dinh dưỡng và tăng trưởng của vi khuẩn

Bài giảng chỉ dành cho sv ngành dược và công nghệ sinh học. Mang tính chất tham khảo ................................. Chúc các bạn học tốt................................................................

DINH DƯỠNG VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN

• Các phương pháp đo lường sự tăng trưởng

• Phân biệt được các nhóm vi sinh vật theo nhiệt độ,

pH và oxy

• Các biện pháp kiểm soát vi sinh vật

• Ứng dụng trong nghiên cứu, chẩn đoán và sản xuất

ĐIỀU KIỆN TĂNG TRƯỞNG

CỦA VSV

CHẤT DINH DƯỠNG

• Là những chất hữu cơ – vô cơ thu nhận từ môi trường được

sử dụng trong các hoạt động của tế bào

• Nguồn sử dụng của mỗi yếu tố cụ thể, dạng hóa học cũng như nhu cầu cần thiết bao nhiêu tùy thuộc vào mỗi loại vi sinh vật khác nhau

Thành phần hóa học của tế bào E coli

% trọng lượng khô % trọng lượng khô

PHÂN LOẠI CHẤT DINH DƯỠNG

• Về mức độ cần thiết:

• Chất dinh dưỡng thiết yếu

• Chất dinh dưỡng có ích

• Về mức độ yêu cầu:

• Chất dinh dưỡng đa lượng

• Chất dinh dưỡng vi lượng

PHÂN LOẠI CHẤT DINH

DƯỠNG

NGUỒN CARBON

• Vai trò: Carbon là thành phần chủ yếu của tế bào, chiếm hơn 50% trọng lượng khô, có trong hầu hết các thành phần của tế bào => Tối cần thiết

• Được sử dụng ở tất cả các dạng – trừ kim cương và than chì

• Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp phụ phụ thuộc vào:

• Thành phần và cấu tạo hóa học và mức độ oxy hóa

• Đặc điểm sinh lý của vi sinh vật

• Trong nuôi cấy vi khuẩn,

nguồn carbon thường dùng là

glucose, lactose và tinh bột…

• Một số vi khuẩn cố định nitơ (Cyanobacteria,

Rhizobium, Azotobacter) sử dụng được nitơ có

trong không khí (N2)

• Trong các môi trường nuôi cấy: pepton, cao thịt, cao ngô, đậu tương…

NGUỒN PHOSPHO

• Cần thiết cho sự tổng hợp ADN,

ARN, ATP, phospholipid…

phosphat: KH2PO4

thủy phân thành phosphat vô cơ

trước khi được hấp thu

NGUỒN LƯU HUỲNH

• Thiết yếu cho vi sinh vật do có trong một số acid amin (cystein và methionin) và một số vitamin (thiamin, biotin, acid lipoic)

sulfat, sulfit): MgSO4.7H2O

CÁC CHẤT KHOÁNG

• Kali: hoạt hóa các enzyme sinh tổng hợp protein

• Magiê: ổn định ribosom, cần cho hoạt động của nhiều enzyme

• Natri: cần cho một số vi sinh vật

• Sắt: hoạt hóa một số enzyme của chuỗi hô hấp tế bào

YẾU TỐ VẾT

• Coban: co-factor của một số enzyme, thành phần của vitamin B12

• Kẽm: co-factor của nhiều enzyme: carbonic anhydrase, alcohol

dehydrogenase, ADN và ARN polymerase…

• Molypden: trong các enzyme molybdoflavoprotein khử nitrat hoặc nitrogenase khử N2

• Đồng: co-factor của các enzyme trong chuỗi hô hấp tế bào

• Mangan: hoạt hóa một số enzyme, đặc biệt là superoxide

dismutase giải độc các gốc tự do của Oxy

• Niken: có trong các enzyme hydrogenase có chức năng nhận và phóng thích H2

Vai trò của các ion kim loại trong hoạt động

của các enzyme

CÁC YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG

• Là các chất hữu cơ cần một lượng rất nhỏ, thiết yếu cho sự tăng trưởng của vi sinh vật nhưng chúng

không tự sản xuất được

• Mỗi loại vi khuẩn khác nhau cần các yếu tố tăng

trưởng khác nhau

• Vitamin, purin, pyrimidin, acid amin… thường có

sẵn trong các nguyên liệu hữu cơ phức tạp như

pepton, cao thịt…

CÁC YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG

• Vitamin:

