Tuyển chọn các bacteriocin kháng ung thư tiềm năng từ hệ vi sinh vật đường ruột người bằng kỹ thuật sinh học phân tử đọc lập nuôi cấy

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Tuyển chọn các bacteriocin kháng ung thư tiềm năng từ hệ vi sinh vật đường ruột người bằng kỹ thuật sinh học phân tử độc lập nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYẾN THỊ THANH TRÀ

TUYỂN CHỌN CÁC BACTERIOCIN KHÁNG UNG THƯ TIỀM NĂNG TỪ HỆ VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỘC LẬP NUÔI CẤY

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA – 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ THANH TRÀ

TUYỂN CHỌN CÁC BACTERIOCIN KHÁNG UNG THƯ TIỀM NĂNG TỪ HỆ VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỘC LẬP NUÔI CẤY

Người hướng dẫn khoa học:

TS NGUYỄN VĂN DUY

Chủ tịch hội đồng

PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa

Khoa sau đại học

KHÁNH HÒA –2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Tuyển chọn các bacteriocin kháng

ung thư tiềm năng từ hệ vi sinh vật đường ruột người bằng kỹ thuật sinh học phân

tử độc lập nuôi cấy” được trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách

quan

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận văn đều đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều chính xác và được chỉ rõ nguồn gốc

Khánh Hòa, ngày 24 tháng 03 năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thanh Trà

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều

tổ chức và cá nhân Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Khoa Sau đại học - Trường Đại học Nha Trang, đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành chương trình đào tạo Thạc sĩ tại Viện

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học là

TS Nguyễn Văn Duy, Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Trường Đại học Nha

Trang đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài luận văn Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số 106-YS.04-2014.40 do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ và TS Nguyễn Văn Duy làm chủ nhiệm đề tài

Đồng thời tôi cũng gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Phạm Thu Thủy, TS Đặng Thúy Bình cùng toàn thể Quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học và Bộ môn Sinh học đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện luận văn

Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè đã đóng góp công sức, động viên tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, ngày 24 tháng 03 năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thanh Trà

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN x

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về bacteriocin 3

1.2 Phân loại bacteriocin 3

1.3 Cơ chế hoạt động của bacteriocin 4

1.4 Những bacteriocin có hoạt tính kháng ung thư 5

1.4.1 Azurin 5

1.4.2 Các bacteriocin có hoạt tính kháng ung thư khác 7

1.5 Tình hình nghiên cứu tuyển chọn các bacteriocin có tiềm năng kháng ung thư 9

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 9

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 13

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 16

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

2.2 Nguyên vật liệu 17

2.2.1 Hóa chất 17

2.2.2 Môi trường 19

2.2.3 Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1.Thu mẫu phân 21

2.3.2 Phân lập chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 22

2.3.3 Bảo quản chủng 22

2.3.4 Tách chiết DNA 23

2.3.4.1 Tách chiết DNA đa hệ gen 23

2.3.4.2 Tách chiết DNA hệ gen từ chủng vi khuẩn đã phân lập Pseudomonas

aeruginosa 25

2.3.5 Khuếch đại gen bằng PCR 26

2.3.6 Phương pháp thôi gel 29

2.3.7 Điện di trên gel agarose 30

2.3.8 Giải trình tự gen 31

2.3.9 Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh loài 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Kết quả thu mẫu 32

3.2 Kết quả sàng lọc gen mã hóa Azurin bằng kỹ thuật sinh học phân tử phụ thuộc nuôi cấy 32

3.2.1 Kết quả phân lập chủng Pseudomonas aeruginosa từ mẫu phân 32

3.2.2 Kết quả tách chiết DNA hệ gen từ các chủng Pseudomonas aeruginosa 33

3.2.3 Kết quả khuếch đại đoạn gen azurin từ chủng Pseudomonas aeruginosa sử dụng cặp mồi Azu 441F/R 34

3.2.4 Kết quả khuếch đại đoạn gen azurin từ các chủng Pseudomonas aeruginosa sử dụng cặp mồi Azu 677F/R 34

3.3 Kết quả sàng lọc các gen mã hóa Azurin bằng kỹ thuật sinh học phân tử độc lập nuôi cấy 36

3.3.1 Kết quả tách chiết DNA đa hệ gen 36

3.3.2 Kết quả khuếch đại đoạn gen azurin từ các mẫu DNA đa hệ gen sử dụng cặp mồi Azu 441F/R 36

3.3.3 Kết quả khuếch đại đoạn gen azurin từ các mẫu DNA đa hệ gen sử dụng cặp mồi Azu 677F/R 37

3.4 Kết quả giải và phân tích trình tự các đoạn gen azurin thu được 40

3.5 Quy trình sàng lọc đoạn gen mã hóa Azurin từ khu hệ vi sinh vật đường ruột người Việt Nam bằng phương pháp độc lập nuôi cấy và so sánh với phương pháp phụ thuộc nuôi cấy 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

bp : Base pair (cặp bazơ)

DNA : Deoxyribonucleic Acid

EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

FDA : Food and Drug Administration

HNSCC : Head and Neck Squamous Cell Carcinomas

L : lít

LAB108 : Pseudomonas Agar Base (Môi trư ờng thạch phân lập

Pseudomonas aeruginosa của hãng LabM)

NAFOSTED : National Foundation for Science and Technology Development (Quỹ

Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia) PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

PTEN : Phosphatase and tensin homolog

TBE : Tris-Borat-EDTA

WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số peptit điều trị bệnh hiện có sẵn trên thị trường 12

Bảng 2.1 Thông tin 23 mẫu phân 16

Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi Azu 441F/R và Azu 677F/R 19

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 28

Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của Azurin 6Hình 1.2 Cấu trúc và hoạt tính kháng ung thư của Azurin (Chakrabarty 2014) 13Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 21

