Đề tài sản xuất vitamin b12 trên quy mô công nghiệp

 Cyanocobalamin, được định nghĩa l| vitamin B12, l| một hợp chất cobalamin bền vững, được sản xuất ở quy mô công nghiệp nhưng không tìm thấy trong tự nhiên.. Sản xuất vitamin B 12 trên

1

MỤC LỤC

PHẦN I: TỔNG QUAN 4

I GIỚI THIỆU CHUNG 4

II VITAMIN B12 5

1 Giới thiệu chung 5

2 Tính chất của vitamin B12 5

3 Sản xuất vitamin B12 trên quy mô công nghiệp 7

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT 9

I VI SINH VẬT 9

1 Yêu cầu về nguyên liệu 9

2 Vi sinh vật sản xuất vitamin B12 9

II RỈ ĐƯỜNG 14

III HÈM RƯỢU 15

IV DỊCH WHEY 16

PHẦN III: SẢN XUẤT 19

I QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ VI SINH VẬT 19

1 SƠ ĐỒ KHỐI 19

2 SƠ ĐỔ THIẾT BỊ 20

II GIẢI THÍCH C[C GIAI ĐOẠN 21

1 NHÂN GIỐNG 21

2 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG LÊN MEN 24

3 LÊN MEN 26

4 LY TÂM 30

5 ACID HÓA 31

6 HẤP PHỤ 32

7 GIẢI HẤP 34

8 CÔ ĐẶC 35

9 KẾT TINH 36

10 LY TÂM 38

11 SẤY 39

2

Phần IV: SẢN PHẨM 41

Phần V: THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ 45

I Nghiên cứu kh{m ph{ ra bí ẩn cuối cùng của qu{ trình sinh tổng hợp 45

II Kỹ thuật đột biến gen vi sinh vật sản xuất vitamin B12 46

III Nghiên cứu việc ổn định thuốc viên nén vitamin B1+B6+B12: 51

IV Sản phẩm Tempeh 53

PHẦN VI: PHỤ LỤC 60

I Folic acid & vitamin B12 injection 60

II Vitamin B12 1000µg/1ml-Thuốc tiêm 60

III Viên nén vitamin B12 61

PHẦN VII: TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

3

Lời mở đầu

Vitamin B12 là một loại vitamin rất cần thiết cho cơ thể con người Trong

cơ thể, nó tồn tại dưới dạng bốn dẫn xuất m| người ta gọi là cobalamin và hoạt động như c{c yếu tố enzyme Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng của viatmin B12 trong việc chữa trị bệnh thiếu máu ác tính và các bệnh về viêm dây thần kinh

Vitamin B12 chỉ có nhiều trong các thực phẩm đi từ nguyên liệu động vật, thực vật chứa rất ít vitamin B12 Vì thế nhu cầu tổng hợp viatmin B12 trên quy mô công nghiệp là thiết yếu, để bổ sung vitamin B12 cho những người ăn chay trường và chữa các loại bệnh do thiếu vitamin B12 Trong công nghiệp, vitamin B12 hoàn toàn được tổng hợp bởi các vi sinh vật

Chúng em xin c{m ơn thầy Lê Văn Việt Mẫn đã tạo điều kiện cho chúng

em có dịp tìm hiểu và thực hiện đề tài tiểu luận Sản xuất vitamin B 12 trên quy

mô công nghiệp, để chúng em đ{p ứng yêu cầu và nắm vững hơn những kiến

thức của môn học Công nghệ lên men Trong quá trình thực hiện mặc dù chúng em đã cố gắng hết sức nhưng cũng không thể tránh khỏi sai sót, c{m ơn thầy đã tận tình giúp đỡ và sửa chữa để bài làm của chúng em được hoàn chỉnh hơn

Nhóm thực hiện

4

PHẦN I: TỔNG QUAN

I GIỚI THIỆU CHUNG

Vitamin l| chất hữu cơ không cung cấp năng lượng cho tế b|o trong qu{ trình ph{t triển Tuy nhiên, vai trò của vitamin lại vô cùng quan trọng cho hoạt động sống của tế b|o: vitamin thúc đẩy c{c qu{ trình trao đổi chất v| l| th|nh phần không thể thiếu được trong cấu tạo của nhiều loại enzym Do đó việc nghiên cứu, sản xuất vitamin trở nên rất cần thiết Vitamin được sử dụng chủ yếu ở ba lĩnh vực:

