Tóm tắt bài giảng công nghệ protein enzyme (phần protein)

Lê Thị Trà My TamiPhần 1: PROTEIN 1 CẤU TẠO − Polymers of amino acids − Có 20 loại khác nhau − Gồm: • Amino acids với R không phân cực: Gly, Ala, Val, Leu, Ile • Amino acids với R phân c

Lê Thị Trà My (Tami)

Phần 1: PROTEIN

1) CẤU TẠO

− Polymers of amino acids

− Có 20 loại khác nhau

− Gồm:

• Amino acids với R không phân cực: Gly, Ala, Val, Leu, Ile

• Amino acids với R phân cực: Ser, Thr, Cys, Met

• Amino acids có tính acid và amide: Asp, Asn, Glu, Gln

• Amino acids có tính base: Arg, Lys, His

• Amino acids chứa vòng thơm và Proline: Phe, Tyr, Trp, Pro

− Phân cấp cấu trúc:

• Cấu trúc bậc 1: là thành phần và trình tự sắp xếp các gốc acid amin nhờ liên kết

peptide  quan trọng nhất quyết định pro đó là pro nào

• Cấu trúc bậc 2: lk hydro

 Right-hand helix: α-helix

 Extended: antiparallel β-sheet

 Left-hand helix (rare): α-helix

• Cấu trúc bậc 3: lk disunfit  quan trọng thứ 2

o Quyết định tính tan

o Quyết định hoạt tính sinh học

(phá b3  mất hoạt tính, phá b1  k còn protein)

• Cấu trúc bậc 4

2) PHÂN LOẠI protein đơn giản: chỉ đc cấu tạo bởi aa (vd : albumin, globulin,

prolanin, glutelin, histon)

Protein phức tạp : aa + phi protein

*MỘT SỐ PROTEIN PHỨC TẠP

Nucleoprotein protein + acid nucleic tập trung trong nhân tế bào,

riboxom.

Lipoprotein Protein + lipit đóng vai trò quan trọng trong quá

trính vận chuyển lipit trong cơ thể

Glycoprotein Protein + saccharid (monosaccharid,

oligosaccharid và dẫn xuất của chúng).

Phosphoprote

in nhóm ngoại là acid phosphoric, kết hợp với protein qua –OH của Ser hoặc Thr.

Metaloprotein Protein + Kim loại.

3) CHỨC NĂNG

1

Lê Thị Trà My (Tami)

1 Chất xúc tác SH: enzyme

2 Vận chuyển: hemoglobin

3 Chuyển động: actim-miozin

4 Bảo vệ: interferon

5 Truyền xung TK: opsin+Rhodospin

6 Điều hoà: insulin

7 Kiến tạo chống đỡ cơ học:

Keratin, collagen

8 Dự trữ dinh dưỡng: Albumin

2

4) TÍNH CHẤT

điện ly lưỡng tính:

dung dịch keo pro – sự kết tủa pro: Hai yếu tố đảm bảo độ bền dd keo pro

• Sự tích điện cùng dấu của các phân tử protein (pH ≠pI).

• Lớp vỏ hydrat bao quanh phân tử protein

sự biến tính pro:

• tác nhân vật lý (tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy cơ học) hoặc hóa học

(acid, kiềm mạnh, muối kim loại nặng, )

• biến đổi các cấu hình bậc 2, 3 và 4 nhưng không phá hủy cấu trúc bậc

nhất, kèm theo các tính chất tự nhiên ban đầu của nó cũng bị mất đi.

- pI: là giá trị pH mà tại đó pro trung hòa điện (điểm đẳng điện)

- Gốc R tích điện (+) hoặc (-)  lưỡng tính

- pH = pI  pro trung hòa điện  dễ kết tủa nhất

- pro chỉ phân tán trong nước  dd keo hoặc sol do phân tử lớn  không thể hòa tan

- pH < pI  (+)

- pH > pI  (-)

 Tác nhân gây kết tủa protein: t o

pH Muối: NaCl, (NH 4 ) 2 SO 4

Dung môi hữu cơ: Ethanol, Acetone

5) TIÊU HÓA-SINH TỔNG HỢP PROTEIN

a) Tiêu hóa protein

o Trong dạ dày:

Pepsin: chủ yếu thủy phân lk peptide trong đó có sự tham gia của a.a mạch vòng và lk

