Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB 534 dạng đột biến

Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB534 dạng đột biến phục vụ cho nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố của vi khuẩn tụ cầu. Nhận làm thuê slide cực đẹp, chuyên nghiệp, giá cực rẻ và nhanh chóng tại Hà Nội: 0966.839.291. Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Tài Nguyên Và Môi Trường. Nhận đào tạo về Office và Powerpoint.

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

IPTG Isopropylβ-D-1thiogalactopyranosideD-D-1thiogalactopyranoside1thiogalactopyranoside

MHC II Major histocompatibility complex II

S aureus Staphylococcus aureus

TEMED N,N,N’,N’tetramethylethylenediamine

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Danh mục các hóa chất chính 11

Bảng 2.2: Công thức pha gel tách (12%) 14

Bảng 2.3: Công thức pha gel cô (5%) 14

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh tụ cầu vàng staphylococcus aureus 4

Hình 1.2: Cấu trúc tinh thể của protein seb 6

Hình 3.1 Điện di kết quả protein mtseb534 trước tinh sạch 17

Hình 3.2 Điện di kết quả tinh sạch protein mtseb534 tái tổ hợp 18

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1.Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B tại Việt Nam và trên thế giới 2

1.2 Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus và độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B 3

1.2.1 Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 3

1.2.2 Độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B 4

1.3 Các phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp 6

1.3.1 Kỹ thuật lọc 7

1.3.2 Kỹ thuật sắc ký 7

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 11

2.1.1 Vật liệu 11

2.1.2 Các bộ kít 11

2.1.3 Hóa chất, máy móc và thiết bị sử dụng 11

2.2 Phương pháp nghiên cứu 12

2.2.1 Phương pháp tinh sạch protein 12

2.2.2 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 14

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16

KẾT LUẬN 19

KIẾN NGHỊ 19

TÀI LIỆU THAM KHẢO 20

MỞ ĐẦU

Thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn chứa các chất

có tính độc hại đối với người ăn là một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biếntrên toàn cầu Trong các vụ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn tụ cầu vàng

(Staphylococcus aureus) là nguyên nhân chủ yếu gây ra ngộ độc Người bị ngộ độc

thực phẩm có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu, có thể do tiếp xúc trực tiếpvới tụ cầu qua các vết thương hở hoặc cũng có thể do tụ cầu vốn cư trú ở đường ruột

chiếm ưu thế về số lượng Độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B (SEB) bền với nhiệt là tác nhân chính thường gặp trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S aureus gây

nên

Hiện nay, việc phòng và điều trị bệnh ngộ độc thực phẩm do tụ cầu còn gặp rấtnhiều khó khăn vì không phát hiện kịp thời tác nhân gây bệnh Chính vì vậy, việc xácđịnh sự có mặt SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm là vấn đề thật sự cần thiết.Trên thế giới và tại Việt Nam hiện nay cũng đã phát triển các loại kít phát hiệnnhanh tác nhân gây bệnh dựa trên nguyên tắc liên kết miễn dịch, phương pháp nàyđòi hỏi cần có kháng thể đặc hiệu Do vậy việc tinh sạch kháng nguyên SEB tái tổhợp không có độc tính, có khả năng gây đáp ứng miễn dịch tạo các kháng thể IgG đặchiệu là cấp thiết

Để phục vụ cho nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố của vi khuẩn

tụ cầu, chúng tôi tiến hành: “Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB534 dạng đột biến”.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố ruột

Staphylococcal enterotoxin B tại Việt Nam và trên thế giới

Tuy thời gian gây bệnh ngắn nhưng những vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu đểlại hậu quả không nhỏ Theo đánh giá của tổ chức Y tế thế giới, hàng năm Việt Nam

có khoảng trên 3 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại trên 200 triệu USD Trongnhững năm gần đây số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta ngày càng gia tăng

Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ của Cục An toàn vệ sinh Thực phẩm từ đầutháng 4/2012, cả nước đã xảy ra 10 vụ ngộ độc thực phẩm làm 972 người mắc, trong

