Tóm tắt bài giảng công nghệ protein enzyme (phần enzyme)

1 Bản chất sinh học - Tạo ra bởi tế bào sinh vật - Xúc tác phản ứng trong và khi tách ra khỏi tế bào sống - Điều kiện phản ứng ôn hòa - Tỷ lệ chất phản ứng: chất xúc tác lớn - Tính đặc

1) Bản chất sinh học

- Tạo ra bởi tế bào sinh vật

- Xúc tác phản ứng trong và khi tách ra khỏi tế bào sống

- Điều kiện phản ứng ôn hòa

- Tỷ lệ chất phản ứng: chất xúc tác lớn

- Tính đặc hiệu cao

- Năng lượng tiêu hao cho phản ứng thấp

2) Bản chất hóa học

• Thành phần cấu tạo Enzyme đơn giản(1 cấu tử, 1 thành phần)

o có cấu tạo giống như một pro

o Thường là enzyme thủy phân (hydrolase) Enzyme phức tạp(2 cấu tử, 2 thành phần)

o Cấu tạo: Apoenzyme: protein

Cofactor: ion KL, vitamin,

nucleotic, focfirin…

o Thường là enzyme oxh khử

− Cofactor có thể là:

 Nhóm prostetic (nhóm ngoại): chứa vòng hem gắn chặt với phần apoenzyme có trong các enzyme như catalase, peroxydase

 Coenzyme: 1 phần k phải pro của enz trong TH khi nó dễ tách khỏi phần apoenzyme có thể tồn tại độc lập thường là dẫn xuất của các loai vit tan trong nước lk yếu với protit

 Các ion kim loại: ion của Cu, Zn, Mo, Co, Ca, K, Na có trong các metaloenzyme

• Một số coenzyme quan trọng

 Coenzyme là các vitamin hoặc dẫn xuất của chúng

Vitamin

B1-Tiamin

pirophotphat

(TPP),

Vit hoặc dẫn xuất của chúng Tách nhóm các đề carboxyl

hoặc vận chuyển các nhóm ceto

Vitamin B2 Các coenzyme FMN

Flavin FAD Tham gia quá trình hô hấp, vận chuyển hidro, vòng

izoalloxazin nhận 2 proton H +

và 2e, coenzyme từ oxh khử

Vitamin B6 Pirydoxal photphat -Tham gia nhóm ngoại của

enzyme transaminase

-V/c nhóm amin từ aaaa khác

Vitamin PP Nicotin amit nucleotit (NAD, NADP) Tham gia q/t hô hấp, v/c

enzyme Vòng nicotin amit của NAD nhận proton H + và 2 điện

tử trở thành đường khử NADP

Vitamin B3 Coenzyme A (coA, CoASH) -Xúc tác cho qtr acetyl hóa

-Vị trí hđ: nhóm -SH

Axit lipoic Anti-oxidant có chứa S, hđ trong pha béo

và nước Là cofactor của pyruvate dehydrogenase complex

Biotin (vitamin H) Là coenzyme của các enzyme vận chuyển

CO 2

Gắn với CO 2 tại nhóm NH  Biotin cacboxylated

 Các coenzyme là nucleotit và dẫn xuất

Các adenin nucleotide vận chuyển nhóm P hoặc là

thành phần cấu tạo của coenzyme: AMP, ADP, ATP

vận chuyển nhóm phosphatnhóm vận chuyển năng lượng

Các nucleotit photphat

Các coenzyme pocfirin sắt.

(Các cytocrom quan trọng:

a,b,c)

Fe 2+ : Ferohem Hem

Fe 3+ : Ferihem

- Hemoproteit không có hoạt tính xúc tác như mioglobin, Hemoglobin

- Hemoproteit có tính xúc tác như Peroxydase và Catalase.

- Hemoproteit nội bào: hệ thống cytocrom là các enzyme vận chuyển

điện tử cùng sự biến đổi thuận nghịch hóa trị của Fe trong hem Các cytocrom thường gắn trên màng ty thể, đến nay biết được khoảng 20

cytocrom khác nhau.

