Bài thuyết trình về: "Alkali and Halotolerant Catalase from Halomonas sp. SK1: Overexpression in Escherichia coli, Purification, Characterization, and Genetic Modification"

Biểu hiện vượt mức catalase có khả năng chịu muối và chịu kiềm có nguồn gốc từ Halomonas trên vi khuẩn E.coli, tinh sạch, xác định đặc tính và biến đổi di truyềnMỤC TIÊU NGHIÊN CỨUTỪ KHÓATỔNG QUANIV. NỘI DUNG – KẾT QUẢBiểu hiện vượt mức catalase có khả năng chịu muối và chịu kiềm có nguồn gốc từ Halomonas trên vi khuẩn E.coli, tinh sạch, xác định đặc tính và biến đổi di truyềnTừ khóa Alkali and halotolerance CatalaseHalomonasOverexpressionEscherichia coli UM2Genetic modificationCatalaseBản chất hóa học: là enzyme chống oxi hóa trong hệ thống bảo vệ tế bào. 2H2O2 2 H2O + O2Catalases điển hình: 200 – 340 kDa.Có vai trò trong quá trình hô hấp đối với hầu hết sinh vật, có cấu trúc tứ phân với 4 tiền chất.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

 - 

Môn học: Những vấn đề vi sinh hiện đại

Chủ đề: Alkali- and Halo-tolerant Catalase from

Halomonas sp SK1: Overexpression in Escherichia coli, Purification, Characterization,

and Genetic Modification

Biosci Biotechnol Biochem 68(4): 814-9 (2004)

Le Huyen Ai Thuy, Krisana Phucharoen, Akira Ideno, Tadashi Maruyama and Takao

Shinozawa

GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy

Th.S Lao Đức Thuận Th.S Trương Kim Phượng.

I MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU II.TỪ KHÓA

III.TỔNG QUAN

IV NỘI DUNG – KẾT QUẢ

I MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Biểu hiện vượt mức catalase có khả

năng chịu muối và chịu kiềm có

nguồn gốc từ Halomonas trên vi

khuẩn E.coli, tinh sạch, xác định đặc

tính và biến đổi di truyền

Catalase

2 Halomonas sp SK1

− Trực khuẩn, Gram (-).

− Thích nghi trong điều kiện hiếu khí tùy nghi.

− Có khả năng sinh trưởng dưới điều kiện nồng

độ muối cao và kiềm cao

− Có hoạt tính tổng hợp catalase điển hình.

3 Escherichia coli UM2

− Khuyết gen catalase do đột biến trên

gene katE và gene katG.

− Gene katE và gene katG lần lượt mã hóa

cho gene kháng ampicillin và kanamycin.

4 Chaperone

+ Chuỗi polypeptide tương tác, thúc đẩy sự

gấp cuộn của protein.

+ Phân loại chaperone dựa vào trọng lượng

phân tử.

+ Ngoài ra, chaperone còn có vai trò trong lắp ráp các phân tử phức tạp, hỗ trợ các protein

tạo hình sai hoặc kết tụ được tái gấp cuộn,…

(Yujin E Kim, Mark S Hipp, Andreas Bracher, Manajit Hayer-Hartl, and F Ulrich Hartl 2013

Molecular Chaperone Functions in Protein Folding and Proteostasis Annual Review of Biochemistry

82:323–55.)

a Gen mục tiêu oHktA

(Original Alkali- and Halo-tolerant Catalase)

- Có nguồn gốc từ vi khuẩn Halomonas sp SK1.

- Gen mã hóa cho catalase điển hình oHktA (57.8 kDa)

- Đặc tính của oHktA: nhạy với nhiệt, mất hoạt tính ở 370C trong 5 phút.

b Dòng tế bào chứa gen mục tiêu

- Plasmid pKK223- 3

- Plasmid pET21a +

- Plasmid pACYC184

c Hệ thống vector

Plasmid pKK223- 3

(Amersham Pharmacia Biotech, USA)

• tac_promoter: 43-71

• EcoRI (G▼AATTC): 4584-3

• HindIII(A▼AGCTT) 4554-4559

Plasmid pET21a +

(Novagen )

Plasmid pACYC184

(Nippon Gene, Tokyo, Japan)

• SalI: 2146-2151 (G▼TCGAC)

• SphI: 2057-2062 (GCATG▼C)

d Dòng tế bào chủ

Vi khuẩn Escherichia coli UM2

(Giáo sư C P Loewen, Đại học Manitoba, Canada)

- Nuôi cấy trong môi trường 2xYT, pH=11, nhiệt độ 37C, điều kiện hiếu khí trong 8- 16h.

