Tìm hiểu sự hình thành virus rubenla ở trẻ em 1 14 tuổi và phụ nữ mang thai 3 tháng đầu tại hà nội, hải phòng và thanh hóa

Protein cấu trúc của virut rubella lần đầu tiên được phát hiện bằng kỹ thuật kết tủa miễn dịch là 26 giờ sau khi gây nhiễm tế bào và bằng miễn dịch huỳnh quang TF, tất cả tế bào có phát

BAO CAO TONG KET DE TAI NGHIEN CUU KHOA HOC

TÌM HIỂU SỰ LUU HANH VIRUT RUBELLA 6 TRE EM 1-14

TUỔI VÀ PHỤ NU MANG THAI 3 THÁNG ĐẦU TẠI HÀ NỘI,

HẢI PHÒNG VÀ THANH HOÁ

Chủ nhiệm đề tài: GS TS Huỳnh Phương Liên

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Vệ sinh Dịch tế Trung ương

BAO CAO TONG KET DE TAI NGHIEN CUU KHOA HOC

HẢI PHÒNG VÀ THANH HOÁ

Chủ nhiệm đề tài: GS TS Huỳnh Phương Liên

Các cán bộ thực hiện đề tài:

Nguyễn Thị Thắng

Nguyễn Thị Út Nguyễn Thị Thường Nguyễn Thị Quý Nguyễn Hiển Thanh Nguyễn Hồng Hạnh

Thời gian thực hiện đề tài: 2000-2004

Tổng kinh phí được duyệt: 100 triệu đồng

Tổng kinh phí được cấp: 100 triệu đồng

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG BAO CAO

Vệ sinh Dịch tế Trung ương

Tiêm chủng mở rộng quốc gia Measles Mump Rubella: Sdi, Quai bi, Rubella

Huyét thanh hoc

Thần kinh trung ương

Phan ứng chuỗi polymeraza ngược

Ức chế ngưng kết hồng cầu (Heaglutinin Inhibition)

Tổ chức y tế thế giới Enzym Link Immuno Assay Cytopatic Effect

Dị tật bẩm sinh

Đơn vị Quốc tế

O-Phenyl dimethyl Tetramethyl Benizidin

MUC LUC

Trang

I ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU «c2 1

1 Đặt vấn GE coos cccececcssseesossvesosssecesstsscesseseesessusssesssevesssivessrasecsestareeeseeserssaceessenees 1

2 Muc thu nghién Cutu 1

TL TONG QUAN .Ô 2

1 Lịch sử nghiên cứu bệnh sốt phát ban do virut rubelia Virut Rubella 2

1 Kết quả nghiên cứu tỷ lệ phơi nhiễm Rubella ở trẻ 1-14 tuổi - 35

2 Nghiên cứu sự phơi nhiễm rubella ở phụ nữ có thai 3 tháng đầu 41

3 Tìm hiểu các khuyết tật bẩm sinh có liên quan đến Rubella 44

4 Chẩn đoán xác định phát ban do Rubella ở một số tỉnh miền Bắc

và miền Trung năm 2000-2003 Q.21 re 46

V KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 2. -EE2++ee©222EEZvvzadecovvevrrexee 48

VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 2-5-5 se se escss se sscssssrexes sec 49

LOI CAM ON

Để hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, chúng tôi xin chân thành

cảm ơn các cơ quan:

Chương trình Tiêm chủng mở rộng quốc gia

- Trung tam YTDP Hai Phong

- Trung tam YTDP Thanh Hoa

- Bénh vién Nhi Trung uong

- Nha Ho sinh B, Ha Noi

I ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Dat van đề

Rubella là bệnh sốt phát ban do virut Bệnh thường xảy ra vào mùa xuân-hạ

Rubella có mặt trên cả 4 châu lục và ở mọi lứa tuổi nếu không được dự phòng bằng văcxin Bệnh có các triệu chứng lâm sàng mở đầu với các biểu hiện: sốt, đau đầu, buồn nôn, ho, đau họng, đau các khớp và phát ban có thể sưng các hạch ở cổ Là bệnh sốt có

phát ban nên thường khó phân biệt với một số bệnh như bệnh sởi, bệnh tinh hồng nhiệt, phát ban do virut Dengue hoặc do Coxsackie Với rubella, cdc triệu chứng lâm sàng

sẽ nhẹ nhàng qua đi nhưng điều cần quan tâm nhất là các biến chứng do rubella ở những trẻ sinh ra từ các bà mẹ bị nhiễm virut trong thời kỳ mang thai Hiện nay, ở nước

ta chiến dịch tiêm văcxin sởi mũi 2 cho trẻ em 1-10 tuổi đã khống chế và từng bước thanh toán bệnh sởi Do vậy, việc giám sát bệnh sốt phát ban để loại trừ những trường

hợp mắc sởi sau chiến địch tiêm chủng là hết sức cần thiết Để tài này cũng chỉ bước đầu đánh giá mức độ phơi nhiễm ở trẻ em, nhóm phụ nữ mang thai và chẩn đoán hồi cứu một số trẻ mang dị tật bẩm sinh nghỉ do virut rubella

2 Mục tiêu nghiên cứu

Để góp phần giám sát sởi, chẩn đoán phân biệt sởi và rubella của chương trình TCMRQG đề tài nhằm hai mục đích:

2.1 Chẩn đoán xác định sốt phát ban do rubella trong các vụ dịch sốt phát ban nghỉ SỞI

2.2_ Nghiên cứu đánh giá tỷ lệ nhiễm với rubella ở trẻ em 1-14 tuổi và phụ nữ mang

thai 3 tháng đầu, để xuất phương pháp dự phòng ở các đối tượng nguy cơ

II TONG QUAN

1 Lịch sử nghiên cứu bệnh sốt phát ban do virut rubella

Vào giữa thế kỷ 18, lần đầu tiên 2 nhà khoa học người Đức đã miêu tả về bệnh sốt phát ban rubella, đó là Bergen và Orlow Lúc bấy giờ người ta thường gọi với cái tên của Đức là “Rötcln” và trở thành một cái tên quen thuộc là “Sởi Đức” (German Measles) Trong nhiều năm, sốt phát ban không phân biệt được với sởi, tỉnh hồng nhiệt (Scarlet fever) và một số bệnh nhiễm khuẩn khác có phát ban Hội nghị quốc tế y học năm 1881 ở London đã chính thức lấy tên là bệnh rubella và từ đó các sự kiện lịch sử

chính của rubella bắt đầu được ghi nhận:

-_ 1881: Hội nghị Quốc tế tại London đã chấp nhận tên rubella

- 1938: Đã chứng minh tác nhân gây bệnh phát ban rubella là virut

- 1941 Grey (Australia) lần đầu tiên phát hiện các thương tổn bẩm sinh do rubella gây

Tả

- 1962: Phân lập được virut rubella trên tế bào và thực hiện thử nghiệm trung hòa trên

- 1963-1964: Dịch sốt phát ban xảy ra ở châu Mỹ và châu Âu: Thống kê của Enders

va Milk me mang thai nhiễm, hậu quả tổn thương bam sinh mắt 78%, điếc 66%, thiểu năng vận động 62% và TBS 58%

- 1965-1967: Nghiên cứu thành công văcxin sống giảm động lực và thử nghiệm lâm

sàng

-_ 1967: Chẩn đoán huyết thanh học bằng kỹ thuật ngăn ngưng kết hồng cầu (HỊ)

- 1969: Tại Mỹ đã nghiên cứu và sử dụng 3 chủng: HPV-77:DE-5 (duck embryo),

HPV-77:DK-12 (dog kidney) và GMK-3:RK-53 (rabbit kidney) để sản xuất văcxin Sau đố chủng HPV-77:DK-12 không được sử dụng vì khi tiêm văcxin từ chủng này thường kèm theo các triệu chứng đau khớp Cũng năm 1969, Mỹ quyết định đưa

văcxin vào tiêm phòng cho trẻ 4-5 tuổi

- 1970: Ở Anh quốc đồng thời nghiên cứu chủng Cendehill và sản xuất văcxin bằng

chủng này để tiêm phòng cho trẻ em gái 11-14 tuổi

- 1971: Mỹ nghiên cứu kết hợp 3 loại văcxin sống giảm động lực là Sởi, Quai bị và

Rubella (MMR)

- 1972: Anh quốc chủ trương tiêm chủng cho các đối tượng có nguy cơ như phụ nữ

tuổi sinh đẻ, trẻ em gái 12-14 tuổi

-_ 1977: Chương trình tiêm chủng mở rộng tại Mỹ đã tiêm chủng văcxin cho trẻ em gái

và phụ nữ ở tuổi có nguy cơ mắc rubella

- 1978-1979: Dịch sốt phát ban Rubella để lại hậu quả 124 ca dị tật bẩm sinh do mẹ mắc rubella trong thời kỳ mang thai