Hình 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc các chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập được 32 Hình 3.2.Các mẫu DNA hệ gen từ các chủng Pseudomonas aeruginosa 33 Hình 3.3 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ các chủng Pseudomonas

aeruginosa sử dụng cặp mồi Azu 441F/R 34

Hình 3.4 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ các chủng Pseudomonas

aeruginosa sử dụng cặp mồi Azu 677F/R ở nhiệt độ gắn mồi 56o 34

Hình 3.5 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ các chủng Pseudomonas

aeruginosa bằng cặp mồi Azu 677F/R ở nhiệt độ gắn mồi 58oC 35

Hình 3.6 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ các chủng từ các chủng Pseudomonas

aeruginosa bằng cặp mồi Azu 677F/R ở nhiệt độ gắn mồi 60oC 35Hình 3.7.Các mẫu DNA đa hệ gen được tách chiết từ các mẫu phân 36Hình 3.8 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ các mẫu DNA đa hệ gen bằng cặp mồi Azu 441F/R 37Hình 3.9 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ các mẫu DNA đa hệ gen bằng cặp mồi Azu 677F/R 38Hình 3.10 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ các mẫu DNA đa hệ gen sử dụng cặp mồi Azu 677F/R 38Hình 3.11 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ các mẫu DNA đa hệ gen sử dụng cặp mồi Azu 677F/R 39Hình 3.12 Kết quả thôi gel sản phẩm PCR từ mẫu K13 40Hình 3.13 Sơ đồ quan hệ tiến hóa của gen azurin từ mẫu K13 và các chủng K13P, K15P,

K16P, K17P, K19P, K20P, K22P, K23P, Pseudomonas aeruginosa PAO1 44

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Ung thư là căn bệnh nguy hiểm, là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây

tử vong đối với con người hiện nay Cho đến nay vẫn chưa có một phương pháp điều trị nào có thể ngăn chặn được ung thư tái phát Phương pháp điều trị hiện nay thường

là bằng phẫu thuật, xạ trị và hóa trị liệu Trong các biện pháp điều trị thì phẫu thuật và

xạ trị gây nhiều đau đớn nhiều về thể xác và để lại nhiều phản ứng phụ cho người bệnh, hóa trị liệu có thể gây ra tác động phụ đối với các tế bào bình thường và dẫn tới hiện tượng kháng thuốc của tế bào ung thư Chính vì vậy, việc nghiên cứu và tìm kiếm các liệu pháp điều trị mới là cấp thiết

Hiện nay, mô hình điều trị ung thư sử dụng các vi khuẩn sống và sản phẩm tinh sạch từ chúng đang được quan tâm Trong đó, azurin là một bacteriocin do vi khuẩn

Pseudomonas aeruginosa tiết ra, có khả năng gây độc và cảm ứng quá trình chết tế

bào theo chương trình đối với các tế bào ung thư ở người, nhưng không tác động đối với tế bào bình thường Điều này đã mở ra một hướng mới trong việc điều trị bệnh ung thư ở người

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành sàng lọc các bacteriocin Azurin có tiềm năng kháng ung thư từ khu hệ vi sinh vật đường ruột người Việt Nam, bằng kỹ thuật sinh học phân tử độc lập và phụ thuộc nuôi cấy nhằm định hướng phát triển các thuốc chống ung thư mới góp phần bảo vệ sức khỏe con người

Mục tiêu của đề tài là:

 Sàng lọc gen mã hóa bacteriocin Azurin có tiềm năng kháng ung thư từ khu

hệ vi sinh vật đường ruột người Việt Nam bằng kỹ thuật sinh học phân tử phụ thuộc và độc lập nuôi cấy nhằm định hướng phát triển các thuốc chống ung thư mới góp phần bảo vệ sức khỏe con người

 Thiết lập quy trình kỹ thuật sinh học phân tử độc lập nuôi cấy nhằm sàng lọc gen mã hóa bacteriocin từ khu hệ vi sinh vật đường ruột người Việt Nam và so sánh với quy trình kỹ thuật sinh học phân tử phụ thuộc nuôi cấy

Để đạt được mục tiêu này chúng tôi tiến hành: thu mẫu phân, phân lập vi khuẩn

Pseudomonas aeruginosa, tách chiết DNA từ các mẫu phân và từ các chủng vi khuẩn

phân lập được, khuếch đại gen azurin bằng PCR, giải và phân tích trình tự gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại

Kết quả chúng tôi đã thu thập được 23 mẫu phân từ những người tình nguyện

Khánh Hòa Từ các mẫu này, chúng tôi đã phân lập được 10 chủng vi khuẩn P

aeruginosa, đã khuếch đại và giải trình tự đoạn gen azurin của 8 chủng vi khuẩn P

aeruginosa, khuếch đại và giải trình tự đoạn gen azurin từ 1 mẫu phân, xây dựng cây

phân loại để đánh giá quan hệ tiến hóa giữa các chủng

Kết quả cho thấy:

 Đề tài đã thu thập được 23 mẫu phân từ những người tình nguyện thuộc tỉnh Khánh Hòa

 Bằng kỹ thuật sinh học phân tử phụ thuộc nuôi cấy (phân lập chủng vi khuẩn

Pseudomonas aeruginosa, tách chiết DNA hệ gen, nhân đoạn gen mã hóa Azurin bằng

kỹ thuật PCR) chúng tôi đã khuếch đại đặc hiệu được đoạn gen azurin từ 8 chủng P

aeruginosa sử dụng cặp mồi Azu 677F/R Nhiệt độ gắn mồi tối ưu đối với các mẫu

K13P, K15P, K16P, K20P, K22P, K23P là 56oC; của mẫu K19P là 58oC và của mẫu K17P là 60oC

 Bằng kỹ thuật sinh học phân tử độc lập nuôi cấy (tách chiết DNA đa hệ gen từ các mẫu phân, nhân đoạn gen mã hóa Azurin bằng kỹ thuật PCR), chúng tôi đã khuếch đại đặc hiệu được đoạn gen azurin từ mẫu DNA đa hệ gen K13 với nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 58oC

 Đã giải và phân tích trình tự đối với 9 đoạn gen mã hóa Azurin cho thấy: Trình tự đoạn gen azurin từ chủng K13P (từ phương pháp phụ thuộc nuôi cấy) và của mẫu K13 (từ phương pháp độc lập nuôi cấy) giống nhau 100% thể hiện sự chính xác cao của cả 2 phương pháp

Các trình tự thu được đều có độ tương đồng cao so với với trình tự đoạn gen

azurin của chủng P aeruginosa PAO1 trên ngân hàng gen Trong đó, trình tự đoạn gen

azurin từ các chủng K15P, K16P, K17P, K19P, K20P, K22P, K23P, sai khác từ 1-2

nucleotit so với trình tự đoạn gen azurin của chủng P aeruginosa tuy nhiên các sai

khác này đều không ảnh hưởng tới protein chức năng

Thiết lập thành công quy trình kỹ thuật sinh học phân tử độc lập và phụ thuộc nuôi cấy nhằm sàng lọc gen mã hóa bacteriocin từ khu hệ vi sinh vật đường ruột người