Công nghệ sản xuất vitamin theo phương ph{p sinh học chỉ tập trung v|o một số vitamin đặc trưng v| có hiệu quả nhất, bao gồm vitamin B12, vitamin B2, hỗn hợp vitamin D2 và các vitamin nhóm B khác

5

II VITAMIN B 12

1 Giới thiệu chung

 Thuật ngữ vitamin B12 rất rộng, dùng để chỉ những hợp chất có chứa cobalamin vì trong ph}n tử của nó có chứa kim loại Coban Tại hội nghị quốc tế về hóa sinh năm 1961, c{c nh| b{c học đã đề nghị gọi tên nhóm vitamin B12 là corinoit Hiện nay người ta biết khoảng 100 loại chất tương tự vitamin B12 trong số đó có c{c chất quan trọng thường gặp như cyancobalamin (B12), hydroxycobalamin (B12 ‚b‛), nitritocobalamin (B12 ‚c‛) Hợp chất corinoit bị loại mất coban được gọi l| corin, còn acid corinic là corin có cả c{c nh{nh bên Dạng tự nhiên của những hợp chất cobalamin l| adenosylcobalamin, methylcobalamin và hydroxocobalamin

 Cyanocobalamin, được định nghĩa l| vitamin B12, l| một hợp chất cobalamin bền vững, được sản xuất ở quy mô công nghiệp nhưng không tìm thấy trong tự nhiên Vitamin B12 l| một vitamin quan trọng để chữa bệnh thiếu m{u nguy hiểm v| bệnh viêm d}y thần kinh ngoại biên, đồng thời nó cũng l| một vitamin quan trọng cần bổ sung trong khẩu phần ăn động vật v| cả con người

tốn kém nên người ta thường sản xuất vitamin B12 đại trà bằng phương pháp lên men vi sinh vật gi{n đoạn hoặc kết hợp gi{n đoạn và liên tục

2 Tính chất của vitamin B 12

 Vitamin B12 có công thức hóa học là C63H90N14O14PCo

 Cấu trúc hóa học của vitamin B12 bao gồm:

trí trung tâm của c{c vòng đó

- Phần thứ hai của phân tử là một nhóm nucleotid thẳng góc với mặt phẳng, trên phần nucleotid này bao gồm thành phần bazơ nitơ l| dimetyl benzimidazol và thành phần đường là -D-ribofuranoza

6

Hình 1: Cấu trúc phân tử vitamin

 Vitamin B12 thường ở dạng kết tinh, có kích thước rất nhỏ, m|u đỏ sẫm, không có mùi và vị

 Tan trong nước, trong các dung dịch trung tính, cồn; không tan trong eter, acetol, benzen, clorofoc

 Chúng bền nhiệt khi ở dạng cyamit, nhưng khi tiếp xúc với kim loại nặng thì rất dễ mất hoạt tính, vitamin B12 không bền trong môi trường pH kiềm

Có thể nói vitamin B12 có ý nghĩa rất quan trọng trong qu{ trình trao đổi chất: nếu thiếu hoặc không đủ vitamin B12 trong cơ thể con người v| động vật

sẽ g}y ra hiện tượng rối loạn trao đổi chất hydratcacbon v| axit béo Cụ thể:

 Vitamin B12 tham gia v|o việc sinh tổng hợp enzym metyl malomye – CoA - mutase v| rất nhiều enzym quan trọng kh{c C{c enzym n|y tham gia v|o c{c phản ứng chuyển metyl v| qu{ trình tổng hợp methionin, cholin, thimin

7

 Vitamin B12 tham gia v|o việc đảm bảo hoạt động của c{c cơ quan tạo ra m{u v| l|m tăng cường c{c phản ứng bảo vệ cơ thể Thiếu vitamin sẽ dẫn tới sự tho{i hóa mỡ ở gan

 Cùng với methionin, vitamin B12 tham gia v|o qu{ trình trao đổi nhóm methyl Vitamin B12 giúp cơ thể tổng hợp methionin từ homosistein

Hình 2 Phân tử vitamin B 12

3 Sản xuất vitamin B 12 trên quy mô công nghiệp

 Khi vitamin B12 được sản xuất theo quy mô công nghiệp thì ta phải quan tâm, kiểm so{t đến c{c yếu tố như giống vi sinh vật, cơ chất sử dụng, qu{ trình phản ứng v| qu{ trình thu nhận, tinh chế sản phẩm Bản chất của qu{ trình sản xuất theo quy mô công nghiệp l| sản phẩm của qu{ trình có định hướng rõ r|ng, qui trình sản xuất được kiểm so{t từ kh}u sản xuất giống đến qu{ trình lên men v| cuối cùng l| qu{ trình thu nhận sản phẩm

