Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Phương pháp này có đặc điểm là cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy. Phương pháp đếm khuẩn lạc có thể được thực hiện bằng kỹ thuật hộp trải hay hộp đổ.
Trang 1Bài 1 ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT TỔNG SỐ
I Nguyên tắc
Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc Phương pháp này có đặc điểm là cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy Phương pháp đếm khuẩn lạc có thể được thực hiện bằng kỹ thuật hộp trải hay hộp đổ Trong phương pháp này, cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc
10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán Mật độ tế bào quá lớn làm các khuẩn lạc chồng chéo lên nhau hoặc tạo thành màng sinh khối Ngược lại, số lượng khuẩn lạc trên một đĩa quá nhỏ sẽ không có giá trị thống kê Số lượng khuẩn lạc tối ưu được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín như FDA, AOAC là 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa
Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường và điều kiện ủ Các tế bào trên đĩa không tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc với tốc độ như nhau, do vậy nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc nếu thời gian
ủ không đủ dài Thông thường, điều kiện nuôi cấy (môi trường, nhiệt độ, thời gian) cần đảm bảo sao cho số khuẩn lạc xuất hiện tối đa Phương pháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai
số lớn nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất 2 đĩa Ngoài ra, do có khả năng nhiều tế bào hình thành chung một khuẩn lạc nên số đếm khuẩn lạc không nhất thiết trùng lặp với số tế bào ban đầu được đưa lên môi trường nên kết quả đếm và mật độ tế bào ban đầu được đưa lên môi trường nên kết quả đếm và mật độ tế bào thường được trình bày bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/ml thay vì số tế bào/ml
Mặc dù vẫn có một số nhược điểm nhưng phương pháp đếm khuẩn lạc vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định mật độ tế bào sống Ngoài ra, phương pháp này còn
có ưu điểm là độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm
II Nguyên liệu - Dụng cụ - Thiết bị
- Mẫu mỹ phẩm: Phấn phủ Pond’s magic power
Trang 2- Ống nghiệm
- Que cấy trải
- Micropipette
- Đầu típ (100μl, 1000μl)l, 1000μl, 1000μl)l)
- Đèn cồn
- Bộ kít bọc thức ăn
- Cốc thủy tinh
- Ống đong
- Bình tam giác
- Cân điện tử
- Box cấy
- Máy hấp
- Bếp hồng ngoại
III Môi trường - Hóa chất
- Môi trường PCA nuôi cấy vi khuẩn:
Cao nấm men 2,5g
- Môi trường PGA nuôi cấy nấm mốc:
Khoai tây 200g (khoai tây cắt lát, đun nhừ, chắt dịch chiết)
IV Cách tiến hành
Thu mẫu:
- Thu mẫu phấn phủ Pond’s magic power tại khu vực chợ D, thành phố Buôn Ma Thuột, tỉnh Đắk Lắk Mẫu mỹ phẩm này đã qua sử dụng
Trang 3Hình 1 Phấn phủ Pond’s magic power
Chuẩn bị:
- Pha nước muối sinh lý vô trùng: Pha nước muối NaCl 0,9% Phân phối vào các ống nghiệm với thể tích 9ml/ống Nút bông, báo và đem hấp khử trùng ở 1,5 atm/20 – 30 phút
- Pha chế môi trường và khử trùng: Pha chế môi trường PCA và PGA sau đó nút bông và báo lại rồi đem hấp khử trùng
- Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường vô trùng: hấp khử trùng đĩa
- Chuẩn bị hộp đầu típ vô trùng: Cho đầu típ vào hộp petri, gói báo và đem hấp khử trùng
- Chuẩn bị que cấy trải: Cho que cấy vào giấy bạc, gói lại rồi đem hấp khử trùng
Lưu ý: Để tiết kiệm thời gian, cần bố trí hấp 1 lần duy nhất cho các phần chuẩn bị trên.