Việt Nam

Kết quả nghiên cứu của đề tài làm cơ sở cho việc sàng lọc gen mã hóa bacteriocin mới tương tự Azurin có tiềm năng kháng ung thư từ khu hệ vi sinh vật đường ruột người Việt Nam bằng kỹ thuật sinh học phân tử phụ thuộc và độc lập nuôi cấy từ đó góp phần vào việc phát triển các thuốc chống ung thư mới góp phần bảo vệ sức khỏe con người

Từ khóa: Azurin, bacteriocin, DNA đa hệ gen, hệ vi sinh đường ruột người,

peptide kháng ung thư

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Sức khỏe con người luôn là đề tài được quan tâm hàng đầu Ngành y dược và nhiều ngành khác luôn luôn không ngừng nghiên cứu và phát triển để phục vụ cho lợi ích sức khỏe của con người Cho đến hiện nay rất nhiều căn bệnh nguy hiểm đã được đẩy lùi nhờ sự tiến bộ của y học Trong số này ung thư là căn bệnh gây tỷ lệ tử vong cao Cho đến nay vẫn chưa có một phương pháp điều trị nào có thể ngăn chặn được ung thư tái phát

Ung thư là bệnh lý trong đó một số tế bào thoát ra khỏi sự kiểm soát phân bào, sự biệt hóa tế bào và tiếp tục nhân lên Những tế bào này có khả năng xâm lấn và phá hủy các tổ chức xung quanh Đồng thời chúng di trú và đến phát triển ở nhiều cơ quan khác nhau và hình thành nên di căn, cuối cùng ung thư gây ra tử vong

Trong một thời gian dài việc phẫu thuật để loại bỏ khối u được xem là phương pháp duy nhất để điều trị ung thư và đến nay nó vẫn còn được xem là hòn đá tảng trong điều trị ung thư hiện đại Phẫu thuật có thể kết hợp với phương pháp xạ trị để tiêu diệt các tế bào ung thư còn sót lại Hóa trị liệu lâu dài nhằm ngăn chặn các tế bào ung thư phát triển trở lại Ngoài ra người ta còn kết hợp với một số phương pháp khác như nội tiết, miễn dịch…

Trong các phương pháp điều trị trên, phẫu thuật có thể dẫn đến biến chứng và đe dọa đến tính mạng của bệnh nhân, hoặc làm mất chức năng sinh lý của một số cơ quan, bên cạnh đó những khối u ác tính đã di căn thì phương pháp phẫu thuật không còn phù hợp Hóa trị liệu có thể gây ra tác động phụ đối với các tế bào bình thường và dẫn tới hiện tượng kháng thuốc của tế bào ung thư bằng cách sử dụng con đường sinh trưởng khác hoặc các bơm ngược để bơm thuốc ra ngoài Do đó, việc tìm kiếm các liệu pháp điều trị mới là cấp thiết

Hiện nay, cách tiếp cận điều trị ung thư sử dụng các vi khuẩn sống và sản phẩm tinh sạch từ chúng đang được quan tâm Trong số sản phẩm từ vi khuẩn, một số protein và peptide được quan tâm hơn cả Đặc biệt, bacteriocin – chất kháng khuẩn có bản chất protein và peptide – đang hứa hẹn là một trong những chất kháng ung thư

hiệu quả và an toàn Vì vậy đề tài: “Tuyển chọn các bacteriocin kháng ung thư tiềm

năng từ hệ vi sinh vật đường ruột người bằng kỹ thuật sinh học phân tử độc lập nuôi cấy” được tiến hành

2 Mục tiêu của đề tài

- Sàng lọc gen mã hóa bacteriocin Azurin có tiềm năng kháng ung thư từ khu hệ

vi sinh vật đường ruột người Việt Nam bằng kỹ thuật sinh học phân tử phụ thuộc và độc lập nuôi cấy nhằm định hướng phát triển các thuốc chống ung thư mới góp phần bảo vệ sức khỏe con người

- Thiết lập quy trình kỹ thuật sinh học phân tử độc lập nuôi cấy nhằm sàng lọc gen mã hóa bacteriocin từ khu hệ vi sinh vật đường ruột người Việt Nam và so sánh với quy trình kỹ thuật sinh học phân tử phụ thuộc nuôi cấy

3 Nội dung chính của đề tài

- Thu mẫu phân để nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột người

- Sàng lọc gen mã hóa Azurin bằng kỹ thuật sinh học phân tử phụ thuộc nuôi cấy

- Sàng lọc gen mã hóa Azurin bằng kỹ thuật sinh học phân tử độc lập nuôi cấy

- Giải và phân tích trình tự các đoạn gen azurin thu được

- Thiết lập quy trình kỹ thuật sinh học phân tử độc lập nuôi cấy và so sánh với kỹ thuật phụ thuộc nuôi cấy

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Ý nghĩa khoa học: đây là nghiên cứu đầu tiên sàng lọc các bacteriocin kháng ung thư ở Việt Nam; đồng thời thiết lập quy trình kỹ thuật sinh học phân tử độc lập và phụ thuộc nuôi cấy nhằm tuyển chọn các gen mã hóa các bacteriocin có tiềm năng kháng ung thư từ mẫu phân người phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

- Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài này là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển thuốc chống ung thư mới góp phần bảo vệ sức khỏe con người

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về bacteriocin

Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là các peptit hoặc protein do gen mã hóa được sản sinh từ cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương để ức chế các vi khuẩn cạnh tranh khác Bacteriocin có hoạt tính kháng các vi sinh vật cạnh tranh trong cùng ổ sinh thái, thường kháng cùng loài (phổ hẹp) nhưng đôi khi kháng nhiều loài khác (phổ rộng) Vì vậy chúng được mong đợi có tác động có lợi đến sức khỏe của người, động vật nuôi và một số thực vật (Riley, 2009) Bacteriocin hứa hẹn là một trong các chất kháng ung thư hiệu quả, các tính chất hóa sinh của chúng đã và đang được nghiên cứu Từ cuối những năm 1970, từ phát hiện dịch bacteriocin thô có thể gây độc ở các tế bào động vật có vú dẫn đến phát hiện khả năng kháng ung thư của

bacteriocin (Cornut và cs, 2008) Hiện nay các nhóm bacteriocin phổ biến như pyocin,

colicin, pediocin và microcin đã có đại diện được chứng tỏ có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư khác nhau (Chakrabarty, 2014)