 Như vậy qu{ trình lên men công nghiệp thực chất l| thực hiện v| kiểm so{t những công việc sau:

 Tạo giống v| n}ng cao chất lượng giống

- Để l|m được việc đó cần phải giải quyết hai vấn đề sau:

a) Kỹ thuật lên men: nghiên cứu điều kiện tối ưu trong qu{ trình lên men như thiết bị, công nghệ…nhằm đạt được hiệu suất cao cho c{c sản phẩm mong muốn

b) Kỹ thuật thu hồi sản phẩm sau lên men v| chế biến th|nh c{c dạng thương phẩm, nghiên cứu c{c điều kiện trích ly, tinh chế nhằm thu được c{c chất có hoạt tính sinh học dạng tinh khiết Nhiều kỹ thuật trong công nghiệp hóa học như: lọc, kết tủa, ly t}m, kết tinh, hấp phụ, chưng cất, sấy… đều được

sử dụng ở đ}y Điều kiện kh{c nhau cần lưu ý tới l| c{c chất có hoạt tính sinh học thường không bền vững với c{c điều kiện nhiệt độ, pH v| c{c yếu tố vật lý khác

thành thành phần và tính chất của chất lỏng canh trường Các chế độ sinh tổng hợp cần hướng tới kết quả thu nhận môi trường có chất nền và những tạp chất khác còn lại là tồi thiểu và có nồng độ các sản phẩm mong muốn là cực đại

9

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT

Sản xuất vitamin B12 trong công nghiệp đi từ nguyên liệu vi sinh vật v|

rỉ đường hay hèm rượu, dịch whey

I VI SINH VẬT

1 Yêu cầu về nguyên liệu

Trong công nghệ lên men, giống vi sinh vật đóng vai trò hết sức quan trọng, ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng v| gi{ th|nh của sản phẩm Như vậy, giống vi sinh vật sử dụng trong công nghệ lên men vitamin B12 phải thỏa mãn những yêu cầu sau:

 Giống vi sinh vật đó phải cho ra vitamin B12 có chất lượng v| số lượng cao hơn hẳn c{c sản phẩm phụ kh{c

 Năng suất cao

 Phải có khả năng đồng hóa c{c nguyên liệu rẻ tiền v| dễ kiếm

 Sản phẩm của qu{ trình phải dễ d|ng t{ch ra khỏi c{c tạp chất môi trường v| sinh khối vi sinh vật giống

 Vi sinh vật phải thuần khiết

 Vi sinh vật phải có tính thích nghi cao, đặc biệt phải thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp, sự ổn định nhiệt độ, {p suất thẩm thấu, pH

 Giống phải có tốc độ sinh sản v| ph{t triển mạnh trong điều kiện môi trường công nghiệp

 Tốc độ trao đổi chất mạnh để nhanh tạo ra sản phẩm mong muốn

 Giống phải ổn định trong bảo quản v| điều kiện bảo quản dễ d|ng

2 Vi sinh vật sản xuất vitamin B12

- Hiện nay, khoa học đã kh{m kh{ ra rất nhiều vi sinh vật có thể tham gia qu{ trình sinh tổng hợp vitamin B12 Một số quy trình sản xuất vitamin được biết đến l| quy trình sản xuất vitamin từ vi khuẩn Propionic, từ xạ khuẩn

Actinomyces olivacens, v| vi khuẩn sinh khí metan

10

- Một số vi khuẩn có khả năng sản xuất vitamin: Agrobacterium

tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Bacillus megaterium, Clostridium sticklandii, Clostridium tetanomorphum, Clostridium thermoaceticum, Corynebacterium XG, Eubacterium limosum, Methanobacterium arbophilicum, Methanobacterium ivanovii, Methanobacterium ruminantium, Methanobacterium

thermoautotrophicum, Methanosarcina barkeri, Propionibacterium freudenreichii,

Propionobacterium shermanii, Protaminobacter ruber, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas putida, Rhizobium meliloti, Rhodopseudomonas sphaeroides, Salmonella typhimurium, Spirulina platensis, Streptomyces antibioticus, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces griseus, Streptomyces olivaceus , ngoài ra còn có các

giống thuộc xạ khuẩn Actinomyces

Hình 3: Vi khuẩn Propionibacterium freudenreichii

- Trước đ}y, người ta sử dụng chủ yếu Streptomyces griseus để sản xuất vitamin trên quy mô công nghiệp nhưng hiện nay vi khuẩn Propionibacterium

shermanii và Pseudomonas denitrificans đã thay thế ho|n to|n vi khuẩn Streptomyces