- Đổ đĩa: Đĩa môi trường phải được đổ trong điều kiện vô trùng ở box cấy (lau bằng cồn 70o, UV trong 30 phút) Đổ đĩa phải được thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn Thao tác nhanh, chính xác, tránh mở nắp đĩa quá lâu, chạm tay vào bên trong đĩa hoặc để bình môi trường đứng khi không đậy nút Đĩa đổ xong cần đậy nắp lại và ghi tên môi trường sau đó chờ môi trường đông hẳn mới sử dụng
- Các dụng cụ được cho vào box cấy trong quá trình bật UV: que cấy trải, ống nghiệm chứa nước muối sinh lý, đĩa petri chứa môi trường, đầu típ, cốc thủy tinh đựng đầu típ, bộ kít bọc thức ăn, diêm, cốc thủy tinh đựng cồn 70o
Tiến hành:
- Cân mẫu: cân 1g phấn phủ
- Pha loãng mẫu tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân: 10-1, 10-2, 10-3 Mỗi bậc pha loãng là 1/10 được thực hiện bằng cách dùng 1g mẫu thêm vào 9ml nước muối
Trang 4sinh lý Sau khi lắc kỹ sẽ được độ pha loãng 1/10 Tiếp tục tiến hành cho đến độ pha loãng cuối cùng
Hình 2 Phương pháp pha loãng mẫu
- Dùng micropipette và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1ml dịch chứa
vi sinh vật ở độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 trải lên đĩa petri chứa 2 môi trường PCA
và PGA
- Nhúng đầu que cấy trải vào cồn 70o, hơ qua ngọn lửa đèn cồn để khử trùng Để đầu que cấy nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa
- Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng que cấy trải lên bề mặt thạch của đĩa petri Dùng đầu que cấy xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng ½ chu vi đĩa tạo điều kiện cho que cấy trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường
- Đậy nắp đĩa petri, sử dụng bộ kít bọc thức ăn bọc kỹ đĩa, để đông tự nhiên
- Ủ các đĩa petri trong tủ ấm 30oC trong 24 – 48h cho đến khi xuất hiện các khuẩn lạc
Lưu ý: Các thao tác pha loãng mẫu và cấy mẫu đều được thực hiện trong điều kiện
vô trùng ở box cấy, khử trùng tay bằng cồn 70o Cần ghi chú tên người thao tác, tên chủng vi sinh vật, tên môi trường, ngày tháng tiến hành thí nghiệm lên tất cả các đĩa petri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy,…
Trang 5V Kết quả
Ở môi trường nuôi cấy vi khuẩn PCA
Hình 3 Khuẩn lạc mọc trên trên môi trường PCA
- Ở đĩa petri có độ pha loãng 10-1 đều xuất hiện khuẩn lạc đơn:
+ Đĩa 1: 11 khuẩn lạc/đĩa
+ Đĩa 2: 5 khuẩn lạc/đĩa
- Ở đĩa petri có độ pha loãng 10-2 đều xuất hiện khuẩn lạc đơn:
+ Đĩa 1: 2 khuẩn lạc/đĩa
+ Đĩa 2: 1 khuẩn lạc/đĩa
- Ở cả 2 đĩa petri có độ pha loãng 10-3 không xuất hiện khuẩn lạc đơn
Ở môi trường nuôi cấy vi khuẩn PGA
Hình 4 Khuẩn lạc mọc trên môi trường PGA
Trang 6- Ở đĩa petri có độ pha loãng 10-1 đều xuất hiện khuẩn lạc đơn:
+ Đĩa 1: 9 khuẩn lạc/đĩa
+ Đĩa 2: 3 khuẩn lạc/đĩa
- Ở cả 2 đĩa petri có độ pha loãng 10-2 không xuất hiện khuẩn lạc đơn
- Ở cả 2 đĩa petri có độ pha loãng 10-3 không xuất hiện khuẩn lạc đơn
VI Kết luận
Hiện nay chưa có tiêu chuẩn nhà nước về vi sinh vật trong mỹ phầm Một số chỉ tiêu vi sinh vật thường được kiểm tra là tổng số vi khuẩn hiếu khí, tổng số nấm men,
nấm mốc, kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật như Staphylococcus aureus, E coli, Candida albicans,…