đó có 726 người phải nhập viện và đã có 4 trường hợp tử vong Phần lớn các vụ ngộđộc là do thực phẩm nhiễm vi sinh vật Điển hình như vụ ngộ độc tập thể xảy ra trongmột đám cưới ngày 12/4/2012 tại bản Hùn, xã Chiêng Cọ, thành phố Sơn La do thực

phẩm nhiễm vi khuẩn Staphylococcus areus làm hơn 300 người mắc và phải nhập

viện cấp cứu Một vụ ngộ độc tập thể khác xảy ra ngày 16/4/2012 khiến hơn 200công nhân của Công ty DreamMeKong thuộc xã An Cư, huyện Cái Bè, tỉnh TiênGiang bị ngộ độc [ 8]

Theo báo cáo của Cục An toàn Thực phẩm, trong năm 2014 (tính đến ngày15/12), toàn quốc ghi nhận 189 vụ ngộ độc thực phẩm với hơn 5.100 người mắc,4.100 người đi viện và 43 trường hợp tử vong Nếu so với năm 2013, số người mắc

và đi viện do ngộ độc thực phẩm năm 2014 có giảm nhưng số vụ tăng hơn 13%, đặcbiệt số người tử vong tăng gần 54% (tăng thêm 15 người) [9]

Ngộ độc thực phẩm không chỉ xảy ra ở nước ta mà còn xảy ra ở nhiều nước trênthế giới kể cả những nước phát triển Ở Mỹ, mỗi năm có khoảng 76 triệu ca ngộ độcthực phẩm với 325.000 người phải vào viện và 5.000 người chết Trung bình cứ1.000 dân có 175 người bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm và chi phí cho 1 ca ngộ độcthực phẩm mất 1.531 đôla Mỹ (US -D-1thiogalactopyranoside FDA 2006) Nước Úc có Luật thực phẩm từ năm

1908 nhưng hiện nay mỗi năm vẫn có khoảng 4,2 triệu ca bị ngộ độc thực phẩm vàcác bệnh truyền qua thực phẩm, trung bình mỗi ngày có 11.500 ca mắc bệnh cấp tính

do ăn uống gây ra và chi phí cho 1 ca ngộ độc thực phẩm mất 1.679 đôla Úc Ở Anh

cứ 1.000 dân có 190 ca bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm và chi phí cho 1 ca ngộ độcthực phẩm mất 789 bảng Anh Tại Nhật Bản, vụ ngộ độc thực phẩm do sữa tươi giảmbéo bị ô nhiễm tụ cầu vàng tháng 7/2000 đã làm cho 14.000 người ở 6 tỉnh bị ngộ độcthực phẩm Công ty sữa SNOW BRAND phải bồi thường cho 4.000 nạn nhân mỗingười mỗi ngày 20.000 yên.Tại Hàn Quốc, tháng 6 năm 2006 có 3.000 học sinh ở 36trường học bị ngộ độc thực phẩm [ 10]

Đầu năm 2015, cơ quan Kiểm tra và an toàn thực phẩm của bộ Nông nghiệp Mỹcông bố công ty Murr của Lebanon, PA bị thu hồi khoảng 31,689 sản phẩm gà tẩmbột gluten-D-1thiogalactopyranosidefree có thể bị nhiễm nội độc tố của khuẩn tụ cầu.[11]

Ngộ độc thực phẩm bởi độc tố của Staphylococcus aureus là một căn bệnh phổ

biến có tỷ lệ nhiễm khá cao ở Việt Nam và trên toàn thế giới Trên thực tế, bệnh làmmất nhiều thời gian và năng suất của nhân viên cũng như tốn kém kinh phí cho điềutrị tại bệnh viện Hơn thế, bệnh cũng gây thiệt hại đáng kể về kinh tế trong ngànhcông nghiệp thực phẩm, các công ty cung cấp thực phẩm và nhà hàng Do đó, việc

kiểm soát ngộ độc thực phẩm bởi độc tố của S aureus đóng vai trò quan trọng đối với

vấn đề sức khỏe của con người, kinh tế và xã hội

1.2 Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus và độc tố ruột Staphylococcal

enterotoxin B

1.2.1 Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus

Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Cocci, bộ

Bacillales, họ Staphylococcaceae, chi Staphylococcus, loài Staphylococcus aureus.

