Bài khóa luận tôt nghiệp Khảo sát tính chất methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK ở bệnh nhân Việt Nam với yếu tố nhiễm HPV

Theo báo cáo của Tổ chức y tế Thế giới (World Health Organization – WHO, 2012), ung thư cổ tử cung (cervical cancer) là bệnh ung thư đứng hàng thứ tư trong nhóm ung thư gây tử vong cao nhất ở phụ nữ trên thế giới. Hàng năm, trên thế giới có khoảng 528.000 trường hợp mới mắc bệnh ung thư cổ tử cung và khoảng 266.000 trường hợp mắc ung thư cổ tử cung bị tử vong. Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 5.146 trường hợp ung thư cổ tử cung mới được phát hiện[83]. Tỷ lệ chữa khỏi bệnh ung thư cổ tử cung tăng cao nếu các trường hợp mắc bệnh được phát hiện sớm và có phác đồ điều trị thích hợp[98]. HPV (Human Papillomavirus) thuộc họ Papillomaviridae[80], gồm có hơn 100 type. Nhóm HPV nguy cơ cao là nguyên nhân gây bệnh ung thư cổ tử cung, gồm các type: 16, 18, 31, 33, 35,... Nhóm HPV nguy cơ thấp là nguyên nhân dẫn đến bệnh lý sùi mào gà (Condyloma Acuminata), gồm các type: 6, 11, 42, 43, 44...[13][15][79]. Đáng lưu ý, HPV type 16 và HPV type 18 là yếu tố nguy cơ cao dẫn đến khoảng 70% các trường hợp ung thư cổ tử cung trên toàn thế giới[13][15][79]. Một số công trình nghiên cứu của Sharma và cộng sự (2009), Zhao và cộng sự (2008) xác định tính chất methyl hóa trên đảo CpG thuộc vùng promoter gen DAPK có chức năng ức chế khối u (tumor suppressor gene) liên quan đến quá trình sinh ung[69][91]. Tính chất methyl hóa vượt mức (hypermethylation) DNA ở nhóm gen này được ghi nhận là dấu chứng sinh học (biomarker) đặc trưng cho nhiều loại bệnh ung thư, cụ thể là ung thư cổ tử cung[69]. Gene DAPK (Death-associated protein kinase) nằm trên nhiễm sắc thể 9q21, mã hóa nhân tố điều hòa dương cơ chế chết theo chương trình của tế bào (apoptosis)[96]. Ở trạng thái bình thường, protein DAPK giữ vai trò ức chế quá trình sinh u[57][91]. Công bố khoa học của Zhao và cộng sự (2008) khẳng định tính chất methyl hóa vượt mức trên đảo CpG thuộc vùng promoter gen DAPK bị methyl hóa dẫn đến “đóng” hoạt động của DAPK, hệ quả là kích hoạt cơ chế sinh ung[57][91]. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài Khóa luận tốt nghiệp: “Khảo sát tính chất methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK ở bệnh nhân Việt Nam với yếu tố nhiễm HPV”. Mục tiêu: Xác định tính chất methyl hóa DNA trên vùng promoter thuộc gen DAPK liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung ở Việt Nam, dựa trên bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao, nhiễm HPV nguy cơ thấp hoặc không nhiễm HPV (mẫu lành). Nội dung nghiên cứu: Khảo sát bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa vùng promoter gen DAPK liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung và tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/không nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV nguy cơ cao/nhiễm HPV nguy cơ thấp và không nhiễm HPV. Khảo sát bộ mồi phù hợp với phương pháp sinh học phân tử (Nested-MSP) phù hợp nhằm khảo sát tính chất methyl hóa trên các gen DAPK trên bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/không nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV nguy cơ cao/nhiễm HPV nguy cơ thấp và không nhiễm HPV. Khảo sát thực nghiệm dựa vào phương pháp Nested-MSP nhằm khảo sát tính chất methyl hóa gen DAPK trên bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/không nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV nguy cơ cao/nhiễm HPV nguy cơ thấp và không nhiễm HPV.  PHẦN I: TỔNG QUAN I.1 Tổng quan về ung thư I.1.1 Khái niệm ung thư Ung thư là các dạng bệnh lý do một số tế bào thoát khỏi sự kiểm soát, dẫn đến sự tăng sinh bất thường và hình thành các khối u (u lành, u ác tính) (hình 1.1). Những tế bào bất thường có khả năng xâm lấn ở các vùng mô lân cận hoặc di trú đến nhiều cơ quan khác nhau thông qua hệ thống máu và hình thành sự di căn, cuối cùng gây tử vong[3]. Ung thư bao gồm hơn 200 bệnh khác nhau, đặc trưng bởi sự tăng sinh bất thường của tế bào khối u, tế bào ác tính trong các mô, cơ quan[99]. Theo báo cáo của Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization - WHO, 2013), ung thư là các dạng bệnh lý ảnh hưởng ở tất cả các đối tượng, trẻ em, phụ nữ và đàn ông. Đối với nam giới, các loại ung thư thường gặp là ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư đại trực tràng, ung thư dạ dày và ung thư gan. Đối với nữ giới, các loại ung thư thường gặp là ung thư vú, ung thư đại trực tràng, ung thư phổi, ung thư cổ tử cung và ung thư dạ dày. I.1.2 Phân loại khối u Theo công bố của Alison và cộng sự (2001), có hai dạng khối u: khối u lành tính và khối u ác tính. Khối u lành tính là các khối u có mức độ phát triển chậm, không xâm lấn đến các mô lân cận. Khối u lành tính thường ít gây hại nghiêm trọng cho sức khỏe bệnh nhân và thường được cắt bỏ dễ dàng, ngoại trừ khi phát triển trong một không gian giới hạn như hộp sọ. Tuy nhiên, khối u lành tính có khả năng biến đổi thành khối u ác tính[5]. Khối u ác tính là các khối u thường có mức độ phát triển nhanh. Các tế bào khối u ác tính có thể tách ra khỏi khối u nguyên phát, di cư và xâm lấn các mô, cơ quan ở vùng lân cận hoặc ở xa trên cơ thể, hình thành các khối u thứ phát[5].

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến những người Thầy, người

Cô khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình và tâm huyết truyền đạt những kiến thức nền tảng về ngành học cho em trong suốt 4 năm qua Những kiến thức Thầy Cô truyền đạt thật sự rất cần thiết và quan trọng giúp em có cơ sở để viết lên bài Khóa luận tốt nghiệp này

Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Cô Lê Huyền Ái Thúy và Cô Trương Kim Phượng đã chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình Em mãi trân trọng và biết ơn về điều đó

Cảm ơn những người bạn cùng lớp, cùng phòng và những bạn cùng nhóm thí nghiệm đã luôn ở bên động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi những lúc tôi khó khăn nhất Cuối cùng, điều không thể thiếu sót, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã sinh con ra, nuôi dưỡng và đem đến cho con những điều tốt đẹp nhất trong cuộc sống này Con biết ơn rất nhiều vì Ba Mẹ đã tạo cho con điều kiện tốt nhất để con yên tâm học hành trong suốt 4 năm qua

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến thầy cô khoa Công nghệ sinh học, kính mong Thầy Cô có thật nhiều sức khỏe, mãi luôn đồng hành cùng sinh viên thân yêu trong

sự nghiệp giáo dục của đất nước

Tôi xin chúc những người bạn của tôi sẽ hoàn thành xuất sắc đề tài Khóa luận tốt nghiệp của mình

Em xin chân thành cảm ơn!