Dựa vào số khuẩn lạc đếm được sau nuôi cấy, tính mật độ của VSV (vi khuẩn, nấm mốc) theo công thức sau:
A (CFU/g hay CFU/ml) = n 1 vf 1+ …+nivfi N Trong đó:
A: Tổng số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1g hoặc 1ml mẫu
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: tổng số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng
v: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa
fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm
Tuy nhiên, trong thí nghiệm định lượng vi sinh vật tổng số trong mẫu mỹ phẩm (phấn phủ Pond’s magic power) thì số lượng khuẩn lạc xuất hiện trong môi trường nuôi cấy là quá ít nên không có giá trị thống kê (Số lượng khuẩn lạc tối ưu được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín như FDA, AOAC là 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa) Do đó, không thể áp dụng được công thức trên để xác định mật độ vi sinh vật
Vì vậy, có thể kết luận rằng mẫu mỹ phẩm phấn phủ Pond’s magic power là mẫu
mỹ phẩm sạch, sự xuất hiện của vi sinh vật là không đáng kể
Trang 7Bài 2 MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA CỦA VI SINH VẬT
I Thử nghiệm catalase
1 Nguyên tắc
Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome
đều có enzyme catalase (trừ các Streptococcus spp.) Enzyme này là một trong các
thành viên của hệ thống các enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của oxi phân tử trong tế bào hiếu khí và kỵ khí tùy ý Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxi là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử tạo H2O2 Catalase thủy phân
H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ của phân tử có độc tính cao này trong tế bào Tuy nhiên, ngoài catalase, nhiều enzyme peroxidase khác trong hệ thống các enzyme bảo vệ tế bào khỏi stress oxi hóa cũng có khả năng thủy phân H2O2 Các enzyme này cũng chỉ hiện diện ở các tế bào, vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp hiếu khí Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí
2 Nguyên liệu - Dụng cụ - Hóa chất
- Khuẩn lạc thuần từ môi trường PCA (bài 1)
- Lam kính
- Que cấy vòng
- Đèn cồn
- Micropipette
- Đầu típ (100μl, 1000μl)l, 1000μl, 1000μl)l)
- H2O2
- Cốc thủy tinh
3 Cách tiến hành
Cần khử trùng que cấy, đầu típ, micropipette, lam kính cần được khử trùng bằng cồn 70o
Khử trùng đầu que cấy trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một lam kính sạch, chà nhẹ Dùng
Trang 8micropipette nhỏ một giọt H2O2 lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính Ghi nhận sự sủi bọt
4 Kết quả và nhận xét
Hình 5 Hoạt tính catalase ở 2 chủng vi sinh vật
Phản ứng dương tính được nhận thấy ở thí nghiệm trên chính là do các phân tử oxy sinh ra làm xuất hiện bọt khí, điều này chứng tỏ rằng 2 chủng vi sinh vật đều có hoạt tính catalase phân hủy H2O2 và giải phóng O2 2 chủng này đều là vi sinh vật kỵ khí hoặc hiếu khí tùy ý
Hầu hết các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý đều có hệ enzyme catalase Enzyme này là một trong các thành viên của hệ thống các enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của oxi phân tử trong tế bào hiếu khí và kỵ khí tùy ý