1.2 Phân loại bacteriocin

Bacteriocin được phân loại với nhiều tiêu chí khác nhau như: họ vi khuẩn sản sinh, trọng lượng phân tử của chúng và trình tự chuỗi axit amin…Cho tới hiện nay bacteriocin được chia thành 4 lớp

a) Lớp I: là lớp lantibiotic, là polypeptit có trọng lượng phân tử < 5 kDa, bền

nhiệt hoạt động theo cơ chế tác động lên màng tế bào Lantibiotic bacteriocin lớp I được chia thành hai lớp phụ

Lớp Ia: thường là những protein nhỏ (2-5 kDa) có hình ốc vít, kéo dài và chứa những phân tử mang điện tích dương Nisin thuộc vào lớp này

Lớp phụ Ib: là những peptit đặc trưng hình cầu, không linh động, tích điện âm hoặc không tích điện Chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây nhiễu đối với những phân tử enzyme thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm Đại diện: Mersacidin…

b) Lớp II: gồm các bacteriocin không phải là lantibiotic, là những peptide có

trọng lượng phân tử biến thiên, nhưng thông thường nhỏ (< 10 kDa), bền nhiệt, chứa những amino axít thông thường Nhóm này được chia vào trong ba nhóm nhỏ:

Lớp IIa: là lớp lớn nhất gồm những peptide hoạt động chống Listeria, đại diện

đặc trưng cho nhóm này là pediocin PA-1 Leucocin A và Sakacin P Các bacteriocin nhóm này hứa hẹn có nhiều ứng dụng trong công nghiệp nhờ vào hoạt động kháng

Listeria mạnh của chúng Thậm chí chúng còn được chú ý hơn nhiều so với

bacteriocin lớp I (nisin) vì chúng có phổ ức chế đặc hiệu với vi khuẩn đích

Lớp IIb: được hình thành bởi phức hợp của hai peptide riêng biệt, những peptide này ít hoặc không hoạt động Bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là: Lactococcin G, Plantaricin EF và Plantaricin JK

Lớp IIc: là những peptide nhỏ, bền nhiệt Trong phân lớp này chỉ tìm thấy các bacteriocin như Divergicin A và Acidocin B

c) Lớp III: lớp này bao gồm các peptide lớn có trọng lượng phân tử > 30 kDa,

không tan, không bền nhiệt Nhóm này bao gồm các enzyme ngoại bào có hoạt tính kháng lại các vi khuẩn Các bacteriocin lớp III cho đến nay chỉ được phân lập từ chi

Lactobacillus Đại diện: Acidofilicin A và Lactacins A,B

d) Lớp IV: là các bacteriocin phức hợp, ngoài thành phần chính là protein chúng

còn chứa lipid và cacbonhydrat Cấu trúc và chức năng của nhóm này chưa được biết nhiều, ví dụ Leuconocin B

1.3 Cơ chế hoạt động của bacteriocin

Cơ chế tác động bacteriocin rất đa dạng, nó có thể làm biến đổi các enzym, ức chế sự sản sinh bào tử, chúng xâm nhập vào tế bào làm mất lực đẩy proton, làm giảm thế năng của màng nguyên sinh chất và thay đổi pH nội bào do đó tạo ra các lỗ thủng không thể khắc phục được dẫn đến tế bào bị phá vỡ (Thomas và cs, 1994) Nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào

Lớp I (điển hình là nisin): tác động lên thành peptidoglycan hoặc màng nguyên

sinh, hoặc kết hợp cả hai cơ chế Ví dụ, nisin có cả hai cơ chế trong khi đó thì lacticin chỉ có khả năng tác động lên thành peptidoglycan

Đối với thành peptidoglycan; lipid II giữ vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển các đơn vị tổng hợp nên thành peptidoglycan từ trong tế bào chất Bacteriocin thuộc nhóm này có khả năng liên kết với lipid nằm trên màng nguyên sinh, sự liên kết

này được giải thích rằng do phần lớn bacteriocin mang điện tích dương và lipid màng mang điện tích âm vì thế sự liên kết được dễ dàng tạo ra trên màng Sau khi tạo liên kết, bacteriocin sẽ khóa lipid làm chúng mất khả năng vận chuyển các tiểu đơn vị cấu tạo nên thành peptidoglycan

Đối với màng sinh chất, bacteriocin liên kết và sử dụng lipid trên màng nguyên sinh thực hiện quá trình oxi hóa khử, lúc này lipid có tác dụng như những con dao cắt tạo nên những lỗ hỏng trên màng nguyên sinh Những lỗ hỏng này làm thất thoát nhiều các ion, các chất hòa tan trong nguyên sinh chất (muối khoáng, acid amin, acid nucleic…), làm thủy phân và thất thoát nhiều ATP dẫn đến tế bào chết nhanh hơn (Heschard và cs, 2002)

Lớp II (điển hình là Sakacin): do có nhóm kỵ nước nên sau khi tạo ra kênh dẫn

trong màng, bacteriocin thuộc nhóm này sẽ liên kết với lipid trong thành phần phospholipid màng, và gắn trực tiếp vào màng như một thành phần của màng, sau đó thực hiện các phản ứng oxi hóa khử tạo nên những lỗ hỏng và tác động như nhóm I (Heschard và cs, 2002)

Lớp III (điển hình là lysostaphin): tác động trực tiếp lên thành tế bào, làm phân

hủy thành tế bào và phá vỡ tính thẩm thấu (Heschard và cs, 2002)

Lớp IV : Hiện vẫn chưa có kết luận rõ ràng về cơ chế hoạt động của nhóm này

Tuy nhiên các nhà khoa học giả định rằng cơ chế hoạt động của nhóm này chủ yếu tác động lên DNA, RNA và sự tổng hợp protein Các bacteriocin nhóm này có thể tạo phức hợp không tan với DNA, ngăn cản DNA tổng hợp nên RNA và protein hoặc liên kết với DNA làm dịch mã ra các protein bất thường

1.4 Những bacteriocin có hoạt tính kháng ung thư

1.4.1 Azurin

Azurin là thành viên của họ protein cupredoxin do Pseudomonas aeruginosa có mặt trong hệ vi sinh vật đường ruột người tiết ra, có thể thấm chọn lọc các tế bào ung thư ở người Giả thuyết đặt ra là liệu Azurin từ P aeruginosa có phải là protein duy

nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột người có khả năng chống ung thư hay không Vì vậy, nghiên cứu này nhằm mục tiêu phân tích đa dạng trình tự đoạn gen mã hóa