Ala-Ala, Ala-Ser và 1 số liên kết khác

o Ruột non

Trypsin: thể hiện hoạt lực cao nhất đối với các lk peptide có chứa nhóm cacboxyl của

amino acid (lysine, arginine)

Chymotrypsin: hđ tối ưu ở pH=8, thủy phân lk peptide có nhóm –CO- thuộc amino acid

nhân thơm (Phe, Tyr, Trp)

Cacboxylpeptidase: các peptidase ngắn hơn được thủy phân hoàn toàn ở ruột non nhờ

Cacboxylpeptidase phân cắt các liên kết peptide nằm sát đầu nhóm carboxyl tự do

Aminopeptidase (trong dịch ruột): phân cắt lk peptide nằm sát đầu nhóm amine tự

do

o Ruột già:

- Lên men: VSV hữu ích tác động lên cellulose, bột, đường

- Thối rửa: do vi khuẩn gây thối, chủ yếu là E.coli tác động lên các protein còn lại, phân giải thành indol, scatol, phenol, cresol, H 2 S, CO 2, N 2 ….1 phần đào thải theo phân, phần lớn hấp thu ở ruột già

 TÓM TẮT

Protein

HCl

pH: 1,5-2,5 pepsin pepsinogen

Dạ dày

Polypeptide

pH: 7-8 Trypsinogen trypsin

Procacboxylpeptidase C.peptidase

Proaminopeptidase A.peptidase

Acid Amin

b) Phân giải acid amin: gồm khử amine

Chuyển amine Chuyển carboxyl

• Khử amine: bằng cách oxi hóa Gồm 2 giai đoạn

o Oxh a.a  iminacid

o Thủy phân tự phát các imin acid để tạo α-ketonic acid và NH 4 +

Khử amine bằng cách oxy hóa của L-glutamate

L-glutamate được chuyển vào ti thể dưới tác động của enzyme l-glutamate

dehydrogenase có coenzyme (coe) là NAD hoặc NADP + sẽ bị khử amin bằng cách oxh

Glutamate + H 2 O NAD hoặc NADP + α-Ketoglutare + NH 4 +

Khử amine bằng cách oxy hóa của các amino acid khác

Xảy ra ở bào tương nhờ enzyme L-amino acid oxidase

L-Amino acid L-amino acid oxidase α-ketonic acid

• Chuyển amine:

nhóm a-amin của amino acid  nguyên tử carbon của keto-acid

 amino acid sẽ trở thành keto-acid

keto-acid sẽ biến thành các amino acid tương ứng.

Phản ứng tổng quát của quá trình chuyển amin như sau:

PP(phosphopyridoxal) + Amino acid IPPA (phosphopyridoxamin) +

Keto-acid I

PPA (phosphopyridoxamin) + Keto-acid II  PP (phosphopyridoxal) + Amino

acid II

Ở động vật: chất cho nhóm amin chủ yếu: glutamic acid

(dễ tổng hợp từ α-ketoglutamate-sp của cacbohydrat và lipid)

Chất nhận nhóm amin chủ yếu: pyruvate hoặc oxaloacetate (tạo

α-ketoglutamate)

Phản ứng giải độc NH3 xảy ra ở gan, não: enzyme tổng hợp glutamin

• Khử carboxyl:

- Ở động vật, thường gặp ở gan, thận và vách ruột amin tương ứng

- Enzyme xúc tác: decarboxylase cĩ coenzyme là pyridoxal phosphate.

- Các amino acid tham gia vào phản ứng khử carboxyl: His, Tyr, Glu, 5 – oxy -

tryptophan, Cys và 3,4-dihydroxy phenylalanine

- Các amine hữu cơ cĩ vai trị sinh học nhất định trong cơ thể

Ví dụ: + histamine được hình thành từ histidine, chất này cĩ tác dụng giãn mạch, co

cơ trơn và tăng tính thấm của thành mạch.

+ Ở não cĩ γ-amino butyrate là chất hình thành từ glutamate, cĩ tác dụng điều hịa hoạt động của hệ thần kinh.