3) Cấu trúc enzyme

• Trung tâm hoạt động:

- TTHĐ là 1 bộ phận nhỏ của enzyme liên quan  hđ xúc tác

- Thành phần cấu tạo TTHĐ: tập hợp nhóm chức khác nhau của a.a hay ion KL và nhóm

chức của coenzyme

- Cấu trúc: không gian xđ Các nhóm này xa nhau trong mạch polypeptide  cuộn lại của mạch  gần nhau trong không gian

- Nhóm chức của TTHĐ gồm: Nhóm xúc tác: trực tiếp biến đổi cơ chất

Nhóm tiếp xúc: định E với S đúng vị trí Nhóm xt gần nhóm tx nhờ cấu trúc bậc 3,4

Enz 2 cấu tử: Fe, Co, Mg  nhóm tx Nhóm hỗ trợ: cầu disunfua, lk H và lk khác

TTHĐ bền vững

- TTHĐ enzyme 1cấu tử: tổ hợp các nhóm định chức của các aa không tham

gia tạo thành trục chính của sợi polypeptide, gồm:

 SH của cystein,

 OH của serine,

 NH2 của lysine,

 COOH của acid glutamic, aspartic,

 vòng imidazol của histidin,

 vòng indol của tryptophan…

enzyme 2 cấu tử: do cofactor và các nhóm định chức của các acid amin ở phần apoenz

• Trung tâm điều hòa dị lập thể

- Một số enzyme trong phân tử ngoài TTHĐ còn có chứa một số vị trí khác có thể tương tác với các chất khác trung tâm dị lập thể (allosteric).

chất kết hợp với trung tâm này gọi là chất điều hoà dị lập thể gồm:

 Chất điều hoà (+): làm tăng hoạt độ

 Chất điều hòa (-): làm giảm hoạt độ.

 Chất điều hòa (↑↑)(homotropic):cơ chất có thể thực hiện chức năng của chất điều hoà

 Chất điều hòa (↑↓) (heterotropic): chất điều hòa có cấu trúc khác cơ chất.

• Phức hợp multienzyme: gồm các enzyme xúc tác cho một dây chuyền phản ứng

Nồng độ sản phẩm cuối đạt mức đủ cao sẽ kìm hãm hoạt động của enzyme đầu tiên ngừng toàn bộ hệ thống (do tương tác allostetic giữa sản phẩm cuối khi nó kết hợp với trung tâm điều hoà của enzyme làm cho enzyme không hoạt động)

* Các phức hợp thường tham gia các quá trình chuyển hóa trong cơ thể

− Quá trình khử cacbboxyl oxh acid pyruvic → acetyl coenzyme A

− Quá trình tổng hợp acid béo ngoài ty thể ở các loài nấm men, ĐV có vú, chim.

− Quá trình tổng hợp các peptide có hoạt tính kháng sinh như gramicidin, tirocidin

− Quá trình tổng hợp tryptophan

• Các tiền chất của enzyme (proenzyme, zymogen)

- Các protease ở tụy, dạ dày và protease trong quá trình đông máu khi chưa hoạt động đều

ở dạng zymogen (pepsinogen, tripsinogen, chymotripsinogen, protrombin…) có

chủ yếu ở ĐV có vú (thường là các enzyme thủy phân) cơ chế tự bảo vệ của cơ thể

- Các tiền enzyme được tạo ra ở các tuyến sinh học nếu không qua giai đoạn tiền enzyme phá hủy cấu tạo các tuyến →các tuyến bị tổn thương

liên kết peptide → loại bỏ vài 1 vài đoạn peptide có tác dụng kìm hãm TTHĐ, phần còn lại

sẽ thay đổi cấu hình không gian  hình thành trung tâm hoạt động và chuyển thành enzyme

- Cách hoạt hóa: tự xúc tác, enzyme protease

- Hiệu suất hoạt hóa phụ thuộc: nồng độ enzyme, bản chất enzyme,nhiệt độ, pH

- Pepsinogen tiền enzyme của pepsin, M=42 kDa

Pepsin, thủy phân protein, M = 35 kDa

 Trypsinogen được tạo ra trong tuyến tụy

protease kiềm tính Trypsin là một chuỗi polypeptide có 249 aminoacid , trọng lượng phân tử 22680-23400 Da

 Chymotrypsinogen protease kiềm tính

cấu tạo từ 3 sợi polypeptide

+ Sợi A: các aa từ 1-13 + Sợi B: các aa từ 16-146 + Sợi C: các aa từ 149-245

• Vai trò của các nhóm chức trong phân tử enzyme

*Các nhóm chức hoạt động theo cơ chế:

- Nhờ khả năng cho nhận proton: chúng có thể hoạt động như chất xúc tác acid hay base