• Coenzyme trong các quá trình trao đổi chất

• Nguồn tổng hợp hoặc thu nhận từ môi trường

• Acid amin:

• Cần để tổng hợp protein

• Nguồn tổng hợp, thu nhận từ môi trường

• Purin và pyrimidin

• Tổng hợp ADN, ARN, các coenzyme NAD, NADH, FAD…

• Cung cấp từ môi trường

• Haemophilus influenzae

- Yếu tố từ máu: Hemin (yếu tố X), NAD (yếu tố V)

- Các vitamin: Thiamine (B1) và pantothenic acid

- Uracil, cysteine từ các sinh vật khác

CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI

CẤY VI KHUẨN

Phân loại theo thành phần

• Môi trường tổng hợp

• Môi trường tự nhiên

Phân loại theo mục đích

• Môi trường cơ bản

• Môi trường phong phú

• Môi trường chọn lọc

• Môi trường phân biệt

• Môi trường chuyên chở

CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI

CẤY VI KHUẨN

• Môi trường tổng hợp: Chất dinh dưỡng ở dạng hóa học tinh

khiết, thành phần hóa học xác dịnh, đắt tiền, dùng trong

nghiên cứu

CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI

CẤY VI KHUẨN

Thành phần Hàm lượng (gam) Vai trò

Sucrose 10 Nguồn Carbon, năng lượng

CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI KHUẨN

• Môi trường tự nhiên: là môi trường có

chứa các thành phần cần thiết nhưng

Môi trường cơ bản:

• Đầy đủ dinh dưỡng cần thiết thích hợp cho đa số vi khuẩn tăng trưởng

• Có 2 loại: môi trường lỏng (canh thang) và môi trường đặc (thạch) có thêm chất làm đặc như agar, silicagel 1 – 2%

Môi trường chuyên chở:

• Chứa muối đệm, ít hoặc không có chất dinh dưỡng

• Một số có chứa kháng sinh, glycerol…

• Giữ vi khuẩn sống, không thay đổi số lượng, để giữ mẫu hay bệnh phẩm nguyên trạng trước khi về phòng thí nghiệm

• Tùy vào loại mẫu, loại vi sinh vật mà sử dụng môi trường

chuyên chở thích hợp

• Môi trường Cary –Blair: môi trường bán rắn, vận chuyển

mẫu phân – định danh Salmonella, Shigella, Vibrio,

• Môi trường chuyên chở virus

• Môi trường chuyên chở vi khuẩn kị khí

Môi trường phong phú: đầy đủ chất dinh dưỡng và có thêm

các yếu tố tăng trưởng (máu, huyết thanh, dịch nấm men,

acid amin…) giúp nuôi cấy và tăng sinh các vi khuẩn “kén ăn”

THẠCH MÁU TRONG XÉT NGHIỆM

BỆNH PHẨM CỔ HỌNG THẠCH MÁU CHOCOLLATE

Môi trường chọn lọc:

• Ngoài chất dinh dưỡng còn chứa thêm các chất ngăn chặn

sự tăng trưởng của hầu hết các loại vi khuẩn trừ loại muốn khảo sát

• Có nhiều mức độ chọn lọc:

• Môi trường chọn lọc ít

• Môi trường chọn lọc vừa

• Môi trường chọn lọc cao

Môi trường phân biệt:

• Có các yếu tố làm cho vi khuẩn muốn nuôi cấy mọc lên dưới một hình thức riêng biệt giúp dễ xác định và phân biệt với loài khác

• Các môi trường phân biệt thường là môi trường chọn lọc

THẠCH CHROMOCULT® COLIFORM

SỬ DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM MẪU NƯỚC SINH HOẠT

E coli

Các VK gram âm khác

SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA VI

KHUẨN

• Sự tăng trưởng: là sự tăng số lượng tế bào vi sinh

vật – sự gia tăng sinh khối

• Tốc độ tăng trưởng: lượng thay đổi về số lượng tế

bào trong một đơn vị thời gian

• Thời gian thế hệ - thời gian nhân đôi: thời gian cần

thiết để tế bào vi khuẩn tăng gấp đôi số lượng

• Tăng trưởng lũy thừa: là sự tăng trưởng có số tế bào tăng

gấp đôi sau mỗi thế hệ

CHU KỲ TĂNG TRƯỞNG CỦA TẾ

BÀO

• Pha tiềm ẩn: vi khuẩn chưa tăng trưởng, cần thời gian để

thích ứng với môi trường mới (tổng hợp các enzyme cần

thiết cho sự phát triển) Pha tiềm ẩn dài ngắn phụ thuộc vào

trạng thái của vk nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy Số lượng tế

bào tăng chậm

• Pha lũy thừa: số lượng vi khuẩn tăng theo cấp số nhân, kéo

dài từ 4 – 10 giờ

CHU KỲ TĂNG TRƯỞNG CỦA TẾ

BÀO

• Pha ổn định: dinh dưỡng trong môi trường cạn dần hoặc/và sản phẩm thải ra của vi sinh vật đạt đến mức kiềm chế làm ngưng pha lũy thừa Số lượng tế bào sinh ra bằng số lượng

tế bào chết đi => số lượng tế bào gần như không đổi

• Pha suy thoái (pha chết): tỷ suất chết tăng dần theo thời

gian đến mức cố định Số lượng tế bào giảm

CHU KỲ TĂNG TRƯỞNG CỦA TẾ

ỨNG DỤNG CỦA CHU KỲ

TĂNG TRƯỞNG TB

• Cấy chuyền vi khuẩn ở giai đoạn lũy thừa Muốn

kéo dài pha lũy thừa thì phải thay môi trường liên tục

• Nghiên cứu hoạt động enzyme và đặc tính tế bào ở pha lũy thừa

• Thu các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp ở pha ổn

định

ĐO SỰ TĂNG TRƯỞNG TẾ BÀO

• Đo sự tăng trưởng tế bào bằng cách theo dõi số lượng tế bào hoặc trọng lượng sinh khối tế bào

XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VI KHUẨN TOÀN PHẦN

Phương pháp đếm tổng số tế bào:

• Phương pháp sử dụng kính hiển vi: Sử dụng kính hiển vi để trực

tiếp đếm số tế bào trong một buồng đếm đặc biệt.

XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VI KHUẨN TOÀN PHẦN

đếm tế bào khi cho

dòng tế bào chảy qua

một đường ống hẹp

Phương pháp đếm tổng số tế bào:

Phương pháp đo độ đục:

• Nguyên tắc: dựa vào sự tán xạ

ánh sáng của tế bào vi khuẩn, khi

lượng tế bào càng nhiều, ánh

Phương pháp đo độ đục:

- Ở nồng độ vi khuẩn vùa phải, có sự tuyến tính cao giữa số lượng tế bào và độ dục nên phương pháp này khá chính xác, nhanh và dễ thực hiện

- Ở nồng độ vi khuẩn quá cao, ánh sáng bị phân tán giữa các tế bào giống như nó chưa hề bị phân tán nên có thể không còn tuyến tính giữa số tế bào và

độ đục

XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VI KHUẨN TOÀN PHẦN

• Chuẩn đục McFarland

• So sánh với độ đục của chuẩn đục McFarland

• 0,5 McFarland tương ứng với khoảng 108 CFU/ml

XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VI KHUẨN TOÀN PHẦN

XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO SỐNG

• CFU: Colony Forming Unit – Đơn vị tạo khóm: chỉ tế bào còn

sống, có thể phân chia để tạo thành khóm vi khuẩn (khuẩn lạc) trên môi trường nuôi cấy

⇒Số khuẩn lạc mọc lên sẽ tương ứng với vi khuẩn sống ban đầu

XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO SỐNG

Phương pháp đếm số tế bào sống:

• Phương pháp trải trên bề mặt bản thạch (pp trải đĩa)

• Phương pháp pha loãng trong bản thạch (pp đổ đĩa)

• Lựa chọn đĩa thạch có mật độ khóm vi khuẩn vừa phải (30 – 300) Đếm

số lượng khuẩn lạc, tính toán số lượng vi khuẩn bằng cách nhân cho độ pha loãng.

• Kết quả đếm sống được biểu thị bằng đơn vị tạo khuẩn lạc (CFU) thay cho tế bào sống.

XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO SỐNG

Phương pháp đếm số tế bào sống

• Ưu điểm: chính xác, có độ nhạy cao, là phương pháp

được thường quy trong kiểm tra thực phẩm, sản phẩm y

tế, kiểm soát nguồn nước

• Nhược điểm: tốn thời gian, khó thực hiện

CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG LÊN SỰ SINH

TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN

• Nhiệt độ

• pH

• Nước, áp suất thẩm thấu

ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘẢnh hưởng theo hai cách

• Nhiệt độ tăng quá ngưỡng

=> protein bị phân hủy

không phục hồi => VK chết

• Mỗi loại vi khuẩn có một

nhiệt độ tối đa và tối thiểu

để có thể sinh trưởng

ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ

Dựa vào nhiệt độ tối ưu, người ta chia vi khuẩn thành 4 nhóm chính :

• Nhóm ưa lạnh (Psychrophile)

• Nhóm trung bình (Mesophile)

• Nhóm ưa nhiệt (Thermophile)

• Nhóm ưa nhiệt cao (Hyperthemophile )

NỒNG ĐỘ HYDRO (ĐỘ pH)

• Mỗi sinh vật đều có một khoảng pH tăng trưởng và một pH tối

ưu, thường từ 5 – 9 Rất ít loài có thể tăng trưởng được ở pH dưới 2 và trên 10

ẢNH HƯỞNG CỦA NƯỚC VÀ ÁP SUẤT THẨM THẤU

• Nước là yếu tố cần thiết, quan trọng trong sự tăng trưởng của vi khuẩn

• Nồng độ các chất tan trong nước (áp suất thẩm thấu) cũng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của VK

• Đa số vk phát triển tốt trong môi trường đẳng trương

• Trong môi trường nhược trương, vi khuẩn vẫn phát triển được do có lớp thành tế bào giữ vững được hình dạng

• Trong môi trường ưu trương, vi khuẩn tăng nồng độ chất tan nội bào để giữ được hàm lượng nước trong tế bào Tuy nhiên nếu môi trường quá ưu trương thì vi khuẩn sẽ bị mất nước và chết

ẢNH HƯỞNG CỦA OXY

• Các vi khuẩn có nhu cầu và khả năng chịu đựng oxy khác nhau Tùy vào sự tham gia của oxy trong cơ chế tạo năng lượng:

• Hô hấp hiếu khí – có sự tham gia của oxy

• Hô hấp kị khí – không có sự tham gia của oxy

• Lên men - không có sự tham gia của oxy

• Ở các VSV có hô hấp hiếu khí, Oxy sẽ bị oxy hóa chuyển

thành các dạng có độc với tế bào như O2-, H2O2, OH …

• Ở các VSV kị khí, các enzym Flavin có thể phản ứng với oxy tạo thành dạng oxy độc

ẢNH HƯỞNG CỦA OXY

ROS

Reactive oxygen species

ẢNH HƯỞNG CỦA OXY

• Ở các vi sinh vật chịu được oxy: có

các enzyme cần thiết để phân giải

các gốc oxy độc tính

• Catalase

• Peroxidase

• Superoxide dismutase

• Ở các vi sinh vật không chịu được

oxy: có rất ít hoặc không có các

enzyme này => oxy trở thành chất

độc

Nhóm Mối liên hệ với Oxy Loại chuyển hóa Vi khuẩn

Môi trường thyoglycolat

được sử dụng để khảo sát nhu cầu oxy của vi khuẩn

ẢNH HƯỞNG CỦA OXY

KIỂM SOÁT VI SINH VẬT

• Sự tiệt trùng (Sterilisation): Quá trình tiêu hủy tất cả vi sinh vật sống kể cả bào tử Vô trùng (sterility) là trạng thái không

• Tác nhân hóa trị liệu: tác động chọn lọc trên vi sinh vật

Sử dụng để tiêu diệt vi sinh vật trên bề mặt (ảnh hưởng lên cả tế bào khác)

Diệt được bào tử, thường được sử dụng nhất để tiệt trùng cho dụng cụ, môi trường và thiết bị y tế

Ánh sáng tử ngoại (Tia

UV) Sử dụng tia UV ở bước sóng 260 nm

Phá hủy phân tử ADN, tiêu diệt được nhiều mầm bệnh Sử dụng để tiệt trùng không khí hoặc bề mặt

Iron phóng xạ Tia X, tia gamma Khả năng tiêu diệt vi khuẩn tốt hơn tia UV, sử dụng để tiệt trùng sinh phẩm và

thiết bị y tế trong công nghiệp

Lọc Sử dụng các màng lọc 0,25 µm Hiệu quả Sử dụng để tiệt khuẩn cho các thuốc tiêm, dịch truyền không bền

với các tác nhân khác

LÒ HẤP AUTOCLAVE TỦ AN TOÀN SINH HỌC

TÁC NHÂN HÓA HỌCCác yếu tố ảnh hưởng đến sự tẩy trùng

• Thời gian: đủ lâu để tiêu diệt tất cả vi sinh vật Nếu kéo dài

(12-14 giờ) có thể đạt được sự vô trùng

• Nhiệt độ: nhiệt độ tăng -> hiệu quả tăng

• Loại vi sinh vật: Mỗi vi sinh vật có mức độ nhạy cảm khác nhau

• Nhóm A: Đa số vi khuẩn dạng dinh dưỡng và virus có màng bao

• Nhóm B: Vi khuẩn Lao, virus không màng bao

• Nhóm C: Một số Virus và bào tử vi khuẩn

• Nồng độ chất tẩy trùng

• Môi trường xung quanh: đôi khi có thể làm giảm khả năng tác

động lên VSV

Tác nhân diệt trùng trên bề mặt

đồ vật, không sử dụng được cho

mô sống

Ethylen oxid, Andehyde, phenol và dẫn xuất, dẫn chất ammonium bậc bốn

Chất sát trùng

(antiseptic)

Tác nhân chống lại hoặc giảm sự nhiễm trùng do kìm hãm hay giết chết vi sinh vật Có thể sử dụng được cho mô sống

Cồn, dung dịch iot, cồn iot, Chlorohexidine…

Các kháng sinh ức chế sinh tổng hợp protein (trừ kháng sinh nhóm aminosid)

Chất diệt khuẩn

(Bacteriostatic

agent)

Là các chất có tính giết vi khuẩn không thuận nghịch, vi khuẩn không phục hồi sau khi không còn chất diệt khuẩn

Các kháng sinh ức chế tổng hợp hoặc phá hủy thành tế bào, màng tế bào, acid nucleic

• Không có tác dụng với bào tử.

MỘT VÀI CHẤT SÁT TRÙNG THƯỜNG SỬ DỤNG

Iodine

• Chứa iod (2-7%), natri iodid, pha trong nước hoặc cồn

• Cơ chế: biến tính protein

• Sát trùng bề mặt dụng cụ hoặc bề mặt da trước khi phẫu thuật…

• Không có tác dụng với bào tử.

MỘT VÀI CHẤT SÁT TRÙNG THƯỜNG SỬ DỤNG

Chlorhexidine

dụng trong dung dịch với nồng độ từ 0,5 – 4%

• Cơ chế: ở pH sinh lý, chlorhexidine mang điện tích dương sẽ liên kết với các thành phần mang điện tích âm trong thành tế bào và bào tương gây biến tính Rất hiệu quả trên vk gram dương

• Tác động phụ thuộc vào nồng độ:

• Nồng độ cao -> sát khuẩn -> chất tiệt trùng bề mặt

• Nồng độ thấp -> kìm khuẩn -> chất bảo quản

• Ứng dụng:

• Sát trùng bề mặt

• Y học: DD xúc miệng trong nha khoa, rửa vết thương (cho thú vật)…

• Dược học: chất bảo quản cho các dược phẩm dùng ngoài

MỘT VÀI CHẤT SÁT TRÙNG THƯỜNG SỬ DỤNG

Oxy già – H2O2

• Thường sử dụng dạng dung dịch nước, nồng độ từ 3 – 6 %

• Cơ chế: sản sinh các gốc oxy độc, oxy hóa các thành phần của tế bào.

• Ở nồng độ trên 50% có thể ăn mòn niêm mạc

• Có thể gây tổn thương cho mô và tế bào người

• Không sử dụng trong các khoang kín của cơ thể

ĐIỀU KIỆN TĂNG TRƯỞNG

CỦA VSV

CÂU HỎI 1

Nitơ thuộc nhóm chất dinh dưỡng

a Chất dinh dưỡng đa lượng

b Chất dinh dưỡng vi lượng

c Yếu tố vết

d Yếu tố tăng trưởng

CÂU HỎI 2

Môi trường tự nhiên là:

a Môi trường chứa các chất dinh dưỡng ở

CÂU HỎI 3

Phương pháp có thể xác định được số lượng vi khuẩn sống là

a Phương pháp đo độ đục

b Phương pháp đếm dưới kính hiển vi

c Phương pháp trãi đĩa

d Phương pháp đo tỷ trọng sinh khối

c Vi khuẩn hiếu khí tùy ý

d Vi khuẩn kỵ khí chịu được oxy