Bình Dương, ngày 05/2016

Sinh viên thực tập

Trần Thị Thùy Trinh

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I: TỔNG QUAN 3

I.1 Tổng quan về ung thƣ 3

I.1.1 Khái niệm ung thư 3

I.1.2 Phân loại khối u 4

I.1.3 Tình hình ung thư trên thế giới 4

I.1.4 Tình hình ung thư ở Việt Nam 5

I.2 Ung thƣ cổ tử cung 5

I.2.1 Các giai đoạn của ung thư cổ tử cung 5

I.2.2 Phân loại tiền ung thư cổ tử cung 6

I.2.3 Yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư cổ tử cung 7

I.2.4 Tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới 8

I.2.5 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam 8

I.3 Tổng quan về HPV 9

I.3.1 Human papillomavirus (HPV) 9

I.3.2 Phân loại type HPV 9

I.3.3 Ung thư gây ra bởi HPV 10

I.3.4 Cơ chế gây bệnh ung thư của HPV 11

I.4 Epigenetics, sự methyl hóa DNA và đảo CpG 12

I.4.1 Epigenetics 12

I.4.2 Sự methyl hóa DNA 12

I.4.3 Đảo CpG 13

I.5 Gen DAPK (Death-Associated Protein Kinase) 14

I.5.1 Vị trí, cấu trúc 14

I.5.2 Chức năng 14

I.5.3 Sự methyl hóa trên gen DAPK 15

I.6 Phương pháp xác định tính chất methyl hóa DNA 16

I.6.1 Phương pháp MSP (Methylation - specific PCR) 16

I.6.2 Phương pháp Nested-MSP 18

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

II.1 Vật liệu 19

II.2 Phương pháp nghiên cứu 19

II.2.1 Khảo sát dữ liệu 19

II.2.2 Khảo sát in silico 19

II.2.3 Khảo sát thực nghiệm 20

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

III.1 Kết quả khai thác dữ liệu 28

III.1.1 Bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK trên các loại ung thư 28

III.1.2 Bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa vùng promoter thuộc gen DAPK trên ung thư cổ tử cung 32

III.2 Kết quả khảo sát in silico 39

III.2.1 Thu thập trình tự gen DAPK (Death – Associated Protein Kianase) 39

III.2.2 Xác định vị trí đảo CpG và vị trí nhận biết nhân tố phiên mã trên vùng promoter thuộc gen DAPK 39

III.2.3 Thu thập và khảo sát bộ mồi methyl và unmethyl phù hợp với phương

pháp Nested–MSP 40

III.3 Kết quả khảo sát thực nghiệm 46

III.3.1 Kết quả phân tích tính chất methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK ở mẫu dịch phết tế bào có tính chất nhiễm/không nhiễm HPV 47

II.3.2 Kết quả phân tích sự tương quan giữa tính chất methyl hóa và tính chất nhiễm HPV 48

III.3.2 Kết quả giải trình tự mẫu đại diện sản phẩm MSP thuộc gen DAPK 51

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

IV.1 Kết luận 54

IV.2 Đề nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC I

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CIN Cervical intraepithelial neoplasia

CpG Cytosine phosphodiester guanine

DNA Deoxyribonucleotic acid

FIGO International Federation of Gynaecology and Obstetrics

IARC International Agency for Research on Cancer

IDT Integrated DNA Technologies

MSP Methylation specific PCR

NCBI National Center for Biotechnology Information

NSCLC Non-small cell lung carcinoma

PCR Polymeration chain reaction

SCC Squamous cell carcinomar

SIL Squamous intraepithelial lesion

STT Số thứ tự

UTCTC Ung thƣ cổ tử cung

WHO World Health Organization

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại tiền ung thư cổ tử cung: thuật ngữ cho tế bào học và mô học Bảng 2.2: Thành phần phản ứng Nested-MSP

Bảng 3.1: Bộ dữ liệu tài liệu khoa học về gen DAPK

Bảng 3.2: Bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa trên gen DAPK trong tổng số 11 công trình nghiên cứu

Bảng 3.3: Tóm tắt sự ảnh hưởng biến thiên của tính chất methyl hóa trên gen DAPK

và nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung dựa vào một số yếu tố trong những nghiên cứu thực nghiệm đối chứng (case control study)

Bảng 3.4: Thông tin bộ mồi Nested-MSP gen DAPK

Bảng 3.5: Khảo sát thông số vật lý của bộ mồi MSP và bộ mồi Nested-MSP gen

DAPK

Bảng 3.6: Sự tương quan giữa tính chất methyl hóa và tính chất nhiễm HPV

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Sự phân chia ở tế bào bình thường và tế bào ung thư

Hình 1.2: Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thư tính trên 100.000 người/ 1 năm trên thế giới (2012)

Hình 1.3: Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thư tính trên 100.000 người/ 1 năm tại Việt Nam (2012)

Hình 1.4: Sự methyl hóa bất thường trong ung thư

Hình 1.5: Vị trí gen DAPK trên NST số 9

Hình 1.6: Chức năng của gen DAPK trong kiểm soát sự chết theo chương trình của

tế bào (apoptosis)

Hình 1.7: Cơ chế chuyển đổi DNA bằng sodium bisulfite

Hình 1.8: Sự biến đổi DNA gốc bằng sodium bisulfite

Hình 1.9: Sơ đồ phương pháp methylation - specific PCR (MSP)

Hình 1.10: Sơ đồ phương pháp Nested-MSP

Hình 2.1: Chương trình luân nhiệt của quá trình biến đổi bisulfite

Hình 2.2: Chu trình luân nhiệt cho phản ứng Nested-MSP

Hình 3.1: Đồ thị mô tả các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để khảo sát

tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK

Hình 3.2: Đồ thị mô tả các loại mẫu được sử dụng trong khảo sát tính chất methyl

hóa vùng promoter trên gen DAPK

Hình 3.3: Đồ thị khảo sát các loại ung thư liên quan đến tính chất methyl hóa vùng

promoter trên gen DAPK

Hình 3.4: Đồ thị ―Forest plot‖ phản ánh sự tương quan giữa tính chất methyl hóa

trên gen DAPK và nguy cơ ung thư cổ tử cung theo phân tích mô hình ảnh hưởng

biến thiên

Hình 3.5: Định vị gen DAPK trên NST số 9

Hình 3.6: Định vị đảo CpG trên vùng promoter gen DAPK

Hình 3.7: Kết quả Annhyb cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc Nested-MSP trên trình tự

vùng promoter gen DAPK

Hình 3.8: Kết quả Annhyb cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc methyl trên trình tự vùng

promoter gen DAPK

Hình 3.9: Kết quả Annhyb cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc unmethyl trên trình tự vùng

promoter gen DAPK

Hình 3.10: Cấu trúc đảo CpG trên vùng promoter gen DAPK, vị trí nhận biết nhân

tố phiên mã trên đảo CpG và vị trí bắt cặp của mồi gen DAPK

Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm MSP gen DAPK các mẫu PAP1 - PAP12 Hình 3.12: Kết quả giải trình tự mẫu HP5 với cặp mồi methyl gen DAPK (DAPK -

MF và DAPK - MR)

Hình 3.13: Kết quả giải trình tự mẫu HP5 với cặp mồi unmethyl gen DAPK (DAPK

- UF và DAPK - UR)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo báo cáo của Tổ chức y tế Thế giới (World Health Organization – WHO, 2012), ung thư cổ tử cung (cervical cancer) là bệnh ung thư đứng hàng thứ tư trong nhóm ung thư gây tử vong cao nhất ở phụ nữ trên thế giới Hàng năm, trên thế giới

có khoảng 528.000 trường hợp mới mắc bệnh ung thư cổ tử cung và khoảng 266.000 trường hợp mắc ung thư cổ tử cung bị tử vong Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 5.146 trường hợp ung thư cổ tử cung mới được phát hiện[83] Tỷ lệ chữa khỏi bệnh ung thư cổ tử cung tăng cao nếu các trường hợp mắc bệnh được phát hiện sớm và có phác đồ điều trị thích hợp[98]