- Có thể lk bằng lk đồng hóa trị với cơ chất tạo phức hợp ES để thực hiện qt xúc tác

a Nhóm imidazol của His: His dễ t/d với glucid, những phức chất của His với hexose,

pentose thường rất bền thông qua lk H

b Nhóm hydoxyl của Serine: Trong các enzyme esterase, proteinase,

phosphoglucomutase

c Nhóm ε - amine của lysine: nằm xa nhóm OH, phản ứng dễ dàng với các nhóm

aldehyde

d Nhóm cacboxyl: tham gia vào việc bảo vệ và duy trì cấu hình nguyên thủy của enzyme,

t/d tương hỗ ion với các nhóm base, hình thành lk H, lk ester, lk amide

e Nhóm sulfhydryl: tham gia nhiều biến đổi hóa học như: ion hóa, acyl hóa, phosphoryl

hóa, oxy hóa, alkyl hóa, lk H và những phức hợp điện từ.

-• Tính đặc hiệu của enzyme Đặc hiệu kiểu phản ứng: mỗi enzyme xúc tác

cho một trong các kiểu phản ứng nhất định

Đặc hiệu cơ chất: mỗi enzyme có một

kiểu lựa chọn cơ chất để xúc tác chuyển hóa

ĐH tuyệt đối: chỉ t/d lên một cơ chất nhất định

ĐH tương đối: t/d lên một kiểu lk hóa học nhất định trong phân tử cơ chất, k phụ thuộc

vào cấu tạo của TP tham gia vào mối liên kết

Ex: enzyme lipase thủy phân tất cả các liên kết ester.

ĐH nhóm tuyệt đối tác dụng lên một kiểu liên kết nhất định với điều kiện một trong hai phần tham gia tạo thành liên kết phải có cấu tạo nhất định

Ex: protease xúc tác thuỷ phân liên kết peptide gồm:

+Exopeptidase: thủy phân lk ở đầu tận cùng

+Endopeptidase: thủy phân lk peptide bên trong

+ cacboxylpeptidase thuỷ phân lk gần nhóm cacboxyl tự do

ĐH quang học: đồng phân quang học D và L, α và β , cis và trans…

Ex: enzyme fumarahydratase chỉ tác dụng lên L-malic acid

• Gọi tên và phân loại enzyme theo hệ thống quốc tế

- Theo tên thông dụng : papain,

- Theo tên cơ chất + ase: peptidase

- Tên cơ chất ghép với tên kiểu phản ứng: pyruvate dehydrogenase

VD : EC 3.1.1.3

(triacylglycerol lipase)

-Lớp: thủy phân

-Phân lớp: thủy phân lk

ester

-Nhóm: thủy phân lk ester

cacboxylic

-Số thứ tự: Enzyme thứ 3

trong nhóm

- Danh mục mã số của 6 nhóm enzyme và các phân nhóm chính của chúng

a. OXYREDUCTASE: oxi hóa khử

Dehydrogenase:

- Tách H trực tiếp từ cơ chất

- coenzyme: NAD+, NADP+,

- vai trò trong sinh tổng hợp

- Vd: alcohol dehydrogenase, chuyển rượu thành aldehyd

CH3CH2OH + NAD+CH3CHO + H+

Oxidase:

- Chuyển e- đến Oxi oxi có khả năng kết hợp với proton

- Vd: Cytocrom C oxydase xúc tác

4 ferrocytocrom C + O2 + 4H+  4 ferricytocrom C + H2O

Oxygenase:

- Xúc tác phản ứng kết hợp oxi vào hợp chất hữu cơ

- Gồm oxygenase (kết hợp O2) và hydroxylase (kết hợp OH)

Peroxydase:

- Xúc tác oxi hóa các chất hữu cơ khi có H2O2

- Điển hình là catalase, giải độc H2O2 cho cơ thể

- Vd: catalase H2O2 + H2O2  O2 + 2H2O

b. TRANSFERASE: Xúc tác chuyển các gốc, nhóm từ chất này sang chất khác Tùy bản chất nhóm

- Acyl-transferase: chuyển nhóm acyl, quan trọng trong trao đổi chất

- Glucozyl-transferase: chuyển gốc đường

- Amino-transferase: chuyển amin từ acid amin sang á-ketoacid acid amin mới

- Phospho-transferase (kinase): chuyển gốc phosphat từ ATP đến –OH của alcohol hoặc

