Nghiên cứu đa dạng di truyền một số giống gấc (momordica cochinchinensis (lour ) spreng) thu thập ở việt nam bằng chỉ thị phân tử DNA

Trong thực tế, các nhàphân loại học phân tử hiện nay đang hình dung ra danh mục tất cả các loài sinh vậtsống trên trái đất bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử DNA thông qua việc xácđịn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quảnghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từngdùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã đượccám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 10 tháng 6 năm 2016

Tác giả luận văn

Phùng Thị Hương

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhậnđược sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên củabạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng vàbiết ơn sâu sắc TS Nguyễn Văn Khiêm và TS Nguyễn Xuân Cảnh đã tận tìnhhướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quátrình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các anh chị, cán bộ công tác tại Bộ mônGiống và Công Nghệ Sinh Học – Trung tâm Nghiên cứu Trồng và Chế biến câythuốc Hà Nội – Viện Dược Liệu, Ban giám đốc Trung tâm, đã tạo điều kiện thuậnlợi, giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Học Viện Nông Nghiệp ViệtNam, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học cùng toàn thể các thầy, cô giáo đãtruyền đạt cho tôi những kiến thức, kĩ năng quý báu trong suốt thời gian học tập vàrèn luyện tại Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức, anh chị

em công tác tại Bộ môn Đa dạng sinh học nông nghiệp – Trung tâm tài nguyênthực vật- Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điềukiện tốt nhất cho tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học vừa qua

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, giúp

đỡ, làm động lực cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học cũng nhưtrong cuộc sống

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 6 năm 2016

Học viên

Phùng Thị Hương

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục bảng v

Danh mục hình vi

Danh mục các từ viết tắt vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis Abstract ix

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Ý nghĩa khoa học 2

1.2.3 Ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Giới thiệu chung về cây gấc 4

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố cây gấc 4

2.1.2 Phân loại thực vật và đặc điểm hình thái cây gấc 4

2.1.3 Trồng trọt giống gấc 5

2.1.4 Thành phần dinh dưỡng, công dụng, tác dụng của một số nhóm chất chính 6

2.2 Các chỉ thị trong đánh giá đa dạng di truyền 8

2.2.1 Chỉ thị hình thái 8

2.2.2 Chỉ thị hóa sinh 9

2.2.3 Chỉ thị phân tử DNA 10

2.3 Tình hình nghiên cứu gấc trên thế giới 14

2.4 Tình hình nghiên cứu gấc ở Việt Nam 17

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp 21

3.1 Đối tượng nghiên cứu 21

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

3.3 Nội dung nghiên cứu 22

3.4 Hóa chất và thiết bị 22

3.4.1 Hóa chất 22

3.4.2 Thiết bị 22

3.5 Phương pháp nghiên cứu 22

3.5.1 Tách chiết DNA tổng số 22

3.5.2 Khuếch đại các vùng gen của gấc bằng kỹ thuật PCR 23

3.5.3 Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự vùng ITS 24

3.5.4 Phân tích trình tự các vùng gen các giống gấc 25

3.5.5 Xác định mối quan hệ di truyền các mẫu giống gấc thu thập từ các vùng khác nhau .25 Phần 4 Kết quả và thảo luận 27

4.1 Tách chiết DNA tổng số 27

4.2 Khuếch đại các vùng gen nghiên cứu 28

4.3 Phân tích kết quả 31

4.3.1 Kết quả giải trình tự các mẫu giống gấc 31

4.3.2 Phân tích trình tự DNA trên các vùng gen 38

Phần 5: Kết luận và kiến nghị 52

5.1 Kết luận 52

5.2 Kiến nghị 52

Tài liệu tham khảo 53

Phụ lục 58

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Danh sách nguồn gốc các mẫu giống gấc và nguồn gốc thu thập 21

Bảng 3.2 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 3.3 Thành phần và nồng độ các chất cho phản ứng PCR 26

Bảng 4.1 Hàm lượng DNA tổng số trong mẫu giống gấc 30

Bảng 4.2 Mức độ tương đồng các giống gấc đã giải trình tự đối với gen ITS 36

Bảng 4.3 Mức độ tương đồng các giống gấc đã giải trình tự trên gen rbcL 37

Bảng 4.4 Mức độ tương đồng các giống gấc đã giải trình tự trên gen rpl20 38

Bảng 4.5 Mức độ tương đồng các giống gấc đã giải trình tự trên gen psbA 39

Bảng 4.6 Mức độ tương đồng các giống gấc đã giải trình tự trên gen trnL 39

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hình thái cây gấc (bên trái), hoa gấc (ảnh phải) 4

Hình 2.2 Phân biệt gấc nếp, gấc tẻ 5

Hình 2.3 Các công dụng của gấc 7

Hình 2.4 Sơ đồ vùng ITS của gen ribosome trong DNA nhân thực vật bậc cao 13

Hình 2.5 Mô hình không gian của RuBisCO với các tiểu phần lớn, tiểu phần nhỏ 14

Hình 2.6 Cấu trúc hóa học của β-carotene và lycopen trong quả gấc 15

Hình 4.1 Ảnh điện di sản phẩm DNA tổng số của các giống gấc 29

Hình 4.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen ITS các mẫu giống gấc M1-M14) M: DNA Marker 31

Hình 4.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen rbcL ở các mẫu giống gấc (M1-M14) M: DNA Marker 31

Hình 4.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen rbl20 ở các mẫu giống gấc (M1-M14) M: DNA Marker 32

Hình 4.5 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen psbA ở các mẫu giống gấc khác nhau (M1-M14) M: DNA Marker 32

Hình 4.6 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen trnL ở các mẫu giống gấc khác nhau (M1-M14) M: DNA Marker 32

Hình 4.7 Trình tự các gen đích ở mẫu giống gấc M1 trên máy đọc trình tự (A): ITS, (B): rpl20, (C): psbA, (D): trnL, (E): rbcL 34

Hình 4.8: Kết quả Blast mẫu M1 với các gen đích khác nhau (A): Blast gen ITS, (B): Blast gen rbcL, (C): Blast gen rpl20, (D): Blast gen psbA, (E): Blast gen trnl 35

Hình 4.9 Căn trình tự gen ITS 42

Hình 4.10 Cây phát sinh di truyền các giống gấc dựa trên trình tự ITS 43

Hình 4.11 Căn trình tự gen rbcL 44

Hình 4.12 Cây phát sinh di truyền các giống gấc dựa trên trình tự gen rbcl 45

Hình 4.13 Căn trình tự gen psbA 47

Hình 4.14 Cây phát sinh di truyền các giống gấc dựa trên trình tự gen psbA 48

Hình 4.15 Căn trình tự trên gen rpl20 50

Hình 4.16 Cây phát sinh di truyền các giống gấc dựa trên trình tự gen rpl20 51

Hình 4.17 Căn trình tự trên gen trnL 52

Hình 4.18 Cây phát sinh di truyền các giống gấc dựa trên trình tự gen rpl20 54

RNA: Ribonucleic axit

PCR: Polymerase chain reaction

PCR-RFLP: Polymerase chain reaction – Restriction fragment length polymorphism

Na2EDTA: Ethylene diamine tetra acetate sodium

SDS: Sodium dodecyl sulfate

TAE:

BLAST:

Tris Acetate EDTABasic Local Alignment Search Tool

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Nghiên cứu đa dạng di truyền một số giống gấc (Momordica cochinchinensis

(Lour.) Spreng) thu thập ở Việt Nam bằng chỉ thị phân tử DNA”

Gấc là một loại quả giàu dinh dưỡng và là một loại dược liệu tốt, vì thế nhucầu sản xuất dược liệu từ gấc ngày càng cao trong đời sống Gấc trồng chủ yếu từnguồn gen hỗn tạp của địa phương nên năng suất, chất lượng chưa cao Hiểu biếtthông tin di truyền là cơ sở cho chiến lược chọn tạo giống gấc thế nhưng nghiên cứu

đa dạng di truyền nguồn gen gấc ở nước ta còn ít được quan tâm Từ thực tế đó,

chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền một số giống gấc

(Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng) thu thập ở Việt Nam bằng chỉ thị

phân tử DNA” Đề tài đánh giá đa dạng di truyền 14 mẫu giống gấc trên cơ sở phân

tích trình tự các gen ở DNA nhân như ITS, và DNA lục lạp là trnL, rpl20, rbcL, psbA; từ đó hỗ trợ công tác chọn giống gấc năng suất cao, chất lượng tốt phục vụ

ngành sản xuất, chế biến gấc ở Việt Nam

Kết quả nghiên cứu đã khuếch đại và giải trình tự thành công 5 vùng gen của

14 mẫu giống gấc là ITS kích thước 727 bp, rbcL kích thước 703 bp, rpl20 kíchthước 765 bp, psbA kích thước 277-279 kb và trnL kích thước 939 bp Các mẫu

giống đã giải trình tự đều tương đồng với loài Momordica cochinchinensis.