Dựa vào phương diện gây bệnh, người ta chia tụ cầu khuẩn thành hai nhómchính: tụ cầu có men coagulase và tụ cầu không có men coagulase Nhờ có mencoagulase mà trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màuvàng Do vậy vi khuẩn này còn gọi là tụ cầu vàng

Tụ cầu (“Staphylococcus” bắt nguồn từ tiếng Hy lạp, với “staphyle” có nghĩa là

chùm nho) là vi khuẩn gram dương, có hình cầu, đường kính khoảng 0,8-D-1thiogalactopyranoside1 µm, có thể

đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không đều giống như chùmnho (hình 1.1)

Hình 1.1: Hình ảnh tụ cầu vàng Staphylococcus aureus

(<www.biotox.cz/ /staphylococcus_aureus_1s.jpg>)

Đây là loại vi khuẩn không di động, không có lông, cầu khuẩn Staphylococcus aureus (S aureus) không có khả năng tạo bào tử như các vi khuẩn Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum và Bacillus cereus cũng thường được tìm

thấy trong các thực phẩm nhiễm khuẩn, và thường không có vỏ [6]

Dựa theo các nghiên cứu và các báo cáo khoa học: Tụ cầu S aureus sản sinh ra

11 độc tố bao gồm cả độc tố ruột (enterrotoxin) – trong đó có SEB là một trongnhững nhóm độc tố được liệt kê trong danh mục vũ khí sinh học dùng để tấn côngkhủng bố sinh học và chiến tranh sinh học…và 20 độc tố ruột (từ SEA đến SEE, từSEG đến SER và SEU) [1, 4]

1.2.2 Độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B

Staphylococcal enterotoxin B (SEB) là một trong các độc tố ruột được sản sinh

ra bởi Staphylococcus aureus Nó là một trong những độc tố gây nên ngộ độc thực

phẩm do tụ cầu ở con người và đã được sản xuất bởi một số quốc gia như là một vũkhí sinh học Khi bị lây nhiễm vào cơ thể, SEB sẽ tác động chủ yếu lên các hệ thốngvận chuyển ion và nước của ruột, do đó được gọi là enterotoxin (độc tố ruột)

SEB là một hợp chất tương đối bền vững trong môi trường cũng như trong thựcphẩm, có thể dễ dàng hòa tan trong nước, chịu biến động nhiệt độ và có thể chịu được

sôi ở 100oC trong vài phút Khuẩn tụ cầu enterotoxin B đã được các nhà khoa họcnghiên cứu chi tiết SEB được thanh lọc đồng nhất và bao gồm 239 axit amin trongmột chuỗi polypeptide đơn với trọng lượng phân tử 28336 kDa, SEB có sự tươngđồng cao với SEC1, cũng bao gồm 239 axit amin [7] Giống như các cấu trúc protein

ngoại bào khác của S aureus thường được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy hay

trong thực phẩm bị ô nhiễm, protein SEB bao gồm một trình tự tín hiệu (signalpeptide) gồm 27 axit amin ở đầu N’ Đoạn trình tự tín hiệu này có chức năng “dẫn”SEB tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ bị cắt bởi protease ở vịtrí nhất định Ở dạng hoạt động protein SEB có cấu trúc gồm: 7 cấu trúc xoắn α, 14phiến gấp nếp β và một cầu nối disulphit nối cystein ở vị trí 120 và 140

Đoạn gen seb được phân lập từ các chủng S aureus ở nhiều vùng địa lý khác

nhau và đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu chi tiết Trong nghiên cứu này,

chúng tôi chọn nhân đoạn gen seb có chiều dài 534 bp thay vì đoạn gen seb có kích

thước 720 bp như tác giả Korolev, Savransky và nhiều tác giả trên thế giới đã công

bố là vì đoạn gen seb dài (720 bp) sau khi tạo kháng thể đơn dòng sẽ gặp khó khăn hơn trong việc gắn lên que thử ở giai đoạn sau này, còn đoạn gen seb (534 bp) là lựa

chọn tối ưu nhất, nó thỏa mãn cả hai điều kiện là giữ nguyên vị trí epitop (tức là đảmbảo phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể, cấu hình không gian) và thuận lợihơn trong việc tạo kháng thể đơn dòng gắn lên que thử SEB chỉ thiếu các vị trí bámcủa kẽm so với các siêu kháng nguyên Staphylococcal enterotoxin A, C2 và D chỉ cómột vị trí bám trên phân tử MHC nhóm II Phân tích chi tiết vị trí bám trên TCR củacác kháng nguyên SEA, SEB và SEC2 sẽ chỉ ra sự khác biệt dẫn tới hiệu quả bám lên

vùng Vβ Protein SEB có cấu trúc nhỏ gọn tạo khả năng đề kháng tốt với protease

trong ruột bao gồm trypsin, chymotrypsin, papain (hình 1.2) [3]

Hình 1.2: Cấu trúc tinh thể của protein SEBNguồn: [http://www.pdb.prg/pdb/explore.do?structureId=3SEB.]

Staphylococcal enterotoxin B (SEB) kích thích miễn dịch ở cơ thể vật chủ tạo ramột lượng lớn interleukin I và II SEB được xem là một siêu kháng nguyên của vikhuẩn vì có thể tạo thành một cầu nối giữa MHC lớp II của các tế bào trình diệnkháng nguyên và vùng Vβ của các thụ thể tế bào T như: CD4, CD7 Từ đó kích thíchhoạt hóa các tế bào T biểu hiện các đoạn gen Vβ mà không cần thiết phải có một quátrình chế biến và trình diện thông thường Các siêu kháng nguyên có khả năng kíchhoạt các tế bào Lympho T lớn hơn rất nhiều lần so với kháng nguyên thông thường.Kết quả của quá trình tương tác là sản sinh ra một số lượng lớn của cytokine vàinterleukin (IL-D-1thiogalactopyranoside2), các yếu tố hoại tử khối u beta (TNF-D-1thiogalactopyranosidebeta) và các interferon Nếu

ăn thực phẩm có SEB bệnh nhân có các triệu trứng như: chán ăn, buồn nôn, tiêuchảy…Các triệu trứng này xuất hiện là do các cytokine trong các tế bào T của lôngruột được sinh ra ồ ạt

1.3 Các phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp

Trong dịch chiết thô thu được ngoài protein quan tâm còn có các protein tạp, cácchất cao phân tử khác như polysaccharid, acid nucleic và các chất phân tử nhỏ nhưđường monose, các chất lipid, muối khoáng…Để loại bỏ chúng phải sử dụng phốihợp nhiều biện pháp khác nhau

Dựa vào các tính chất của protein như tính phân ly đẳng điện, tính chất bề mặt(protein có thể hấp thụ, hấp phụ trên các chất mang khác nhau nhờ đó protein có thểđược phân tách nhờ sắc ký ái lực), kích thước phân tử Thông thường sử dụng các kỹthuật để tinh sạch protein như kĩ thuật lọc và kĩ thuật sắc kí [2].

1.3.1 Kỹ thuật lọc

Protein là cao phân tử, do vậy các phương pháp phân tách protein sử dụng mànglọc phân tử khá hữu hiệu Tuy nhiên các phương pháp này chỉ sử dụng được đối vớicác nguồn protein động vật trong dung dịch sinh lý như sữa, máu, huyết thanh màkhông áp dụng được với các protein thực vật do chúng thường nằm trong phức hợppolyme khác Kỹ thuật này được thực hiện nhờ một màng bán thấm hoặc màng lọcphân tử Dung dịch protein được phân làm 2 pha, một pha không đi qua màng lọcchứa các cao phân tử trong đó có protein, pha còn lại đi qua màng lọc chứa các phân

tử có kích thước nhỏ hơn như glucid đơn giản, peptid, muối

1.3.2 Kỹ thuật sắc ký

Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì

nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngaycho việc định lượng và định danh.Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp đượcứng dụng nhiều nhất là sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (size exclusionchromagraphy), sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích của phân tử (ion exchangechromagraphy), sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác(affinity chromagraphy) và sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước của phân tử nhưng

có độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquid chromagraphy)

-D-1thiogalactopyranoside Sắc ký lọc gel: Phương pháp này tốt hơn các phương pháp trên vì nó dựa vào

kích thước phân tử Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từpolymer không tan nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạngcabohydrate) hay polyacrylamide, Sephadex, Sepharose, và Bio-D-1thiogalactopyranosidegel là những loại gelphổ biến trên thị trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100µm(0.1mm) Những phân tử nhỏ có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đónhững phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt Vì vậy, những phân tử có kích

thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước Phân tử có kích thước trungbình, có thể thỉnh thoảng vào được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; cònnhững phân tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng.