- Các amine sau khi hết tác dụng sẽ được phân giải theo con đường khử amine bằng cách oxy hĩa nhờ enzyme amino-oxydase để tạo NH4+ và aldehyde Các aldehyde bị oxy hĩa tạo thành carboxylic acid rồi tiếp tục thối hĩa đến CO2 và H2O

Amine  NH 4 + aldehyde carboxylic  CO 2 + H 2 O c) Sinh tổng hợp protein: 3 giai đoạn Sao mã ADN thành ARN Xử lý RNA

Giải mã tổng hợp protein

Sự giải mã mRNA thành chuỗi polipeptit gồm bốn giai đọan:

- Giai đọan họat hĩa axit amin

- Giai đọan khởi đầu tổng hợp chuỗi polipeptit (AUG)

- Giai đoạn kéo dài chuỗi polipeptit

- Giai đoạn kết thúc chuỗi polipeptit và tách khỏi riboxom (UAA, UAG, UGA)

6) SỰ BIẾN ĐỔI CỦA PROTEIN TRONG CHẾ BIẾN VÀ BẢO QUẢNS

Gồm: thủy phân và biến tính

• Thủy phân: Protein → peptide + acid amin

Các acid anim bị chuyển hĩa qua các phản ứng dezamin, decacboxyl hĩa tạo ra các hợp chất rượu, aldehyde, ceton, mercaptan gây màu và mùi, vị khĩ chịu, cĩ thể gây ngộ độc

• Biến tính : do pH, nhiệt độ, độ ẩm, … kết tủa, vĩn cục, đơng tụ, mất chức

năng sinh học

7) ỨNG DỤNG

• Tạo cấu trúc gel cho sản phẩm

- Các protein bị biến tính tập hợp lại thành một mạng luới không gian có trật tự

→ sự tạo gel Bản chất gel protein Vd: giò lụa, phomat, bánh mì, … sản phẩm có kết cấu bộ khung từ gel protein

- Khả năng tạo gel của protein được sử dụng để tạo độ cứng, độ đàn hồi, cải thiện khả năng hấp thụ nước, tạo độ dày, tạo lực liên kết giữa các nhũ phần, làm bền các nhũ tương và bọt.

• Khả năng tạo màng

- Gelatin có khả năng tạo màng nhờ liên kết hydro

- Màng hình thành do gelatin có tính thuận nghịch, tan chảy trên 30 độ C và tái lập ở

nhiệt độ thấp hơn

• Khả năng tạo bột nhão của protein và kết cấu xốp của sản phẩm

-Glutenin là hợp phần tạo ra độ đàn hồi, lực cố kết và mức độ chịu nhào trộn.

-Gliađin có tính lưu, tính kéo dãn và khả năng trương nở làm tăng thể tích bánh

• Khả năng nhũ hóa

- Protein hấp phụ vào bề mặt liên pha giữa các giọt dầu phân tán và pha nước

liên tục sẽ tạo ra các tính chất cơ lý như độ dày, độ nhớt, độ đàn hồi, độ cứng giúp không hợp giọt

- Tùy thuộc pH, sự ion hóa các nhóm bên của protein  tạo lực đẩy tĩnh điện

làm nhũ tương bền

• Khả năng tạo bọt

- Protein hấp phụ vào bề mặt liên pha tạo ra một màng mỏng, đàn hồi bao quanh

bóng bọt

- Các protein có khả năng tạo bọt: lòng trắng trứng, protein đậu nành, …

• Khả năng cố định mùi

- Protein liên kết với các hợp chất bay hơi phân cực (VD: cồn) nhờ lk hydro

- Các hợp chất bay hơi PTL thấp được cố định vào các gốc acid amin nhờ tương

tác kỵ nước.

- Một số hợp chất bay hơi cố định vào protein nhờ liên kết đồng hóa trị.

• Các sản phẩm protein từ máu

- Hệ tuần hoàn người 5 – 6 lít máu, chiếm 8,5 – 9% trọng lượng cơ thể.

- Máu gồm: hồng cầu (99% số tế bào máu); bạch cầu; tiểu cầu lơlửng trong dịch huyết tương.

- Huyết tương = huyết thanh (albumin, globulin, …) +fibrinogen

- Vai trò máu: vận chuyển oxy, chất dinh dưỡng, enzyme, hormone,…

- Các dạng sản phẩm từ máu:

 Máu toàn phần: thu nhận vô trùng từ người hiến máu,

truyền máu trực tiếp hoặc cung cấp BC, TC và các nhân tố dòng máu khác nhau, immunoglobulin và các thành phần bổ sung của huyết tương

 Albumin huyết thanh: loại protein chủ yếu

60% tổng số protein huyết tương Tinh lọc từ huyết thanh, huyết tương hoặc nhau thai

- α1 – antitrypsin, glycoprotein huyết thanh → khí thủng (emphysema)

- Các chất chống đông máu:

+ Heparin: bản chất glucosaminglycan

Chiết xuất từ màng nhầy ruột heo/ phổi bê

+ Hirudin: peptide chống đông máu từ tuyến nước bọt của đĩa (hirudomedicinalis)

+ Ancrod: là serine protease chống độc từ nọc rắn lục ở Malaysia, xúc tác sự phân cắt

firin

+ Các tác nhân làm tan máu: t-Pa, urokinase, streptokinase điều trị nhồi máu cơ tim,

tắc mạch, đột quỵ

• Hormon và các nhân tố tăng trưởng

Glucagon Tuyến tụy heo, bò Làm tăng đường huyết

Hormone kích thích tạo

buồng trứng (FSH –

Follicle

stimulating hormone)

Tuyến yên của heo/nước

tiểu phụ

nữ sau mãn kinh

Cảm ứng siêu rụng trứng ở ĐV Trị rối loạn chức năng sinh sản ở

người

Gonatrophin màng ối

người

(hCG – human chrionic

gonatrophin)

Nước tiểu phụ nữ mang thai Trị rối loạn chức năng sinh sản ở người

Hormone hoàng thể (LH

– Luteinizing hormone)

Thùy trước tuyến

yên Kích thích tạo hormon sinh dục estrogen

và progesteron ở nữ, testosteron

ở nam

• Các cytokine: interleukin và interferon

- Cytokine: nhân tố điều hòa, kích thích các TB thuộc hệ miễn dịch do bạch cầu

tổng hợp Các cytokine là glycoprotein hay polypeptide, SX do các TB không tổ chức thành tuyến

- Interleukin: 15 loại (IL-1 – IL-15), IL-2 được ngiên cứu kĩ nhất, có vai trò

chống TB ung thư và nhiễm virus liệu pháp miễn nhiễm

- Interferon: là 1 loại cytokenin, sx khi tb cảm thụ với virus, có đặc tính bằng mọi

con đường có thể ức chế sự hoạt động của mRNA ức chế sinh sản của virus,

ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển (sự phân hóa) của các tb khối u

và tb bình thường được sử dụng như một chất điều trị không đặc hiệu cho

mọi nhiễm trùng do virus

• Các vaccine và kháng thể

- Vaccine: là chế phẩm có tính kháng nguyên  tạo miễn dịch đặc hiệu

chủ động  tăng sức đề kháng của cơ thể

có thể là các vk sống giảm độc lực hoặc vsv bị bất

hoạt/chết hoặc sản phẩm tinh chế từ vsv

- Kháng thể: là các phân tử immunoglobulin ( bản chất là glycoprotein) do các tb lympho B cũng như các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân còn lại như VK, VR

8) NGUỒN THU NHẬN PROTEIN

- Các yếu tố cần lưu ý

• Đặc tính kỹ thuật của protein

• Dễ kiếm

• Chi phí sản xuất

• An toàn

• Khác: bản quyền, sự chấp nhận của khách hàng

- Nguồn thu nhận:

• VSV vi khuẩn (B subtilis, B amylolyquefacien, nhiều loài bacilli,

lactobacillli và treptomyces) nấm mốc (Aspergillus, Pennicillium, Mucor, Rhizopus) nấm men (S cerevisae)

o Yêu cầu:

-Thời gian nhân đôi ngắn.

-Có khả năng tạo thành 40-70% protein.

-Tiêu hoá tối đa các chất dinh dưỡng của môi trường.

-Không gây bệnh và đem vào môi trường độc tố.

-Có sức bền cao

- Dễ tách khỏi dịch nuôi cấy

o Có nhiều thuận lợi:

+ Sản xuất lượng lớn trong thời gian ngắn

+Sản xuất dễ dàng, tốn ít chi phí hơn

+ Bền hơn protein tương tự từ ĐV, TV

+ Dễ dàng tác động gen hơn ĐV, TV

 Tảo đơn bào và đa bào: Chlorella, Spirulina, Scenedesmus

- Tảo đơn bào có hàm lượng protein rất cao: 40-50% chất khô, Spirulina 70%

- Protein của tảo thuộc loại protein hoàn hảo và có chất lượng cao: lysine tảo > lysine lúa mạch Tổng số a.a không thay thế trong pro rất cao, 42%

- Tảo chứa nhiều protein và vitamin: B12, C  SX thức ăn

 Nấm men và vi khuẩn

 Nấm men

+ Nấm men rất giàu protein và VTM

+ Sinh khối nấm men chứa khoảng 75-80% nước, 20-25% chất khô

+ Protein của nấm men gần giống protein nguồn gốc động vật

- Tiêu chuẩn giống nấm men để sản xuất protein:

+ Có khả năng đồng hoá nhiều nguồn cacbon khác nhau, nhất là các loại pentose (xylose, arabinose) và các axid hữu cơ.

+ Có khả năng phát triển nhanh, có sức đề kháng cao đối với nồng độ CO 2

+ Sản lượng cao, sinh khối chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị (hàm lượng protein cao, có nhiều axit amin không thay thế, vitamin )

+ Kích thước tế bào tương đối lớn để dễ tách bằng li tâm.

+ Chịu đựng được nhiệt độ tương đối cao, ít làm biến đổi pH môi trường.

- Trong sản xuất nấm men thường dùng các chủng thuộc ba giống Saccharmyces,

Candida và Torulopsis

 Vi khuẩn

+ Tốc độ sinh trưởng nhanh

+ Dùng được nhiều cơ chất.

+ pH cần giữ 5-7, nếu không  nguy cơ nhiễm các vi khuẩn gây bệnh.

+ Khó thu hồi bằng li tâm

+ Hàm lượng các axit amin chứa S hơi thấp.

+ Khi dùng các vi khuẩn Gram âm để sản xuất SCP (single cell protein) cần lưu ý khả năng sản sinh độc tố của chúng

 Nấm mốc và xạ khuẩn

-ít được sử dụng

- Protein kém giá trị hơn

-Về kĩ thuật nuôi cấy, do hệ sợi phát triển thành búi chằng chịt nên trở ngại đến việc sục khí và khuấy trộn.

• Nguồn thực vật

Đặc điểm của nguồn protein TV:

- Các protein quan trọng từ TV cũng có thể tìm thấy trong các nguồn ng/liệu sinh học khác.

-Sự sinh trưởng của TV

- Các TV bậc cao cũng có khuynh hướng tích lũy nhiều chất thải trong không bào

Một số protein TV quan trọng:

- Hệ thống các protein đậu tương

-Monellin và Thaumatin là 2 chất tự nhiên có độ ngọt cao nhất Monellin, từ trái

cây Dioscoreophyllum cumminsii mọc ở West Africa,fsaccharose = 100 000 Thaumatin

từ trái cây nhiệt đới Thaumatococcus danielli

- Amylase từ malt

-Protease từ thực vật

• Nguồn động vật: protein thực phẩm, protein trị liệu, các protein máu,

enzyme

- Nhược điềm : tác nhân gây bệnh trong ng/liệu thô

→ Biện pháp phòng ngừa: sử dụng mô lấy từ ĐV không mang bệnh, sử dụng protein đã được tinh sạch, nuôi cấy tế bào ĐV

• Protein tái tổ hợp

- Các r-protein đầu tiên được sản xuất từ VK và nấm men, sau đó từ ĐV, TV chuyển gen.

- Hiện nay: sx chủ yếu là các protein trị liệu, một số enzyme, kháng thể chẩn đoán và trị bệnh Từ thế hệ r-protein đầu tiên được cải tiến→ có nhiều đặc tính ưu việt hơn nhờ đột biến điểm định hướng tác động lên gen, acid amin

• Protein tổng hợp hóa học

- Phổ biến: pp Merrifield (Merrifield solid phase synthesis)

- Sự thêm vào liên tục theo thứ tự của các acid amin  tạo thành một chuỗi peptide được gắn trên bề mặt của các hạt polystyrene có chứa nhóm phản ứng chloromethyl (-CH2Cl)

- PP Merrifield được sử dụng để tổng hợp các peptide/polypeptide dài khoảng

60 acid amin

- PP native chemical  120 acid amin.

Nguyên tắc: các acid amin riêng lẻ được ủ với di-tert butyldicarbonate → dẫn xuất của acid amin là tert – butoxycarbonyl amide (BOC-amide)

Nhóm BOC bảo vệ nhóm amin của acid amin, do đó đảm bảo việc thêm vào mỗi acid amin mới để tạo chuỗi peptide được thực hiện qua nhóm carboxyl của acid amin

- B1: BOC-acid amin đầu tiên kết hợp các hạt thực hiện trong mt kiềm

- B2: xử lý với acid trifluoroacetic để tách nhóm BOC ra Acid amin thứ hai được bảo vệ bởi nhóm BOC được thêm vào

- B3: hình thành lên kết peptide