- 1979: Mỹ sử dụng chủng RA27/3 (human diploid fibroblast) để sản xuất văcxin (Meruvax-II), và tất cả các chủng khác đều không được sử dụng tiếp

.~ 1983: Xây ra dịch sốt phát ban ở Anh, do đó thực hiện chiến dich tiêm phòng văcxin rubella cho các đối tượng có nguy cơ

- 1988: Bộ Y tế nước Anh đã chỉ đạo tiêm chủng MMR cho tất cả các trẻ em trước tuổi đi học

- 1996: Tại Anh kế hoạch tiêm văcxin cho trẻ em gái bị gián đoạn do đó tiêm mũi 2

MMR cho trẻ 4-5 tuổi

- 1997: Mỹ thay đổi chiến lược tiêm chủng MMR mũi 1 từ 12-15 tháng tuổi, mũi 2 từ

4-6 tuổi

Ghỉ chú: MMRI?: Sởi (chúng Moralen), quai bị (chúng Jeryl Lynn} Rubella (chủng

HPV77:DE-5); MMR phái mình của Anh: Sởi (chủng Schwartz), quai bị (chủng Jeryl Lynn)

va Rubella (ching RA27/3)

Cho đến nay'väcxin rubella đơn hoặc phối hợp với sởi và quai bị được tiêm phòng

đầy đủ cho trẻ em ở các nước phát triển, còn ở các nước đang phát triển vẫn còn là vấn

đề cần được quan tâm, rubella chưa được đưa vào chương trình tiêm chủng mở rộng

Do vậy, việc trẻ em bị phơi nhiễm rubella cũng là điều tất yếu

2 Virut rubella

2.1 Tém tat nghién citu 6 phong thi nghiém

Nam 1962, Parkman, Buescher va Artenstein đã phát hiện sự có mặt của virut

rubella ở tế bào thận khi tiên phát bằng kỹ thuật interference.cũng trong năm này, đồng thời 2 nhà khoa học Weller và Neva đã tìm thấy thương tổn tế bào bào thai tiên phát

1962- 1964, Parkman, Buescher, Artenstein đã thử nghiệm thành công kỹ thuật

ˆ trung hoà, ngưng kết hồng cầu, ngăn ngưng kết hồng cầu

1967, Stewart và cộng sự đã nghiên cứu dịch tế huyết thanh học

1967, Best và cộng sự, 1968 Homes và cộng sự đã quan sát siêu cấu trúc của virut rubella qua kính hiển vi điện tử

Cuối năm 1980 đến đầu năm 1990, nhiều công trình nghiên cứu về cấu trúc phân

tử và sự nhân lên của virut rubella và thấy rằng virut rubella phát triển chậm trên nuôi

cấy tế bào và ở một số loại tế bào, không quan sát thấy CPE dưới kính hiển vi quang

học

2.2 Xếp loại

- Rubella duge xép vao chi (genus) Rubivirus thudc ho (family) Togaviridae Có quan

hệ thân thiện với các Arbovirus nhóm A (Frey 1994) Không giống cdc togavirus khác, virut rubella không có vật chủ là động vật không xương sống và các động vật chân khớp

-_ Virut rubella chứa vật liệu di truyền là ARN, có vỗ bọc Chỉ có duy nhất mot type

kháng nguyên, không phản ứng chéo với các thành viên khác trong nhém togavirus

2.3 Hình thể và cấu trúc

- Hat virut cé đường kính trung bình 58nm và có đường kính của lõi (core) la 30nm

(Homes, Murphy, Halonen, Harrison 1968)

-_ Lõi được bao bọc bởi một lớp lipit kép và trên bể mặt của lớp vỏ (envelope) có các gai nhú dài 5-6nm, các gai nhú này chính là các hợp phần cla céc glycoprotein El

và E2 Nhìn tiêu bản cất lát dưới kính hiển vi của các tế bào gây nhiễm với virut

rubella có thể thấy vùng giới hạn giữa lõi và vỏ

3

-_ Hạt virut đa dạng, lớp vỏ mảnh dẻ, kiểu đối xứng của Nucleocapsid làm cho nó khó

bền vững, khi phân tích về chuyển động quay ở lớp màng của hạt virut cho thấy lõi

có 1T=3 icosahedral đối xứng và có 32 capsomers (Matsumoso va Higashi 1974)

- Duy trì sự bền vững của virut bằng cách thêm MgSO¿ vào môi trường nuôi cấy vì

lipid ở phần vỏ của hạt virut rubella bị bất hoạt bởi các chất tẩy rửa, formaline, ánh sáng đèn cực tím, pH thấp, nhiệt độ, amantadine và các dung môi hoà tan

Hình 1 : Nhuém dm ban virut rubella (Banatvala va Best)

2.4 Cấu trúc hệ gen vả chức năng

Hé gen cua virut rubella 14 một sợi đơn ARN, phân cực dương ARN là yếu tố

gây nhiễm nhưng rất yếu (Hovi và cộng sự, 1970) Chiểu dài của ARN là 9762 nucleotit bao gồm đầu 3° poly (A) và đầu cuối 5” (Frey 1994) Đầu nắp được dịch mã

như một sự nhan biét 1 ribosome Theo Frey (1994), thành phần các base nitơ của hệ gen là: A (14,9%); C (38,7%); U (15,4%) và G (30,8%)

Hệ gen có 2 khung đọc mở ORE (Open Reading Frame) và có một vài điểm giống alphavrrus (Dominguez, Wang và Frey 1990) Đầu 5” gồm ORF có 6345 nucleotit mã hoá cho 2 protein phi cấu trúc (nontructure protein) là p150 và p90 Trong khi đó ORF đầu 3° có chiều dài 3189 nucleotit (6509- 9697) mã hoá cho protein cấu trúc là C (Capsid), céc glycoprotein E2 va El Hai ORF cing phiên mã như nhau và duge tach riéng ra boi 123 nucleotit va Polyadenylated- ARN phu duge đậy lại, và

được sao chép lại từ ARN âm bản Như vậy, đầu khởi động là nucleotit 6433 (U) Frey

1995 Các dòng ADN được sản sinh ra và sử dụng để tổng hợp các ARN gây nhiễm (Wang, Dominguez và Frey 1994)

Trinh tự ở đầu 5° và 3° của ARN của virut rubella có thể tạo thành một dạng cấu

trúc vòng bền vững

nonstructural ORF structural ORF

Hình 2: Sơ đô mô tả quá trình dịch mã tạo ra các protein cấu trúc và phì cấu trúc của virut rubella

(Lee J va Bowden DS, 2000): Hệ gen của virut rubella bao gồm 2 khung đọc mở không có chồng lớp, vớt

ORF đầu 5` mã hoá cho các protein phi cấu trúc và ORF đầu 3" mã hoá cho các protein cấu trúc Một polyprotein

chưa hoàn chỉnh là p200 được dịch mã từ ORF dau 5’ cia hé gen ARN virut rubella va qua phan cat Cis tao

thành 2 protein phi cấu trúc là p150 và p90 Cac vi trí cha cdc axit amin duoc coi 1A motif nhu methyltransferase (M), X motif, papain-like cysteine protease (P), helicase (H), and replicase (R) déu nam trén ORF dau 5° Cac

protein cấu trúc được tổng hợp từ một tiểu hé gen ARN 24S dich ma tir ORF dau 3’ Một polyprotein chưa hoàn chỉnh là p100 được dịch mã từ tiểu hệ gén ARN và trải qua một số lần phân cắt, phiên mã muộn, biến đổi để cuối

cùng tạo ra các protein thành thục là C, E2 và E1

RUBELLA VIRUS

icosahedral nucieosapsid

RMA ‡siogla-2r anded 64114+0xasttSe}

Hình 3: Hình thái của vữut rubella

2.5 Tinh chat hod ly cia virut rubella

“2.51 Hat-virut

2.5.5 Polypeptid chi yếu

Envelope: E1 (58 kDa) va E2 (42-47 kDa)

Nucleocapsid: C (33-38 kDa)

2.5.6 Độ bén viing:

Bén ving nhiét: + 4°C bén vitng > 7 ngay

+ 375C bị bất hoạt 0,1-0,4 log10 TCID 50/ml/gid + 56°C bi bat hoạt 1,5- 3,5 log10 TCTD 50/ml/giờ + 70°C bị bất hoạt 5,5 log10 TCID 50/ml/giờ