Phân tích trình tự các mẫu giống gấc cho thấy có sự đa dạng di truyền caogiữa các mẫu nghiên cứu: M13 (Gia Lai) khác biệt nhất so với các mẫu giống cònlại, nhưng có trình tự psbA giống hệt M14 (TP.HCM) M14 (TP.HCM) và M5 (TừSơn, Bắc Ninh) có trình tự ITS và rbcL giống nhau Điều này cho thấy các mẫugiống này có thể có nguồn gốc chung M2, M4, M5, M6, M8, M9, M11, M12, M13

có trình tự pspA và rpl20 giống nhau M7 có nhiều sai khác so với các mẫu giốngcòn lại nhưng lại có 2 vị trí sai khác giống hệt nhau so với M2 ở trình tự ITS, nên

có thể coi các mẫu giống này khá gần nhau trong đó M8 (Hải Dương), M9 (HàNam) gần nhau hơn cả

THESIS ABSTRACT

RESEARCH ON GENETIC DIVERSITY OF SOME VARIETIES GAC

(MOMORDICA COCHINCHINENSIS (LOUR.) SPRENG) IN VIETNAM BY

DNA MOLECULAR MARKERS

Gac (Momordica cochinchinensis) is a nutritious fruit and is also a good

medicine Gac is grown in Vietnam using mainly from the local resources with highheterogeneity Threrefore, the productivity, the quality is not high Understanding aboutgenetic information of gac genetic resources is important for breeding research

However, up to now there is not much about genetic information in ourcountry other countries From this fact, we have carried out the project "Research

on genetic diversity of some varieties Gac (Momordica cochinchinensis (Lour.)

Spreng.) in Vietnam by DNA molecular markers" Genetic diversity of 14 isolatescollected from 12 provinces in Vietnam analyzed on the basis of the DNA sequence

of genomic DNA such as ITS region, and chloroplast DNA such as trnL, rpl20,rbcL, psbA genes

These genes were isolated, amplified and sequenced from isolates ITSregion is 727 bp, genes such as rbcL is 703 bp, rpl20 is 765 bp, psbA is 277-279 bpand trnLis 939 bp in length All genes sequences are matched with genes sequences

of Momordica cochinchinensis, that submitted on NCBI, respectively.

M13 (derived from Gia Lai province) is different compared with the otherisolates, but identical sequences of psbA of M14 (derived from HCM city) M14and M5 (from Tu Son, Bac Ninh province) have ITS region and rbcL genesequence of similarity M5 (from Tu Son, Bac Ninh) and M6 (from Thuan Thanh,Bac Ninh province) have identical sequences of psbA gene This suggests that theycould be have common origin M2, M4, M5, M6, M8, M9, M11, M12, havesequence similarity of rpl20 and pspA genes M7 is different from other isolatesbased on ITS region

Our sequence analysis results have showed that high genetic diversityamong Gac isolates in Vietnam

PHẦN 1: MỞ ĐẦU1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây gấc với tên khoa học Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng

thuộc họ Cucurbitaceae, là một loại thực vật có nguồn gốc ở Việt Nam và các nướcĐông Nam Á Gấc là một loại quả giàu dinh dưỡng và là một loại dược liệu tốt TạiViệt Nam, thịt gấc được sử dụng chủ yếu để nhuộm màu xôi gọi là xôi gấc, còn từcách đây rất lâu, dân gian ta đã biết dùng quả gấc để giúp sáng mắt và phòng ngừacác bệnh về mắt như nhức mỏi mắt, khô mắt Quả gấc còn có hàm lượng lycopencao, là chất chống oxy hóa liên quan đến việc ngăn chặn sự phát triển tế bào ungthư trong cơ thể con người

Gần đây, quả gấc đã bắt đầu được tiếp thị ra ngoài khu vực châu Á trongdạng nước ép trái cây bổ dưỡng, dầu gấc do nó có chứa hàm lượng tương đối caocác dinh dưỡng Gấc đặc biệt giàu lycopene Theo tỷ lệ khối lượng, nó chứa nhiềulycopene gấp 70 lần cà chua Người ta cũng phát hiện thấy nó chứa β-caroten nhiềugấp 10 lần cà rốt hoặc khoai lang Ngoài ra, các carotenoit có mặt trong gấc liên kếtvới các axít béo mạch dài, tạo ra kết quả là nó có tính hoạt hóa sinh học cao hơn.Một nghiên cứu gần đây cho thấy gấc chứa các loại protein có thể ngăn cản sự phát

triển của các tế bào ung thư (Ishida et al., 2004).

Với nhận thức về các công dụng gấc mang lại cho con người, nhu cầu sảnxuất dược liệu từ gấc để sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng ngày càng caotrong đời sống Gấc được trồng ở nhiều tỉnh trong phạm vi cả nước để phục vụ nhucầu trong nước và xuất khẩu Các nghiên cứu cho thấy năng suất và chất lượng gấcphụ thuộc nhiều vào giống, canh tác, vùng sản xuất Gấc được trồng ở nước ta chủyếu lấy từ nguồn gen hỗn tạp của địa phương Nhìn chung, các giống gấc chưađược tuyển chọn, chọn lọc do đó năng suất, chất lượng chưa cao Tuy nhiên, nghiêncứu đánh giá, chọn lọc các giống gấc cho năng suất và hàm lượng hoạt chất cao theophương pháp cổ điển tốn nhiểu thời gian và cho kết quả kém chính xác do phụ thuộcvào ngoại cảnh Vấn đề đặt ra là cần tuyển chọn được các giống gấc có tiềm năngnăng suất và hàm lượng hoạt chất cao phục vụ nhu cầu thị hiếu người tiêu dùng vàxuất khẩu

Hiểu biết thông tin di truyền là rất quan trọng, làm cơ sở cho chiến lược chọntạo giống gấc Nói chung nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen gấc ở nước ta còn

ít được quan tâm

Trong công tác kiểm nghiệm dược liệu hiện nay, phương pháp được dùngchủ yếu dựa trên phân tích hình thái vĩ mô (quan sát bằng mắt) và vi mô (quan sáttiêu bản hiển vi) của mẫu vật Tuy vậy, phương pháp hình thái học gặp trở ngại saukhi các nguyên liệu thực vật đã qua xử lý hoặc sơ chế Vì vậy, các phương pháp bổsung giúp xác định chính xác các giống, loài cây thuốc dựa trên hệ gen DNA đặc thùcủa chúng đã được phát triển vào cuối những năm 1990s Trong thực tế, các nhàphân loại học phân tử hiện nay đang hình dung ra danh mục tất cả các loài sinh vậtsống trên trái đất bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử DNA thông qua việc xácđịnh được các trình tự DNA ngắn đặc trưng của chúng và sử dụng chúng như mãvạch để nhận biết các mẫu sinh học kể cả khi chúng đã được sơ chế hoặc bảo quản

lâu dài Từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền

một số giống gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng) thu thập ở Việt

Nam bằng chỉ thị phân tử DNA” Đề tài sẽ đánh giá đa dạng di truyền các giống

gấc trên cơ sở phân tích trình tự các gen ở DNA nhân như ITS, và DNA lục lạp là trnL, rpl20, rbcL, psbA; từ đó hỗ trợ cho công tác chọn giống gấc năng suất cao, chất

lượng tốt phục vụ cho ngành sản xuất, chế biến gấc ở Việt Nam

1.2 MỤC ĐÍCH, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1 Mục đích

Giải trình tự được một số vùng gen đặc thù của các giống gấc như ITS, trnL, rpl20, rbcL, psbA và đánh giá được mối quan hệ di truyền giữa các giống gấc

thu thập từ một số tỉnh khác nhau ở Việt Nam

1.2.2 Ý nghĩa khoa học

Gấc là loài cây đặc hữu của Việt Nam, tuy nhiên cho đến nay có ít nghiêncứu về các vùng gen ở cây gấc Nghiên cứu thành công của đề tài góp phần đánhgiá quan hệ di truyền, nhận dạng các giống gấc phục vụ công tác bảo tồn, chọn tạogấc cho năng suất và hoạt chất cao Để tài nghiên cứu này sẽ cung cấp thông tinkhoa học về trình tự một số gen mã vạch như vùng ITS của gen ribosome nhân, vàcác gen khác nhau trong DNA lục lạp của các giống gấc thu thập từ các tỉnh khácnhau ở nước ta Trên cơ sở đó có thể xác định được quan hệ di truyền của các giốnggấc cũng như mối liên quan với năng suất, hàm lượng hoạt chất trong quả gấc.Thông tin về vùng gen mã vạch của các giống gấc cũng sẽ được gửi tới ngân hànggen thế giới (NCBI) cho các nhà nghiên cứu tham khảo

1.2.3 Ý nghĩa thực tiễn

Thông tin về mối quan hệ di truyền các giống gấc trên cơ sở phân tích trình

tự vùng gen đặc thù sẽ làm cơ sở cho công tác bảo tồn, nhận dạng và chọn tạogiống gấc có năng suất và hoạt chất cao ở nước ta

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY GẤC

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố cây gấc

Cây gấc có nguồn gốc ở Việt Nam và các nước Đông Nam Á với tên khoa

học là Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng, họ Cucurbitaceae Hiện nay, gấc cũng được trồng ở một số nước châu Á như Bangladesh (Hasan et al., 1987), Trung Quốc (Iwamoto et al., 1985), và Ấn Độ (Shadeque and Baruah, 1984) Tuy

nhiên, gấc trồng ở miền Bắc Việt Nam cho năng suất, chất lượng cao (Vuong,2000) Gấc được gọi với các tên khác nhau như “Gấc” ở Việt Nam, “Fak Kao” ởThái Lan, “Bhat Kerala” ở Ấn Độ, “Moc Niet Tu” ở Trung Quốc và “Mak Kao” ởLào Gấc cũng được sử dụng như là cây lương thực và cây thuốc ở Tây và ĐôngNam Á (Kubota & Siriamornpun, 2011)

2.1.2 Phân loại thực vật và đặc điểm hình thái cây gấc

Cây gấc thuộc loại cây thân dây leo, mỗi năm lụi một lần nhưng lại đâmchồi từ gốc cũ lên vào mùa xuân năm sau Đây là loại cây đơn tính khác gốc, tức là

có cây cái và cây đực riêng biệt Cây gấc leo khỏe, chiều dài có thể đạt đến 15 mét(Hình 2.1)

Hình 2.1: Hình thái cây gấc (bên trái), hoa gấc (ảnh phải).