HPV (Human Papillomavirus) thuộc họ Papillomaviridae[80], gồm có hơn 100 type Nhóm HPV nguy cơ cao là nguyên nhân gây bệnh ung thư cổ tử cung, gồm các type: 16, 18, 31, 33, 35, Nhóm HPV nguy cơ thấp là nguyên nhân dẫn đến bệnh lý sùi mào gà (Condyloma Acuminata), gồm các type: 6, 11, 42, 43, 44 [13][15][79] Đáng lưu ý, HPV type 16 và HPV type 18 là yếu tố nguy cơ cao dẫn đến khoảng 70% các trường hợp ung thư cổ tử cung trên toàn thế giới[13][15][79]

Một số công trình nghiên cứu của Sharma và cộng sự (2009), Zhao và cộng sự

(2008) xác định tính chất methyl hóa trên đảo CpG thuộc vùng promoter gen DAPK

có chức năng ức chế khối u (tumor suppressor gene) liên quan đến quá trình sinh ung[69][91] Tính chất methyl hóa vượt mức (hypermethylation) DNA ở nhóm gen này được ghi nhận là dấu chứng sinh học (biomarker) đặc trưng cho nhiều loại bệnh ung thư, cụ thể là ung thư cổ tử cung[69]

Gene DAPK (Death-associated protein kinase) nằm trên nhiễm sắc thể 9q21, mã

hóa nhân tố điều hòa dương cơ chế chết theo chương trình của tế bào (apoptosis)[96]

Ở trạng thái bình thường, protein DAPK giữ vai trò ức chế quá trình sinh u[57][91] Công bố khoa học của Zhao và cộng sự (2008) khẳng định tính chất methyl hóa

vượt mức trên đảo CpG thuộc vùng promoter gen DAPK bị methyl hóa dẫn đến

―đóng‖ hoạt động của DAPK, hệ quả là kích hoạt cơ chế sinh ung[57][91]

Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài Khóa luận tốt nghiệp: “Khảo sát tính chất

methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK ở bệnh nhân Việt Nam với

yếu tố nhiễm HPV”

Mục tiêu: Xác định tính chất methyl hóa DNA trên vùng promoter thuộc gen

DAPK liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung ở Việt Nam, dựa trên bộ mẫu có tính

chất nhiễm HPV type nguy cơ cao, nhiễm HPV nguy cơ thấp hoặc không nhiễm HPV (mẫu lành)

Nội dung nghiên cứu:

Khảo sát bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa vùng promoter gen DAPK liên quan

đến bệnh ung thư cổ tử cung và tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/không nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV nguy cơ cao/nhiễm HPV nguy cơ thấp và không nhiễm HPV

Khảo sát bộ mồi phù hợp với phương pháp sinh học phân tử (Nested-MSP) phù hợp

nhằm khảo sát tính chất methyl hóa trên các gen DAPK trên bộ mẫu có tính chất

nhiễm HPV type nguy cơ cao/không nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV nguy cơ cao/nhiễm HPV nguy cơ thấp và không nhiễm HPV

Khảo sát thực nghiệm dựa vào phương pháp Nested-MSP nhằm khảo sát tính chất

methyl hóa gen DAPK trên bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ

cao/không nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV nguy cơ cao/nhiễm HPV nguy cơ thấp

và không nhiễm HPV

PHẦN I: TỔNG QUAN

I.1 Tổng quan về ung thư

I.1.1 Khái niệm ung thư

Ung thư là các dạng bệnh lý do một số tế bào thoát khỏi sự kiểm soát, dẫn đến sự tăng sinh bất thường và hình thành các khối u (u lành, u ác tính) (hình 1.1) Những

tế bào bất thường có khả năng xâm lấn ở các vùng mô lân cận hoặc di trú đến nhiều

cơ quan khác nhau thông qua hệ thống máu và hình thành sự di căn, cuối cùng gây

cổ tử cung và ung thư dạ dày

Hình 1.1: Sự phân chia ở tế bào bình thường và tế bào ung thư [99]

I.1.2 Phân loại khối u

Theo công bố của Alison và cộng sự (2001), có hai dạng khối u: khối u lành tính và khối u ác tính

Khối u lành tính là các khối u có mức độ phát triển chậm, không xâm lấn đến các

mô lân cận Khối u lành tính thường ít gây hại nghiêm trọng cho sức khỏe bệnh nhân và thường được cắt bỏ dễ dàng, ngoại trừ khi phát triển trong một không gian giới hạn như hộp sọ Tuy nhiên, khối u lành tính có khả năng biến đổi thành khối u

ác tính[5]

Khối u ác tính là các khối u thường có mức độ phát triển nhanh Các tế bào khối u

ác tính có thể tách ra khỏi khối u nguyên phát, di cư và xâm lấn các mô, cơ quan ở vùng lân cận hoặc ở xa trên cơ thể, hình thành các khối u thứ phát[5]

I.1.3 Tình hình ung thư trên thế giới

Theo báo cáo Globocan (2012), trên thế giới có khoảng 14,1 triệu trường hợp mới mắc ung thư, 8,2 triệu ca tử vong do ung thư và 32,6 triệu trường hợp đang sống với ung thư trong vòng 5 năm chẩn đoán

Hằng năm, châu Phi, châu Á, Trung và Nam Mỹ là các khu vực có khoảng 60%, 70% số trường hợp mới mắc và trường hợp tử vong do ung thư so với số liệu trên toàn thế giới[98]

Theo Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thư (International Agency for Research

on Cancer - IARC) đã ước tính tổng số trường hợp mắc mới ung thư trên toàn thế giới lần lượt sẽ tăng từ 14 triệu trường hợp (năm 2012) lên 22 triệu trường hợp (năm 2035) Đồng thời, IARC ước tính số trường hợp tử vong do ung thư hằng năm

sẽ tăng từ 8,2 triệu lên 13 triệu trường hợp[93]

I.1.4 Tình hình ung thư ở Việt Nam

Theo báo cáo Globocan (2012), Việt Nam có khoảng 125.000 trường hợp ung thư mới được phát hiện, 94.700 trường hợp tử vong do ung thư và 211.800 trường hợp đang sống với ung thư trong vòng 5 năm chẩn đoán[103]

I.2 Ung thư cổ tử cung

Ung thư cổ tử cung (cervical cancer) là dạng ung thư ác tính, hình thành từ tầng tế bào biểu mô trong vùng cổ tử cung[95] Các tế bào bình thường của cổ tử cung trải qua quá trình bị biến đổi từ giai đoạn tiền ung thư chuyển biến thành ung thư cổ tử cung[95]

Ung thư cổ tử cung có hai loại tế bào chính là tế bào vảy (squamous cell) và tế bào tuyến (glandular cell) Các dạng ung thư cổ tử cung gồm có: ung thư biểu mô tế bào vảy (Squamous cell carcinoma - SCC) và ung thư tuyến (Adenocarcinoma - AC), trong đó chiếm 80% - 90% là ung thư biểu mô tế bào vảy[95]

Ung thư cổ tử cung gồm các dạng tổn thương biểu mô vảy/biểu mô gai ở mức độ thấp (Low grade squamous intraepithelial lesion - LSIL) và ở mức độ cao (High grade squamous intraepithelial lesion - HSIL) và các dạng tân sản/loạn sản biểu mô (Cervical intraepithelial neoplasia - CIN)[95]

I.2.1 Các giai đoạn của ung thư cổ tử cung

Liên đoàn quốc tế phụ khoa và khoa sản (International Federation of Gynaecology and Obstetrics - FIGO) là một trong những hệ thống thường được sử dụng nhiều nhất dựa trên kích thước khối u, mức độ xâm lấn vùng chậu và các mô lân cận để phân loại các giai đoạn của ung thư cổ tử cung[101]