Azurin của P aeruginosa trong hệ vi sinh vật đường ruột người Việt Nam bằng cách

tiếp cận phụ thuộc và độc lập nuôi cấy, làm cơ sở thiết lập quy trình sàng lọc các đoạn peptide tương tự Azurin để tìm kiếm các loại thuốc kháng ung thư mới từ vi sinh vật đường ruột

Azurin gây độc và cảm ứng quá trình chết tế bào theo chương trình, nhưng không

tác động đối với tế bào bình thường (Punj và cs, 2004; Yamada và cs, 2004, 2002) Azurin có thể tương tác trực tiếp và làm ổn định cấu trúc protein p53 (Punj và cs,

2003) Vùng chức năng chịu trách nhiệm đối với quá trình xâm nhập vào tế bào ung

thư của azurin nằm từ vị trí axit amin từ 50–77 (được gọi là vùng p28) (Hình 1.1)

Vùng này có cấu trúc xoắn alpha và lưỡng tính Quá trình xâm nhập vào tế bào của azurin không kèm theo phá vỡ màng tế bào và dẫn tới làm tan bào Một thử nghiệm cận lâm sàng nhằm đánh giá các thông số dược động học, trao đổi chất và độc tính của azurin-p28 (đoạn peptit tổng hợp dài 28 aa có nguồn gốc azurin) tiến hành trên linh trưởng và chuột đã chứng minh peptit này không độc và không cảm ứng đáp ứng miễn

dịch (Jia và cs, 2011) Hơn thế nữa, gần đây tương tác protein-protein giữa azurin và

p53 đã được phân tích bằng công cụ tin sinh học và kính hiển vi lực nguyên tử

(Grandis và cs, 2007; Taranta và cs, 2008, 2009)

Axit amin

Hình 1.1 Cấu trúc của Azurin

Đoạn peptit tổng hợp dài 28 axit amin (p28) với hoạt tính kháng ung thư và xâm nhập đặc hiệu các tế bào ung thư đã được kiểm tra độc tính trên các động vật trong đó

có khỉ Độc tính và đáp ứng miễn dịch không được ghi nhận Tương tự Azurin, bằng các kích thích động học phân tử và sử dụng kính hiển vi lực nguyên tử, peptit p28 được ghi nhận có khả năng tương tự liên kết với protein p53 cũng như ức chế sự hình

P18

Xâm nhập và ức chế sự nhân lên của tế bào ung thư

1

P28

128

77

thành mạch máu mới, và các đặc tính ức chế khối u khác Vì vậy, peptit p28 đã được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I trên người bởi công ty CDG Therapeutics Inc, Mỹ Mười lăm bệnh nhân ung thư di căn giai đoạn IV đã kháng thuốc với tuổi thọ dự tính không quá 6 tháng thử nghiệm (trong đó có 7 bệnh nhân ung thư da, 4 bệnh nhân ung thư trực tràng, 2 bệnh nhân ung thư mô mềm sarcoma, 1 bệnh nhân ung thư tuyến tụy

và 1 bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt) Độc tính và đáp ứng miễn dịch đã không được ghi nhận ở tất cả các bệnh nhân Kết quả thử nghiệm p28 cho thấy ung thư đã suy giảm một phần ở hai bệnh nhân trong khi ở hai bệnh nhân khác ung thư hoàn toàn suy giảm

chứng tỏ cơ chế tác động hiệu quả của p28 (Yamada và cs, 2011)

Các nghiên cứu còn chứng minh Azurin có khả năng gắn với nhiều đích khác nhau ở trong và ngoài tế bào của động vật có vú Ngoài khả năng gắn với protein p53, Azurin cũng tác động đến quá trình phân chia tế bào thông qua EphB2 tyrosine kinase

(Chaudhari và cs, 2007) Bên cạnh đó, sự ưu tiên xâm nhập của Azurin và quá trình ức

chế phosphoryl hóa VEGFR-2, FAK và Akt dẫn đến ức chế sự hình thành mạch, vì vậy ức chế sự phát triển của khối u Khả năng liên kết của Azurin với các thụ thể ephrin cho phép tạo ra một peptit dung hợp với nicotinamide có hiệu quả cao hơn gấp

13 lần (Micewicz và cs, 2011)

Điều thú vị là hiệu quả của Azurin với hoạt tính kháng ung thư của vi khuẩn đã

được chứng minh thông qua chủng E coli Nissle 1917 (EcN) biểu hiện Azurin, làm

giảm 40% lượng các hạch di căn sau 30 ngày điều trị so với nhóm đối chứng Các kỹ thuật gần đây cho phép thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư của các loại thuốc có nguồn gốc từ vi khuẩn theo các cách mới như dưới dạng các phân tử vàng nano, các hạt từ nano, axit folic, sợi cacbon nhằm tăng cường hiệu quả của chúng (Keyhanian và

cs, 2010) Như vậy, các sản phẩm này có thể được đóng gói trong các tế bào vi khuẩn,

một phương tiện vận chuyển thuốc hiệu quả đến các tế bào ung thư

1.4.2 Các bacteriocin có hoạt tính kháng ung thư khác

Hệ vi sinh vật đường ruột người rất đa dạng gồm 1014vi khuẩn, gồm các nhóm chính như: Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium, Bifidobacterium, Enterococci…Chúng tiết rất nhiều bacteriocin, trong đó azurin không phải là

bacteriocin kháng ung thư duy nhất do các vi sinh vật của khu hệ vi sinh người tiết ra Đặc tính kháng ung thư của dịch bacteriocin thô đã được phát hiện từ những năm

1970 Ngày nay, nhiều bacteriocin tinh sạch thể hiện hoạt tính ức chế đối với nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau đã được phát hiện, bao gồm pyocin, colicin, pediocin

và microcin (Hetz và cs, 2002; Cornut và cs, 2008)

Nisin là đại diện điển hình lớp Ia của các bacteriocin, là một peptit kháng khuẩn

