và 4 chủng mang gen nrps [3, 3] Hai chủng xạ khuẩn tiềm năng được định danh: Streptomyces

angustmyceticus HBQ19 và Streptomyces graminisoli HBQ33

Cho đến nay, rất ít công trình nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế được công bố Do vậy, nghiên cứu về vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế tại Việt Nam giúp cung cấp các số liệu tham khảo cho các

nhà khoa học trong và ngoài nước