Vitamin B12 l| sản phẩm phụ trong sản phẩm Streptomixin nhờ

Streptomyces griseus hay l| sản phẩm phụ của qu{ trình sản xuất Clotetracyclin

nhờ Str Aureofaciens C{c qu{ trình n|y thường tạo được lượng vitamin B12 là 2 mg/l dịch nuôi cấy nên rất khó t{ch

11

Việc sản xuất dựa v|o Propionibacterium shermanii hay P

freudenreichii cho hiệu suất vitamin cao hơn Tế b|o của c{c vi khuẩn n|y chứa

một lượng vitamin khoảng 20 mg/l

2.1 Vi khuẩn propionic

a Phân loại vi khuẩn propionic

- Đặc điểm chung:

động, không sinh bào tử, kị khí không bắt buộc

 Chúng có hình cầu, xếp th|nh đôi hoặc chuỗi

 Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của vi khuẩn là 300C.Lượng

G+C trong DNA của chúng nằm trong khoảng 53-67 mol%

- Phân loại: vi khuẩn Propionic được phân loại thành 2 nhóm:

 Nhóm vi khuẩn propionic sống trong sản phẩm sữa Chúng phát triển trong môi trường phômai và sữa Trên cơ sở tính tương đồng của DNA trong thành phần cấu tạo của thành tế bào, nhóm vi khuẩn propionic sống

trong sản phẩm sữa được phân loại thành 6 loài: Propionibacterium

freudenreichii, P jensenii, P.theonii, P.acidipropionici, P.coccoides và P.cyclohexanicum

 Nhóm vi khuẩn propionic sống trên da Môi trường sống chính của giống propionic sống trên da l| da người.Nhóm vi khuẩn sống trên da được

phân loại thành 6 loài: P.acnes, P.avidium, P.granulosum, P.lymphophilums,

P.propionicum và Propioniferax innocua Nhóm vi khuẩn sống trên da có dạng

que, kị khí

 Tr{i ngược với vi khuẩn propionic sống trên da, nhóm vi khuẩn propionic sống trong sản phẩm sữa không sản sinh indole và không thể hóa lỏng gelatin Hơn thế nữa, hai nhóm này có thể được phân biệt rõ dựa vào các đặc điểm sinh lý học của nó Do đó, hai nhóm vi khuẩn propionic này khác nhau chủ yếu dựa trên môi trường sống tự nhiên của chúng

12

b Đặc điểm của vi khuẩn Propionibacterium shermanii

Hình 4 Vi khuẩn Propionibacterium shermanii

Trong các giống vi khuẩn tham gia tổng hợp vitamin B12 có giống

Propionibacterium shermanii là giống có nhiều ưu điểm nhất và có thể đưa v|o

sản xuất công nghiệp Vi khuẩn này có một số đặc điểm quan trọng được tóm tắt như sau:

 Chúng có khả năng lên men acid lactic, glycerol, glucose, fructose, manit, lactose

 Khoảng pH hoạt động 4,5 - 7,5, pH tối ưu cho việc sinh tổng hợp vitamin B12 là 5,8-7,5

 Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp vitamin B12 là 28 - 300C

 Các chất dinh dưỡng cho sự phát triển bao gồm muối amon, nước amoniac, CoCl2 hoặc Co(NO3)2; các kim loại như Fe, Cu, Zn, Mn thường làm giảm quá trình sinh tổng hợp vitamin B12

 C{c vitamin l|m tăng hiệu suất tổng hợp B12 bao gồm thiamin, biotin, acid nicotinic, acid tolic

2.2 Xạ khuẩn Actinomyces

Trong tất cả các giống thuộc Actinomyces có giống Actinomyces

olivaceus có khả năng tổng hợp vitamin B12 cao hơn cả v| chúng được sử dụng

để sản xuất vitamin B12 theo quy mô công nghiệp Một số đặc điểm quan trọng của giống xạ khuẩn n|y được tóm tắt như sau:

 Xạ khuẩn Act Olivacens thuộc loại hiếu khí

13

 Chúng phát triển mạnh và sinh nhiều vitamin B12 trong môi trường chứa glucose, tinh bột, mật rỉ, bã rượu Trong thành phần môi trường

 Sinh tổng hợp vitamin B12 chỉ xảy ra mạnh sau 24 giờ nuôi cấy

 Trong quá trình lên men, xạ khuẩn tạo ra hai pha rất rõ rệt:

o Pha tạo thành sinh khối

o Pha tạo thành vitamin B12.