+ Ở -70°C bền vững trong nhiều năm

Đông khô: Bền vững lâu dài nhiều năm

Độ pH thích hợp: pH 6,0- 8,1; không bền vững ở pH quá kiểm và quá axit

Nhạy với tia cực tím: mất hoạt tính trong 40 giây1350 w/cm”; bị bất hoạt 7,0 log10

TCTD 50/0,1ml/giờ

Cảm quang: Labile, K = 0,07/phút trong PBS

Siêu âm: Bền vững > 9 phút

2.6 Sự nhân lên của virut

Virut rubella tiếp xúc với thụ thể của tế bào Thụ thể này không nhận biết được,

cơ quan đóng vai trò quan trọng trong việc nhận biết và tiếp nhận là phân tử lipid ở

` màng tế bão Chu kỳ nhân lên được thực hiện ở trong nguyên sinh chất, quá trình thâm

6

nhập, cởi áo (bộc lộ ARN) giống như các Alphavirus Hạt virion được hoàn thiện trong lớp vỏ và vận chuyển đến lớp trong màng tế bào Ở độ pH thấp, protein C trong màng

tế bào chuyển thành lipid có thể hoà tan và kết hợp capsid với màng của virut, ARN được lớp vỏ của virut bọc lại pH thấp cũng còn có khả năng châm ngòi cho một thay đổi thích hợp trong vỏ glycoprotein và gắn kết màng của virut với màng của tế bào rồi giải phóng ARN của virut vào nguyên sinh chất của tế bào

Hạt virion có chứa 2115 axit amin Polyprotein được mã hoá bởi đầu gần 5° ORF

Polyprotein này bị phân huỷ để tạo ra các protein phi cấu trúc có thể hoạt hoá bên

trong tế bào chủ để tổng hợp một sợi ARN âm và sau đó sử dụng làm khuôn mẫu để

tạo thành sợi ARN duong mdi va ARN 243 Sợi ARN âm chỉ có mặt ở dạng sợi kép và chức năng như một công cụ để tổng hợp ARN dương

Polyprotein có trọng lượng phân tử 110 kDa được tách khỏi tế bào chủ, tạo ra 3 protein cau tric: 2 glycoprotein El va E2 va protein capsid Protein C cua virut thiéu hoạt tính tự phân chia trong Alphavirus Tất cả protein cấu trúc được vận chuyển đến

bộ máy Golgi của tế bào để hoàn thiện

Các nghiên cứu của Frey và cộng sự (1994) cho thấy: Chu kỳ nhân lên của virut

rubella ở tế bào động vật không xương sống chậm và ít hiệu quả hơn Alphavirus Chu

kỳ nhân lên cao nhất (đỉnh) là 48 giờ sau khi gây nhiễm trên tế bào thận khi (Vero) Protein cấu trúc của virut rubella lần đầu tiên được phát hiện bằng kỹ thuật kết tủa

miễn dịch là 26 giờ sau khi gây nhiễm tế bào và bằng miễn dịch huỳnh quang (TF), tất

cả tế bào có phát quang ở nguyên sinh chất sau khi gây nhiễm 48 giờ Còn ARN lần đầu tiên được phát hiện 12 giờ sau khi gây nhiễm và đỉnh ở 26 giờ Các loại tế bào

khác nhau sẽ có tốc độ và thời gian nhân lên khác nhau, tuỳ thuộc vào độ nhạy của từng loại tế bào chủ đối với virut

2.7 Polypeptid

Forng và Frey (1995), sử dụng kỹ thuật kết tủa miễn dịch (IP) để xác định protein phi cấu trúc trong tế bào gây nhiễm và đã xác định thứ tự trong ORF đầu 5’ 14 NH,- p150- p90- COOH chức năng còn chưa biết Bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang cho thấy những kháng thể gắn p150 phát quang ở vùng quanh nhân Không có các kháng thể gắn protein phi cấu trúc phát quang ở nhân tế bào

- Protein C cé 293- 300 axit amin trong chuỗi peptid đài có trọng lượng phân tử 33 kDa và không glycosyl hoá

-_ Chuỗi polypeptid của E1 và E2 tương ứng là 282 và 481 axit amin

- Mang El va E2 bao lấy Glycoprotein và bộc lộ trên bề mặt của hạt virut

Protein E1 có trọng lượng phân tử 58 kDa và khi phân tích trình tự axít amin cho thấy chúng cố 3 vị tf glycosyl hod liên kết với Nucleoprotein (N- linked glycosylation) Ngược lại số lượng vị trí glycosyl hoá liên kết với Nucleoprotein trên phân tử protein E2 lại phụ thuộc vào từng chủng Ví dụ như ở các chủng M33 và HPV-

77 có 4 vị trí, trong khi đó ở các chủng Therien và RA27/3 lại chỉ có 3 vị trí (Qiu, 1992) Protein E2 được coi là màng vận chuyển đến gần điểm tận cùng của protein C, Trong các hạt virion hoàn chỉnh thì E1 và E2 tồn tại như protein cấu trúc bậc hai khác loại, tạo bởi những chuỗi móc xích cầu nối disulphit và trồi lên bể mặt của vỏ như

những gai nhú E2 có quan hệ xa với hoạt tính enzym và sinh đáp ứng miễn dịch Điều

đó cho thấy E2 bị che lấp dưới lớp E1

Glycoprotein cia virut rubella da duoc tach chiét từ Escherichia coli v6i vector là

Vaccina va Barculovirus

2.8 Khang nguyén

Kháng nguyên HA: Bằng những phương pháp xử lý dịch tế bào nhiễm virut

rubella khác nhau cho thấy: Khi xử lý với EDTA sẽ tách thành phân HA từ các yếu tố

ức chế không đặc hiệu bằng cách loại bỏ ion Ca?* (Furukawa, 1967) Kháng nguyên

HA cồn có thể tách chiết từ tế bào BHK-21 gây nhiễm virut rubella hoặc tế bào Vero

có pH kiềm (Halonen, Steward, 1967) Xử lý với ctc và Tween 80 thì ngăn hoạt tính ngưng kết hồng cầu (HA) và tăng hiệu giá kháng nguyên vì Ca?! làm cho thành phần

HA gắn vào hồng cầu Việc loại bỏ các yếu tố ức chế ngưng kết không đặc hiệu trong

huyết thanh thử nghiệm làm cho hiệu quả của phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu càng cao

Kháng nguyên kết hợp bổ thể (CF): Phần lớn kháng nguyên có tỷ trọng 1,19 đến

1/23 g/ml trong sucrose gradient và kết hợp với hoạt tính HA, có một phần nhỏ kháng

nguyên hoà tan Các thành phần kháng nguyên này có thể kết hợp với Ribonucleoprotein lõi của virut Muốn có hiệu quả kháng nguyên cao cần cô đặc dịch

tế bào nhiễm virut rubella hoặc chiết xuất bằng dung dịch pH kiểm

Khi nhiễm virut rubella thì kháng thể xuất hiện kháng lại 3 protein cấu trúc nhưng protein E1 biểu thị miễn dịch trội Những nghiên cứu sử dụng kháng thể đơn dòng để xác định một vài epitop biểu lộ hoạt tính trung hoà hoặc ngưng kết hồng cầu Năm 1992, Chaye và Mitchell đã phân tích và xác định chúng phân bố ở axít amin

245-285 Hoạt tính trung hoà thì phân bố từ axít amin 211-239 Huyết thanh người

phản ứng với các peptid tổng hợp ở axít amin 214- 285 của protein EI, có thể đây là vùng biểu lộ hoạt tính trung hoà chủ yếu Protein tái tổ hợp cũng nằm trên epitop này

Tác giả Newcombe 1994 thấy epitop chứa hoạt tính trung hoà cũng còn nằm ở Glycoprotein E2 từ 1-26 Còn các epitop khác được giới hạn giữa axít amin 51 và 105

Ít nhất có 2 epitop có mặt trên protein C

Cả 3 protein cấu trúc đều có epitop tế bào T, nhưng vùng phản ứng miễn dịch đã

được xác định trong protein capsid 9-29, 255-280, ở E2 là 54-74 và EI là 273- 284,

358- 377 và 402- 422 Mối liên quan về vị trí kháng nguyên cpitop của những tế bào T này còn chưa rõ

Có nhiều thử nghiệm để phân biệt chủng giảm độc lực và chủng hoang đại tuy nhiên sự khác nhau này cũng được quan sát bằng thử nghiệm trung hoà chéo và động lực kháng thể trung hoà (Best, 1990)