6 Kỹ thuật tạo dòng

gen/

- Protein được biến tính bằng SDS

 Xác định trọng lượng phân tử của protein.

Hình:Bộ điện di SDS-PAGE

https://ww2.chemistry.gatech.edu/~lw26/bCourse_Information/4581/tec hniques/gel_elect/page_protein.html

8 NATIVE – PAGE

(NATIVE– Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

- Là phương pháp điện di một chiều trên

gel Polyacrylamide, pH = 8.8.

- Protein không bị biến tính.

- Xác định trọng lượng phân tử; kiểm tra thành phần và cấu trúc của protein.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Thiết lập plasmid biểu hiện oHktA.

Thu nhận gDNA của Halomonas sp SK1

Phản ứng PCR khuếch đại oHktA với cặp mồi hkt1 và

hkt2 (sản phẩm PCR:1530 bp)

Phản ứng cắt sản phẩm PCR và pKK223-3 bằng EcoRI và HindIII

Phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp pKK223-3 –oHktA

Điện biến nạp vector tái tổ hợp pKK223-3 –oHktA vào

tế bào vi khuẩn E.coli UM2

Nuôi cấy/Sàng lọc trên môi trường thạch 2xYT (pH= 7.4)

bổ sung ampicillin

Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm và ly tâm thu dịch nổi

Ly tâm thu nhận tế bào.

Huyền phù hóa trong dung dịch đệm A

Nuôi cấy, sàng lọc và thu nhận oHktA

Nuôi cấy hệ thống tế bào E.coli UM2 mang vector tái tổ hợp

pKK223-3 –oHktA có/hoặc không có IPTG, trong 6h, ở 37C

Tinh sạch oHktA bằng phương pháp sắc kí cột DEAE-Toyopearl

và Chelating-Sepharose Fast Flow.

Các phân đoạn protein được phân tích bằng phương pháp

SDS-PAGE và xác định hoạt tính bằng phương pháp

Native-PAGE *

Kết quả thu nhận oHktA tái tổ hợp bằng

SDS - PAGE

+ Lane 1: Thang phân tử trọng lượng thấp + Lane 2: Protein ở phân đoạn nổi (10.0 µg protein/lane) của E coli UM2/pKK223-3- ohktA ( có chất cảm ứng IPTG )

+ Lane 3: Protein tổng số (12.0 µg protein/lane) từ E coli UM2/pKK223-3- ohktA ( không có chất cảm ứng IPTG ) + Lane 4: Protein tổng số (12.0 µg protein/lane) từ E Coli UM2/pKK223-3 + Lane 5: Protein ở phân đoạn lắng (12.0 µg protein/lane) của E coli UM2/pKK223-3- ohktA ( có chất cảm ứng IPTG )

+ Lane 6: Phân đoạn dòng chảy từ cột DEAE-Toyopearl (9.0 µg protein/lane) + Lane 7: Phân đoạn rửa giải với 10 m M

imidazole từ cột Chelating-Sepharose Fast

Flow (3.2 µg protein/lane)

Kết quả tinh sạch oHktA tái tổ hợp trong

hệ thống tế bào E.coli UM2

Phân đoạn Protein

tổng (mg)

Hoạt tính tổng (U)

Hoạt tính riêng (U/

mg của protein)

Năng suất (%)

Tinh sạch (Fold)

Chiết xuất thô 146 63.0 x 104 4.30 x 103 100 1.0

=> Phân đoạn qua cột Chelating – Sephalose Fast Flow cho

độ tinh sạch cao nhất, gấp 18 lần chiết xuất thô.