Thân dây có tiết diện góc Lá mọc so le, chia thùy khía sâu tới ½ phiến lá.Hoa đực, hoa cái riêng biệt trên thân cây, cánh hoa màu vàng nhạt Mùa hoa vàotháng 4 – 5 Quả hình bầu dục dài độ 15-20cm, đáy nhọn, ngoài có nhiều gai, khichín màu vàng đỏ đẹp tươi Mùa quả vào tháng 6 đến tháng 2 năm sau Gấc nếp thìthưa gai hơn gấc tẻ Trong quả có nhiều hạt xếp thành những hàng dọc, quanh hạt

có màng màu đỏ máu, tươi Bóc lớp màng đỏ sẽ thấy hạt hình gần giống con ba banhỏ, ngoài có lớp vỏ cứng, mép có răng cưa Trong hạt có nhân trắng chứa nhiềudầu Nghiên cứu hiện đại cho biết trong nhân hạt gấc có 55,3% chất lipit (béo),16,6% chất protit (đạm), 1,8% tanin, 2,8% cenluloza, 6% nước, 2,9% chất vô cơ,2,9% đường, 11,7% chất khoáng Gấc có thể mọc hoang và được trồng khắp nơi ở

nước ta (Đỗ Huy Bích và cs., 2003).

Có nhiều giống cây gấc đang được trồng ở nước ta Tuy nhiên, trong sản xuấthiện nay chỉ phân biệt có hai loại gấc sau đây Sự phân biệt này chỉ có thể thực hiệnkhi cây gấc đã ra quả, phân biệt gấc nếp, gấc tẻ dựa vào đặc điểm quả gấc (Hình2.2)

Gấc tẻ: Quả to có vỏ nhiều hạt, vỏ trái có màu xanh gai to, ít gai, khi chínchuyển sang màu đỏ cam rất đẹp Bổ trái ra bên trong trái có màu vàng tươi, màng

đỏ bao bọc hạt có màu đỏ tươi rất đậm Nên chọn giống gấc nếp để có trái to nhiềunạc bao quanh và chất lượng màu cũng tốt hơn

Gấc nếp: Quả nhỏ hoặc trung bình, vỏ dày tương đối, ít hạt, gai nhọn, tráichín bổ ra bên trong cơm có màu vàng nhạt và màng đỏ bao bọc hạt thường có màu

đỏ nhạt hoặc màu hồng không được đỏ tươi đậm như gấc nếp

Hình 2.2 Phân biệt gấc nếp, gấc tẻ 2.1.3 Trồng trọt giống gấc

Cây gấc được trồng bằng hạt hoặc giâm cành Tuy nhiên gấc có thể được

nhân bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào cho hệ số nhân cao (Lê Văn Hòa và cs., 2009) Trồng bằng hạt có thể có cây toàn hoa đực không có quả, nhưng trồng

bằng dây đã cho quả, sẽ đảm bảo cây có quả 100% Gấc được trồng vào tháng 2 – 3dương lịch, chọn dây gần gốc có chiều dài 40-60cm, 2- 4 đốt tẩm vôi ở 2 đầu và đặtvào hố sâu, đã bón phân chuồng, rồi phủ một lớp đất mỏng Từ tháng 5 – 11, gấc sẽ

ra hoa, tạo quả, và chín dần từ tháng 7 tới tháng 1 – 2 năm sau Để gấc nhiều quả,nhất thiết phải tạo giàn, cây mọc không cao quá cho gấc leo Càng có điều kiệnvươn xa, và có ánh nắng mặt trời, gấc càng cho nhiều quả Mỗi cây gấc có thể tạo

ra 100-150 quả Cây gấc chu kỳ sống khoảng 10 – 20 năm Vào tháng 1, 2 khi gấc

đã rụng lá, có thể vẫn để dây gấc trên giàn, chỉ đốn các dây nhánh để nhân giốnghoặc đốn tới gốc, chỉ để lại 5-10cm, sang năm gốc lại phát triển và có thể sai quảhơn năm trước, nếu được bón đủ phân và tưới nước khi thời tiết nắng nhiều (Đỗ

Huy Bích và cs., 2003).

Thời vụ trồng gấc: Nếu chủ động tưới nước thì có thể trồng gấc quanh năm

Ở miền Bắc thời vụ trồng thường vào đầu tháng 2 dương lịch khi trời bắt đầu ấm áp

và đã có mưa xuân

2.1.4 Thành phần dinh dưỡng, công dụng, tác dụng của một số nhóm chất chính

2.1.4.1 Thành phần dinh dưỡng

Theo Stephen et al (2002), thành phần dinh dưỡng chính trong quả gấc

gồm: ß- carotene (175 µg/g thịt quả), lycopene (802 µg/g thịt quả), tổng carotenoids(977 µg/g thịt quả), lipid (102 µg/g thịt quả), hàm lượng nước của thịt quả (78 %khối lượng) Theo Vuong (2003), gấc có hàm lượng ß-carotene cao nhất trong tất

cả các loại trái cây với nồng độ 35,5 mg/100 g thịt quả Thịt quả gấc chứa nhiềuaxít béo (đa số là các axít béo chưa no) như oleic axít, palmitic axít, linoleic axít.Ngoài ra, phần thịt quả còn chứa nhiều dưỡng chất khác như: lycopene, zeaxanthin,ß-cryptoxanthin Trong đó, hàm lượng lycopene đạt đến 380 µg/g thịt quả, cao gấp

76 lần khoai tây (Ishida et al., 2004)

Trong quả gấc có dầu gấc Màng đỏ bao quanh hạt (áo hạt) của quả gấc chứađựng một lượng dầu gấc màu đỏ sẫm, chất sánh có mùi vị thơm đặc biệt, 100 g dầu

gấc có 150- 175 mg β-carotene, 4 g lycopene và 12 g α-tocopherol (vitamin E thiên

nhiên), 33,4% palmitic acid, 7,9% stearic acid Đặc biệt là 44% oleic acid và 14,7%linoleic acid là hai loại acid béo rất cần thiết cho cơ thể Dầu gấc còn chứa cácnguyên tố vi lượng cần thiết cho cơ thể như: sắt, đồng, colbalt, kali, và kẽm,…Hàm lượng vitamin A trong dầu gấc cao gấp 1,8 lần so với dầu gan cá thu, gấp 15lần so với củ cà rốt và gấp 68 lần so với quả cà chua (Đỗ Tất Lợi, 2003) Trong 1

ml dầu gấc có 30 mg β-carotene tương ứng với 50.000 đơn vị quốc tế vitamin A,

cao hơn so với gan cá thu (1ml dầu cá chứa 1.000 đơn vị vitamin A)

Trong nhân hạt gấc chứa 2,61% protein, 55,3% lipid, 2,9% đường, 1,8%tannin, 2,8 % cellulose Trong lá gấc có chứa vitamin E Trong rễ gấc chứa một sốsaponin triterpenoid: monordin I, monordin II, monordin III, monordin Ia,monordin Ib, monordin Ic,monordin Id, monordin Ie, monordin IIa, monordin IIb,monordin IIc, monordin IId, monordin IIe Trong thân củ gấc chứa chondrilasterol,

momorcochin (Hasan et al.,1987); cucurbitadienol, glucoprotein và glycosid (Đỗ

Tất Lợi, 2003)

2.1.4.2 Công dụng

Theo cách truyền thống người dân trồng gấc dùng quả để nấu xôi vì cho màu

đỏ rất đẹp lại bổ dưỡng hoặc dùng để nhuộm màu Hiện nay, việc sử dụng màu tựnhiên của quả gấc trong chế biến thực phẩm để thay thế cho các phẩm màu hoá họcdùng trong thực phẩm, nấu nướng, … là điều vô cùng quan trọng vì rất có lợi chosức khoẻ Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, quả gấc được ứng dụng để chếbiến ra nhiều sản phẩm là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao (Hình 2.3)

Hình 2.3 Các công dụng của gấc

Theo Đỗ Tất Lợi (2003), dầu gấc có tác dụng như những vị thuốc cóvitamin A, dùng bôi lên các vết thương, vết loét, vết bỏng làm cho da mau lành.Uống dầu gấc, người bệnh chóng lên cân, tăng sức đề kháng cho cơ thể, chống oxyhoá, làm chậm quá trình lão hoá kéo dài tuổi thanh xuân của con người, dùng chotrẻ em chậm lớn, phòng trị các chứng bệnh khô mắt, quáng gà Dầu gấc có nhữngtác dụng tuyệt vời như thế là do trong dầu gấc có nhóm carotenoid Đây là nhữngsắc tố tự nhiên có tác dụng kích thích sự tạo lập melanin và chống lại các gốc tự do

Chúng kích thích hệ miễn dịch và góp phần vào sự đổi mới các tế bào β-carotene

là tiền chất của vitamin A giúp chống lại sự hình thành collagen là loại enzyme huỷ

hoại cấu trúc của làn da Khi vào cơ thể, β-carotene trong quả gấc sẽ biến thành

carotene kích thích sự phân chia các tế bào ở đáy biểu mô làm cho tế bào da luônđược tái tạo Vì thế nếu thiếu vitamin A thì da dễ bị hiện tượng tăng sừng da vảy

cá, dày sừng chân lông, rụng tóc, tóc bạc sớm Trẻ em thiếu vitamin A sẽ giảm sức

đề kháng, khô mắt dẫn tới mù loà, … Vitamin A còn giúp tạo lập tế bào lympholàm tăng khả năng kháng nhiễm của cơ thể, do đó hạn chế các bệnh nhiễm trùng α-tocopherol có trong dầu gấc phòng ngừa sự lão hoá tế bào bằng cách khử các hoáchất độc hại cho cơ thể và cho da do tia cực tím và cải thiện sự dung nạp của da vớiánh nắng mặt trời Ngoài vai trò chống lão hoá toàn diện, α-tocopherol còn tác dụngtương hỗ với các tác dụng của vitamin C để phòng ngừa sự thoái hoá các acid béochính yếu của cơ thể Các bộ phận khác của cây gấc cũng có nhiều tác dụng tíchcực:

Rễ gấc: vị đắng, tính mát, có tác dụng trừ thấp nhiệt, hoạt huyết, lợi tiểu,chữa tê thấp, sưng chân

Hạt gấc: vị đắng, hơi ngọt, tính ôn, hơi có độc, vào 2 kinh can và đại tràng.Dùng chữa các chứng bệnh ung thũng, mụn nhọt độc, tràng nhạt, eczema, viêm dathần kinh, trĩ, phụ nữ sưng vú, hậu môn sưng thũng, chữa chai chân, chữa sangchấn đụng giập trong những trường hợp bị ngã, bị thương, tụ máu

Lá gấc: dùng làm thuốc tiêu sưng tấy

2.1.4.3 Tác dụng của một số nhóm chất chính trong gấc

Màng hạt gấc và dầu gấc là nguồn chính cung cấp β-carotene và lycopene

Phân tích 3 quả gấc trồng ở Việt Nam (Vuong và cs., 2003) đã thu được hàm lượng

trung bình của carotene là 83,3 µg/g và lycopene là 408 µg/g trọng lượng tươi Cómột số nghiên cứu phân tích hàm lượng carotenoids trong quả gấc chỉ ra sự khácnhau đáng kể trong số các nghiên cứu này Chẳng hạn, Vien (1995) phát hiện mức

độ β-carotene tổng số là 458 µg/g trong phần ăn được, trong khi Aoki et al (2002)

thông báo hàm lượng là 101 µg/g Hàm lượng carotenoid tổng số dao động từ 481

(Aoki et al., 2002) đến 2.926 µg/g (Ishida et al., 2004).

2.2 CÁC CHỈ THỊ TRONG ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN

2.2.1 Chỉ thị hình thái

Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựngđược một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy

đủ và toàn diện Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự đa dạng giữa các

cá thể trong quần thể và giữa các quần thể được xác định thông qua đánh giá cácđặc điểm hình thái nổi trội (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ phận…) Với

ưu điểm như dễ dàng tiếp cận và nghiên cứu, không đòi hỏi thiết bị đặc biệt cũngnhư quy trình thực hiện phức tạp, chỉ thị hình thái được sử dụng khá rộng rãi trongnghiên cứu đa dạng di truyền thực vật Trong đánh giá và chọn tạo giống truyềnthống, chỉ thị hình thái được áp dụng phổ biến và khá hiệu quả ở một số loại câytrồng như lúa, ngô, đậu tương

Tuy nhiên, còn có những nhược điểm ảnh hưởng đến tính chính xác cũngnhư hiệu quả của chỉ thị hình thái Thứ nhất, số lượng chỉ thị rất hạn chế (so với cácloại chỉ thị khác) trong khi các đặc điểm hình thái lại chịu tác động rất lớn của môitrường cũng như phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng phát triển của đối tượngnghiên cứu Mức độ tin cậy của công tác đánh giá đa dạng di truyền phụ thuộc vào

số lượng các chỉ thị được xét tới, do số lượng chỉ thị hình thái không đủ nhiều nênkết quả thu được cũng không chính xác Bên cạnh đó, do tính biến thiên của cácđặc điểm hình thái theo điều kiện môi trường và giai đoạn sinh trưởng nên kết quảthường có sự sai lệch giữa các lần đánh giá hoặc trong điều kiện đánh giá khácnhau Thứ hai, việc đánh giá kiểu hình mang tính chất thống kê nên cần thực hiệntrên số lượng lớn đối tượng để đảm bảo độ chính xác Chính vì vậy sẽ cần diện tíchđất đai lớn cũng như nhiều nhân lực và thời gian để gieo trồng và đánh giá đốitượng Cuối cùng, do đặc điểm dựa trên kiểu hình để đánh giá kiểu gen nên chỉ thịhình thái không thể là thước đo chính xác để đánh giá tính đa dạng di truyền giữacác cá thể, nhất là khi không phải toàn bộ các gen đều thể hiện ra kiểu hình có thể đođếm được Hiện nay, tuy có nhiều nhược điểm và trong bối cảnh chỉ thị DNA được

sử dụng phổ biến hơn, nhưng chỉ thị hình thái vẫn được áp dụng khá hiệu quả trongđánh giá đa dạng di truyền (đặc biệt đối với các đối tượng mà chỉ thị phân tử chưa cónhiều) hoặc trong nghiên cứu lập bản đồ liên kết phục vụ chọn tạo giống cây trồng

như ở lúa (Lã Tuấn Nghĩa và cs., 2000; Zeng et al 2003, Hugo et al 2005)

2.2.2 Chỉ thị hóa sinh

Protein và các hoạt chất trao đổi khác là sản phẩm của quá trình biểu hiệngen ở sinh vật Nghiên cứu sự khác biệt trong thành phần của các sản phẩm này cóthể giúp xác định những khác biệt về mặt di truyền giữa các cá thể và loài khácnhau Josh and Ranjekar khẳng định điện di protein trên gel là phương pháp hữahiệu có thể giúp phân biệt, nhận diện giữa các loài và phân loại sinh vật Các

protein, sản phẩm trao đổi chất… được sử dụng như những chỉ tiêu đánh giá, phânbiệt các sinh vật được gọi là chỉ thị hóa sinh Chỉ thị hóa sinh được sử dụng phổbiến nhất là các isozyme (các enzyme có trình tự amio acid khác nhau nhưng cùngxúc tác cho một phản ứng hóa học) Isozyme được trích ly, tinh sạch và điện di trêngel Các thành phần trong gel biến tính (thường là SDS) phá vỡ các cấu trúc bậccao của chuỗi amino acid và khi đó dưới tác động của điện trường, các isozymebiến tính sẽ phân tách trên gel dựa trên khối lượng và độ tích điện Từ sự đa hìnhgiữa các băng điện di thu được sẽ giúp nhận diện từng các thể và đánh giá được sự

đa dạng trong quần thể nghiên cứu

So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị hóa sinh đáng tin cậy hơn bởi mỗi protein

là sản phẩm của một gen, do đó sự đa hình các protein cũng phản ánh gián tiếp sự

đa hình trong kiểu gen của sinh vật Tuy nhiên, đối với các cá thể có quan hệ ditruyền gần gũi (đặc biệt là giữa các giống cây trồng) thì các sản phẩm biểu hiện gen(protein, enzyme ) không cho sự đa hình rõ ràng Đây là một nhược điểm của chỉthị hóa sinh cùng với tính không độc lập với điều kiện môi trường (do quá trìnhbiểu hiện gen thay đổi ở các điều kiện sinh trưởng khác nhau) và số lượng chỉ thị đahình không phong phú Bởi vậy trong hầu hết những nghiên cứu đa dạng di truyềnngày nay, chỉ thị DNA được sử dụng phổ biến hơn cả

2.2.3 Chỉ thị phân tử DNA

Chỉ thị phân tử DNA là đoạn DNA hoặc trình tự gen nằm trên NST của nhân

hoặc ty thể, lạp thể liên kết với gen hoặc tính trạng (Srivatsava et al, 2009) Chỉ thị

phân tử DNA có chính xác và tin cậy cao bởi vì thông tin di truyền là duy nhấtkhông phụ thuộc vào tuổi, các điều kiện sinh lý và môi trường Chỉ thị phân tửDNA là công cụ rất hữu ích trong nghiên cứu phân loại, nhận dạng, sinh lý học,phôi học, chọn tạo giống cây trồng, sinh thái học, kỹ thuật di truyền Chúng cũngđược sử dụng để xác định độ thuần của hạt giống và phân tích tiến hóa, quan hệ họ

hàng (Tharachand et al, 2012) Các loại chỉ thị này đang được sử dụng để nhận biệt

loài, phân tích mối liên quan di truyền giữa các loài, giữa các giống trong loài, các

cá thể trong một loài, mối quan hệ di truyền với hàm lượng các hoạt chất có hoạttính sinh học trong cây thuốc Chỉ thị DNA dựa trên nguyên lý của phản ứng PCR,

sử dụng các loại mồi oligonucleotide khác nhau (mồi ngẫu nhiên, mồi đặc hiệu)nhằm nhân lên các vùng trình tự DNA, nhiều chỉ thị DNA đã được phát triển và

ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền như RAPD (Williams et al, 1990; Caetanos-Anolles et al, 1991), SSR (Litt & Luty, 1989), AFLP (Zabeau et al,

1993), SNP (Lai et al., 1998) Các chỉ thị này đã được ứng dụng và mang lại

những kết quả đáng tin cậy, có giá trị không chỉ với nghiên cứu đa dạng di truyền

mà còn với nhiều lĩnh vực công nghệ sinh học nông nghiệp khác Nghiên cứu tổnghợp của Joshi (1995) và Weising (2005) đã đề ra những đặc điểm và cũng là tiêuchuẩn cho các loại chỉ thị DNA như sau:

Có mức độ đa hình cao

Di truyền đồng trội (cho phép phân biệt cá thể đồng hợp tử- dị hợp tử)

Phân định rõ ràng giữa các alen

Tần suất xuất hiện trong hệ gen cao

Phân bố đều trên hệ gen

Có trạng thái trung tính (không chịu tác động đa gen)

Dễ dàng tiếp cận đánh giá

Có thể phân tích nhanh và đơn giản

Khả năng tái lặp cao

Kết quả có thể trao đổi dễ dàng giữa các cơ sở nghiên cứu

Có chi phí phát triển và thực hiện thấp

Cho đến nay có thể khẳng định rằng không một chỉ thị DNA nào có thể đápứng được đầy đủ các tiêu chuẩn trên Tuy nhiên hoàn toàn có thể chọn lựa trong sốnhững chỉ thị này một hay một vài chỉ thị mang những đặc điểm đáp ứng được yêucầu nghiên cứu với từng đối tượng cụ thể

Thực vật dùng làm thảo dược luôn cần được xác định ở cấp độ loài, vì vậy,xác định chính xác là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về chất lượng sảnphẩm và có tầm quan trọng trong việc nghiên cứu các đặc tính của sự đa dạng ditruyền, phát sinh loài và phát sinh vùng địa lý cũng như bảo vệ các loài có nguy cơtuyệt chủng Cùng với sự phát triển của thị trường thảo dược, sự giả mạo cácnguyên liệu thảo dược thuốc cũng trở thành vấn đề toàn cầu Các nguyên liệu thảodược này có thể được thay thế bằng các loại thảo mộc khác có quan hệ họ hàng gầngũi, thậm chí từ những nguyên liệu giả mạo Việc giả mạo các nguyên liệu thảodược thường là do: (i) vật liệu không phân biệt được bằng đăc điểm hình thái (ii)những vật liệu có tên tương tự nhau, và (iii) việc thay thế những nguyên liệu có giátrị kinh tế bằng nguyên liệu khác rẻ tiền hơn Tuy nhiên, việc xác định chính xáccác nguyên liệu thảo dược làm thuốc theo phương pháp truyền thống như sự đánh

giá cảm quan và phương pháp hóa học đôi khi gặp nhiều khó khăn, đặc biệt lànhững nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật đã được chế biến một phần hoặc ởdạng bột Vì vậy, phương pháp sử dụng các dấu chuẩn phân tử rõ ràng là chính xác

và phổ biến hơn Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dược sử dụng các chỉ thị phân

tử DNA có thể bảo vệ người dụng tránh khỏi tác dụng độc hại của các loại thuốcgiả mạo, đặc biệt trong nhiều trường hợp có thể nguy hiểm đến tính mạng Dướiđây trình bày một số vùng gen đặc thù đã được nghiên cứu và ứng dụng đối với cáccây dược liệu, trong đó có gấc

2.2.4 Đặc điểm một số gen sử dụng trong nghiên cứu.

Vùng gen ITS (Internal transcribed spacer).

rDNA là nhóm gen mã hoá rRNA của ribosome và đóng vai trò quan trọng

trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài rDNA được nghiên cứu vì nó là gen cónhiều bản sao và đặt biệt không mã hoá cho bất kỳ protein nào Các bản sao củagen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hoá.Ribosome hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc Phần lớn phân

tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và cáckhác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau Các primer thiết kế dựa trên nhữngOligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếchđại các vùng tương đương dùng trong so sánh Ngoài ra, nhiều primer và probecũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và địnhdanh vi sinh vật (Howe et al., 2008)

rDNA chứa vùng 18S, ITS1, 5,8S (một tiểu đơn vị ribosome nhỏ hơn trởthành một phần của LSU), ITS2, 28S và vùng IGS (intergenic spacer) Vùng phiên

mã 18S kết thúc tiểu đơn vị nhỏ (SSU), trong khi 28S cộng với 5,8S và một gen 5Sthêm vào từ những phần khác của genome hình thành tiểu đơn vị lớn (LSU) củaribosome RNA Những vùng ITS được phiên mã (tổng hợp từ RNA), nhưng bị cắttrước khi rRNA hoàn thiện được hình thành, tuy nhiên ITS lại có chức năng trong

sự hình thành ribosome (Rainey et al., 1996) Sơ đồ vùng ITS (Rainey et al., 1996).

được mô tả như trong Hình 2.4

Hình 2.4 Sơ đồ vùng ITS của gen ribosome trong DNA nhân thực vật bậc cao.

Vùng ITS là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sửdụng trong nghiên cứu tiến hoá của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trênvùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hoá trong cùng loài (Howe

et al , 2008).

Phân loại và nhận dạng các giống cây thuốc dựa vào đặc điểm hình thái, sinhhóa thường không chính xác Việc so sánh dựa trên trình tự nucleotid vùng ITS –rDNA có thể sử dụng để phân loại, nhận dạng các giống cây thuốc chính xáchơn, cũng như xác định tính đa dạng di truyền của các quần thể trong cùng loài.Vùng ITS1 và ITS2 được tìm thấy giữa gen của tiểu đơn vị ribosome nhỏ (18S)

và tiểu đơn vị ribosome lớn (28S) chỉ ra sự khác nhau của các giống, quần thểtrong cùng loài

Gen psbA

Gen psbA nằm trong DNA của lục lạp Ở thực vật bậc cao, gen psbA mã hóacho protein D1 là trung tâm phản ứng quang hóa II Vùng đệm psbA - trnH thườngđược sử dụng cho nghiên cứu phân loại Vùng này có kích thước xấp xỉ 450 bp, xácsuất nhân bản thành công rất cao (100% với các loài đã được nghiên cứu) Mức độkhác biệt trình tự nucleotide giữa các loài là 1,24% và sự khác biệt bên trong loàirất thấp từ 0,00% – 0,08% Trình tự psbA - trnH cũng đã được công bố trên ngân hànggen với nhiều loài khác nhau thuộc thực vật hạt trần, dương xỉ, rêu và rêu tản Trìn tự

gen trnH, psbA được coi là trình tự hữu ích để phân biệt các loài thảo mộc với loài giả mạo nó Nó được dùng để phân biệt loài giả mạo Shihu Bulbophyllum odoratissimum (Sm.) Lindl ex Hook.f (Orchidaceae) có nguồn gốc từ chi Dendrobium Sw với tỷ lệ

sai khác trong trình tự là từ 2% đến 3,1% (Rogers et al., 2009)

Gen trnL

Là gen mã hoá cho tRNA vận chuyển Leucine trong lục lạp, có kích thước

từ 452 bp đến 528 bp với các loài thuộc họ đậu Gen này được sử dụng nhiều trongnghiên cứu phân loại phân tử Các kết quả thu được trong các nghiên cứu nguồngốc phát sinh loài sử dụng gen trnL cho thấy đây là một vùng DNA hữu ích chophân loại và đánh giá đa dạng di truyền ở nhiều loài thực vật

Gen rbcL (Ribulose – 1,5 – Bisphosphate Carboxylase/oxygenase (Rubisco))

Đây là gen mã hóa cho protein đệm trong lục lạp Protein này có 8 tiểu phầnlớn (trọng lượng 55 kDa) và 8 tiểu phần nhỏ (12 kDa) giống nhau Các tiểu phầnlớn được mã hoá bằng gen lục lạp (rbcL), còn các tiểu phần nhỏ mã hoá bằng gennhân Riêng đối với tảo nâu và tảo đỏ đã phát hiện thấy gen lục lạp mã hoá cho tiểuphần nhỏ Các gen rbcL ở thực vật bậc cao không có intron Các gen này đượcdùng nhiều trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại Hình 2.5 mô tả môhình không gian Rubisco với các tiểu phần lớn màu trắng và xám, tiểu phần nhỏmàu xanh và cam (Cooper and Geoffrey, 2000)

Hình 2.5: Mô hình không gian của RuBisCO với các tiểu phần lớn, tiểu phần nhỏ

Vùng rbcL nằm trong DNA của lục lạp Mức độ biến đổi thấp giữa các loài

khác nhau nhưng rbcL vẫn có thể cho phép nhận dạng dược liệu thảo dược với loại giả mạo nó Ví dụ, thảo dược dương xỉ "Mianmaguanzhong" có nguồn gốc từ Dryopteris crassirhizoma Nakai (Dryopteridaceae) có 19 nucleotide là đa hình trong trình tự rbcL khi đối chiếu với loài giả mạo.

2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU GẤC TRÊN THẾ GIỚI

Màng hạt gấc và dầu gấc là nguồn chính cung cấp β-carotene và lycopene

Phân tích 3 quả gấc trồng ở Việt Nam (Vuong et al., 2003) đã thu được hàm lượng

trung bình của carotene là 83,3 ug/g và lycopene là 408 ug/g trọng lượng tươi Có

một số nghiên cứu phân tích hàm lượng carotenoids trong quả gấc chỉ ra sự khácnhau đáng kể trong số các nghiên cứu này Chẳng hạn, Vien (1995) phát hiện mức

độ β-carotene tổng số là 458 ug/g trong phần ăn được, trong khi Aoki et al (2002)

thông báo hàm lượng là 101 ug/g Hàm lượng carotenoid tổng số dao động từ 481

(Aoki et al 2002) đến 2.926 ug/g (Ishida et al 2004)

Tại Hoa Kỳ, nghiên cứu sử dụng liều cao -caroten trong điều trị bệnh nhân-caroten trong điều trị bệnh nhânHIV pha II 120mg/ngày và tăng nhiệt độ cơ thể 42oC trong 1h, tắm hơi đã tăng khảnăng phục hồi T-helper CD4/CD8 đáp ứng tốt miễn dịch, giảm quá trình tiến triểnHIV - AIDS, đồng thời tăng khả năng đáp ứng miễn dịch của văcxin Vitamin E vàLycopen cùng với lutein, zeaxanthin, -cryptoxanthin trong quả gấc có tác dụng-caroten trong điều trị bệnh nhântrung hòa các gốc tự do, gốc peroxyt trong cơ thể, phòng và điều trị nhồi máu cơtim, đột quỵ, nguy cơ gãy xương ở phụ nữ, đặc biệt phụ nữ sau mãn kinh, bị bệnhđái tháo đường, ung thư vú, tuyến tiền liệt, dạ dày, ung thư gan, xơ gan và phòngbệnh mãn tính, kéo dài tuổi thọ Acid lonoleic (omega-6) còn gọi là vitamin F, acidlinolenic (omega- 3) có ít hơn trong dầu gấc đã giúp sự phát triển sớm về trí tuệ vàthể lực, đặc biệt đối với trẻ em, giúp phòng bệnh tim mạch, huyết áp, xơ vữa độngmạch, do điều hoà chuyển hoá, giảm hàm lượng colesterol trong cơ thể, chữa bệnhngoài da, bệnh rối loạn, thoái hoá thần kinh trung ương, bệnh Ahzheimer sa sút trítuệ ở tuổi trung niên và miễn dịch Dầu gấc còn kích thích sự phát triển hình thànhlớp mô mới làm cho vết thương mau lành, dùng điều trị rất tốt các vết bỏng, loét vànứt kẽ vú, dùng cho bệnh nhân bị ung thư sau khi cắt bỏ khối u, sau hoá trị và xạ trị

(Ishida et al 2004) Hình 2.6 mô tả cấu trúc hóa học của β-carotene và lycopene.carotene và lycopene.

β–carotene

Lycopene

Hình 2.6 Cấu trúc hóa học của β-carotene và lycopen trong quả gấc.carotene và lycopen trong quả gấc.

Các nhà khoa học Mỹ nghiên cứu dầu gấc Việt Nam đã kết luận: Các hợpchất -caroten, lycopen, α-tocopherol có trong dầu gấc có khả năng làm vô hiệu

hoá 75% các chất gây ung thư trong cơ thể, nhất là ung thư vú ở phụ nữ Với thếgiới hiện nay, quả cà chua là cứu cánh cho vấn đề ung thư tiền liệt tuyến bởi hàm

lượng lycopen chứa trong quả Quả gấc Việt nam có hàm lượng lycopen và caroten cao gấp 70 lần cà chua (Vuong et al 2002)

β-Nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học Mỹ cho thấy quả gấc được trồngtại miền Bắc Việt nam có hàm lượng -caroten cao nhất so với quả gấc được trồng

ở các nước khác như Trung Quốc và Ấn Độ Bởi vì miền Bắc Việt Nam hội tụ bởithời tiết của 4 mùa Xuân, Hạ, Thu, Đông Quả gấc là một trong những nguồn dượcliệu tốt nhất do thiên nhiên ban tặng cho con người Quả gấc chứa hàm lượng -caroten cao gấp 15 lần so với củ cà rốt và gấp 68 lần so với quả cà chua Ngoài ra,quả gấc cũng chứa các chất với hàm lượng cao như lycopen, Alphatocopherol, cácchất béo Quả gấc được chế biến làm thực phẩm, thuốc có khả năng miễn dịch,chống oxi hoá, tăng sức đề kháng cho cơ thể và làm vô hiệu hoá các chất gây ungthư, chống lão hoá tế bào, đặc biệt làm chế phẩm dưỡng da, giúp da hồng hào, tươitrẻ (Vuong et al 2002)

Lớp màng mỏng bọc hạt của quả Momordica cochinchinensis chứa giữa

17,000 - 35,000.mu.g β-carotene /100 g trọng lượng tươi, phụ thuộc vào sự chíncủa quả Số lượng lycopen trong lớp màng mỏng bọc hạt của quả gấc thay đổi giữa

2 -5 lần của chất β-caroten (35,000 -175,000.mu.g/ 100g) Khoảng 40% trọnglượng khô là dầu β-carotene có tác dụng giúp tăng cường thị lực, tăng sức đềkháng, giảm LDL cholesterol và phòng ngừa các bệng lý tim mạch Lycopene cótác dụng phòng chống ung thư, các bệnh tim mạch, lão hóa Hàm lượng lycopenetrong gấc khoảng 308μg/g, gấp mười lần so với trái cây giàu lycopene như cà chua.Trái gấc cũng có hàm lượng acid béo rất cao, từ 17 - 22% (tính theo trọng lượng)

(Vuong và King., 2003; Ishida et al 2004) Dầu gấc có chứa nồng độ carotenoids

cao, giàu β-caroten và rất giàu vitamine E, acid béo trong quả gấc rất quan trọngcho việc hấp thu các chất dinh dưỡng hòa tan trong dầu (Vuong & King., 2003)

Gấc có màu đỏ của lycopen và màu vàng của -caroten với hàm lượng caogấp nhiều lần so với các loại thực phẩm khác đang được sử dụng phổ biến trên thếgiới Năm 1941, lần đầu tiên Bùi Đình Sang và F Guichard, trường ĐH Dược HàNội đã chiết từ màng đỏ quả gấc và nhận thấy hàm lượng carotenoid (tiền vitaminA) rất cao, gấp hàng chục lần so với củ cà rốt, quả cà chua và dầu cọ đỏ Tiếp đó,Bùi Đình Oánh đã sử dụng kỹ thuật công nghiệp để ép dầu gấc xuất sang Pháp Vềsau, Nguyễn Văn Đàn, Đinh Ngọc Lâm, Hà Văn Mạo đã nghiên cứu phân tích bổ

sung thành phần carotenoid trong quả gấc và sử dụng trong lâm sàng để phục vụnhu cầu phòng bệnh và điều trị vết thương, đề phòng ung thư gan nguyên phát(Vuong, 2000).

Một số nghiên cứu về sinh học phân tử ở gấc đã được thực hiện Bootprom

và cs (2012) đã nghiên cứu mối quan hệ di truyền 25 mẫu giống gấc trong đó có 23

mẫu giống gấc thu thập ở Thái Lan và 2 mẫu giống gấc thu thập ở Việt Nam Hệ sốtương tự di truyền dao động từ 0,63-0,90% và cho thấy có thể sử phân biệt cây cái

và đực bằng chỉ thị DNA và khẳng định biểu hiện giới tính ở gấc có liên quan đếnchỉ thị PCR-RAPD

Hyun et al (2012) đã nghiên cứu sàng lọc những gen liên quan sinh tổng hợp carotenoid ở gấc Bharathi et al (2011) đã phân tích phân loại tế bào học một

số loài trong chi Momordica đang được trồng ở Ấn Độ, kết luận rằng loài Momordica cochinchinensis là nhị bội có 2n=28 NST Mặc dù có rất nhiều nghiên

cứu về gấc nhưng chưa có nghiên cứu nào phân tích mối liên hệ giữa các giống gấcbằng phân tích trình tự vùng ITS để từ đó chọn lọc ra các giống gấc có năng suất vàhàm lượng hoạt chất cao

Cho đến nay đã có một số nghiên cứu xác định trình tự vùng ITS, đánh giá

đa dạng di truyền, mối liên quan hệ di truyền các giống và quần thể trong loài cây

thuốc Li et al (2012) đã nghiên cứu xác định đa dạng di truyền trong 8 quần thể của loài ngưu tất (Achyranthes bidentata) họ Amaranthaceae thu thập từ 8 vùng của

3 tỉnh của Trung Quốc trên cơ sở trình tự vùng ITS của gen ribosome DNA nhân,

làm cơ sở bảo tồn và chọn tạo giống ngưu tất Choudhary et al (2011) đã nghiên cứu đa dạng di truyền trong các quần thể loài cây thuốc Persicaria barbata (L.) H Hara ở Ấn Độ trên cơ sở trình tự vùng ITS của gen ribosome DNA nhân Xu et al.

(2009) đã nghiên cứu so sánh trình tự vùng ITS của gen ribosome DNA nhân và

hàm lượng tanshinones giữa các quần thể đan sâm (Salvia miltiorrhiza) và các loài trong chi Salvia

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU GẤC Ở VIỆT NAM

Cách đây khoảng 200 năm, nhà thực vật học người Bồ Đào Nha J Lourciso

đến nước ta đã phát hiện ra cây gấc và đặt tên khoa học là Momordica cochinchinesis.

Các lương y Việt Nam từ lâu đã biết đến tác dụng chữa bệnh của cây gấc Rễ gấcchữa ung nhọt, nhọt đầu đinh, viêm tuyến hạch Màng đỏ hạt gấc chữa bệnh trẻ em

chậm lớn, khô mắt, quáng gà, kém ăn, mệt mỏi Hạt gấc chữa quai bị, trĩ, làm tan

khối tụ máu do chấn thương (Đỗ Huy Bích và cs., 2003)

Quả gấc ngoài việc được sử dụng làm thực phẩm theo truyền thống như nấuxôi, bánh cáy thì còn được khai thác để chế biến thành màng hạt gấc, dầu gấc vàcác sản phẩm từ dầu gấc Trong đó phải kể đến các ví dụ điển hình như: Nôngtrường Lục Ngạn (thuộc Tổng công ty xuất nhập khẩu rau quả) sản xuất màng gấcđông lạnh để xuất khẩu Công ty Dược vật tư y tế Hải Dương sản xuất dầu gấc đểbào chế viên nang dầu gấc cũng như cung cấp cho các công ty dược phẩm trongnước Công ty chế biến dầu thực vật và thực phẩm Việt Nam (VNPOFOOD) củaBác sĩ Nguyễn Công Suất sản xuất dầu gấc và các sản phẩm từ dầu gấc Nhu cầusản xuất dược liệu từ gấc, vùng trồng gấc cung cấp nguyên liệu cho công ty Dượcđang được xây dựng trên diện tích lớn Do đó yêu cầu về giống gấc có năng suất vàchất lượng cao để nông dân canh tác là rất cần thiết

Gấc là một thực phẩm và là thuốc độc đáo ở Việt Nam Theo các nghiên cứutrước đây, các hợp chất có trong gấc bao gồm flavoniod, lipid, axit béo, protein,đường, tanin và một số thành phần khác, trong đó các thành phần có hàm lượng cao

và có ý nghĩa nhất là lycopene, β-carotene (tiền vitamin A) và α-tocopherol (vitaminE) Kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy lượng lycopene và β-carotene trong quả gấcvẫn ổn định khi lưu trữ trong 1 tuần lễ, nhưng nó giảm sau 2 tuần Gấc là cây dễtrồng, dễ phát triễn trên nhiều loại đất, ít bị nhiễm sâu bệnh, nếu chăm sóc tốt lại có

thể sống và cho trái từ 10 đến 15 năm (Đỗ Huy Bích và cs., 2003).

Ngày nay, chọn giống cây trồng được áp dụng cho các loài nhằm chọn đượcnhững giống cho năng suất, chất lượng góp phần tăng sản lượng lương thực chocon người Chọn giống thành công có thể đạt được bằng phương pháp chọn tạogiống đơn giản như chọn lọc cá thể mang các đặc tính mong muốn từ những cá thểtrong quần thể tự nhiên

Cho đến nay đã có một số Đề tài, Dự án nghiên cứu về chọn giống gấc ở nước

ta Dương Minh và cs (2006) thu thập được 24 dòng gấc tại một số địa phương trong

nước Các tác giả đã chọn được dòng gấc OM3 có các đặc điểm nông học thích hợpcho nhân giống và cung cấp nguyên liệu tốt cho việc chế biến gấc Kết quả chọnđược dòng gấc tốt của thí nghiệm này cần được khảo sát trong thực tế đồng ruộngcũng như xác định phẩm chất trái qua hàm lượng beta-carotene, lycopene trong màngthịt gấc

Trần Huỳnh Khanh và cs (2012) đã nghiên cứu so sánh năng suất và phẩm chất của ba dòng gấc (Momordica conchinchinesnsis (Lour.) Spreng) trên đất phù

sa Eutric – Haplic – Gleysol, tại Khu II Đại học Cần Thơ Kết quả nghiên cứu chothấy ba dòng gấc sinh trưởng tốt có thời gian phát triển trái 82 – 109 ngày, trọnglượng trái khoảng 1,08 – 1,46 kg và năng suất đạt được 7,8 – 12,5 tấn/ha-1, trong đódòng OMC có trọng lượng trái, năng suất cao nhất 12,5 tấn/ha-1 Hàm lượng beta-carotene ở ba dòng biến động trong khoảng 133,3 – 764,3µg.g-1 cơm tươi, dòngOMX có hàm lượng β-carotene 764,3 µg.g-1 cao nhất Lượng lycopene trong 3dòng biến động 840 - 1223 µg.g-1 cơm tươi, không khác biệt ý nghĩa Dòng OMC

có năng suất cao, hàm lượng lycopen khá, do đó được đề nghị là giống có triểnvọng phát triển trên diện tích rộng trong sản xuất Sản xuất dược phẩm liên quanđến beta – carotene thì dòng OMX thích hợp cho canh tác

Dương Văn Chính và cs (2011) đã nghiên cứu và tuyển chọn cây gấc (Momordica cochinchinensis) cao sản thích ứng với Đồng bằng sông Cửu Long.

Họ đã khảo sát ở vùng trồng ở 13 tỉnh và đã chọn được 5 dòng gấc cao sản chonăng suất cao (trọng lượng trái, bề dày cơm, đường kính của ruột trái, tỷ lệ màng bọchạt ), phù hợp với điều kiện tự nhiên, thổ nhưỡng của thành phố Cần Thơ là: DanhLỹ-AG, ĐHCT 1, Redbi-DVC, Redme-DVC, Thị Bài-KG Trong đó, 2 dòng gấc caosản Danh Lỹ-AG, ĐHCT 1 chứa hàm lượng dinh dưỡng β-carotene và lycopene cao.Bên cạnh đó, Ban Chủ nhiệm đề tài cũng đã xây dựng được quy trình kỹ thuật nhândòng gấc thông qua các phương pháp chiết cành và nuôi cấy mô tế bào

Tại Viện Dược liệu, Phạm Hồng Minh và cs., (2013) đã đánh giá đặc điểm nông sinh học của một số mẫu giống gấc (Momordica cohinchinensis (Lour.)

Spreng) được triển khai tại Trung tâm nghiên cứu cây thuốc Hà Nội, bố trí thínghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên không nhắc lại, diện tích ô thínghiệm 50 m2 Các mẫu giống sau khi đã phân lập được đặt tên theo ký hiệu là G2,G3, G4, G5, G6, G7 và G8 Kết quả nghiên cứu cho thấy : Các mẫu giống khácnhau cho kích thước hoa khác nhau Trong đó mẫu giống G5 có kích thước hoa lớnnhất so với các giống khác Theo dõi kích thước của bầu hoa đã chỉ ra: bầu hoa củamẫu giống G6 có kích thước lớn hơn các mẫu giống G2, G3, G4, G5, G7 và G8.Xác định về hình thái quả khi thu hoạch cho thấy: mẫu giống G7 có kích thước quả

lớn hơn các mẫu giống còn lại Như vậy các mẫu giống khác nhau đã biểu hiện

hình thái của hoa, bầu hoa và quả khác nhau Đây là một trong những chỉ tiêu quan

trọng để nhận biết giống, phục vụ cho công tác chọn tạo giống dựa trên cơ sở biểuhiện của kiểu hình

Một số nghiên cứu đã xác định trình tự vùng ITS của gen ribosome DNAnhân Chẳng hạn, Nhân Dũng và Đỗ Tấn Khang (2009) đã nghiên cứu đa dạng ditruyền 36 giống soài ở Việt Nam và Thái Lan bằng phân tích trình tự vùng ITS củagen ribosome nhân và AFLP

Với hiểu biết của chúng tôi, có ít nghiên cứu ở nước ta về nghiên cứu đadạng di truyền DNA của các giống gấc trên cơ sở trình tự các vùng gen trên DNA

nhân và lục lạp như ITS, trnL, rpl20, rbcL, psbA phục vụ bảo tồn, chọn tạo giống

gấc cho năng suất và hoạt chất cao bằng phương pháp sinh học phân tử

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đề tài nghiên cứu khoảng 14 giống gấc thu thập từ 12 tỉnh miền núi, trung

du, đồng bằng Bắc Bộ, Tây Nguyên và Nam Bộ Tập đoàn giống được trồng tạiTrung tâm nghiên cứu cây thuốc Hà Nội- Viện Dược liệu (Thanh Trì – Hà Nội)(Bảng 3.1)

Bảng 3.1 Danh sách nguồn gốc các mẫu giống gấc và nguồn gốc thu thập

STT Kí hiệu Nguồn gốc thu thập (Tỉnh/ Thành phố)

12 M12 Ninh Bình

3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Luận văn được tiến hành tại Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, Bộ Nôngnghiệp & PTNT và Trung tâm Nghiên cứu cây thuốc Hà Nội - Viện Dược liệu, Bộ

3.4.2 Thiết bị

Thiết bị nghiên cứu gồm có micropippette, lò vi sóng, cân điện tử 4 số,máy điện di, máy chụp và phân tích gel loại Gel DocIt2, máy thermal cycle (thựchiện phản ứng PCR), máy quang phổ hấp thụ UV- 1800 (Shimadzu), máy li tâm, bể

ổn nhiệt, máy khuấy từ và các loại máy móc, thiết bị khác

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách chiết từ mô lá tươi theo phương pháp CTAB củaDoyle (1987): lấy 0,25 g mẫu lá non tươi nghiền trong nitơ lỏng bằng cối chày sứđến bột mịn và chuyển vào ống eppendorf loại 1,5 ml Thêm vào 750 μl dung dịch

đệm chiết DNA, trộn đều và ủ ở 65oC trong bể ổn nhiệt, trong thời gian 1 giờ.Thêm 750 μl phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1), và trộn nhẹ nhàngbằng cách đảo ngược các ống trong 15 phút, sau đó ly tâm mẫu 10 phút ở nhiệt độ

4oC, 10.000 vòng/phút Chuyển phần dịch phía trên sang ống eppendorf mới Quátrình chiết lặp lại lần 2 Tủa DNA với 2/3 isopropanol lạnh Li tâm 10.000vòng/phút ở nhiệt độ 4oC trong vòng 10 phút Rửa tủa DNA bằng cồn 70o 3 lần.Làm khô mẫu trong điều kiện phòng DNA tổng số được hòa tan trong 50 µl H20hoặc đệm TE Xử lý bằng enzyme RNase I để loại bỏ hết RNA trong mẫu

Chất lượng DNA tổng số được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%,với hiệu điện thế 90V, thời gian 30 phút trong dung dịch đệm TAE Sau đó gelđược nhuộm trong Ethilium Bromide 4 µl (10 mg/ml) trong thời gian 30 phút sau

đó băng DNA được kiểm tra dưới đèn UV và chụp ảnh bằng máy chụp và phân tíchgel loại Gel DocIt2 của Hãng UVP, Hoa Kỳ

3.5.2 Khuếch đại các vùng gen của gấc bằng kỹ thuật PCR

Mồi được thiết kế theo White et al (1990) Trình tự mồi được thiết kế trên

cơ sở trình tự gen của gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng đã được công bố trên ngân hàng gen gồm: ITS, trnL, rpl20, rbcL, psbA (Bảng 3.2)