Các nghiên cứu gần đây dùng kháng thể đơn dòng trong thử nghiệm trung hoà, ngăn ngưng kết hồng cầu (HI), miễn dịch enzym (EIA) cho 9 chủng virut rubella có cả

8

4 ching vacxin la Cendehill, RA27/3, HPV77-DE5 va TO336 (Best 1992) Tat ca 9

chủng này đều không thấy biểu lộ sự khác nhau

Trình tự axít nucleic bộc lộ 5 điểm thay đổi về nucleotid được tìm thấy trong trình

tự 1300 nucleotid của vùng mã hoá EI của chủng virut rubella văcxin RA27/3, nhờ đó

có thể phân biệt giữa chủng này với các chủng virut rưbella phân lập được (Frey 1994)

3 Hình ảnh lâm sàng và bệnh lý

3.1 Giới thiệu

Năm 1941 Mc Alister Gregg- Bác sỹ nhãn khoa người Australia đã công bố một

công trình nghiên cứu về đục thuỷ tỉnh thể bẩm sinh mà mẹ có tiền sử mắc bệnh “Sởi Đức = German Measles” ở 3 tháng đầu mang thai Ông theo đõi 78 trẻ đều mắc bệnh

đục thuỷ tỉnh thể (Congenital cataract) tương tự như nhau Số trẻ em này đều được sinh

ra ở New South Wales sau dịch sốt phát ban do rubella vào năm 1940 Các bệnh tim tiên thiên chiếm 66% Tiếp tục theo dõi, người ta phát hiện một số trẻ mà mẹ trong 3 tháng đầu mang thai mắc sốt phát ban rubella đều sinh ra các con có các dị tật: tim tiên

thiên, đục thuỷ tỉnh thể bẩm sinh, điếc, dị tật đầu nhỏ, không đủ trọng lượng khi sinh

(Swan, Gregg 1944 va Wesselhoeft 1947)

1963 Lần đầu tiên ở Mỹ phan lap duoc virut rubella

1964 Gregg và cộng sự đã theo đối một số bà mẹ mang thai trong 16 tuần đầu có sốt, phát ban và chẩn đoán xác định là rubella thì 96% số trẻ bị đị tật bẩm sinh

1965 ở Mỹ bắt đầu nghiên cứu văcxin phòng rubella

1969 văcxin phòng bệnh sốt phát ban rubella bắt đầu được đưa ra sử dụng ở Mỹ

3.2 Triệu chứng lâm sàng và mối liên quan giữa lâm sàng và vừữut học

Thời kỳ ủ bệnh do nhiễm rubella là 14 đến 21 ngày sau đó các triệu chứng xuất

hiện đột ngột: + Sốt nhẹ

+ Phát ban

+ Các hạch Lympho ở cổ và nách

+ Đau khớp và đau mình, thường xuất hiện trước 1 đến 2 ngày trước khi khởi bệnh

Ban xuất hiện đầu tiên ở mặt sau đó phát triển xuống thân và chân tay bệnh nhân Ban thường tồn tại khoảng 3 ngày hoặc có thể lâu hơn

Sinh thiết (Biopsy) mẫu bệnh phẩm từ da bệnh nhân cho thấy không chỉ phân lập được virut ở vùng đa có ban mà ở cả vùng da không có ban (Heggie 1978)

Trong vụ dịch có thể dùng gammaglobulin tiêm cho các cháu đang ở thời kỳ ủ

bệnh sẽ ngăn ngừa được tiến triển của bệnh và không phát ban

Hạch Lympho xuất hiện sớm, có thể 7-10 ngày trước khi phát ban và tồn tại lâu sau khi ban lặn

Biến chứng do rubella hiếm khi gặp, bệnh thường nhẹ nhàng qua đi, song biến chứng viêm não có thể xây ra với tỷ lệ 1/10000 (Krugman và Ward 1968) Tuy nhiên, năm 1987 ở Nhật Bản xảy ra một vụ dịch phát ban do rubella lại xuất hiện biến chứng rất nhiều so với các vụ dịch trước Tại một số vùng ở Nam Mỹ, những bà mẹ khi mang

thai 3 tháng đầu nếu nhiễm rubella cấp tính thì trẻ sinh ra có thể bị điếc, bị mù hoặc cả

hai tật trên (Eckstein và cộng sự 1996) Riêng về biến chứng viêm não lên tới 1/1600

ca (Morirechi 1990)

Một biến chứng thường gặp là giảm tiểu cầu và gây ra ban xuất huyết, chảy máu đường tiết niệu, chảy máu da day

Biến chứng khác cũng thường gặp ở 60% phụ nữ nhiễm Rubella là viêm các khớp

như khớp ngón tay, cổ tay, khớp gối, khớp nách thường kéo dài từ 3 ngày đến một tháng nhưng không để lại di chứng

Việc tiêm phòng văcxin rubella cho bé gái ở tuổi day thi là cần thiết và đó là

phương pháp dự phòng đặc hiệu nhất

Trong chẩn đoán huyết thanh học, ở những người nhiễm rubella bị viêm đa khớp

là yếu tố làm tăng kháng thể đặc hiệu kháng rubella

Thực tế lâm sàng cho thấy phát ban và viêm khớp do rubella thường rất khó chẩn đoán và phân biệt với các bệnh khác như Chikumgunya, Ross Rive virut và Papova

virut B19 Những nghiên cứu về huyết thanh học cho thấy mối liên quan về tiền sử nhiễm rubella và tình trạng miễn dịch cũng không được rõ ràng, đặc biệt là Ở người

lớn Điều này cũng dễ hiểu vì bệnh không phát ban hoặc triệu chứng lâm sàng không

rõ ràng có thể chiếm tới 25%

Mối liên quan giữa lâm sàng và virut học diễn biến như sau: Virut ở dịch hạ hầu

có thể xuất hiện một tuần trước và tồn tại 7-10 ngày sau khởi bệnh Virut còn phát hiện được ở phân, nước tiểu nhưng chỉ trong thời gian ngắn Vì vậy, khó phân lập virut từ

các mẫu bệnh phẩm này và các chất bệnh phẩm này không hẻ đóng vai trò quan trọng trong việc truyền bệnh

3.3 Dịch té học

Hình 4: Phát ban xuất huyết ở trẻ sơ sinh bị nhiễm rubella trong bào thai bệnh nhí bị

tim bẩm sinh và đục thuỷ tỉnh thể (Banatvala và Bes0)

10

Rubella có mặt ở hầu hết các quốc gia trên thế giới, ở các nước nhiệt đới trước

khi có văcxin để tiêm cho trẻ em thì bệnh thường xảy ra vào mùa xuân và đầu mùa hạ,

ở trẻ em và cả người lớn Phụ nữ trong nhóm tuổi sinh đẻ, tỷ lệ miễn dịch khoảng 80- 85% Trẻ em 9-11 tuổi khoảng 50% (Bowdle 1970) Ở các nước phát triển như Mỹ, Anh quốc, Canada đã tiêm văcxin từ lâu, vì vậy tỷ lệ các dj tat bam sinh do rubella rat hiếm

Năm 1993-1996 dịch sốt phát ban do rubella đồng thời với virut Pavo B19 ở Anh

quốc và Wales, phần lớn là nam giới và chính là những người chưa được tiềm văäcxin

Nhiều nước đang phát triển vì chưa đủ văcxin tiêm phòng thì tỷ lệ mắc ở trẻ em nhiều

hơn các nước ôn đới Các dị tật bẩm sinh do rubella chưa đánh giá được đầy đủ

- ea Bát đầu tiêm chủng văo¿n phối

Đổ, Phụ nữ có thai hợp sởi, quai bị và rubella (MMR)

Kháng thể IgG chủ yếu là IgG1 và IgG3 được phát hiện ở hầu hết các mẫu huyết thanh,

chỉ tìm thấy IgG4 trong một số trường hợp (Morgan- capner 1988) IgM thường xuất hiện 4 ngày sau khi ban mọc và tồn tại 4-12 tuần nhưng các tuần cuối ở hiệu giá thấp nên có phát hiện được hay không còn phụ thuộc vào kỹ thuật xét nghiệm

Kháng thể IgM có thể tồn tại được một năm sau khi nhiễm rubella tự nhiên hoặc

đáp ứng kháng thể sau khi tiêm văcxin Đáp ứng kháng thể IgA ở trong huyết thanh

hoặc dịch mũi họng có thể phát hiện 5 năm sau khi mắc bệnh và IgA đặc hiệu này là