Kết quả phân tích hoạt tính catalase tái tổ hợp oHktA

bằng Native-PAGE

A Nhuộm CBB (Coomassie Brilliant Blue)

Giếng 1: Thang phân tử có trọng lượng cao Giếng 2: Chiết suất thô (30.0 μg g

protein/giếng).

Giếng 3: Phần rửa giải với 10mM imidazole

từ cột sắc ký Chelating-Sepharose Fast Flow (3.0 μg g protein/giếng).

B Nhuộm xác định hoạt tính catalase.

Giếng 1: Thang phân tử có trọng lượng cao, bao gồm catalase có nguồn gốc từ gan bò 232kDa (BLC)

Giếng 2: Chiết suất thô (0.5 μg g protein/giếng) Giếng 3: Phần rửa giải với 10mM imidazole

từ cột sắc ký Chelating-Sepharose Fast Flow (0.06 μg g protein/giếng)

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của

catalase oHktA tái tổ hợp

Hoạt tính của oHktA

370C, 400C hoặc 550C trong 5 phút Giảm đáng kể

Hoạt tính của catalase tái tổ hợp oHktA

(So sánh với enzyme hoang dại HktA)

2 Biến đổi đặc tính di truyền để tạo catalase tái

Tinh sạch – Phản ứng nối tạo thành cHktA

Phản ứng cắt cHktA và pKK223-3 bằng EcoRI và HindIII

Tinh sạch – Phản ứng nối thành vector tái tổ hợp pKK223 - chktA

Phản ứng PCR PhFKBP29 từ Pyrococcus horikoshii

Phản ứng cắt sản phẩm PCR và pET21a+ bằng NedI và HindII

Phản ứng nối tạo thành vector pEPhFK-1

Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen chứa pEPhFK-1*

Cắt sản phẩm PCR và plasmid pACYC184 bằng SphI và SalI

Phản ứng nối tạo thành vector pACPhFK-1

Biến nạp vào tế bào E.coli UM2 mang vector pKK223-chktA

Sàng lọc trên môi trường 2xYT, pH=7.4

bổ sung ampicillin (100 g/ml) và chloramphenicol (100 g/ml)

Kết quả sắp gióng cột trình tự acid amin của oHktA với

cHktA, VktA (Vibrio rumoiensis S-1), HP II (E.coli), PVC

(Penicillium janthinell)

=> cHktA ổn định nhiệt hơn

oHktA

Kết quả phân tích tính chịu nhiệt của

cHktA và oHktA

+ Vùng domain đầu N- kéo dài đến β – barrel

Phân tích cấu trúc không gian 3 chiều của

pKK223-3 – oHktA bằng phần mềm 3D-PSSM

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Phucharoen, K., Hoshino, K., Takenaka, Y., and

Shinozawa, T., Purification, characterization, and

gene sequencing of a catalase from an alkali- and

halo-tolerant bacterium, Halomonas sp SK1 Biosci Bio-technol Biochem., 66, 955–962 (2002)

2 Ideno, A., Furutani, M., Iba, Y., Kurosawa, Y., and Maruyama, T., FK506 binding protein from the

hyper-thermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii suppresses the aggregation of proteins in Escherichia coli Appl.Environ Microbiol , 68, 464–469 (2002)

3 Molecular Chaperone Functions in Protein

Folding and Proteostasis.Yujin E Kim, Mark S

Hipp, Andreas Bracher, Manajit Hayer-Hartl, and

F Ulrich Hartl Annu Rev Biochem 2013 82:323– 55.

4 This second printing of the 10th edition of the

pET Manual was published May, 2003 Please check the Novagen website, www.novagen.com.

5 The Bradford Method for Protein Quantitation

Nicholas J Kruger The Protein Protocols

Handbook, 2nd Edition

• https://www.addgene.org/mol-bio-reference/plasm id-background/

• http://richsingiser.com/4402/Novagen%20pET%2 0system%20manual.pdf

Exp.pdf

.bioresource/files/document/vector/226410/c183-0 01.pdf

CẢM ƠN THẦY CÔ VÀ

CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE