DỊCH CHIẾT LÁ HIBISCUS SABDARIFFA CẢM ỨNG CƠ CHẾ TỰ CHẾT CỦA TẾ BÀO UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT NGƯỜI IN VITRO VÀ INVIVO

Slide trình bày về cơ chế tự chết ở tế bào người và cơ chế dịch chiết lá Hibiscus sabdariffa điều trị ung thư tuyến tiền liệt

Dịch chiết lá Hibiscus sabdariffa cảm ứng cơ chế

tự chết của tế bào ung thư tuyến tiền liệt người

invitro và invivo

Tổng quan

Dược liệu Hibiscus sabdariffa Linne (Malvaceae)

Tên Việt Nam: Bụp giấm Xuất xứ: Châu Phi

Đài hoa: dùng làm thức uống, mứt và rau

Ở châu Á: điều trị cao huyết áp, sốt và suy gan

Dịch chiết hoa: hiệu quả trong điều trị bệnh bạch cầu và u dạ dày.

Dịch chiết lá: hạ đường huyết, hạ lipid máu, chống oxy hóa và tác dụng giống estrogen.

Bệnh ung thư tuyến tiền liệt (CaP)

Tổng quan

Tuyến tiền liệt là 1 phần của hệ sinh dục nam, sản xuất và lưu trữ tinh dịch

Vị trí: bao quanh niệu đạo.

bệnh liên quan đến tuyến tiền liệt ảnh hưởng việc đi tiểu và xuất tinh.

CaP là bệnh ác tính phổ biến thứ 2 trên thế giới trong số những bệnh ung thư ở nam.

Tế bào tuyến tiền liệt biến đổi thành tế bào ung thư, cần androgen để hoạt

động.

có thể dùng những dược liệu có glucocorticoid hoặc hiệu quả giống estrogen để điều trị CaP

Apoptosis – sự chết tế bào theo chương trình

Tổng quan

Apoptosis – sự chết tế bào theo chương trình

Tổng quan

Chuẩn bị dịch chiết lá và nghiên cứu thành

phần chức năng

Phân tích HPLC dịch chiết và phân lập

những hợp chất phenolic Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào CaP Thử nghiệm in vivo trên chuột Nude

Nguyên liệu và phương pháp

Chuẩn bị dịch chiết lá và nghiên cứu

Bay hơi dưới áp suất thấp tại -85 oC

Làm khô lạnh, bảo quản ở to = -25 oCChuẩn bị dịch chiết lá H sabdariffa

Xác định nồng độ polyphenol theo phương pháp Folin-Ciocalteau

Chuẩn bị dịch chiết lá và nghiên cứu

thành phần chức năng

0.1 mg dịch chiết + 1 ml nước cất + 0.5 ml TT Folin-Ciocalteau

Sau 3 phút + 3 ml dd Na2CO3 2%

Đo độ hấp thu tại bước sóng 750 nm bằng máy quang phổ kế Hitachi (U-3210)

Chất chuẩn: acid gallic

Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần theo phương pháp Jia

Chuẩn bị dịch chiết lá và nghiên cứu

thành phần chức năng

0.5 mg dịch chiết + 1.25 ml nước cất + 75 µl dd NaNO2 2%

Trộn đều Sau 6 phút+ 150 µl dd AlCl3.6H2O 10%

Đo độ hấp thu tại bước sóng 510 nm

Trộn đều Sau 5 phút+ 0.5 ml NaOH 1M và 2.5 ml nước cất

Chất chuẩn: rutin

Xác định hàm lượng anthocyanin toàn phần theo phương pháp Fuleki và Francis (phương pháp pH vi sai)

Chuẩn bị dịch chiết lá và nghiên cứu

thành phần chức năng

10 mg dịch chiết pha loãng thành 50 ml với đệm pH 1.0 và 4.5

Đo độ hấp thu tại bước sóng 535

nm Mẫu chuẩn: nước cất

Hàm lượng anthocyanin được tính dựa trên hiệu số độ hấp thu toàn phần tại

pH 1.0 và pH 4.5

Chuẩn bị dịch chiết lá và nghiên cứu

thành phần chức năng

Polyphenolic

compound

Peak no.

Hàm lượng dịch chiết (%)

Phân tích HPLC cho dịch chiết và phân

• 1 peak đơn tại 345 nm, theo thời gian lưu trữ: ellagitannin

• Thu được 1.5 mg ellagic acid (EA), tinh khiết hóa bằng kết tinh trong methanol

Nuôi cấy tế bào

• Dòng tế bào CaP: LNCaP, PC3 và DU 145 được lấy từ Trung tâm tài nguyên sinh học toàn cầu - ATCC (Hoa Kỳ).