11

IgAl khang thé IgD va IgE xuat hién nhanh sau khi khỏi bệnh và tổn tại ít nhất 6

thang (Michell va Tingle, 1992), mot diéu dac biét là đáp ứng kháng thể ở nam nhanh hơn ở nữ giới

Bằng kỹ thuật miễn dịch thẩm thấu (immunoblotting) để phát hiện kháng thể đặc

hiệu rất khó khăn Tuy nhiên tác giả Zhang (Mỹ, 1992) đã chứng minh được kháng thể

EI và E2 hiệu quả hơn nếu sử dụng 2 mercaptoethanol Kết quả cho thấy hiệu quả E1

lớn hơn E2 và đáp ứng với kháng thể kháng C rất mạnh

3.5 Các dị tật bẩm sinh do rubella

Các trẻ em sinh ra mắc các tật bẩm sinh về tim, mắt, thính giác sau vụ dịch

rubella bùng nổ năm 1963 - 1964, nhưng chưa có nghiên cứu chứng minh xác định có rubella hay không ở các bà mẹ này, đó là điều rất đáng tiếc Khó xác định hơn là một

số trẻ bị tật bẩm sinh mà sinh ra trước vụ dịch 1963- 1964 với các bệnh giảm tiểu cầu, chảy máu, viêm tai các nghiên cứu thống kê, đánh giá về bệnh sốt phát ban do virut rubella cũng chưa đầy đủ Sau vụ dịch này các nhà khoa học đã quan tâm nhiều hơn và theo dõi những trẻ sinh trong vùng trước đó có dịch rubella và mang các tật bẩm

sinh.Cooper 1975, theo đối một số trẻ có các tật khi vừa sinh ra và chỉ tồn tại vài tuần

lại hết, không để lại di chứng Thai trong dạ con phát triển chậm nhưng hoàn chỉnh

Ngay sau khi đẻ đã quan sát thấy ở trẻ sơ sinh này có các tốn thương mắt, tim va tai

Một vài trường hợp chết trong tháng đầu do xuất huyết nội tạng

Tuổi của trê sơ sinh và trẻ em

Hình 6: Tỷ lệ phân lập được vừut ở trẻ sơ sinh bị nhiễm rubella bào thai

12

Đau khớp Hach Lympho

Peckham 1972 theo d6i 218 tré hic mới sinh hoàn toàn bình thường, nhưng chúng

đã bị nhiễm Rubella lúc mẹ mang thai Khi lên 1-4 tuổi thì 50 cháu (23%) bị điếc 85

cháu 6-8 tuổi được khám lại cho thấy 9 cháu bị hỏng thính giác Trong số này, 90% huyết thanh dương tính với rubella, điều này cho thấy khả năng điếc là do rubella bẩm

sinh

13

3.5.2 Bénh tim

Dị tật bẩm sinh thường xảy ra ở hệ thống tim mạch Nhiều nghiên cứu cho thấy thương tổn thường gặp nhất là các mạch tim, thông liên nhĩ, thông liên thất, ít gặp hơn

là viêm cơ tim bẩm sinh Có thể ảnh hưởng đến động mạch thận, động mạch phổi

3.5.3 Tổn thương thần kinh trung ương

Khoảng 25% trẻ nhiễm rubella bào thai khi sinh ra có các triệu chứng thần kinh, thường là viêm não, chứng ngủ gà, ảo ảnh, thóp phồng, tăng limpho bào ở dịch não tuỷ,

tăng protein trong dịch não tuỷ, liệt cứng thể nhẹ và một số các tổn thương thần kinh

khác xảy ra muộn 6 tháng sau khi sinh

Viêm não lan toả do rubella hiếm hơn Có 20 ca đã được thông báo trong nghiên cứu của một số tác giả Pháp, Đức và Mỹ Các triệu chứng biểu hiện từ 8-19 tuổi (Itabashi va Creamer 1975 Berry 1976)

Người ta đã phát hiện được virut rubella từ não bệnh nhân bằng phương pháp phân lập trên tế bào Mặt khác, còn tìm thấy virut rubella ở tế bào lympho của bệnh

nhân Hiệu giá kháng thể IgG và có thể IgM trong huyết thanh hoặc trong dịch não tuỷ tăng protein và globulin miễn dịch Bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang có thể

phát hiện trong tổ chức não nhưng không thấy kháng nguyên rubella

3.5.4 Tổn thương ở mắt

-_ Võng mạc tổn thương đến 50% ở trẻ em mắc rubella bẩm sinh (Reife 1974)

-_ Đục thuỷ tỉnh thể và dẫn tới mù

3.5.3 Bệnh đái đường

Là một biến chứng hiếm xảy ra & rubella bdm sinh Nhung sau dich rubella

1963-1964 cho thấy có 9 trong 45 trẻ (20% ở Australia) và 30 trong 242 trẻ (12,4% ở

Mỹ) phải dùng Insulin để điều trị

3.5.6 Tổn thương xương

Có thể phát hiện bằng X-quang, khoảng 20% số trẻ rubella bam sinh tim thay cdc vùng xương không bình thường và các biểu hiện này ở các xương dài Nhưng trong vòng 1-2 tháng thì trở lại bình thường

Bảng 1: Tỷ lệ thương tổn bẩm sinh ở trẻ sơ sinh bị nhiễm rubella

sau 3 tháng đầu mẹ mang thai (Coller và M Timbury)

Duc thuy tinh sống nhằn TS

ấp : ì eae: ———— Mà

Tuéi thai (tháng)

Hình 9: Mối liên quan giữa rubella bẩm sinh và tuổi thai

(Cooper và cộng sự, 1969) 3.5.7 Các bệnh xảy ra muộn

Trẻ 3-12 tháng có thể biểu hiện phát ban rubella mãn tính, ia chảy kéo dài, viêm phổi và tý lệ chết cao Thường dùng Corticoid để điều trị

Một số tác giả như Tardieu 1980 đã chứng minh những đứa trẻ mắc rubella bẩm

sinh sau đó vài năm xuất hiện các triệu chứng lâm sàng về tai, mắt và viêm não lan toả bán cấp Cũng có những trường hợp mang di chứng do rubella nhưng khi xây dựng gia đình, sinh con lại bình thường và không bị các đị tật

Ở Mỹ, vụ địch rubella 1963 — 1965 xảy ra đã có rất nhiều trường hợp phải mang

di chứng Trong nghiên cứu theo dõi 125 bệnh nhân đã mắc rubella bẩm sinh cho thấy tổn thương mắt chiếm 78%, tổn thương thính giác 66%, thiểu năng tỉnh thần và vận

động 62% và các bệnh về tim bẩm sinh là 58%: Thường gặp nhất là tổn thương mắt kết

hợp với thính giác hoặc bệnh tim

3.6 Sinh bệnh học

Nguy cơ của bào thai bị nhiễm virut rubella khi thai còn rất bé ở vài tháng đầu Virut lưu thông trong máu và rau thai Virut giải phóng ra sau đó 6 ngày rồi phát ban

và tồn tại có thể lâu hơn Thai nhiễm virut qua rau thai và virut gây tồn thương các phủ

tạng Năm 1966, trong một nghiên cứu của Tondury và Smith cho thấy: khi theo dõi

57 trẻ có mẹ đã bị nhiễm rubella trong 3 tháng đầu mang thai thì 68% trẻ sinh ra bị các

dị tật bẩm sinh Phân tích số trẻ này cho thấy: Mẹ nhiễm virut rubella ở tháng đầu 'mang thaithì nguy cơ di tật 80%, các thương tổn xuất hiện 10 ngày sau khi mẹ phát

15

ban Các nghiên cứu ¿z„vifro trên tế bào bào thai cho thấy virut rubella làm tổn thương

nhiễm sắc thể làm tế bào phân chia chậm hơn các tế bào không bị nhiễm Các cơ quan

của trẻ bị nhiễm virut rubella nhỏ hơn trẻ bình thường, các thương tổn nội mô của bào thai do virut rubella gây ra xuất huyết ở các mao mạch làm xơ cứng các nội tạng như gan, cơ tim virut rubella cũng phân lập được từ trẻ sơ sinh mà mẹ nhiễm virut rubella trong 3 tháng đầu mang thai

3.6.1 Sự tôn lưu của vữut

Nhiễm virut trong thời kỳ có thai ở 3 tháng đầu thì virut tồn tại trong suốt thời gian mang thai và nếu thai sẩy thì có thể phân lập được virut ở hầu hết các phủ tạng của

thai chết lưu

Có thể phát hiện virut ở dịch mũi họng, nước tiểu, phân, địch não tuỷ, nước mắt của trẻ sơ sinh 3 tháng tuổi với tỷ lệ 50-60%; nhưng ở trẻ 9-12 tháng, khả năng phân lập virut chỉ còn 10% (Cooper và Krugman 1967) Đặc biệt vài tuần sau sinh thì lượng virut có mặt trong các dịch tiết cao và nguy cơ lây nhiễm bằng đường tiếp xúc với trẻ

khác là rất dễ dàng Thậm chí có thể phân lập được virut ở trẻ em đục thuỷ tỉnh thể đã