đa vòng, được cấu tạo từ 34 gốc axit amin do vi khuẩn Lactococcus lactis trong quá

trình lên men lactic tiết ra, là một tác nhân kháng khuẩn tự nhiên không thể tổng hợp nhân tạo, có khả năng kiềm hãm nhiều loại vi khuẩn Gram dương, đã được sử dụng phổ biến trong bảo quản thực phẩm, không độc đối với các động vật và con người Bacteriocin này đã được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cấp phép sử dụng năm 1969 và Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép năm 1988 Nisin còn

là chất kháng ung thư đối với ung thư tế bào vảy ở đầu và cổ (HNSCC) bằng khả năng

cảm ứng quá trình chết theo chương trình, làm ngừng chu trình tế bào, ức chế quá trình tăng sinh tế bào chọn lọc ở tế bào HNSCC so với các tế bào sừng (keratinocyte) (Joo

và cs, 2012) Tương tự, plantaricin A (PlnA) là một bacteriocin có điện tích dương từ chủng Lactobacillus plantarum C11 có khả năng thấm qua màng và có hiệu quả kháng

khuẩn Điều thú vị là PlnA cũng có thể thấm qua màng các tế bào nhân chuẩn với hiệu quả tùy thuộc từng loại tế bào bao gồm cả tế bào ung thư và các tế bào thường khác Kết quả nghiên cứu cơ chế thấm qua màng cho thấy, tương tác tĩnh điện giữa PlnA và các glycoprotein màng đóng vai trò then chốt cho PlnA bắt đầu tương tác với các

phospholipit màng (Sand và cs, 2013)

Bằng cách tiếp cận tin sinh học, toàn bộ hệ gen của vi khuẩn hội sinh ở người là

Lactobacillus salavarius đã được quét để tìm kiếm các bacteriocin giả định Sau đó

các bacteriocin này được tuyển chọn thông qua nghiên cứu mô hình cấu trúc và mô hình phân tử gắn kết (docking) với các protein đích của tế bào ung thư như p53, Rb1

và AR trong đó sử dụng Azurin làm đối chứng Kết quả cho thấy Lsl_0510 có ái lực liên kết mạnh nhất với tất cả 3 thụ thể này của tế bào ung thư, vì vậy có thể là ứng cử

viên tốt cho quá trình phát triển thuốc chống ung thư (Shaikh và cs, 2012)

Tóm lại, cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, cũng như các vi khuẩn gây bệnh

và hội sinh ở người đều có thể sản xuất ra các bacteriocin tương tự các chất kháng sinh, có hoạt tính chống ung thư, điều này mở ra kỷ nguyên mới trong việc phát triển thuốc chữa bệnh góp phần bảo vệ sức khỏe con người Nếu các vi sinh vật gây bệnh và

hội sinh cùng tồn tại lâu dài trong cơ thể người sản xuất ra các protein để bảo vệ môi trường sống của chúng khỏi ung thư và các bệnh gây chết người khác, điều này có nghĩa là chúng ta có thể tìm ra các chất chống ung thư mới từ khu hệ vi sinh của người Việc phát hiện các loại thuốc như vậy chỉ mới được bắt đầu

1.5 Tình hình nghiên cứu tuyển chọn các bacteriocin có tiềm năng kháng ung thư

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Ung thư là bệnh liên quan tới các con đường truyền tín hiệu tế bào thông qua Hsp90, PI3 K, AKT, mTOR, ERK protein…; các gen tiền ung thư như Bcl-2 hay Ras; các yếu tố kìm hãm ung thư như p53 hay PTEN Ung thư còn liên quan đến các yếu tố thúc đẩy sinh trưởng như VEGF, PDGF và các thụ thể của chúng Sự thay đổi thông qua các con đường tín hiệu cuối cùng dẫn đến thay đổi trong biểu hiện protein và các quá trình sinh lý cần thiết cho sinh trưởng và sự sống của tế bào (Chakrabarty, 2014).Gần đây, mô hình điều trị ung thư sử dụng các vi khuẩn sống và sản phẩm tinh sạch từ chúng được quan tâm trở lại Vào cuối những năm 1890, sự kiện William B Coley - người đầu tiên ghi nhận sự suy giảm ung thư ở các bệnh nhân được gây nhiễm khuẩn đã dẫn tới phát hiện về hoạt tính kháng ung thư ở vi khuẩn Độc tố sau đó được gọi tên là Coley toxin đã được sử dụng để kháng lại nhiều loại ung thư khác nhau, mặc

dù vậy một số bệnh nhân đã bị nhiễm khuẩn hệ thống và chết (Chakrabarty, 2003) Ngày nay, nhiễm khuẩn hệ thống được loại trừ nhờ sử dụng các vi khuẩn đã được làm suy yếu, do vậy có khả năng xâm nhiễm kém Ngoài ra, người ta có thể sử dụng các sản phẩm chiết xuất từ vi khuẩn có khả năng hướng đích và giết đặc hiệu tế bào ung thư Theo cách này, các sản phẩm chiết xuất từ vi khuẩn có thể được cải biến di truyền

để hướng đích là các thụ thể đặc hiệu trên tế bào ung thư hoặc chỉ xâm nhập các tế bào ung thư mà không tác động lên các tế bào bình thường của cơ thể Các sản phẩm này thường là độc tố vi khuẩn, các protein, peptit và enzyme Cuối cùng, các vi khuẩn đã cải biến có thể được sử dụng để chẩn đoán ung thư nhờ các kỹ thuật phát quang sinh

học, huỳnh quang, cộng hưởng từ và phát xạ positron (Bernardes và cs, 2010)

Độc tố vi khuẩn là một trong những loại độc tố mạnh nhất trong tự nhiên (Pastan

và cs, 2007) Các chiến lược mới trong kỹ thuật gen và protein mở ra khả năng dung

hợp các độc tố này với kháng thể đơn dòng tạo nên các độc tố miễn dịch (immunotoxin) là protein dung hợp có hiệu quả mới với khả năng hướng đích đặc hiệu

các tế bào ung thư (Weldon và Pastan, 2011) Các độc tố vi khuẩn có cấu trúc bao gồm các vùng chức năng: vùng nhận biết cho phép các độc tố tập trung với mật độ cao xung quanh tế bào ung thư, vùng vận chuyển cho phép độc tố xâm nhập vào trong tế bào và vùng gây chết cảm ứng hiệu quả gây độc tế bào Đối với các immunotoxin sử dụng trong liệu pháp chống ung thư, vùng nhận biết tế bào thường được thay thế bằng một phối tử mới gắn kết với các thụ thể đặc hiệu, điều này cho phép độc tố chỉ tác

động lên một số loại tế bào ung thư nhất định (Pastan và cs, 2007; Weldon và Pastan 2011) Ví dụ Exotoxin A từ Pseudomonas aeruginosa và độc tố bạch hầu từ