Hệ thống FIGO (2009) mô tả các giai đoạn của ung thư cổ tử cung như sau:

- Giai đoạn I: là giai đoạn hình thành u nhú, khối u khu trú hoàn toàn tại cổ tử cung (bao gồm IA1, IA2, IB1 và IB2)[101]

- Giai đoạn II: các tế bào ung thư đã di cư đến các vùng mô cạnh cổ tử cung vào âm đạo trên hoặc xâm lấn các mô lân cận nhưng chưa di căn đến vùng chậu (bao gồm IIA1, IIA2 và IIB)[101]

- Giai đoạn III: các tế bào ung thư di căn xuống dưới âm đạo và/hoặc các vùng lân cận trong vùng chậu (bao gồm IIIA và IIIB)[101]

- Giai đoạn IV: ung thư đã di căn đến các cơ quan trên cơ thể như phổi và hạch bạch huyết (bao gồm IVA và IVB)[101]

I.2.2 Phân loại tiền ung thư cổ tử cung

Hiện nay có rất nhiều hệ thống phân loại khác nhau được sử dụng để phân loại tiền ung thư cổ tử cung dựa vào tế bào học và mô học (bảng 1.1)[102]

Bảng 1.1: Phân loại tiền ung thư cổ tử cung: thuật ngữ cho tế bào học và mô học

Tế bào học phân loại

Class II ASC-US

ASC-H

Không điển hình Không điển hình

Class III

LSIL

CIN I bao gồm codyloma phắng

Koilocytosis

Class III HSIL CIN II Loạn sản trung bình

Class IV HSIL CIN III Ung thư biểu mô tại chỗ Class V Ung thư biểu mô

Chú thích: Pap - Papanicolaou; ASC-H - Atypical Squamous Cells: cannot exclude

a high-grade squamous intraepithelial lesion (các tế bào vảy không điển hình, không thể loại trừ HSIL); ASCUS - Atypical Squamous Cells of Ondetermined Significance (các tế bào vảy không điển hình có ý nghĩa không xác định); CIN - Cervical Intraepithelial Neoplasia (loạn sản biểu mô cổ tử cung); HSIL - High- grade Squamous Intraepithelial Lesion (tổn thương biểu mô vảy ở mức độ thấp); LSIL -Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion (tổn thương biểu mô vảy ở mức

độ cao);

I.2.3 Yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư cổ tử cung

I.2.3.1 Human papillomavirus (HPV)

Human papillomavirus là một nguyên nhân hàng đầu dẫn đến ung thư cổ tử cung và

các dạng ung thư khác như hậu môn, âm hộ, âm đạo, dương vật, ung thư đầu và

cổ[83]

I.2.3.1 Một số yếu tố nguy cơ khác

Các bằng chứng khoa học nhận định các yếu tố nguy cơ khác có liên quan đến sự khởi phát và diễn tiến của ung thư cổ tử cung, bao gồm:

Biến đổi bất thường của cơ chế epigenetics: sự methyl hóa vượt mức/sự giải methyl hóa DNA, sự biến đổi histon, miRNA[68]

Mang thai nhiều lần: phụ nữ mang thai đủ tháng ba hay bốn lần hoặc phụ nữ có từ khoảng bảy lần sinh trở lên có nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung lần lượt cao gấp 2,6 lần và 3,8 lần so với những người chưa sinh con[15]

Sử dụng thuốc tránh thai: phụ nữ sử dụng thuốc tránh thai trong suốt mười năm có nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung cao gấp 4 lần ở phụ nữ không sử dụng thuốc tránh thai[15]

Hút thuốc lá: phụ nữ hút sáu điếu thuốc mỗi ngày hoặc nhiều hơn có nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung cao gấp 2 lần so với người không hút thuốc[15]

Mắc các bệnh nhiễm trùng, lây truyền qua đường sinh dục: phụ nữ bị đồng nhiễm HPV và các tác nhân vi sinh vật lây truyền qua đường tình dục như

Chlamydia trachomatis và Herpes simplex vius-2 (HSV-2) có nguy cơ mắc ung thư

cổ tử cung cao hơn so với phụ nữ không bị đồng nhiễm và cao gấp hai lần so với phụ nữ khỏe mạnh[15]

I.2.4 Tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới

Theo báo cáo của Tổ chức y tế Thế giới (WHO, 2012), ung thư cổ tử cung là loại ung thư phổ biến thứ tư trong nhóm ung thư gây tử vong cao nhất ở phụ nữ trên thế giới Báo cáo Globocan (2012) ước tính có 528.000 trường hợp mắc mới và 266.000 trường hợp tử vong do ung thư cổ tử cung (hình 1.2)

I.2.5 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam

Ung thư cổ tử cung đứng hàng thứ hai trong nhóm ung thư gây tử vong cao nhất ở phụ nữ Việt Nam ở độ tuổi 15 - 44 Hàng năm có khoảng 5.146 trường hợp ung thư

cổ tử cung mới được phát hiện[83] (hình 1.3)

Hình 1.2: Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thư tính trên 100.000 người/ 1

năm trên thế giới (2012)

I.3 Tổng quan về HPV

I.3.1 Human papillomavirus (HPV)

Human papillomavirus (HPV) thuộc họ Papillomaviridae và có khoảng 200 type

khác nhau[80], xâm nhiễm trên nhiều loại vật chủ: con người và động vật[13]

I.3.2 Phân loại type HPV

Dựa vào các dạng tổn thương, loạn sản trong ung thư cổ tử cung, HPV được chia thành các nhóm: HPV type nguy cơ cao (high-risk HPV type) và HPV type nguy cơ thấp (low-risk HPV types)[13]

HPV nhóm nguy cơ thấp gồm các type 6, 11, 42, 43 và 44[13] HPV type nguy cơ thấp thường ở dạng ―episome‖ với bộ gen tồn tại độc lập với tế bào chủ, thường chỉ

Hình 1.3: Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thư tính trên 100.000 người/ 1

năm tại Việt Nam (2012)

gây ra các u lành biểu mô (u nhú gai, mụn cóc )[2] Tuy nhiên, một số HPV type nguy cơ thấp hiện diện trong các tế bào ung thư cổ tử cung[13]

HPV nhóm nguy cơ cao bao gồm các type: 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 51, 52, 56,

58, 59, 66, 68 và 70[13] HPV type nguy cơ cao hiện diện trong các mẫu bệnh phẩm LSIL hoặc HSIL[19], HPV type nguy cơ cao có khả năng gắn chèn DNA vào bộ gen

tế bào chủ, dẫn đến sự rối loạn quá trình tăng sinh và phân bào, hình thành khối u ác tính và ung thư[19] Đáng lưu ý, HPV type 16 và 18 là nguyên nhân gây ra khoảng 70% các trường hợp ung thư cổ tử cung trên toàn thế giới[37][83]

I.3.3 Ung thư gây ra bởi HPV

Theo công bố khoa học của Cutts và cộng sự (2007), HPV là nguyên nhân chính dẫn đến một số bệnh ung thư cổ tử cung (100%), ung thư hậu môn (90%), ung thư

bộ phận sinh dục ngoài (âm hộ, âm đạo và dương vật) (40%), ung thư hầu họng (>= 12%) và ung thư miệng (>=3%) (bảng 1.2)[21]

Bảng 1.2: Ung thư do lây nhiễm HPV (2002) [21]

Ung thư âm hộ, âm đạo 40

Ung thư hầu – họng >=12

I.3.4 Cơ chế gây bệnh ung thư của HPV

Công trình nghiên cứu của Moody và cộng sự (2010) ghi nhận số trường hợp dương tính với HPV-16 và HPV-18 lần lượt chiếm khoảng 50% và 50% trong tổng số trường hợp bệnh nhân ung thư cổ tử cung[54]