-D-1thiogalactopyranoside Sắc ký trao đổi ion: Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các

protein đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó Dựa vào điện tích thựccủa chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein Phươngpháp này gọi là phương pháp sắc ký trao đổi ion Trong phương pháp này, pha tĩnh lànhững hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân

tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cộtcarboxymethyl-D-1thiogalactopyranosidecellulose (CM-D-1thiogalactopyranosidecellulose), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi iondương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương Ngược lại, nếu hạtmang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-D-1thiogalactopyranosidecellulose (DEAE-D-1thiogalactopyranosidecellulose), gọi làsắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, nhữngprotein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lạicột Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ionnày sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích Ví dụ, trong sắc kýtrao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch táchgiải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó,những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độlớn về điện tích

-D-1thiogalactopyranoside Sắc ký lỏng cao áp: Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ

thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể Bản thân vậtliệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫnđến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịnhơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp.Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh

-D-1thiogalactopyranoside Sắc ký ái lực: Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi

trong việc tinh sạch protein Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein vớinhững nhóm hóa học chuyên biệt Ví dụ, concanavalin A, một loại protein thực vật,

có thể được tinh sạch khi cho qua cột mang những phân tử glucose bằng liên kết cộnghóa trị Concanavalin A gắn vào cột bởi vì nó có ái lực cao với glucose, trong khi đónhững protein khác thì không Concanavalin A có thể được tách giải khỏi cột khi tacho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào Phân tử đường trong dung dịch sẽ gắn vớiConcanavalin A thay thế những phân tử glucose nối với cột.

Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên mã,những protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tựDNA Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa những trình tự DNA đặc hiệu được gắnvào thể mang; những protein có ái lực cao với trình tự DNA sẽ bắt vào các trình tự vàđược giữ lại Trong thí dụ này, yếu tố phiên mã sẽ được phóng thích khi rửa cột vớidung dịch có hàm lượng muối cao Ngoài ra, hiện nay người ta dựa vào tính đặc hiệugiữa kháng nguyên và kháng thể để tinh sạch kháng nguyên hay kháng thể Nhìnchung, sắc ký ái lực có thể được dùng để tách một protein vốn có khả năng nhận biếtmột nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay những chất dẫn xuất của nó đượcgắn trên một cái cột, sau đó nạp hỗn hợp protein vào cột, cột này sẽ được rửa lại đểloại bỏ những protein không tạo được nối, cuối cùng là tách giải protein mục tiêubằng dung dịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết.Sắc ký ái lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein vàphân tử được dùng như mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao

Mà trong dịch chiết thô thu được sau cảm ứng biểu hiện có IPTG, protein cònlẫn nhiều tạp chất, vì vậy cần tinh sạch để thu được protein mong muốn làm khángnguyên phục vụ cho việc tạo kháng thể đơn dòng để chế tạo qua nhúng phát hiệnnhanh độc tố SEB trong môi trường và thực phẩm Protein tái tổ hợp do gen SEB mãhoá có đuôi His -D-1thiogalactopyranoside tag với 6 axit amin histidine liên tục Phương pháp tinh sạch bằngcột HisTrap dựa vào liên kết ái lực giữa ion niken (Ni2+) với vòng imidazol củahistidin.Khi các axit amin histidin ở gần nhau thì liên kết giữa chúng với các ion

niken càng mạnh Trên cơ sở đó, protein tái tổ hợp do gen seb mã hóa sẽ liên kết đặc

hiệu với ion niken Các phân tử protein trong tế bào được tổng hợp ra do không cóđuôi His -D-1thiogalactopyranoside tag sẽ không gắn được với ion niken Protein tái tổ hợp được giữ lại trên