 Thường pha tạo thành vitamin B12 chỉ mạnh khi kết thúc quá trình tăng sinh khối

 pH ban đầu môi trường nên điều chỉnh vào khoảng 7 Ở pha thứ nhất, pH sẽ giảm xuống khoảng 6,5 v| bước sang pha thứ hai pH sẽ tăng dần lên 8,2 - 8,7

 Thổi khí có ảnh hưởng rất lớn đến sự tổng hợp vitamin B12, do đó trong quá trình lên men bắt buộc phải có thổi khí mạnh

 Nhiệt độ cho sự phát triển và sinh tổng hợp vitamin B12 là 28-300C

 Thời gian lên men là 60 - 120 giờ (trung bình là 60 - 96 giờ)

2.3 Vi khuẩn sinh metan

Trong thiên nhiên có rất nhiều vi sinh vật tham gia lần lượt nhiều phản ứng tạo ra khí metan Khí metan là loại khí có thể đốt được, đồng thời nó

là loại khí tạo ra hiện tượng hiệu ứng nhà kính lớn nhất Cùng với sự tạo thành khí metan, vi sinh vật còn tổng hợp được số lượng vitamin B12 lớn

Đặc điểm chung của vi khuẩn sinh khí metan đươc tóm tắt như sau:

 Chúng thuộc vi khuẩn Gram (-)

 Chúng không chuyển động

 Chúng không tạo bào tử

 Chúng không thuộc loại kị khí bắt buộc

o Nước: 15-20%

o Chất khô: 80-85%

o Trong đó có 60% l| đường (40% l| đường saccharose, 20% là fructose

và glucose) và 40% chất khô còn lại là chất phi đường (không phải l| đường)

o Trong thành phần phi đường có khoảng 30 - 32% hợp chất hữu cơ v| 6

- 10% hợp chất vô cơ Trong hợp chất vô cơ gồm có: K2O 3,5%, Fe2O3 0,2%, MgO 0,1%, sulfat 1,6%, CaO 1,5%, SiO2 0,5%, P2O5 0,2%, Cloride 0,4%

o Trong những hợp chất hữu cơ gồm có hợp chất có chứa nitơ v| không chứa nitơ ở dạng amin như: acid aspactic, acid glutamic, leucin, isoleucin Nitơ tổng chiếm khỏang 0,3 – 0,5% (ít hơn so với lượng nitơ có trong rỉ đường củ cải)

o Ngoài ra trong rỉ đường có một số vitamin sau:

15

- Mặt khác, trong rỉ đường luôn có mặt vi sinh vật với mật độ rất lớn, thường gặp nhất là những vi sinh vật gây màng và gây chua, dẫn tới làm giảm chất lượng của rỉ đường Vì vậy trong sản xuất ta hay dùng fluosilicate natri

20/000 so với trọng lượng mật rỉ để bảo quản

 Ưu điểm của việc sử dụng rỉ đường để sản xuất so với những nguyên liệu khác là:

 Gi{ rẻ

 Khối lượng lớn, dồi d|o

 Sử dụng tiện lợi

III HÈM RƯỢU

Hèm rượu là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất ethanol bằng phương pháp lên men

Bảng 2 Thành phần hóa học của hèm rượu:

Th|nh phần Nguyên liệu khoai t}y Nguyên liệu khoai mì

dụng để phát triển Trong dịch Whey và men chiết có đầy đủ các chất dinh dưỡng cho sự phát triền và hình thành vitamin B12 từ vi sinh vật

- Trên phương diện đó, với nhược điểm của dịch Whey nên việc sử dụng để sản xuất vitamin B12 thì nhỏ và rải rác, riêng lẻ, không đủ cung cấp cho quá trình sản xuất có lợi của vitamin B12