đường

c. HYDROLASE: Xúc tác phản ứng thủy phân, luôn có nước tham gia

Quan trọng trong quá trình tiêu hóa

- Lipase (esterase): thủy phân liên kết ester trong dầu mỡ

- Peptide hydrolase: thủy phân liên kết peptide

- Glycoside hydrolase: thủy phân glucoside trong tinh bột, cellulose

d. LYASE

- - Tách nhóm chức không cần nước

- Ví dụ: pyruvat-decarboxylase, loại CO2 khỏi pyruvat Acetaldehyd (xảy ra trong quá trình lên men rượu)

CH3COCOO-CH3CHO + CO2

- Đồng phân hóa hình học, quang học, chuyển vị nội phân

- Ví dụ: Glucoisomerase chuyển glucose thành fructose

- Xúc tác tổng hợp các chất hữu cơ

- Ví dụ:

• Pyruvat-carboxylase chuyển C đến acid pyruvic và tạo thành oxaloacetic

• Trong chu trình krebs quan trọng trong trao đổi chất

• Cơ chế xúc tác của enzyme

Các loại liên kết trong ES khi E tác dụng lên S Lk ion (tương tác tĩnh điện): nhóm tích

điện của cơ chất + nhóm tích điện trái dấu trên enz

Lk hydro: H lk với A bằng lk cộng hoá trị,

đồng thời tạo lk yếu với B Liên kết H được tạo thành khi khoảng cách giữa A và B khoảng 3A o

Tương tác kỵ nước: các phần không phân

cực của E và S kết lại với nhau.

Tương tác Vandecvan: yếu và ít đặc hiệu

hơn lk H và ion, xảy ra khi có sự ăn khớp về hình

dạng giữa S và E.

Lk cộng hóa trị: lk này thường do nhóm ái nhân trên E tạo với nhóm ái điện tử trên S.

Nucleophiles: -OH, -SH, -S-, -NH2, =N-,

Electrophiles: H+, >C=O, >C=NH, Fe2+, Cu+

Sự tạo thành phức hợp ES và cơ chế tác dụng:

- Gồm 3 gđ phản ứng: Giai đoạn hình thành phức ES

Giai đoạn hoạt hóa và biến đổi cơ chất Giai đoạn tạo thành sản phẩm P và giải phóng E

- Có 2 giả thiết về cơ chế tác dụng của enzym: cơ chế khóa và chìa

cơ chế cảm ứng

*Theo quan điểm “ổ khoá và chìa khóa” của Fisher (thuyết tương ứng tĩnh): TTHĐ có cấu trúc không gian tương ứng với cấu trúc không gian của S giống như sự phù hợp giữa ổ khoá

và chìa khoá

* Theo quan điểm hiện đại “khớp cảm ứng” của Daniel E.Koshland (thuyết tương ứng động) cấu trúc không gian của E mềm dẻo, linh động Khi E tiếp xúc S, các nhóm chức trong TTHĐ của E thay đổi vị trí không gian tạo thành hình thể khớp với S

4) Động học phản ứng enzyme – các yếu tố ảnh hưởng

• Phương trình động học Michaelis – Menten

[ET] nồng độ enzyme tổng;

[E] nồng độ enzyme tự do

Km được gọi là hằng số Michaelis.Km càng nhỏ ái lực enzym và cơ chất càng cao và ngược lại

Từ pt động học xảy ra 3 trường hợp:

-Khi [S]>>Km : V=Vmax ◊ vận tốc phản ứng không phụ thuộc [S]

-Khi [S] = Km : V=1/2 Vmax

-Khi [S] << Km : V phụ thuộc tuyến tính [S]

Phương trình cải tiến (Lineaweaver và Burk)

Ý nghĩa của pt động học: lập mô hình toán để:

- Xác định Vmax  so sánh cường lực xúc tác

- Xác định thời gian thích hợp với S min và P maxtính kinh tế

- Điều khiển tự động

• Ảnh hưởng của nhiệt độ: tăng nhiệt độ  vận tốc phản ứng tăng

Nhiệt độ tối thích, topt : ứng với vận tốc cao nhất topt phụ thuộc thời gian, [E], [S], trạng thái tồn tại của E…

E thực vật: 50-60

E động vật: 40-50

Nhiệt độ tới hạn: enzyme mất hoàn toàn hoạt tính

• Ảnh hưởng của pH: ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất và enzyme

Đối với enzyme: gây ra sự thay đổi mức ion hóa trong các nhóm chức trong TTHĐ  ảnh hưởng hình thành phức chất ES hay khả năng duy trì cấu trúc không gian của enzyme