3 tuổi (Menser 1967) và từ dịch não tuỷ của trẻ bị tổn thương hệ thần kinh trung ương

18 tháng tuổi (Desmond 1967)

Bằng miễn dịch huỳnh quang, Ziring 1977 đã phát hiện được kháng nguyên

rubella ở tuyến giáp trạng trẻ 5 tuổi mắc bệnh Hashimoto Bằng phương pháp phân lập

virut rubella trên tế bào đã phát hiện từ não một trẻ em 12 tuổi bị viêm não lan toả

(Cremer, Itabashi 1975) Các nghiên cứu còn cho thấy ở thần kinh trung ương, tế bào

hình sao là loại tế bào virut rubella nhân lên và tập trung cao độ

Câu hỏi đặt ra là virut rubella tồn tại như thế nào trong thời kỳ mang thai cũng

như trẻ sơ sinh trong năm đầu thì còn chưa rõ Có lẽ do làm tổn thương hệ thống miễn

dịch trung gian tế bào? hay tổng hợp Interferon kém? tất cả hình như gợi ý cho thấy

sự dung nạp miễn dịch chọn lọc đối với protein E1 có thể đồng vai trò quan trọng (Mauracher và cộng sự, 1993)

Bảng 2: Những biểu hiện lâm sàng chính của rubella bẩm sinh

(Dudgeon 1975 & Cooper 1985)

- Thinh giác giảm 1 tai hoặc 2 tai

Hệ thống thính giác: - Điếc l tai hoặc cả 2 tai

- Không nói được

Nhiing nghién cttu invitro cla Chantler va Tingle (1980) cho thay su nhan lén cla virut rubella trong té bao Lympho T, đại thực bào (Macrophage) và cũng có thể tồn tại

trong tế bào Lympho B gây ra ức chế tổng hợp protein của tế bào chủ, và nhiều giả thiết khác được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và thử nghiệm trên tế bào Lympho T

3.6.2 Nguy cơ đối với thai nhỉ

Trong 3 tháng đầu khi mang thai nếu các bà mẹ bi nhiém virut rubella thi 75-

100% thai nhỉ khi sinh ra bị các di tật bẩm sinh Một số các bà mẹ không xét nghiệm

theo dõi về các tật bẩm sinh này, đặc biệt ở các nước đang phát triển (Enders 1982,

Miller 1982, Grillner 1983) Nhiều trẻ em mới sinh bình thường, nhưng sau vài tháng hoặc vài năm mới phát hiện con mình bị các tật bẩm sinh như điếc, thần kinh kém phát

triển

Mẹ mang thai sau 3 tháng: Rất khó phân lập được virut rubella từ trẻ sơ sinh hoặc

thai 3 tháng tuổi Các nghiên cứu về huyết thanh học đã xác định mẹ nhiễm virut rubella trong 3 tháng đầu thì trẻ sơ sinh bị nhiễm rất cao Ngược lại, mẹ nhiễm virut rubella sau 3 tháng mang thai thì có thể phát hiện, kiểm tra IgM 25-33% là mẹ nhiễm

virut rubella vào tuần 16-20 mang thai Tuy nhiên các cơ quan được hình thành vào

tuần 12 và đáp ứng kháng thể có thể bị giới hạn Nhiều các thông báo của các tác giả

cũng chứng minh rằng nguy cơ nhiễm khoảng 17% ở tuần 13-16 và 5,9% vào tuần 17-

20 của thời kỳ mang thai

4 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Chẩn đoán lâm sàng nhiễm virut rubella không thể phân biệt được với các bệnh sốt phat ban khác, mà phải có chẩn đoán xác định ở phòng thí nghiệm Đặc biệt, các bệnh phát ban giống như virut rubella trong thời kỳ mang thai Virut rubella phát triển trên tế bào nuôi rất chậm và thậm chí rất khó nhận biết hiện tượng huỷ hoại tế bào

(CPE), nên chẩn đoán huyết thanh học là tốt nhất Hiệu giá kháng thể có thể phát hiện được bằng nhiều phương pháp: HAI (ngăn ngưng kết hồng cầu), EIA, LA (Latex

agglutination), SRH (Single radial haemolysis), Mặc dù kháng thể HAI xuất hiện 1

hoặc 2 ngày sau phát ban, các kháng thể EIA, LA, SRH có thể kéo dài 7 đén 8 ngày

Kháng thể IgM có thể phát hiện được bằng phương pháp ELISA như tóm bắt IgM, đây

là phương pháp thích hợp nhất

Bộ sinh phẩm EIA sử dụng chẩn đoán kháng thể đặc hiệu IgM đang được thương

mại hoá Đây là kỹ thuật đặc hiệu và nhậy nhất nên được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng để giám sát huyết thanh học Theo Hudson và Morgan (1996) thì IgM đặc hiệu cho rubella xuất hiện trong vòng 4 ngày sau khi khởi ban và tồn lưu 4 đến 12 tuần Trên 4 tuần, sau khi khởi ban việc phát hiện IgM sẽ phụ thuộc vào độ nhậy của kỹ thuật chẩn đoán

Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ tóm bắt kháng thể MACRIA (IgM Antibody

Capture Radio Immuno Assay) được Tenden nghiên cứu năm 1982 và đã sử dụng ở

Anh quốc Kháng thể đặc hiệu IgM và IgG kháng virut rubella có thể được phát hiện trong nước bọt bằng cách sử dụng kỹ thuật này Các kết quả rất tương quan với kháng

thể trong huyết thanh Thời gian tốt nhất để phát hiện kháng thể "TeM là từ ¡ đến 5 tuần sau khởi bệnh

Tái nhiễm rubella được kết hợp với tăng nồng độ kháng thể, đôi khi hiệu giá rất

-cao, đáp ứng kháng thể IgM cũng có thể xuất hiện nhưng thường là thấp và chỉ tạm thời chứ không như sơ nhiễm Yêu cầu vẻ chẩn đoán gồm hồi cứu tiền sử có tiếp xúc

17

voi rubella, tiém vacxin phdng bệnh rubella, phát ban do rubella không? Điều đó rất

khó chấn đoán phân biệt giữa sơ nhiễm và tái nhiễm và nếu như máu thử nghiệm lấy

trước khi tiếp xúc hoặc ngay sau khi tiếp xúc thì cũng chưa tạo được kháng thể Tuy

nhiên, vẫn có thể chẩn đoán phân biệt được tái nhiễm và sơ nhiễm bằng thử nghiệm tìm hiệu giá kháng thể đặc hiệu IgG của những ca bệnh mới sơ nhiễm gần thì thấp hơn những ca tái nhiễm

4.1 Đánh giá rubella ở phụ nữ có thai

Chú ý lời khai của bệnh nhân về ngày phát bệnh Lấy máu ngay sau khi khởi

bệnh càng sớm càng tốt Mẫu máu lấy trong vòng 3-4 ngày đầu khởi bệnh thì sẽ có khả năng phát hiện được kháng thể bằng kỹ thuật HAI và EIA Tìm động lực kháng thể

phải lấy máu hai lần Lần 2 cách lần 1 ít nhất từ 5-7 ngày Hầu hết bệnh nhân xuất hiện kháng thể một vài ngày sau khi khởi bệnh, đáp ứng kháng thể có thể đến 10 ngày Nhiều bệnh nhân ở giai đoạn sau cấp tính, hiệu giá kháng thể tăng đến mức tối đa, nhưng nó không có ý nghĩa gì cho việc chẩn đoán cho bệnh nhân mới nhiễm gần đây hay đang nhiễm Nếu xuất hiện triệu chứng lâm sàng thì phải tiến hành lấy máu xét

nghiệm IgM ngay để có thể xử lý kịp thời (giữ thai hay không) Phụ nữ trước mang thai nên xét nghiệm, nếu kháng thể IgG kháng virut rubella (-) thì phải tiêm vãăcxin ngay

Nồng độ kháng thể < 10-15 IU/mi thì được coi là âm tính

4.2 Phân lập và dinh loai virut rubella

Bệnh phẩm có thể phân lập trên tế bào hoặc bằng kỹ thuật PCR Phân lập virut ít

khi dùng để chẩn đoán vì rất mất thời gian và tốn kém Việc phân lập virut chỉ để

nghiên cứu dịch tễ học phân tử của virut rubella ;