• Nuôi cấy: cấy trong thạch tăng trưởng (theo khuyến nghị của

ATCC), cung cấp 10% FBS, 2 mM glutamine và 100 U/ml

penicillin-streptomycin

• Môi trường: nhiệt độ 37 oC , độ ẩm có 5% CO2

• Mật độ: 7 × 104

• Thời gian cấy: 24 giờ trước khi điều trị

• Để ức chế tăng sinh tế bào: thêm kháng sinh đơn dòng Nok-1 và

peptide ức chế V5 trước khi điều trị bằng dịch chiết (DC)

Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào CaP

Đánh giá khả năng sống của tế bào

• Tế bào được cấy với mật độ 7 × 104 , được ủ với DC lá hoặc

EA tại nồng độ khác nhau trong thời gian quy định (0-24 h)

• Môi trường thay đổi, thêm diphenyltetrazolium bromide ( MTT, 0.1 mg/ml ) trong 4 h

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Số tế bào còn sống tương ứng với sản lượng formazan, được hòa tan với isopropanol, đo quang phổ tại 563 nm

• Đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên sự phát triển tế bào và xác định nồng độ của thuốc ức chế 50% tế bào sống ( IC50 )

Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào CaP

Nhuộm TUNEL

Tế bào chết được đo số lượng bằng pp TUNEL

(terminaol deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick endlabelling): kiểm tra mảnh vỡ DNA bằng kit xét nghiệm ApoAlert.

Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào CaP

• Màng TB được tẩy bằng dd đệm Dulbecco’s phosphate và được ổn

định với paraformaldehyd 4% trong 30 ph tại nhiệt độ phòng.

• TB ổn định được thấm với 0.1% Triton X-100 trong Na citrat 0.1%.

• Sau khi tẩy TB được ủ với hỗn hợp phản ứng trong 60 ph tại 37 oC.

• TB đã nhuộm được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang với màng lọc kích thích 340/380 nm, phóng đại 400×.

• Có 3 thí nghiệm riêng biệt được thực hiện, và ít nhất 300 TB được

đếm trong mỗi thí ngiệm

Phân tích vòng đời TB và lượng hóa sự chết TB

Đo dòng TB LNCaP bằng pp FAScan trong 24 h nuôi cấy

Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào CaP

TN được nhuộm 2 lần với dd PBS Dịch treo TB được ly tâm 1500 vòng/ph

trong 5 ph tại to phòng

Ủ tại -20 oC ít nhất 24 h

+ 1ml dd nhuộm propidium iodide (20 µg/ml PI, 20 µg/ml Rnase A và 0.1%

Triton X-100), ủ 15 ph trong bóng tối tại to phòng

PI được kích thích tại 488 nm và dấu hiệu huỳnh quang được phân tích trên quy

mô logarit với huỳnh quang PI (đỏ) được phát hiện trên 600 nm

Dựa trên cường độ huỳnh quang, đếm số TB có hàm lượng DNA dưới pha G1, G0/G1, S và G2/M với phần mềm CellQuest phiên bản 3.3

sub-Phương pháp Western blot = pp lai thấm protein

Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào CaP

Protein được phân tách bằng điện di trên gel 8-15% SDS-polyacrylamic

Các protein được chuyển đến màng lai nitrocellulose

Màng TB tạo khối với 5% sữa đông khô không béo, ủ qua đêm tại 4 oC với

kháng thể (kháng thể kháng caspase 3, caspase 8, caspase 9, Bcl-2, Bcl-XL,

Mcl-1, Bax, t-Bid, cytocrom c, TNFα, TNFR1, Fas, FasL, và COX IV và

kháng β-lactin )

Màng TB được ủ với kháng thể thứ cấp có enzym horseadish peroxidase đi

kèm Kháng thể thứ cấp sẽ bám vào kháng thể sơ cấp

Phát hiện bằng thuốc thử phát quang hóa học tăng cường

Là pp có độ nhạy cao dựa trên đặc hiệu của kháng thể để phát hiện protein đã được điện di trên gel SDS-PAGE và chuyển lên màng lai

Thử nghiệm màng điện áp ty thể

Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào CaP

Nghiên cứu khối u bằng kĩ thuật ghép dị loài

Thử nghiệm in vivo trên chuột Nude

Chuột nude 8 tuần tuổi được nuôi trong lồng, nhiệt độ 22

± 2 độ C và độ ẩm 65 ± 5% trong điều kiện tiện nghi đối với động vật, chu kì sáng tối 12 h, uống nước theo nhu cầu

8 × 106 tế bào LNCaP trong 100 ml gel protein được cấy vào sườn phải của chuột, dẫn tới hình thành khối u

Chuột được chia ngẫu nhiên thành 3 nhóm (mỗi nhóm 12 chuột), được nuôi với chế độ ăn 5 g/ngày bao gồm 50 (1%) hoặc 100 (2%) µg/ml dịch chiết H

sabdariffa trong 90 ngày

Sau khi chuột bị giết, khối u được phân tách cho thể tích cuối và đo khối lượng ướt

Thực hiện đánh giá mô học

Sử dụng phương pháp Western blotting với dịch mô từ chuột

Thành phần dịch chiết lá H

sabdariffa

Kết quả thử nghiệm in vitro

trên dòng tế bào CaP

Kết quả thử nghiệm in vivo

trên chuột Nude

Kết quả

Cảm ơn sự chú ý lắng nghe của

cô và các bạn