- Việc sản xuất vitamin B12 từ dịch Whey chỉ có ý nghĩa trên quy mô công nghiệp khi việc chuyên chở dịch Whey thực hiện gần nơi sản xuất và lượng Whey tương đối nhiều để có thể kết hợp và sản xuất Chi phí vận chuyển tăng vì lượng dịch Whey thô chứa khoảng 93,1% l| nước Chi phí chuyên chở có thể giảm khi cô đặc dịch thô thành dạng rắn trước khi chuyên chở Một lý do khác là dịch Whey có thể sản xuất nếu như gi{ trị sản phẩm của

nó tăng bởi qu{ trình lên men như qu{ trình lên men vitamin B12 Ngay cả khi quá trình chỉ thải ra lượng thừa dịch Whey m| không tăng gi{ sản phẩm sữa,

nó sẽ có giá trị vì giúp giải quyết vấn đề chất thải trong quá trình sản xuất phô mai

Bảng 3 Thành phần whey protein

17

Whey protein -lactoglobulin -lactalbumin bovine serum albumin minor ‘proteins’

9.6 3.8 1.4 3.0

0.5

0.043 0.040 0.050 0.160 0.110 0.050

0.8

0.120 0.065 0.050 0.160 0.110 0.400

20

2 SƠ ĐỔ THIẾT BỊ

Hình 6 Sơ đồ thu nhận chất cô của vitamin B 12

 Cách thực hiện:

- Nhân giống l| qu{ trình tăng dung tích, dịch chứa sinh khối qua nhiều cấp Mỗi cấp nhân giống thường tăng dung khối từ 10-15 lần Cứ làm như vậy cho đến khi toàn bộ dung tích đủ để tiến hành quá trình lên men

dụng cụ thủy tinh như ống nghiệm, erlenmeyer với các dung tích 750 ml, 1l, 2l kết hợp với tủ ấm, tủ lắc điều nhiệt Do thể tích môi trường nhỏ nên việc sử dụng máy lắc có thể đảm bảo được sự đồng nhất trong canh trường nuôi và cung cấp đầy đủ oxy cho sự sinh trưởng, phát triển của nhóm vi sinh vật hiếu khí

- Khi nhân giống ở giai đoạn ph}n xưởng, người ta sử dụng những thiết bị với dung tích khác nhau: 100l, 500l, 1m3, 3 m3, 5 m3, 10 m3…hoặc lớn hơn tùy theo dung tích của thiết bị lên men đang sử dụng tại nhà máy

Hiện nay người ta sản xuất vitamin B12 theo qui mô công nghiệp

thường sử dụng loài Prop.shermanii Lo|i n|y thường được giữ giống trong

môi trường thạch nghiêng với glucose, KH2PO4, (NH4)2PO4 Trong môi trường, người ta cho thêm cao ngô hoặc nước chiết trái cây, nuôi vi khuẩn ở điều kiện nhiệt độ 28 - 320C trong thời gian 7-8 ng|y v| sau đó bảo quản lạnh, cấy chuyền định kì mỗi tháng 1 lần

khí bắt buộc

men, còn các thành phần khác của môi trường giống như môi trường lên men

- Trong môi trường, ngoài thành phần đường ra, người ta còn cho thêm các muối amon, nước amoniac, CoCl2 hoặc Co(NO3)2

22

- Lưu ý l| trong trường hợp không dùng loài Prop.shermanii để sản

xuất vitamin B12, ta dùng xạ khuẩn hoặc các vi khuẩn sinh metan thì phải thay đổi thành phần môi trường v| điều kiện nuôi cấy Ví dụ: xạ khuẩn phải nuôi trong điều kiện hiếu khí bắt buộc, còn vi khuẩn sinh metan lại nuôi trong điều kiện yếm khí bắt buộc

Bảng 5 Môi trường nhân giống

- H|m lượng cơ chất trong môi trường giảm theo thời gian, sinh

khối vi khuẩn tăng

 Thiết bị nhân giống

- Thiết bị có dạng hình trụ đứng v| được chế tạo bằng thép không rỉ Bên trong thiết bị có hệ thống cánh khuấy Xung quanh thiết bị là lớp vỏ áo cho t{c nh}n điều nhiệt để ổn định nhiệt độ canh trường trong quá trình nhân giống

- Phần trên nắp thiết bị có các cửa với nhiều chức năng kh{c nhau: cửa thông cánh khuấy gắn với motor, cửa nạp giống, cửa vào và ra cho không khí, cửa nạp chất phá bọt, cửa nạp chất điều chỉnh pH…Cửa nạp môi trường v| th{o canh trường ra khỏi thiết bị thường được bố trí ở phần đ{y Ngo|i ra trong thiết bị còn có những đầu dò pH, nhiệt độ, oxy… để nhà sản xuất có thể theo dõi các giá trị này trong quá trình nhân giống