Ngoài ra, các enzyme này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức
hô hấp hiếu khí tạo năng lượng cho tế bào
II Thử nghiệm amylase
1 Nguyên tắc
Enzyme ngoại bào α – amylase xúc tác sự phân hủy tinh bột thành đường maltose Phân tử đường này có tính tan tốt hơn, có thể vào tế bào và được vi sinh vật dùng làm nguồn năng lượng và carbon Hoạt tính phân hủy tinh bột được phát hiện dựa theo
Trang 9nguyên tắc sau đây Tinh bột là một polysaccharide có cấu trúc không gian tương đối phức tạp Khi môi trường chứa tinh bột được nhuộm bằng iod, iod sẽ bị giữ lại trong cấu trúc mạng không gian này của tinh bột và làm môi trường có màu xanh đậm Nếu
vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột thì cấu trúc này bị phá vỡ, do đó sẽ xuất hiện vòng phân giải trong suất bao quanh khuẩn lạc
2 Nguyên liệu - Dụng cụ - Thiết bị
- Khuẩn lạc thuần từ môi trường PCA (bài 1)
- Đĩa petri
- Que cấy vòng
- Đèn cồn
- Bộ kít bọc thức ăn
- Cốc thủy tinh
- Ống đong
- Bình tam giác
- Cân điện tử
- Box cấy
- Máy hấp
- Bếp hồng ngoại
3 Môi trường - Hóa chất
- Môi trường tinh bột:
Cao thịt 10g
Tinh bột 20g
4 Cách tiến hành
Chuẩn bị:
- Pha chế môi trường và khử trùng: Pha chế môi trường PCA và môi trường tinh bột sau đó nút bông và báo lại rồi đem hấp khử trùng
- Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường vô trùng: hấp khử trùng đĩa
Lưu ý: Để tiết kiệm thời gian, cần bố trí hấp 1 lần duy nhất cho các phần chuẩn bị trên.
- Đổ đĩa: Đĩa môi trường phải được đổ trong điều kiện vô trùng ở box cấy (lau bằng cồn 70o, UV trong 30 phút) Đổ đĩa phải được thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn
Trang 10Thao tác nhanh, chính xác, tránh mở nắp đĩa quá lâu, chạm tay vào bên trong đĩa hoặc để bình môi trường đứng khi không đậy nút Đĩa đổ xong cần đậy nắp lại và ghi tên môi trường sau đó chờ môi trường đông hẳn mới sử dụng
- Các dụng cụ được cho vào box cấy trong quá trình bật UV: que cấy vòng, đĩa petri chứa môi trường, bộ kít bọc thức ăn, diêm, cốc thủy tinh đựng cồn 70o
Tiến hành:
- Cấy ria vi khuẩn đã phân lập được ở bài 1 trên môi trường PCA để tạo giống thuần
- Khử trùng đầu que cấy trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ Mở nắp đĩa petri chứa vi khuẩn, làm nguội que cấy và lấy giống, khử trùng lại đĩa
- Dùng một tay mở nắp đĩa petri chứa môi trường làm thuần, một tay ria đầu que cấy trên bề mặt thạch Ria trên bề mặt thạch theo những đường zigzac trên khoảng
¼ đĩa thạch Tránh trường hợp đầu que cấy đâm vào môi trường làm lủng thạch
- Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn Xoay đĩa petri ¼ vòng tròn
- Mở nắp đĩa petri chứa môi trường làm thuần và đợi que cấy nguội bằng cách áp đầu que cấy lên nắp đĩa Bắt đầu ria đường thứ hai từ một vị trí trên đường ria đầu tiên
- Tiếp tục ria các đường tiếp theo tương tự cho đến khi ria kín bề mặt thạch Khử trùng lại que cấy sau khi ria xong
- Đậy nắp đĩa petri, dùng bộ kít bọc thực ăn bọc kỹ đĩa, để đông tự nhiên
- Ủ các đĩa petri trong tủ ấm 30oC trong 24 – 48h cho đến khi xuất hiện các khuẩn lạc
Lưu ý: Các thao tác cấy mẫu được thực hiện trong điều kiện vô trùng ở box cấy,
khử trùng tay bằng cồn 70o Cần ghi chú tên người thao tác, tên chủng vi sinh vật, tên môi trường, ngày tháng tiến hành thí nghiệm lên tất cả các đĩa petri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy,…
- Cấy ria vi khuẩn từ môi trường PCA qua môi trường tinh bột trên đĩa petri: Các bước tiến hành tương tự bước làm thuần giống
5 Kết quả và nhận xét
Sau khi ủ trong tủ ấm một thời gian thì trên đĩa petri chứa môi trường tinh bột có xuất hiện khuẩn lạc
Sự xuất hiện khuẩn lạc chứng tỏ rằng vi sinh vật có khả năng tiết ra enzyme amylase để phân giải tinh bột thành đường Vi sinh vật sử dùng lượng đường này để tạo nguồn dinh dưỡng và năng lượng giúp vi sinh vật sinh trưởng, phát triển
Trang 11Hình 6 Khuẩn lạc mọc trên môi trường tinh bột
III Thử nghiệm gelatinase
1 Nguyên tắc
Một số vi sinh vật có thể tổng hợp nhóm enzyme gelatinase ngoại bào xúc tác sự thủy phân của gelatin thành polypeptide và acid amin Để nhận biết khả năng làm tan gelatine của vi sinh vật, cơ chất này được bổ sung làm đông đặc môi trường nuôi cấy Sau khi cấy chủng, vi sinh vật có khả năng tiết gelatinase sẽ làm môi trường tan chảy thành dạng lỏng
2 Nguyên liệu - Dụng cụ - Thiết bị
- Khuẩn lạc thuần từ môi trường PCA (bài 1)
- Đĩa petri
- Que cấy vòng
- Đèn cồn
- Bộ kít bọc thức ăn
- Cốc thủy tinh
- Ống đong
- Bình tam giác
- Cân điện tử
- Box cấy
- Máy hấp
- Bếp hồng ngoại
Trang 123 Môi trường - Hóa chất
- Môi trường gelatine:
K2HPO4 1,5g
KH2PO4 1,5g
4 Cách tiến hành
Chuẩn bị:
- Pha chế môi trường và khử trùng: Pha chế môi trường PCA và môi trường gelatine sau đó nút bông và báo lại rồi đem hấp khử trùng
- Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường vô trùng: hấp khử trùng đĩa
Lưu ý: Để tiết kiệm thời gian, cần bố trí hấp 1 lần duy nhất cho các phần chuẩn bị trên.
- Đổ đĩa: Đĩa môi trường phải được đổ trong điều kiện vô trùng ở box cấy (lau bằng cồn 70o, UV trong 30 phút) Đổ đĩa phải được thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn Thao tác nhanh, chính xác, tránh mở nắp đĩa quá lâu, chạm tay vào bên trong đĩa hoặc để bình môi trường đứng khi không đậy nút Đĩa đổ xong cần đậy nắp lại và ghi tên môi trường sau đó chờ môi trường đông hẳn mới sử dụng
- Các dụng cụ được cho vào box cấy trong quá trình bật UV: que cấy vòng, đĩa petri chứa môi trường, bộ kít bọc thức ăn, diêm, cốc thủy tinh đựng cồn 70o
Tiến hành:
- Cấy ria vi khuẩn đã phân lập được ở bài 1 trên môi trường PCA để tạo giống thuần
- Khử trùng đầu que cấy trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ Mở nắp đĩa petri chứa vi khuẩn, làm nguội que cấy và lấy giống, khử trùng lại đĩa
- Dùng một tay mở nắp đĩa petri chứa môi trường làm thuần, một tay ria đầu que cấy trên bề mặt thạch Ria trên bề mặt thạch theo những đường zigzac trên khoảng
¼ đĩa thạch Tránh trường hợp đầu que cấy đâm vào môi trường làm lủng thạch
- Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn Xoay đĩa petri ¼ vòng tròn