Virut rubella có thể tạo đám hoại tử trên các dòng tế bào RKI13, SIRC va Vero

bằng hiện tượng giao thoa trên tế bào thận khỉ xanh (GMK) tiên phát (Parkman và Buecher, 1962) và các tế bào thận khi khác hoặc sử dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (Immuno fluorescence) hoặc miễn dịch gấn kết peroxydasse (Immuno peroxydase) để phát hiện kháng nguyên trong tế bào RK13, BHK21, Vero K¥ thuat

nhậy nhất để phân lập virut rubella là cấy truyền 1-2 lần trên tế bào Vero, tiếp đến cấy

trên tế bào RKI13 và sau đó có thể định loại bằng miễn dịch huỳnh quang (Best và

O”Shea, 1995) Tuy nhiên, phân lập virut phải làm nhanh chóng, tối thiểu phải mất 3 tuần mới có kết quả Kỹ thuật này thường được thực hiện ở các phòng thí nghiệm đặc

những trường hợp sơ nhiễm gần hiệu giá kháng thể thấp hơn trường hợp tái nhiễm

4.3 Chẩn đoán phòng thí nghiệm về rubella bẩm sinh

Chương trình giám sát quốc gia rubella bẩm sinh ở Anh quốc đã xếp loại những trường hợp nghỉ ngờ rubella bẩm sinh theo tiêu chuẩn dưới đây:

4.3.1 Phát hiện kháng thể đặc hiệu IgM trong huyết thanh ở trẻ mới sinh Sử đụng MAC-EIA là thích hợp nhất Ở trẻ em 1-3 tháng tuổi có triệu chứng đều có thể phát

hiện IgM ya 6 tré 3-6 tháng tuổi vẫn còn phát hiện thấy IgM Ở trẻ 6 -12 tháng tuổi, tỷ

lệ phát hiện thấy IgM là 50% và rất hãn hữu ở trẻ trên 1 tuổi còn IgM (Chantler, 1982)

18

Nếu không phát hiện được IgM bằng MAC-EIA trong thời kỳ sơ sinh thì loại trừ được

rubella bẩm sinh

4.3.2 Phát hiện kháng thể IgG đặc hiệu trong huyết thanh hoặc nước bọt tại thời điểm

mà kháng thể mẹ truyền không còn nữa (Ví dụ: thai tháng thứ 8) Có thể đây là kỹ

thuật hữu hiệu khi đã quá muộn để xét nghiệm IgM.-

4.3.3 Phân lập virut rubella hoặc xác định ARN bằng phương pháp RT-PCR (Bosma 1995) trong bệnh phẩm như dịch ngoáy họng ở trẻ sơ sinh Điều kiện phân lập virut rubella không thể làm ở các Bệnh viện hoặc viện không chuyên khoa, nhung RT-PCR

có thể ứng dụng cho dịch hút trong đục thuỷ tỉnh thể để chẩn đoán kháng nguyên rubella bẩm sinh Dịch hút xong được bảo quản trong điều kiện lạnh, dung dịch bảo

quản là NaCI1 0,85%, rồi gửi đến phòng thí nghiệm để xét nghiệm (Bosma, 1995)

Bảng 3: Tiêu chuẩn xếp loại rubella bẩm sinh

Nhiễm Rubella bẩm sinh

- Khong di tat do rubella nhưng có nhiễm bẩm sinh

~_ Xác định bằng phân lập virut hay phát hiện kháng thể IgM

đặc hiệu hoặc có kháng thể IgG ở trẻ sơ sinh

- Xác định -_ Các thương tổn do rubella điển hình có thêm IgM(+) và có

IgG lúc mới sinh; Hoặc có 2 hoặc nhiều hơn các tổn thương

đo rubella, và xác định được mẹ nhiễm trong thời kỳ mang thai

- Tương hợp -_ Có 2 hoặc nhiều thương tổn do rubella mà không có chẩn

đoán phòng thí nghiệm hoặc một thương tổn do rubella Xác

định mẹ nhiễm trong thời kỳ thai nghén

- Có thể xảy ra + - Những phát hiện lâm sàng tương hợp với số liệu phòng thí

nghiệm không kết luận được, hoặc chỉ có tổn thương do

rubella và mẹ nhiễm trong thời kỳ thai nghén

- Không xếp loại được - _ Thiếu thông tin để xác định hoặc loại trừ virut Rubella phân

lập được từ phân, nước tiểu, nước mắt, địch não tuỷ và dich tiết nước mũi, họng của trẻ sơ sinh

Cooper va Krugman (1967) phan lập được virut rubella từ dịch mũi họng ở hầu hết trẻ sơ sinh bị nhiễm lúc mới sinh Nhưng trẻ 3 tháng tuổi giảm còn 60% và 9-12

tháng tuổi còn 10% Tuy nhiên, virut rubella có thể tồn tại ở các vị trí khác có thể lâu

hơn Tỷ lệ chết chu sinh cao ở các trường hợp (+) virut rubella có thể phân lập được ở hầu hết các sinh thiết phủ tạng từ các trẻ sơ sinh nhiễm virut rubella và chết sau sinh

Trẻ phân lập được virut rubella có thể bị mất kháng thể glycoprotein E1 và có thể

không phát hiện được kháng thể HAI một cách liên tục Để xác định tình trạng miễn

dịch của những trẻ đã đến khám muộn có thể cần thiết dùng thử nghiệm EiA và LA,

phát hiện kháng thể cho tất cả Polypeptide của virut rubella

5 Du phong rubella

5.1 Vdcxin rubella

Chủng virut rubella đầu tiên giảm độc lực là một nghiên cứu của Viện NIH-USA

‘Ching nay duge phân lập từ một tân binh mắc rubelia cấp tính, sau đó chủng được làm

19

giảm độc bằng cấy truyền 77 lần trên tế bào thận khi xanh (vevirut Rubellaet monkey

kidney) Tiếp theo thử nghiệm bước đầu trên khi kết quả là có bảo vệ Sau đó tiếp tục làm giảm độc lực bằng cách cấy truyền 5 lần trên tế bào phôi vịt

Trong một thời gian ngắn, một chủng văcxin virut rubclla tiếp tục được nghiên cứu làm giảm độc lực trên tế bào thận thỏ và trên tế bào lưỡng bội của người RA27/3 Vacxin từ chủng RA27/3 có nguồn gốc phân lập từ thận bào thai khi đã nhiễm rubclla

Ching này đã được sử dụng rộng rãi khắp thế giới để sản suất văcxin Mặc dù ở Nhật

Bản, một số chủng văcxin virut rubella cũng được phát triển nhưng hiện nay vẫn đang

sử dụng chủng RA27/3 Các số liệu thử nghiệm về rubella cho thấy chúng có tính miễn

dịch, được bảo vệ và thử thách Những người tiêm văcxin thải virut rubella qua đường

mũi, họng nhưng +virut không còn có khả nang gây bệnh Những nghiên cứu về các chủng virut rubella để sản xuất văcxin đã được Banatvala và Best tổng kết (1989) và

Best (1991)

3.2 Chương trình tiêm chúng văcxin

Vãcxin rubella được ra đời ở Mỹ 1969 và ở Anh quốc 1970 Ở Mỹ, đường lối dự phòng các bệnh trẻ em được để ra nhằm mục dích ngăn chặn đường lây truyền của virut Việc tiêm phòng văcxin cho trẻ em ở trước tuổi đi học làm giảm nguy cơ phụ nữ

mang thai bị nhiễm rubella Tỷ lệ tiêm vãcxin càng cao thì rõ ràng càng làm giảm đáng

kể các tật bẩm sinh mắc phải Tuy nhiên, 1989 và 1990 sốt phát ban do virut rubella lại xảy ra ở phụ nữ không tiêm văcxin ở một vài nơi của Mỹ, hậu quả để lại các dị tật bẩm

sinh ở trẻ em (Lindegren và cộng sự 1991)

Ngược lại, chương trình tiêm văcxin có lựa chọn mới bắt đầu ứng dụng ở Anh

quốc là tiêm cho bé gái tuổi dậy thì và cho các phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ Sau đó, họ

khuyến cáo rằng: Tất cả phụ nữ mang thai đều phải xét nghiệm, nếu kháng thể rubella