23

Hình 7 Thiết bị nhân giống

1 Hệ thống điều nhiệt(nh}n giống trong erlen)

2 Bình nh}n giống trung gian

- Dung tích thiết bị nhân giống: 1m3

- Nhiệt độ nuôi cấy: 28-320C

- pH=6.9-7

- Thời gian nuôi cấy: 7-8 ngày

này chiếm từ 0,5% - 10% khối lượng môi trường nuôi cấy

- Nguồn Nitơ l| c{c protein trong soybean, yến mạch, bắp, bột mì, dịch chiết nấm men, nước Whey Khối lượng chiếm 1% - 5% khối lượng môi trường nuôi cấy

- Yếu tố tăng trưởng cho vi sinh vật như l| dịch chiết nấm men, dịch khoai tây, bắp

phosphate dibasic, potassium phosphate monbasic Hợp chất cobalt: cobalt chloride, sulfate, nitrate

Bảng 6 Thành phần môi trường lên men

Clorua coban 1,5 - 10 ppm

dinh dưỡng thì h|m lượng vitamin B12 sẽ tăng lên Trong khi một số loại acid amin như analine, leucine, isoleucine, tyrosine, methionine, acid glutamic không l|m tăng m| ngược lại có thể làm giảm h|m lượng vitamin B12

- Trong sản xuất người ta bổ sung thêm 5,6 - dimetylbenzinaldazol l|m tăng sự tổng hợp vitamin B12 Ngoài ra, muối cobalt cũng được bổ sung v|o môi trường với nồng độ 3 - 5µg/l

Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20

đun nóng, bộ giữ nhiệt, bộ thu hồi nhiệt, bộ trao đổi nhiệt, hệ thống điều chỉnh

tự động các thông số của quá trình

Cùng lúc mở các van xả nước ngưng v| khi đạt được nhiệt độ lớn hơn

1400C thì bắt đầu tiệt trùng

Khi nhiệt độ và áp suất trong nồi phản ứng đạt trị số ổn định thì khuấy đảo các cấu tử của môi trường dinh dưỡng, môi trường mới lại cho vào thùng chứa để bơm đẩy qua khe đứng nhỏ vào bộ phận đun nóng

6- Thiết bị trao đổi nhiệt- thu hồi

7- Thiết bị trao đổi nhiệt- thiết bị làm mát

8- Thiết bị lên men

3 LÊN MEN

 Mục đích:

Khai th{c: L|m tăng hàm lượng vitamin trong tế bào vi sinh vật

 Các biến đổi:

 Quá trình lên men gồm có 2 giai đoạn:

- Giai đoạn đầu kị khí,

- Giai đoạn sau hiếu khí

 Thời gian cho mỗi giai đoạn là 72 - 88 giờ

- Vật lý: Nồng độ vitamin B12 sẽ tăng nhanh trong giai đoạn hiếu khí, khoảng 25 – 40 mg vitamin B12/l

- Hóa học: pH môi trường thay đổi Ta điều chỉnh pH bằng cách thêm dextrose, sucrose, hoặc thêm ammonium hydroxide, potassium phosphate dibasic, urea, calcium carbonate

27

 pH tối ưu của môi trường lên men vào khoảng 7 – 7,5 Nếu pH qu{ cao, môi trường mang tính kiềm, nó sẽ phân hủy sản phẩm cuối, hoặc ngăn cản quá trình tạo thành vitamin B12, vì thế h|m lượng vitamin B12 sẽ giảm

đi

 Nếu pH quá thấp, tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật bị kiềm hãm, dẫn đến giảm h|m lượng vitamin B12 Nhiệt độ tối ưu cho qu{ trình lên men là 28 - 320C

- Sinh học: Vi sinh vật sinh tổng hợp vitamin B12 trong tế bào

 Đ}y l| một quá trình rất phức tạp, trải qua rất nhiều giai đoạn khác nhau nhờ sự tham gia của rất nhiều enzym

 Quá trình bắt đầu bằng sự tạo th|nh c{c porphinin, sau đó l| gắn nucleotat và các thành phần khác vào Porphinin của vitamin B12 khác với porphinin của xitocrom, clorofin ở chỗ nó chứa rất nhiều nhóm –