Corynebacterium diphtheria là những độc tố được sử dụng phổ biến nhất trong liệu

pháp chống ung thư (Lorberboum-Galski 2011) trong khi đó OntakTM là immunotoxin đầu tiên được FDA cấp phép sử dụng trong điều trị ung thư tế bào

từ Staphylococcus aureus, có khả năng ức chế sự di chuyển của tế bào ung thư máu

Jurkat và tế bào ung thư cổ tử cung Hela theo cơ chế cảm ứng biểu hiện CXCl12

(Walenkamp và cs, 2009) SSL5, một protein giống siêu kháng nguyên khác từ S

aureus, có thể ngăn chặn sự dính bám của các tế bào bạch cầu lên các tế bào nội mạc

của thành mạch và các tiểu cầu Sự dính bám của các tế bào khối u vào tế bào nội mạc kích thích sự hình thành mạch máu và di căn, do vậy đóng vai trò quan trọng trong việc kìm hãm sự phát triển của khối u (Walenkamp và cs, 2010) Các trường hợp khác, ActA, protein cảm ứng sự tập hợp actin, đóng vai trò quan trọng trong tiến trình gây bệnh của

L monocytogens, đã được sử dụng sử dụng rộng rãi trong liệu pháp miễn dịch đối với

các đáp ứng miễn dịch trung gian qua tế bào TCD8 (Wood và cs, 2010) Romidepsin, một dipeptit tự nhiên từ Chromobacterium violaceum có hoạt tính ức chếcác histone

deacetylase, enzyme quan trọng trong sự phát triển và lan rộng của khối u, vì vậy là một trong các đích quan trọng đối với bệnh ung thư máu (Vinodhkumar và cs, 2008)

Spiruchostatin B, một peptit có cấu trúc tương tự Romidepsin từ Pseudomonas sp cũng

thể hiện hoạt tính tương tự đối với các tế bào ung thư (Kanno và cs, 2012) Cuối cùng,

Pep27anal2, phân tử có cấu trúc tương tự peptit Pep27, từ Streptococcus pneumoniae

cảm ứng quá trình chết theo chương trình của các tế bào ung thư theo các con đường truyền tín hiệu khác nhau Peptit này sau đó đã được cải biến nhằm làm tăng hoạt tính chống ung thư ở các nồng độ thấp hơn (Lee và cs, 2005 a,b)

Tuy nhiên, hiện nay phương pháp tiếp cận mới là sử dụng protein để làm thuốc theo đường uống Các nghiên cứu đang được thực hiện nhằm tạo ra các phân tử polyme insulin nhỏ, trong đó một đoạn oligomer amphiphilic, thường là polyethylene glycol, được liên kết đồng hóa trị với axit amin đặc biệt trong insulin cho phép nó có thể chống lại sự tiêu hủy bới các axit hoặc enzyme trong dạ dày và ruột nhằm hấp thụ vào máu Các thử nghiệm lâm sàng thử nghiệm uống viên nang insulin (ORMD-0801, 8 mg insulin) đã thể hiện khả năng dung nạp tốt và hiệu quả trong việc giảm đường huyết trong 8 bệnh nhân bị bệnh tiểu đường (Eldor và cs, 2013) Kích thước azurin (14 kDa) mặc dù hơi lớn hơn insulin (5,7 kDa), nhưng nó có thể sử dụng để phát triển một loạt uống azurin (hoặc P28 một nửa kích thước của insulin) để điều trị và ngăn cản sự phát bệnh ung thư

Điều thú vị là Azurin không chỉ có hoạt tính chống ung thư mà còn ức chế sự

xâm nhiễm của virus HIV-1, ký sinh trùng sốt sét Plasmodium falciparum (Chaudhari

và cs, 2006) và ký sinh trùng Toxoplasma gondii (Naguleswaran và cs, 2008, Fialho và Chakrabarty 2010) Vì vậy Azurin được cho rằng là vũ khí của P aeruginosa sử dụng

để xâm nhập cơ thể người và cư trú lâu dài mà không gây hại hay gây ra bất cứ độc tính nào đối với tế bào vật chủ (Fialho và Chakrabarty, 2010) Như vậy Azurin có thể

đặc hiệu cho các khối u trong các cơ quan có P aeruginosa xâm nhiễm

Bên cạnh đó, Neisseria meningitides sản xuất một protein giống azurin được đặt tên là Laz gồm 127 gốc axit amin (Azurin của P aeruginosa dài 128 axit amin) có mức độ tương đồng 56% so với Azurin của P aeruginosa Tuy nhiên, Laz được gắn thêm 39 axit amin ở đầu N, đoạn này được gọi là epitope H8 (Hong và cs, 2006) Điều

ngạc nhiên là trong khi Azurin có khả năng xâm nhập hiệu quả tế bào ung thư vú MCF-7, phân từ này lại không có khả năng xâm nhập các tế bào ung thư thần kinh đệm LN-229 Ngược lại, H8-azurin đi qua hàng rào máu não và xâm nhập hiệu quả các

tế bào thần kinh đệm Điều này cho thấy N meningitides đã trang bị Azurin như một

vũ khí chống ung thư cùng với “áo giáp” epitope H8 đóng vai trò hỗ trợ Azurin vượt

qua các hàng rào và xâm nhập vào các tế bào u thần kinh đệm để giết chúng (Chakrabarty 2014) (Hình 1.2)

Bảng 1.1 Một số peptit điều trị bệnh hiện có sẵn trên thị trường

(Chakrabarty và cs, 2014) Tên gọi chung và

tên thương mại

Hiện nay, một số bằng phát minh của Mỹ đã được cấp cho việc sử dụng Azurin

và Laz để chống ung thư (Fialho và cs, 2012), trong đó azurin đã thể hiện hoạt tính

mạnh cũng như khả năng tăng cường hoạt tính của các loại thuốc chống ung thư khác như ung thư tế bào vảy trong khoang miệng (Choi và cs, 2011)

Hầu hết các peptit điều trị được cho nhiều bệnh khác nhau như bệnh tiểu đường, thiếu máu, vv, chỉ một vài peptit như Carfilzomib được chỉ định điều trị cho các bệnh

về ung thư máu chẳng hạn như đa u tủy (Bảng1.1.) Các peptit, tùy thuộc vào kích

thước hoặc tính chất của chúng, có thể được uống bằng đường miệng hoặc tiêm dưới

da hoặc hít để điều trị ung thư Mặc dù số lượng ít nhưng liệu pháp sử dụng peptit có tiềm năng thú vị trong điều trị ung thư

Hình 1.2 Cấu trúc và hoạt tính kháng ung thư của Azurin (Chakrabarty 2014)