(-) thì yêu cầu tiêm vacxin Mac dù 90% bé gái ở tuổi dậy thì đã tiêm và chỉ một phần phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ chỉ có 2-3% tiêm văcxin vì vậy số còn lại vẫn có khả năng

bị nhiễm khi rubella ở cộng đồng Chính vì vậy, cái đích tiêm văcxin là chương trình trong toàn cộng đồng cần phải thực hiện ở trẻ trai và gái ở độ tuổi đến trường phải được thực hiện (Banatvala 1987) Hiện nay, tiêm 3 loại văcxin cùng phòng 3 bệnh MMR

(Sởi, quai bị, Rubella) ở 15 tháng tuổi, và tiêm MR (Sởi, Rubella) cho tất cả trẻ 5 đến

16 tuổi để dự phòng dịch sởi, quai bị và rubella

5.3 Virut rubella thải ra như thế nào?

Người ta phát hiện được virut rubclla từ dịch mũi, họng ở những người tiêm văcxin từ 6 đến 29 ngày sau tiêm cũng như trong sữa của phụ nữ cho con bú; nhưng nồng độ virut rất thấp và không có khả năng lây truyền hoặc gây bệnh thể lâm sàng vì chủng virut văcxin đã giảm độc lực

Giéng nhu cdc vac xin virut s6ng khác, bệnh nhân thoả hiệp miễn dịch như các

bệnh hiểm nghèo, những người đang dùng thuốc gây độc cho tế bào, điều trị bằng tia, các chất corticoid, bệnh nhân giảm tiểu cầu và HIV dương tính

Các văcxin sống có thể tiêm đồng thời nhưng ở các phía khác nhau của chi, loại trừ văcxin hỗn hợp MMR Hai văcxim sống cùng tiêm phải tách ra,cách nhau khoảng 3 tuần Nếu có sốt thì đó là phản ứng và sẽ qua nhanh chóng Văcxin rubella có chứa kháng sinh như Neomycin, Kanamycin hoặc Polymycin vì vậy nếu cơ địa dị ứng với các kháng sinh này cũng không nên tiêm văcxin Tiêm vãcxin rubella, phải để sau 3 tháng mới được truyền máu hoặc dùng globulin miễn dịch Tuy nhiên, sử dụng

globulin miễn dịch kháng D không lấn át được đáp ứng miễn dịch

5.6 Tiêm văcxin trong thời kỳ có thai

Mặc dù các chủng virut rubella hoang dại đã tạo ra quái thai Các số liệu tích lũy

từ những nghiên cứu đã thông báo ở nhiều nước, trong đó có hơn 500 phu nit man cam với rubella được tiêm văcxin trong thời kỳ thai nghén, đặc biệt trong 3 tháng đầu mang

thai Chủng virut vãcxin có thể gây nhiễm virut cho thai nhi, vì virut rubella vẫn phân

lập được từ rau thai, thận và tuy xương đến 94 ngày sau khi tiêm vãcxin Hơn thế nữa, kháng thể IgM có mặt hoặc tồn lưu ở 3% số trẻ em có mẹ mang thai tiêm văcxin ở thời

I DOI TUONG VA PHUGNG PHAP NGHIEN CỨU

1 Đối tượng nghiên cứu

-_ 728 mẫu huyết thanh của trẻ em 9 tháng đến 14 tuổi của Tiên Lãng-Hải Phòng

-_ 308 mẫu huyết thanh của trẻ em L đến 10 tuổi của Thanh Hoá

- _ 100 mẫu huyết thanh của phụ nữ mang thai 3 tháng đầu của Hà Nội

- 452 mau huyết thanh bệnh nhi sốt phát ban nghị Sởi

- _ 52 mẫu huyết thanh của bệnh nhi 1 ngày đến 3 tuổi

* Sinh phẩm

Bộ sinh phẩm Enzygnost® Anti Rubella-virus/[gM (Behring-CHLB Ditc)

Bộ sinh phẩm Platelia® Rubella-IgG (BioRad-Pháp)

* Phiếu điều tra một số thông tin của các bà mẹ mang thai

2 Phương pháp

Từ khi phát hiện được virut rubella năm 1962, nhiều tác giả nghiên cứu các

phương pháp phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng rubella

Trước đây một số phương pháp đã được ứng dụng như kỹ thuật trung hòa (NT) kết hợp bổ thể (CF) miễn dịch huỳnh quang (IF) Nhưng cũng có một số khó khăn ở các phòng thí nghiệm thông thường và các kết quả xét nghiệm cũng có lúc không

chính xác Dùng kỹ thuật ƯCNKHC (HỊ) có thể chẩn đoán giai đoạn cấp và tình trạng miễn dịch của bệnh nhân Engvall và Perlman 1971 đã miêu tả về kỹ thuật miễn dịch

Enzyme Sự phát triển của kỹ thuật này đã góp phần cải thiện sự phát hiện kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu và có độ nhạy cao Phụ nữ trước thời kỳ mang thai nếu xết nghiệm có IgG kháng vi rút rubclla là đủ bảo vệ thai nhi không nhiễm bệnh hoặc đánh giá tình trạng miễn dịch sau khi tiêm vắc xin Hoặc xét nghiệm huyết thanh cho thấy IgG tăng lên 2 lần chứng tỏ mới nhiễm Rubella mà có thể không có triệu chứng lâm sàng điển hình

2.1 Kỹ thuật ELISA phát hiện IgŒ

Sử dụng bộ sinh phẩm Platelia rubella IgG (Bio-Rad) Bộ sinh phẩm này để định

tính và định lượng IgG người kháng vi rút Rubella trong huyết thanh hoặc huyết tương bệnh nhân

2.1.1 Nguyên lý

Là thử nghiệm miễn dịch Enzyme trên phiến cứng (Solid phase enzyme 1mmunoassay) như phương pháp ELISA gián tiếp

Phủ bản kháng nguyên virut rubella đã bất hoạt Kháng thể kháng virut Rubella

trong mẫu huyết thanh sẽ kết hợp với kháng nguyên Sau đó rửa bản để loại bỏ các lgG

và protein không đặc hiệu của huyết thanh Thêm vào cộng hợp (kháng thể đơn dòng đặc hiệu chuỗi gamma người gắn Enzyme peroxidase) tạo thành phức hợp kháng

nguyên + kháng thể + cộng hợp Các kháng thể không gắn vào phức hợp được loại bỏ trong quá trình rửa bản Tiếp đến dung dịch cơ chất OPD Phản ứng tạo màu ở mức đậm, nhạt cho phép định lượng IgG trog mẫu thử Dừng phản ứng bằng axit sulfuric Sử

dụng máy đọc ELISA để đo mật độ quang học (OD) ở bước sóng 492 nm

22

Bước | © KN Rubella

Rửa bản loại bỏ Globulin miễn dịch không đặc hiệu và protein trong huyết thanh

Bước 3 A È Cộng hợp: kháng IgG người gắn Peroxydase

Bước 4 bàn Cơ chất OPD

2.1.2 Giới thiệu và hướng dẫn sử dụng sinh phẩm trong bộ kH: Platelia Rubella IgG

Bản phủ kháng nguyễn được để ở nhiệt độ phòng 10-15 phút trước khi sử dụng

Cát bỏ túi giấy bạc và dùng ngay Các dãy (strips) chưa dùng có thể để 2-8°C trong túi giấy bạc và dán kín bằng băng dính

R2 Dung dịch rửa đặc 10 lần (10x) 100ml

Dung dịch đệm Tris-NaCl (pH 7,4 + 0,15) ; 1% Tween 20 và 0,01% Thiomerosal

Pha 100ml dung dịch rửa 10x với 900ml nước cất để có 1000ml vừa đủ để rửa I bản Nước cất hoặc nước trao đổi lon để ở nhiệt độ phòng Dung dịch R2 có thể giữ 4 tuần ở

2-8°C Trước khi dùng phải để ở nhiệt độ phòng khoảng 10-15 phút

R3 Huyết thanh mẫu chuẩn âm: 0,50 ml

Huyết thanh người không có kháng thể IgG khang Rubella, khong cé HBsAg,

HCV va HIV, bao quan trong Thiomerosal 0,01%

R4a Huyét thanh mau chudn duong (1): 0,5 ml; 15UI/ml

Huyết thanh người có chứa kháng thể IgG kháng Rubella va khong cé HBsAg,

HCV và HIV, bảo quản trong Thiomerosal 0,01%

R4b Huyết thanh mẫu chuẩn dương (II): 0,5 ml; 60 U1/ml (như R4a)

Rác Huyết thanh mẫu chuẩn dương (II): 0,5 ml; 120 UI/ml (như R4a)

R4d Huyết thanh mẫu chuẩn dương (IV): 0,5 ml; 500 UI/ml (như Ráa)

RS Khong có R5

23