Công bố khoa học của Moondy và cộng sự (2010) xác định sự tích hợp bộ gen HPV vào bộ gen tế bào vật chủ (tế bào người) là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành khối

u ác tính[54]

Đối với HPV type nguy cơ thấp, gen E2 của HPV hoạt động mã hóa protein E2, giữ

vai trò trực tiếp ức chế sự biểu hiện của các gen sớm khác, kiểm soát quá trình sao chép vật liệu di truyền và quá trình tái bản của virus trong tế bào vật chủ dẫn đến sự hình thành khối u ác tính[54][68]

Đối với HPV type nguy cơ cao, bộ gen virus HPV gắn vào tế bào vật chủ dẫn đến

ức chế sự biểu hiện protein E2 Hệ quả là kích hoạt sự biểu hiện của hai oncogenes

là E6 và E7 dẫn đến rối loạn sự tăng sinh, sự phân bào và sự chết theo chương trình

của tế bào vật chủ (apoptosis)[54][68]

Protein E6 ức chế hoạt động của p53, dẫn đến hiện tượng khóa sự chết theo chương trình của tế bào[68] Protein E7 ức chế hoạt động của protein kiểm soát chu trình tế bào, chính là protein retinoblastoma (pRB)[68]

Protein E6 của HPV type nguy cơ cao gồm khoảng 150 acid amin và có hai motif ngón tay kẽm (zinc finger) Protein E6 định vị ở nhân và tế bào chất của tế bào vảy nhiễm HPV P53 là một protein ức chế khối u tham gia vào sự điều khiển điểm dừng ―checkpoints‖ trong chu trình tế bào của cả pha G1/S và pha G2/M Để sửa chữa sự hỏng DNA và đáp ứng stress nội bào (cellular stress), gen ức chế khối u

p53 hoạt động thúc đẩy sự biểu hiện của nhân tố điều hòa âm chu trình tế bào

hoặc/và gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) Protein E6 tương tác với p53 bởi sự hình thành phức hợp với E6AP Protein p53 bị ubiquitin hóa bởi enzym ubiquitin dẫn đến việc giảm trạng thái ổn định của p53, qua đó dẫn đến giảm khả năng tổng hợp DNA trong tế bào và cho phép virus sao chép[31]

Protein E7 bao gồm khoảng 98 acid amin và bao gồm 3 vùng bảo tồn gọi là CR1, CR2 và CR3 Vùng domain CR1 bao gồm motif đầu tận cùng N, CR2 bao gồm motif LXCXE gián tiếp gắn kết E7 với protein ức chế khối u Rb (retinoblastoma) và CR3 bao gồm 2 motif ngón tay kẽm (zinc finger) Một trong những chức năng chính của protein E7 trong chu kỳ sống của HPV là liên kết và làm suy giảm protein

Rb[31] Protein Rb là yếu tố điều hòa chính của chu trình tế bào Phosphory hóa Rb kiểm soát chu trình tại pha G1/S của chu trình tế bào thông qua sự gắn kết với yếu

tố phiên mã E2F, điều này kích hoạt sự phiên mã của nhiều thành phần tham gia vào sự sao chép trong pha S Sự liên kết giữa protein E7 và Rb có thể phá vỡ phức hợp Rb-E2F qua đó giải phóng phức hợp E2F dẫn đến kết quả thúc đẩy sớm pha S

và tổng hợp DNA[31][54] Các phức hợp E2F được tìm thấy ở vùng promoter của nhiều gen, nó có liên quan đến sự điều hòa chu trình tế bào, biệt hóa (differentiation), phân bào (mitosis) và chết theo chương trình (apoptosis)[54]

I.4 Epigenetics, sự methyl hóa DNA và đảo CpG

I.4.1 Epigenetics

Epigenetics lần đầu tiên được C H Waddington định nghĩa là ―sự tương tác nhân quả giữa gen và sản phẩm của gen, điều đó dẫn đến kiểu hình được hình thành‖ Hiện nay, epigenetics được nhận định là ―sự biến đổi di truyền trong biểu hiện gen xảy ra độc lập với sự biến đổi xảy ra trong trình tự DNA ban đầu‖[69]

Cơ chế epigenetics giữ vai trò cho sự phát triển bình thường của tế bào và giữ ổn định cho biểu hiện gen ở động vật có vú Sự bất thường của quá trình epigenetics có thể dẫn đến biến đổi chức năng gen và hình thành tế bào ác tính Sự biến đổi epigenetics trong bộ gen được coi là một dấu hiệu hình thành của ung thư Epigenetics bao gồm sự methyl hóa DNA, sự biến đổi histone, định vị nucleosome, các RNA không mã hóa và sự biểu hiện chuyên biệt của microRNA[68] Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào sự methyl hóa DNA

I.4.2 Sự methyl hóa DNA

Sự methyl hóa DNA là một trong những biến đổi epigenetics được nghiên cứu nhiều nhất ở động vật có vú[69] Nhiều nghiên cứu cho thấy methyl hóa DNA đóng

vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý và bệnh lý ở động vật có vú: biểu hiện gen, phát triển của phôi thai, tăng sinh tế bào, biệt hóa, in dấu bộ gen, bất hoạt nhiễm sắc thể X và ổn định nhiễm sắc thể[46][53] Sự methyl hóa DNA thường xảy ra

ở base Cytosine (C) đứng trước base Guanosine (G) ở vùng điều hòa gen thuộc vùng promoter[4][46]

Sự methyl hóa DNA được xúc tác bởi nhóm enzym DNA methyltransferase, là phản ứng hóa học chuyển một nhóm methyl (CH3) từ S-adenosyl-methionine (SAM) đến

vị trí C5 của phân tử Cytosine tạo thành dạng 5-methylcytosine (5mC)[53]

Sự methyl hóa bất thường gồm có methyl hóa vượt mức (hypermethylation) và giải methyl hóa (hypomethylation) Sự methyl hóa vượt mức tại vùng đảo CpG thuộc vùng promoter của gen ức chế khối u dẫn đến sự ―im lặng‖ của các gen này Ngược

lại, sự giải methyl hóa tại vùng đảo CpG thuộc vùng promoter của các ―oncogene‖ dẫn đến kích hoạt sự biểu hiện của các ―oncogene‖, dập tắt cơ chế chết theo chương

trình của tế bào (hình 1.4)[87]

I.4.3 Đảo CpG

CpG là các cặp dinucleotide được hình thành bởi liên kết phosphodiester giữa cytosine và guanine Ở cơ thể người, các đảo CpG có kích thước trong khoảng 300-

3000 bp, tập trung ở đầu 5’ của các gen và thuộc 60% các vùng promoter của gen[4]

Hình 1.4: Sự methyl hóa bất thường trong ung thư [87]

I.5 Gen DAPK (Death-Associated Protein Kinase)

I.5.1 Vị trí, cấu trúc

Gene DAPK (Death-Associated Protein Kinase) định vị trên nhiễm sắc thể số 9 (hình 1.5) tại vị trí 9q21.33 bao gồm 29 exon và 28 intron Gen DAPK có kích

thước 211.407 bp, định vị ở nucleotide 87.497.228 đến 87.708.634 trên nhiễm sắc

thể số 9 Gen DAPK mã hóa protein DAPK, là nhân tố điều hòa dương cho cơ chế

chết theo chương trình của tế bào (apoptosis)[66][97]

I.5.2 Chức năng

Gen Death-associated protein kinase (DAPK) mã hóa cho enzyme kinase

Serine/Threonine được điều hòa bởi Calcium (Ca2+)/calmodulin (CaM) có cấu trúc chỉ khoảng 160 kD[96]