Đối với cơ chất: ảnh hưởng tới mức độ ion hoá sự hình thành phức chất ES

pH tối thích (pHopt): pH thích hợp nhất cho hoạt động của enzyme

pHopt của đa số enzyme: 6-8

pHopt pepsin: 1,5- 2

acginase, phosphatase kiềm: 9,5 -10

• Ảnh hưởng của chất kìm hãm (Inhibitor): Ức chế, làm giảm hoạt tính của

enz hay làm enz không có khả năng xúc tác biến cơ chất thành sản phẩm

Có thể là những ion, các phân tử

vô cơ, hữu cơ, protein… Không bị chuyển hóa bởi E

- Chất kìm hãm kìm hãm cạnh tranh: có cấu trúc tương tự cấu trúc cơ chất, nên

kết hợp vào TTHĐ của enz chiễm chỗ của cơ chất

-kìm hãm không cạnh tranh: chất -kìm hãm kết hợp với enz ở 1

vị trí không phải TTHĐ làm thay đổi cấu trúc

Kìm hãm do thừa cơ chất: Một cơ chất thứ 2 gắn vào một

vị trí nào đó trên ES Enzyme trở nên không hoạt động

Kìm hãm do sản phẩm của phản ứng:

Một số trường hợp: E có ái lực với cả các sản phẩm phản ứng

Các sản phẩm là chất kìm hãm không cạnh tranh

• Ảnh hưởng của chất hoạt hóa (Activator): làm tăng hoạt độ xúc tác của enzyme, có thể là các anion, cation kim loại, hợp chất vô cơ, hữu cơ…

-Trực tiếp: phá vỡ lk trong tiền enzyme

phục hồi nhóm chức trong TTHĐ tạo phức với ion kim loại

-Gián tiếp:

• Điều hòa quá trình sinh tổng hợp enzyme Điều hòa theo kiểu đóng mở

bởi gen operator

Điều hòa tương tác giữa ARN – polymerase với gen promotor

 Điều hòa theo kiểu đóng mở bởi gen operator

- Các kiểu điều hòa Hiện tượng trấn áp

Hiện tượng cảm ứng

- Cơ chế điều hòa:

a. Sự phân hóa chức năng ở các đoạn khác nhau trong NST, chia thành các

loại gen: Theo mô hình Jacobbb và Monod

+ Gen cấu trúc (S):

+ Gen điều khiển (O_operator):

+Gen khởi động promotor (P) đứng trước gen O, là đoạn DNA mà RNA-polymerase sẽ kết hợp và bắt đầu sao chép các gen cấu trúc +Gen điều hòa regulator (R) mã hóa cho 1 protein đặc biệt được gọi là chất trấn áp (repressor), có vai trò đóng mở O

b. Trong trường hợp điều hòa sth enzyme theo cơ chế trấn áp:

- Repressor (gene điều hoà tổng hợp) còn ở dạng không hoạt động (aporepessor) chưa có khả năng kết hợp với gene operator  sao chép các gene cấu trúc tiến hành bình thường.

- Các enzyme được tổng hợp xúc tác cho các phản ứng  sản phẩm cuối cùng, sản phẩm cuối này kết hợp với aporepessor và hoạt hóa nó.

- Aporepessor đã được hoạt hoá sẽ kết hợp với operator ngăn cản quá trình sao chép các gene cấu trúc, làm ngừng việc tổng hợp ARNtt tương ứng do đó đình chỉ quá trình sinh tổng hợp các enzyme tương ứng Trong trường hợp này các sản phẩm mới được coi như

là chất trấn áp (repressor).

c. Trường hợp cảm ứng:

theo cơ chế cảm ứng

cơ chế khác nhờ tác dụng của AMP vòng (cAMP).

- AMP : kích thích quá trình sao chép mã của các operon phân giải, nhờ một protein trung gian sẽ hoạt hóa gene phân giải

- Khi AMP kết hợp với protein này tạo phức hợp có tác dụng hoạt hóa gen P làm cho ARN-polymerase dễ dàng kết hợp với nó để bắt đầu quá trình sao chép mã, như vật AMP có tác dụng tăng cường quá trình sao chép

Vd: Hiệu ứng glucose ở VK E.coli RNA polymerase có ái lực thấp với các promotor của lac operon trừ khi được sự giúp đỡ của một proten CRP

(catabolite) CRP chỉ trở nên kích hoạt nếu nồng độ của AMP vòng (cAMP) cao

Một số gene chịu trách nhiệm sinh tổng hợp

một số enzyme cảm ứng chịu tác động