Bảng 3.2 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Thành phần hóa chất của phản ứng PCR gồm đệm phản ứng PCR, dNTPs,

Taq DNA Polymerase, cặp mồi xuôi – mồi ngược, DNA khuôn mẫu và nước cất 2

lần vô trùng được trình bày trong Bảng 3.3

Chu trình phản ứng PCR: Chu trình nhiệt gồm 5 bước, đó là bước 1 giaiđoạn khởi đầu ở 940C trong 5 phút, bước 2 giai đoạn biến tính ở 940C trong 30giây, bước 3 giai đoạn gắn mồi ở 550C trong 30 giây, bước 4 giai đoạn kéo dài ở

720C trong 90 giây, lặp lại bước 2- 4 với 39 chu kỳ, bước 5 giai đoạn ổn định ở

720C: 10 phút

Sau đó điện di sản phẩm PCR: sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose0,8% ở hiệu điện thế 100V, 30 phút trong dung dịch đệm TAE Tiếp theo gel đượcnhuộm trong Ethilium Bromide 4 µl (10 mg/ml), trong thời gian 30 phút sau băngsản phẩm PCR được kiểm tra dưới đèn UV và chụp ảnh bằng máy chụp và phântích gel loại Gel DocIt2

3.5.3 Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự vùng ITS

Chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng cách sử dụng kit tinhsạch GeneAll của Hàn Quốc: cho đệm PB vào hỗn hợp sản phẩm PCR, ly tâm loại

bỏ phần dịch Thêm đệm NW vào rồi ly tâm lại 2- 3 lần để loại bỏ hết dung dịchđệm còn dư Sau đó bổ sung thêm đệm EB hoặc nước cất vô trùng rồi ly tâm thudịch chứa sản phẩm PCR Cuối cùng kiểm tra chất lượng DNA sau tinh sạch bằngkít bằng điện di trên gel agarose 0,8% Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch bằng kítđược gửi đi xác định trình tự tại Singapore

3.5.4 Phân tích trình tự các vùng gen các giống gấc

Khi so sánh trình tự hoặc cấu trúc các đại phân tử người ta thấy rằng cácphân tử DNA, RNA hoặc protein có trình tự giống nhau thì cấu trúc của chúng sẽtương tự nhau hoặc giống nhau và cùng thực hiện chức năng như nhau Trong quátrình tiến hóa những biến đổi trong trình tự sinh học có thể xảy ra ngẫu nhiên dochính bản thân sinh vật hoặc ảnh hưởng của các yếu tố gây đột biến Sự biến đổi vềtrình tự diễn ra ngẫu nhiên ở khắp genome của mỗi cá thể Khi có sự tác động củacác điều kiện ngoại cảnh, những biến đổi này liên quan trực tiếp đến khả năng thíchnghi, tồn tại của sinh vật Quá trình này dẫn đến sự thay đổi tần số allele trong quầnthể, làm nền tảng cho sự hình thành loài mới Mặc dù sự kiện phân loài có thể xảy

ra nhưng theo quan điểm của tiến hóa, các loài mới được phát sinh từ các loài tổtiên gần gũi với chúng nhất Chính vì vậy bằng cách so sánh trình tự genome hoặcmột số gen đặc thù có thể hỗ trợ cho việc xác định mối quan hệ tiến hóa cũng như

vị trí của sinh vật trong hệ thống phân loại

Ở đây, trình tự các gen phân lập được chúng tôi sử dụng phần mềm củaNCBI Blast để khẳng định chúng có đúng với các gen của cây gấc đã được công bốtrên ngân hàng gen NCBI Trong tin sinh học, BLAST (Basic Local AlignmentSearch Tool), là một giải thuật để so sánh các chuỗi sinh học, như các chuỗi amino-acid của các protein hay của các chuỗi DNA khác nhau BLAST cần đầu vào là 2chuỗi: một là chuỗi truy vấn (chuỗi đích) và một cơ sở dữ liệu chuỗi BLAST sẽtìm kiếm các chuỗi con trong câu truy vấn mà giống với các chuỗi con trong cơ sở

dữ liệu chuỗi; thông thường, khi sử dụng, chuỗi truy vấn là nhỏ hơn rất nhiều sovới cơ sở dữ liệu (Nguyễn Đức Bách, 2013)

3.5.5 Xác định mối quan hệ di truyền các mẫu giống gấc thu thập từ các vùng khác nhau

Trình tự của mỗi gen trong các giống gấc được phân tích bằng sử dụngphần mềm CluxtalX để căn nhiều trình tự Căn nhiều trình tự là công cụ hỗ trợ chủyếu để xác định sự giống và khác nhau về vị trí trong gen từ đó đánh giá sự biếnđổi trong trình tự DNA, protein Các phần mềm phân tích tiến hóa đều dựa trên cơ

sở căn trình tự Việc xây dựng cây phân loại được dựa vào 2 nhóm, nhóm thứ nhấtdựa vào xác định khoảng cách (distance based methods) và nhóm thứ 2 dựa vào các

ký tự giống nhau của trình tự (character based methods) Đối với nhóm thứ nhất cácphương pháp UPGMA, Neighbor Joining Method (NJ), Weighted Neighbor-

Joining (Weighbor), Fitch- Margoliash (FM) and Minimum Evolution (ME)Methods Đối với nhóm thứ 2 các phương pháp được sử dụng gồm: Maximumparsimony (MP), Maximum Likelihood (ML) Mối quan hệ di truyền các giống gấcthu thập từ các vùng khác nhau được xây dựng trên cơ sở phân tích và so sánh trình

tự các gen bằng sử dụng phần mềm MEGA 6 để xây dựng mối quan hệ di truyền.Trên cơ sở đó, việc xây dựng cây phân loại được chúng tôi dựa theo nhóm thứ 2 tức

là dựa vào các ký tự giống nhau của trình tự (character based methods) theophương pháp Maximum parsimony (MP), Maximum Likelihood (ML) (NguyễnĐức Bách, 2013)

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1 TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ

Tổng số 14 mẫu giống gấc đã được tách chiết theo quy trình tách chiết như

mô tả trong phần phương pháp Tất cả các mẫu DNA tổng số được xử lý bằngRNAse để loại bỏ RNA, sau đó kiểm tra độ nguyên vẹn và tinh sạch trước phảnứng PCR DNA tổng số từ các mẫu (1,5 µl) được điện di trên gel agarose 0,8%.Hình 4.1 cho thấy DNA tổng số của các mẫu giống gấc sau khi được tách chiết

M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14

Hình 4.1 Ảnh điện di sản phẩm DNA tổng số của các giống gấc.

Quan sát vạch băng trên bản gel điện di (Hình 4.1) cho thấy mẫu DNA saukhi chiết tách từ các mẫu lá gấc tương đối rõ nét, không bị đứt gãy, không cònRNA Các mẫu DNA tổng số sau đó được kiểm tra nồng độ bằng phương phápquang phổ, kết quả xác định được thể hiện ở Bảng 4.1 Chất lượng DNA là một yếu

tố quan trọng ảnh hưởng tới kết quả phản ứng PCR Bảng 4.1 cho ta thấy tỷ sốA260/A280 dao động trong khoảng 1,80 đến 1,99, chứng tỏ DNA có độ tinh sạchcao Nồng độ DNA dao động trong khoảng từ 510 ng/µl đến 825 ng/µl Như vậy,DNA tổng số đã tách chiết từ các mẫu đã được tinh sạch, nồng độ DNA cao, có thể

sử dụng cho các phản ứng PCR

Bảng 4.1 Hàm lượng DNA tổng số trong mẫu giống gấc

sử dụng trong phản ứng PCR Từ kết quả này, chứng tỏ DNA tổng số mà chúng tôitách có chất lượng tốt được sử dụng cho các phản ứng PCR

4.2 KHUẾCH ĐẠI CÁC VÙNG GEN NGHIÊN CỨU

Dựa trên cơ sở tách chiết và điện di DNA chúng tôi đã tiến hành phản ứngPCR với các mồi khuếch đại Sau đó chúng tôi tiến hành tinh sạch các sản phẩmPCR bằng kit tinh sạch GenAll của Hàn Quốc và đem điện di trên gel agarose0,8%, kết quả thu được biểu diễn ở các Hình 4.2, Hình 4.3, Hình 4.4, Hình 4.5,Hình 4.6

Nhìn vào Hình 4.2, ta thấy vùng ITS đã được khuếch đại thành công ở cả14/14 mẫu nghiên cứu và tất cả các sản phẩm khuếch đại cho cùng kích thướckhoảng 0,7 kb Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu khuếch đại đoạn genđích ITS dài 727 bp.

Hình 4.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen ITS các mẫu giống gấc M1-carotene và lycopen trong quả gấc.

M14) M: DNA Marker

Theo Hình 4.3, ta thấy các mẫu nghiên cứu đã được khuếch đại thành công

ở 12/14 mẫu và tất cả các sản phẩm đã khuếch đại đều cho cùng kích thước gần 0,8

kb Kết quả này tương ứng với kích thước gen đích rbcL dài 765 bp Như vậy, kíchthước vùng gen rbcL được khuếch đại là phù hợp

Hình 4.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen rbcL ở các mẫu giống gấc (M1-carotene và lycopen trong quả gấc.

M14) M: DNA Marker.

Dựa theo Hình 4.4, ta thấy 11/14 mẫu nghiên cứu đã được khuếch đại thànhcông và tất cả các sản phẩm đã khuếch đại đều cho cùng kích thước khoảng 0,7 kb.Kết quả này gần với kết quả nghiên cứu khuếch đại đoạn gen đích rbl20 có kíchthước 703 bp Như vậy, kích thước gen rbl20 được khuếch đại là phù hợp với yêucầu của kết quả nghiên cứu