Enzym kinase Serine/Threonine tham gia vào nhiều đường tín hiệu tế bào kích hoạt

tế bào sống, cơ chế chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) và sự tự tiêu của tế bào (autophagy)[96][50]

Gen DAPK gián tiếp điều hòa apoptosis bằng cách kiểm soát con đường ổn định

protein (protein stability) và tình trạng phosphory hóa[92]

DAPK là một thành phần nội tại dọc theo con đường p19/MDM2/p53 và được kích

hoạt bởi oncogen c-Myc hoặc E2F-1 nhằm tạo ra apoptosis DAPK được

―up-regulated‖ bởi tín hiệu tăng sinh vượt mức và hoạt động ―upstream‖ của p19 và p53 dẫn đến sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) Sự bất hoạt hoặc giảm tín hiệu của DAPK sẽ làm giảm sự đáp ứng với c-Myc hoặc E2F-1, theo đó làm giảm hoạt động của p53 trong kìm hãm sự tăng trưởng của tế bào (hình 1.6)[66]

Hình 1.5: Vị trí gen DAPK trên NST số 9[96]

I.5.3 Sự methyl hóa trên gen DAPK

Nhiều công trình nghiên cứu tính đến năm 2015 cho thấy trạng thái methyl hóa trên

gen DAPK có liên quan đến nhiều loại ung thư như ung thư cổ tử cung, ung thư

phổi, ung thư dạ dày, ung thư bàng quang, ung thư bạch cầu, ung thư da, ung thư đại trực tràng và ung thư thận[77][6][18][19][24][45][56][91]

Công trình nghiên cứu của Narayan và cộng sự (2003) xác định tần suất methyl hóa

gen DAPK là 45,1%, tương ứng với 37/82 mẫu ung thư cổ tử cung[57]

Một công trình nghiên cứu của Jeong và cộng sự (2006) ghi nhận tính chất methyl

hóa vượt mức vùng promoter gen DAPK trên ung thư cổ tử cung Kết quả nghiên

cứu xác định tần suất methyl hóa ở mẫu mô ung thư cổ tử cung và mẫu mô cổ tử cung bình thường (mẫu lành) lần lượt là 44,9% (35/78 mẫu bệnh phẩm ung thư) và 4,2% (1/24 mẫu lành)[38]

Công trình nghiên cứu của Zhao và cộng sự (2008) khảo sát sự methyl hóa trên

vùng promoter thuộc gen DAPK trên 52 mẫu biểu mô ung thư cổ tử cung và 60 mẫu

ung thư biểu mô tại chỗ (cervical intraepithelial neoplasia, CIN) Công trình nghiên cứu xác định tần suất methyl hóa lần lượt là 65,4% (34/52) và 18,3% (11/60) Trong

khi đó, tất cả mẫu lành không có tính chất methyl hóa trên gen DAPK [91]

Công trình nghiên cứu của Tang và cộng sự (2000) nghiên cứu về sự methyl hóa

trên gen DAPK trên ung thư phổi không tế bào nhỏ (non-small cell lung carcinoma,

NSCLC) Trong tổng số 135 mẫu bệnh phẩm thuộc các bệnh nhân giai đoạn 1 đã

Hình 1.6: Chức năng của gen DAPK trong kiểm soát sự chết theo chương trình

của tế bào (apoptosis) [66]

trải qua phẫu thuật Kết quả nghiên cứu ghi nhận trạng thái methyl hóa vượt mức

xảy ra ở vùng promoter thuộc gen DAPK là 44% (59/135 mẫu bệnh phẩm)[78]

Năm 2015, công trình nghiên cứu của Almeida và cộng sự thực hiện nghiên cứu về

sự methyl hóa trên ung thư đại trực tràng Công trình được tiến hành trên 5 mẫu sinh thiết khối u của bệnh nhân ung thư đại trực tràng và 7 mẫu sinh thiết liền kề

khối u Kết quả cho tần số trạng thái methyl hóa gen DAPK ở hai trường hợp lần

lượt là 80% tương ứng với 4/5 trường hợp và 100% tương ứng với 7/7 trường hợp[6]

I.6 Phương pháp xác định tính chất methyl hóa DNA

I.6.1 Phương pháp MSP (Methylation - specific PCR)

Methylation – specific PCR (MSP) là phương pháp đơn giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép xác định tình trạng methyl hóa ở hầu hết đảo CpG thuộc vùng promoter trên từng gen[33]

 Nguyên tắc phản ứng MSP

Đầu tiên, DNA bộ gen được biến đổi bằng sodium bisulfite Sau quá trình biến đổi, Cytosine không bị methyl hóa (unmethylated cytosines) được chuyển đổi thành Uracil, trong khi đó Cytosines bị methyl hóa (5-methylcytosines) vẫn không bị thay đổi (hình 1.7, hình 1.8)[22]

Tiếp theo, phản ứng PCR thực hiện với hai cặp mồi: (1) một cặp mồi chuyên biệt cho DNA bị methyl hóa (M); (2) một cặp mồi chuyên biệt cho DNA không bị methyl hóa (U)

Để phân biệt trạng thái DNA methyl hóa hay DNA không bị methyl hóa thì trình tự mồi phải chứa nhiều hơn một cặp dinucleotide CpG Tuy nhiên, các cặp mồi methyl hóa (M) và không methyl hóa (U) có chứa vị trí CpG giống nhau nhưng vị trí khởi đầu khuếch đại (start point) và kích thước sản phẩm MSP có thể không giống nhau[43]

Kết quả MSP xác định các tình trạng methyl hóa: (a) methyl hóa hoàn toàn khi chỉ khuếch đại thành công sản phẩm PCR với cặp mồi methyl hóa (M); (b) không

methyl hóa khi chỉ khuếch đại thành công sản phẩm PCR với cặp mồi không methyl hóa (U); (c) methyl hóa không hoàn toàn khi khuếch đại thành công với cặp mồi M

và U [43] (hình 1.9)

Hình 1.7: Cơ chế chuyển đổi DNA bằng sodium bisulfite [22]

Hình 1.8: Sự biến đổi DNA gốc bằng sodium bisulfite

(Trình tự DNA gốc từ vùng promoter của gen RUNX3[43] )

Hình 1.9: Sơ đồ phương pháp Methylation-specific PCR (MSP) [43]

I.6.2 Phương pháp Nested-MSP

Phương pháp Nested-MSP là phương pháp MSP cải tiến, với độ nhạy cao gấp 50 lần so với phương pháp MSP truyền thống[43][61] Phương pháp Nested-MSP sử dụng hai bộ mồi trong ba phản ứng PCR riêng biệt[43] (hình 1.14) Trong phản ứng thứ nhất, cặp mồi đầu tiên khuếch đại đặc hiệu vùng trình tự mục tiêu bao quanh các

vị trí CpG (vị trí hot spot) Trình tự cặp mồi không chứa bất kỳ vị trí CpG, khuếch đại allele methyl hóa và allele không methyl hóa[43] Trong phản ứng này, DNA bản mẫu là DNA bộ gen được biến đổi bisulfite

Hai phản ứng PCR tiếp theo thuộc phản ứng MSP với DNA bản mẫu là sản phẩm phản ứng PCR thứ nhất Hai phản ứng PCR này được thực hiện riêng biệt với một cặp mồi đặc hiệu allele methyl hóa và một cặp mồi đặc hiệu allele không methyl hóa

Đầu tiên, một cặp mồi khuếch đại vùng trình tự bao phủ vùng trình tự đảo CpG mục tiêu trên DNA mạch khuôn, đó là DNA bộ gen đã được biến đổi bisulfite Sản phẩm PCR lần đầu là mạch khuôn trong hai phản ứng PCR tiếp theo: mỗi phản ứng PCR tương ứng lần lượt với cặp mồi M và cặp mồi U Hai cặp mồi M, U này chính là cặp mồi trong phản ứng MSP thông thường (hình 1.10)[43]