CH2CH2COOH và – CH3

cacboxyl thành monopyrol porphobilinogen

 Coenzym B12 là một hợp chất có 5 - dezoxyadenozyl ở vị trí của nguyên tử Carbon trung tâm thay cho nhóm xianit Coenzym corinoid tham gia vào phản ứng của các metylmalonyl - mutaza là phản ứng chuyển succinyl

- CoA thành metylmalonyl - CoA trong lên men propionic

chuyển thành 5,6 – dimetyl - benzinmidazol cobanit – 5 - dezoxyadenozin tức

là phần quan trọng nhất đối với sự tạo thành vitamin B12

 Bên cạnh acid propionic, acid acetic cũng được sản xuất trong điều kiện yếm khí, với tỉ lệ 2:1 Acid propionic ở h|m lượng thấp có thể ức chế các

vi sinh vật nhiễm v|o môi trường lên men như vi khuẩn acid lactic, vi khuẩn

acid acetic Propionibacterium có thể chịu được nồng độ acid propionic xấp xỉ

20g/l (pH lên men gần bằng 7), đ}y cũng l| nồng độ tại đó sự tạo thành acid propionic bị kiềm hãm Acid propionic không phân ly là chất độc đối với

Propionibacterium shermanii Tốc độ sinh trưởng riêng giảm nhanh khi nồng độ

acid propionic trên 5 mM H|m lượng acid propionic lớn nhất chấp nhận được khi lên men đạt 25 - 35g sinh khối/l H|m lượng acid propionic là 1 yếu tố hạn chế sự tăng sinh khối, và sản xuất vitamin B12

 Thiết bị lên men:

Ta sử dụng hệ thống gồm nhiều bình lên men nối tiếp

Cấu tạo của bình lên men: cấu tạo tương tự như thiết bị nhân giống vi sinh vật Chúng cũng cũng có dạng hình trụ đứng, được chế tạo từ vật liệu thép không rỉ Bên trong thiết bị có hệ thống cánh khuấy v| c{c đầu dò nhiệt

độ, pH… để có thể theo dõi trực tiếp các thông số công nghệ trong quá trình lên men Motor cho cánh khuấy thường được đặt phía trên nắp thiết bị Còn

29

cửa nạp v| th{o môi trường được bố trí phía đ{y Ngo|i ra thiết bị còn có cửa quan sát, van lấy mẫu…

Hình 8 Thiết bị lên men

Hình 9 Thiết bị lên men vitamin B12 trong công nghiệp

 Thông số công nghệ của thiết bị lên men

- Thông khí bằng cách khuấy đảo liên tục

- Tốc độ thông khí: 0.5 lít/phút

- Lên men trong 6 - 8 ngày

- Nhiệt độ lên men 28 - 300C

- Vật lý: Độ nhớt dung dịch giảm, nhiệt độ dung dịch tăng

Thực tế c{c cobamide được hình th|nh trong qu{ trình lên men được tích tụ trong tế b|o Bước đầu tiên l| t{ch tế b|o từ môi trường lên men M{y

ly t}m tốc độ cao được sử dụng để tập trung vi khuẩn th|nh v{ng trên bề mặt, trong khi m|ng lọc được sử dụng để t{ch tế b|o

 Thiết bị sử dụng: thiết bị ly tâm lọc

Trên thành thùng quay của máy ly tâm lọc có đục lỗ v| được bọc bằng các lớp lưới hoặc vải có kích thước lỗ phù hợp với tính chất sản phẩm Dưới tác dụng của lực ly tâm pha lỏng bắn ra qua các lỗ, pha rắn nằm lại trên thành máy

Hình 10 Máy ly tâm lọc

 Thông số công nghệ

- Tốc độ quay: 4000 vòng/phút

- Năng suất nhập liệu: 363 lít/ phút

- Công suất động cơ: 30 KW

- Khối lượng thiết bị: 1.9 tấn

31

5 ACID HĨA

Vào lúc kết thúc quá trình thì coenzym B12 trong tế b|o được giải phĩng nhờ phương ph{p acid hĩa bằng cách bổ sung KCN m| được chuyển thành cyancobalamin tức là vitamin B12 thật sự

quả là tạo thành cyanocobalamin

 Thiết bị sử dụng:

cánh khuấy

tháo liệu bộ phận

gia nhiệt

Hình 11 Thiết bị acid hĩa