Hình 1.10: Sơ đồ phương pháp Nested-MSP [43]

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1 Vật liệu

Chúng tôi thu thập bộ mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào có tính chất nhiễm HPV hoặc không nhiễm HPV, nhiễm HPV type nguy cơ cao hoặc nguy cơ thấp do Công

ty cổ phần dịch vụ Phân tích di truyền cung cấp

II.2 Phương pháp nghiên cứu

II.2.1 Khảo sát dữ liệu

Dựa vào công cụ trực tuyến PubMed, PubMed Central (PMC) trên NCBI và công

cụ trực tuyến Google, chúng tôi thu thập bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa trên

vùng promoter gen DAPK trên bộ mẫu ung thư, điển hình là ung thư cổ tử cung và

bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV hoặc không nhiễm HPV, nhiễm HPV type nguy cơ cao hoặc nguy cơ thấp trên thế giới

Chúng tôi tổng hợp, xử lý và phân tích số liệu bằng phần mềm MedCalc phiên bản 16.4.3

Chúng tôi xác định mối tương quan giữa tính chất methyl hóa vùng promoter gen

DAPK và bệnh ung thư cổ tử cung bằng phần mềm Meta-analysis

II.2.2 Khảo sát in silico

II.2.2.1 Thu thập trình tự gen DAPK

Thu thập trình tự gen DAPK trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) và cơ sở dữ liệu GeneCards (http://www.genecards.org/)

II.2.2.2 Xác định vị trí đảo CpG và vị trí nhận biết nhân tố phiên mã trên vùng promoter thuộc gen DAPK

Công cụ tin sinh học:

- Methprimer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi): xác định vị trí đảo CpG trên vùng promoter của gen

- Gene Promoter Miner (http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/): xác định vị trí nhận biết nhân tố phiên mã trên vùng promoter của gen

II.2.2.3 Thu thập và khảo sát bộ mồi methyl và unmethyl phù hợp với phương pháp Nested-MSP

Dựa vào các công bố khoa học thực nghiệm xác định tính chất methyl hóa trên gen

DAPK, chúng tôi thu thập và khảo sát các cặp mồi phù hợp với phương pháp

Nested-MSP

Công cụ tin sinh học:

- Oligoanalyzer 3.1 (http://sg.idtdna.com/calc/analyzer): khảo sát các thông số vật

lý của các cặp mồi: chiều dài, kích thước sản phẩm, %GC, nhiệt độ nóng chảy

Tm (0C), cấu trúc kẹp tóc (Hairpin), cấu trúc tự bắt cặp (Self - dimer) và cấu trúc dị bắt cặp (Hetero - dimer)

- Annhyd 4.946: kiểm tra vị trí bắt cặp và kích thước sản phẩm khuếch đại của các

cặp mồi trên trình tự gen mục tiêu DAPK

- Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi): khảo sát độ tương đồng của các cặp

mồi với trên trình tự gen mục tiêu DAPK

II.2.2.4 Xử lý trình tự nucleotide đã giải trình tự

Công cụ tin sinh học:

- Chromas Lite 2.1: đọc và phân tích trình tự nucleotide sau khi có kết quả giải trình

tự sản phẩm gen DAPK

II.2.3 Khảo sát thực nghiệm

II.2.3.1 Tách chiết DNA bộ gen người

 Nguyên tắc

Trong quy trình tách chiết DNA bộ gen người từ các mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào, chúng tôi sử dụng chất tẩy sodium dodecyl sulfate và proteinase K để phá vỡ màng tế bào và màng nhân Sau đó, biến tính và loại bỏ protein bằng phương pháp phenol/chloroform Tiếp theo, chúng tôi thu tủa DNA bộ gen bằng dung dịch

ethanol 99% trữ lạnh và rửa tủa bằng dung dịch ethanol 70% Sau quá trình tách chiết, DNA bộ gen người được bảo quản trong nước cất hai lần vô trùng, trữ ở -20OC

- Bổ sung một thể tích phù hợp (500-700 µl) dung dịch ly giải, bao gồm: NaCl 5M, Tris-HCl 1M (pH=8), dung dịch đệm EDTA 0,5M (pH=8), SDS 10%, H2O cất hai lần và proteinase K (nồng độ 20 ng/ml), ủ mẫu trong trong 2 giờ, 480C

- Bổ sung một thể tích phù hợp của dung dịch phenol:chloroform (tỷ lệ 1:1) , trộn đều Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf mới

- Thêm một lượng dung dịch chloroform bằng thể tích dịch nổi thu được, đảo nhẹ

Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf mới (thể tích V1)

- Bổ sung một lượng Ammonium acetate 5M và một lượng Ethanol tuyệt đối theo

tỷ lệ 0,2: 2,5 thể tích V1

- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút, 40C Loại bỏ phần dịch nổi, thu tủa

- Bổ sung 500 µl Ethanol 70% Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, 40C

- Loại bỏ dịch nổi, thu tủa Để khô trong 30 phút

- Hòa tan DNA trong 30-50 µl nước cất hai lần vô trùng Bảo quản DNA ở 40C đến -200C

II.2.2.2 Phương pháp đo quang phổ kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch sản phẩm DNA

bộ gen người

 Nguyên tắc

Nguyên tắc dựa vào đỉnh hấp thụ mạnh ánh sáng ở mỗi bước sóng khác nhau của mỗi loại phân tử có cấu trúc khác nhau Nucleic acid có đỉnh hấp thu ánh sáng ở bước sóng 260 nm và protein có đỉnh hấp thu ánh sáng ở bước sóng 280 nm Một đơn vị OD260nm tương ứng nồng độ DNA sợi đôi = 50 (ng/µl), do vậy nồng độ DNA được tính theo công thức:

CDNA (ng/µl) = OD260nm x 50 x Độ pha loãng

Độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid (DNA bộ gen người) được xác định dựa vào tỷ số OD260nm/OD280nm =1,8-2

vị trí tương ứng trên trình tự DNA được biến đổi

 Hóa chất

- CT conversion reagent ( EZ1)

- M-Dilution buffer (EZ2)

- M-Dissolving buffer (EZ3)

- M-Binding buffer (EZ4)

- M-Wash buffer (EZ5)

- M-Desulphonation buffer (EZ6)

- M-Elution buffer (EZ7)

 Các bước tiến hành

- Chuẩn bị dung dịch biến đổi EZ1: Thêm 900 µl dung dịch nước cất 2 lần, 300 µl dung dịch EZ2 và 50 µl dung dịch EZ3 vào ống CT Conversion Reagent, trộn đều trong 10 phút

- Bổ sung 130 µl dung dịch CT Conversion Reagent (EZ1) vào 20 µl dung dịch DNA đã hút vào eppendorf 250 µl, trộn đều Sau đó đưa vào chu trình luân nhiệt như sau:

- Bổ sung 600 µl EZ4 vào cột Zymo-spinTMIC (C1), sau đó thêm dung dịch DNA (đã chạy chu trình nhiệt) vào cột C1, đảo trộn thật đều Sau đó, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm

- Bổ sung 100 µl EZ5 vào cột C1, ly tâm 13000vòng/ phút trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm

Hình 2.1: Chương trình luân nhiệt của quá trình biến đổi bisulfite

- Bổ sung 200 µl EZ6 vào cột C1, để nhiệt độ phòng 15-20 phút, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 30 giây Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm

- Bổ sung 200 µl EZ5 vào cột C1, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng (lặp lại 2 lần)

- Đặt cột C1 vào Eppendorf 1,5 ml, thêm 10 µl EZ7, ly tâm 13000 vòng/ phút trong

Trong phương pháp Nested-MSP, chúng tôi thực hiện ba phản ứng PCR riêng biệt:

- Phản ứng 1: phản ứng khuếch đại allele methyl hóa và allele không methyl hóa

- Phản ứng MSP, bao gồm hai phản ứng riêng biệt:

o Phản ứng đặc hiệu allele methyl hóa (phản ứng methyl hóa): tiến hành với một cặp mồi chuyên biệt cho DNA bị methyl hóa (M)

o Phản ứng đặc hiệu allele không methyl hóa (phản ứng không methyl hóa): tiến hành với một cặp mồi chuyên biệt cho DNA không bị methyl hóa (U)

Chú thích: T a : nhiệt độ lai tối ưu; x: số chu trình luân nhiệt

II.2.2.5 Phương pháp điện di

 Nguyên tắc

Kỹ thuật điện di nhằm phân tách các phân tử nucleic acid dựa vào sự di chuyển về phía điện cực trái dấu của các phân tử tích điện trong điện trường ở trạng thái pha lỏng Các nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm, trong điện trường các phân tử DNA sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường

Hình 2.2: Chu trình luân nhiệt cho phản ứng Nested-MSP [38][35]

Kỹ thuật điện di nucleic acid thường được tiến hành trên gel agarose hoặc gel acrylamid cho phép các phân tử nucleic acid di chuyển qua Bản gel được đặt trong môi trường tích điện, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng và cấu trúc DNA Các phân tử DNA được phát hiện trên gel agarose nhờ Ethidium bromide (EtBr) dưới tia tử ngoại Chất EtBr có khả năng chèn vào base của phân tử nucleic acid và phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia tử ngoại thích hợp

poly-Quá trình điện di cần phải có thang DNA chuẩn là hỗn hợp gồm nhiều đoạn DNA

có kích thước xác định Dựa vào kích thước đã biết trên thang chuẩn và vị trí của chúng trên bản gel để xác định kích thước của các đoạn phân tử mục tiêu

 Hóa chất

- Dung dịch TAE (Tris-acetate-EDTA) 25X

- Agarose

- Ethidium bromide

- Dung dịch loading dye

- Thang DNA chuẩn (50 bp)

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

III.1 Kết quả khai thác dữ liệu

III.1.1 Bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK trên các loại ung thư

III.1.1.1 Các loại ung thư được nghiên cứu về tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK

Bằng cách khai thác nguồn cơ sở dữ liệu (PubMed) trên NCBI và Google, chúng tôi

đã thu thập đƣợc các công trình nghiên cứu liên quan đến gen DAPK Với các từ

khóa ―DAPK gene‖, ―promoter methylation of DAPK gene‖, ―methylation of DAPK gene and cancer‖, ―cervical cancer‖, ―lung cancer‖,…chúng tôi đã thu thập đƣợc 40 công trình nghiên cứu bằng tiếng Anh (bảng 3.1) Trong đó, 3 bài báo khoa

học cung cấp các kiến thức tổng quan (mô tả đặc điểm, chức năng gen DAPK) và 37 công bố khoa học khảo sát tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK ở

các loại ung thƣ nói chung và ung thƣ cổ tử cung nói riêng

Bảng 3.1: Bộ dữ liệu tài liệu khoa học về gen DAPK

Chúng tôi ghi nhận có nhiều công trình nghiên cứu về tính chất methyl hóa vượt

mức của gen DAPK trong nhiều loại ung thư khác nhau (hình 3.3) Tuy nhiên, trong

bài báo cáo này, chúng tôi tập trung tìm hiểu các công bố khoa học liên quan đến sự

xác định tần suất methyl hóa gen DAPK trong tổng số 8 loại ung thư thường gặp:

ung thư cổ tử cung (CC) (18/37), ung thư phổi (LC) (9/37), ung thư dạ dày (GASC) (4/37), ung thư bàng quang (BLC) (3/37), ung thư bạch cầu (LEUC) (2/37), ung thư buồng trứng (OVC) (1/37), ung thư đại trực tràng (COLC) (2/37) và ung thư thận (KIDC) (2/37)

III.1.1.2 Phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để nghiên cứu về tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK

Dựa vào tài liệu thu thập được, chúng tôi ghi nhận có nhiều phương pháp sinh học phân tử như phương pháp MSP, QMSP hay Nested-MSP được sử dụng để xác định

tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK (hình 3.1) ở các loại ung thư

Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy phương pháp MSP là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất (83,3%) trong các công trình nghiên cứu chúng tôi khảo sát Điều này phần nào cho thấy phương pháp MSP là công cụ sinh học phân tử đắc lực trong việc

xác định tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu, cụ thể là gen DAPK

Hình 3.1: Đồ thị mô tả các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để

khảo sát tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK

Chú thích: BLC (Bladder cancer): ung thư bàng quang; CC (Cervical cancer):

UTCTC; COLC (Colorectal cancer): ung thư đại trực tràng; GASC: (Gastric cancer): ung thư dạ dày; KIDC (Kidney cancer): ung thư thận; LC (Lung cancer): ung thư phổi; LEUC (Leukemia cancer): ung thư bạch cầu; OVC (Ovarian cancer):

ung thư buồng trứng

III.1.1.3 Các loại mẫu được sử dụng để khảo sát tính chất methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK

Tùy thuộc vào loại ung thƣ trong từng công trình nghiên cứu, các nhóm tác giả có cách thức lấy mẫu khác nhau và cách lựa chọn mẫu khác nhau Tuy nhiên dựa vào kết quả khảo sát các công trình nghiên cứu ở hình 3.2, chúng tôi ghi nhận thấy mẫu

mô đƣợc sử dụng phổ biến nhất (60,0%) trong các công trình nghiên cứu chúng tôi khảo

Chú thích: BLC (Bladder cancer): ung thư bàng quang; CC (Cervical cancer):

UTCTC; COLC (Colorectal cancer): ung thư đại trực tràng; GASC: (Gastric cancer): ung thư dạ dày; KIDC (Kidney cancer): ung thư thận; LC (Lung cancer): ung thư phổi; LEUC (Leukemia cancer): ung thư bạch cầu; OVC (Ovarian cancer): ung thư buồng trứng

Hình 3.2: Đồ thị mô tả các loại mẫu đƣợc sử dụng trong khảo sát tính chất

methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK

III.1.1.4 Tần suất methyl hóa gen DAPK trong các loại ung thư

Kết quả hiển thị ở hình 3.3 cho thấy tần suất methyl hóa gen DAPK xuất hiện trong

từng loại ung thƣ khác nhau dao động ở khoảng 24% - 64%, kết quả phân tích có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Chúng tôi ghi nhận tần suất tính chất methyl hóa trung

bình có trọng số trên gen DAPK xấp xỉ hơn 50% ở một số bệnh lý: ung thƣ dạ dày,

và ung thƣ thận Bên cạnh đó, tần suất methyl hóa trung bình có trọng số trên gen

DAPK vào khoảng hơn 60% ở ung thƣ bàng quang

Chú thích: : Tần suất methyl hóa trung bình có trọng số; : Tần suất

methyl hóa trong một công trình nghiên cứu; BLC (Bladder cancer): ung thư bàng

quang; CC (Cervical cancer): UTCTC; COLC (Colorectal cancer): ung thư đại trực tràng; GASC: (Gastric cancer): ung thư dạ dày; KIDC (Kidney cancer): ung thư thận; LC (Lung cancer): ung thư phổi; LEUC (Leukemia cancer): ung thư bạch cầu; OVC (Ovarian cancer): ung thư buồng trứng

Hình 3.3: Đồ thị khảo sát các loại ung thƣ liên quan đến tính chất methyl

hóa vùng promoter trên gen DAPK