(Cột bên trái: Cấu trúc dự đoán của azurin, Laz và azurin dung hợp với epitope H8 nằm ở đầu N Vùng tương ứng với đoạn peptit p28 được đánh dấu Cột ở giữa: Vị

trí của azurin, Laz và H8 azurin được đánh dấu huỳnh quang trong tế bào ung thư vú MCF-7 và u bào thần kinh đệm LN-229 Màu đỏ là protein dung hợp bắt màu nhuộm

của Alexa fluor 568, phần màu xanh là nhân tế bào được nhuộm bằng DAPI Cột bên

phải: Hiệu quả gây độc của azurin, H8-azurin và Laz ở các nồng độ khác nhau đối với

tế bào LN-229 (Chakrabarty, 2014))

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam gần đây đã có những sàng lọc các chất chống ung thư từ các nguồn khác nhau Các chất có hoạt tính kháng ung thư từ thực vật như arabinoxylan cám gạo

MGN-3 (Bang và cs, 2010), dịch chiết ethanol của cây Selaginella tamariscina (Le và

cs, 2012), cleistanthane diterpene từ hạt cây Caesalpinia sappan (Nguyen và cs, 2013)

và geranyl dihydrochalcone từ cây Artocarpus altilis (Nguyen và cs, 2014); Các hoạt

Phương pháp phân tích quá trình xâm nhập tế bào

Phương pháp phân tích độc

tố tế bào

chất từ tảo như fucoidan từ tảo nâu Sargassum mcclurei (Thinh và cs, 2013); Các hoạt chất từ động vật như các steroid của bọt biển Ianthella sp (Nguyen và cs, 2009) và sao biển Astropecten polyacanthus (Thao và cs, 2013) Bên cạnh đó, người ta cũng tổng

hợp hóa học và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các chất ức chế histone deacetylase mới (Nam và cs, 2013) và các dendrimer (polymer với kích thước nano) (Ly và cs, 2013) Tuy vậy, cho đến nay những nghiên cứu về các thuốc điều trị ung thư từ vi khuẩn và các sản phẩm của chúng như peptit và bacteriocin là rất hạn chế ở Việt Nam

Hiện có một vài nghiên cứu cơ bản hoặc ứng dụng về bacteriocin từ vi khuẩn lactic tại Việt Nam Điển hình như các nhà nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội đã khảo sát đa dạng sinh học, khả năng sinh bacteriocin và tính chất probiotic của hệ vi khuẩn lactic trong đường tiêu hóa động vật (Đề tài Khoa học cơ bản 2004-2005, Mã số: 62 05 04) Nhóm tác giả ở Đại học Quốc gia Hà Nội đã nghiên

cứu và phát hiện khả năng sinh bacteriocin II của chủng vi khuẩn Lactobacillus

plantarum L24 (Nguyễn Thị Hoài Hà và cs, 2002) Trong nghiên cứu này, bacteriocin

được tinh sạch bằng sắc kí lọc gel và phân tách bằng điện di trên gel SDS - PAGE với trọng lượng phân tử vào khoảng 10-30 kDa Tại Viện Sinh học nhiệt đới, Thành phố

Hồ Chí Minh, một báo cáo khoa học cho thấy vi khuẩn L acidophilus sản xuất bacteriocin có khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm như E coli,

Salmonella và một số vi khuẩn lactic khác (Lê Thị Hồng Tuyết và cs, 2004)

Bacteriocin này nhạy cảm với protease nhưng lại ổn định với các dung môi hữu cơ, pH

và nhiệt độ Ngoài ra, một nhóm nghiên cứu ở Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí

Minh đã thu nhận bacteriocin bằng phương pháp lên men Lactococcus lactic cố định

trên chất mang là cellulose của vi khuẩn nhằm ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ

chế (Nguyễn Thúy Hương và cs, 2008) Gần đây, gen minD mã hóa cho một protein tương tự MinD (chất ức chế phân chia tế bào) ở Lactobacillus acidophilus VTCC-B-

871 đã được chứng minh có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của tế bào chủ Điều này mở ra những ứng dụng hữu ích trong lĩnh vực kháng sinh và dẫn truyền thuốc trong hóa trị liệu ung thư (Nguyen và cs, 2013)

So sánh với những nghiên cứu về bacteriocin trên thế giới, những nghiên cứu ở Việt Nam chủ yếu tập trung vào bacteriocin từ vi khuẩn lactic nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Bởi vì Việt Nam là đất nước có tiềm năng đa dạng sinh học lớn, do đó cơ hội phát hiện các loại bacteriocin mới đa dạng về tính chất và nguồn gốc cũng rất lớn Tuy nhiên, hiện chưa có thông báo nào ở trong nước về việc tìm kiếm các bacteriocin có hoạt tính kháng ung thư từ hệ vi sinh vật người Mặc dù bacteriocin đã được tìm thấy ở nhiều nhóm vi khuẩn nhưng tiềm năng phát hiện bacteriocin mới có tính chất mới và nguồn gốc mới vẫn còn rất lớn Các bacteriocin hiện có chủ yếu là từ vi khuẩn lactic trong thực phẩm lên men và colicin từ vi khuẩn Escherichia coli Còn rất ít nghiên cứu về bacteriocin không phải colicin có nguồn gốc từ ruột, cũng như các bacteriocin

có hoạt tính kháng tế bào sinh vật nhân chuẩn và tế bào người Chính vì vậy việc thực

hiện đề tài này là có tính cấp thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đề tài tiến hành nghiên cứu đoạn gen mã hóa Azurin khu hệ vi sinh vật đường

ruột (mẫu phân) của người Việt Nam có tiềm năng tương tự azurin của các chủng vi khuẩn đường ruột Các mẫu phân được thu thập từ những người tình nguyện trong tỉnh Khánh Hòa thuộc 3 nhóm lứa tuổi khác nhau (người già, trẻ em, thanh niên) Chúng tôi ưu tiên chọn những người có sức khỏe tốt, không mắc bệnh đường ruột, không sử dụng kháng sinh trong vòng ít nhất 3 tháng trước đó Thông tin mẫu được thể hiện trong Bảng 2.1 sau:

Bảng 2.1 Thông tin 23 mẫu phân

không sử dụng trong vòng 15 tháng

Vĩnh Thọ, Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 5 tháng

Vĩnh Thọ, Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 3 tháng

Phước, Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 3 tháng

Vĩnh Thọ, Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 3 tháng

Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 4 tháng

Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 15 tháng

Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 8 tháng

Vĩnh Thọ, Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 4 tháng

Vĩnh Phước, Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 14 tháng

11 K13 62 Nữ Tổ 22 Hòn Nghê, Vĩnh

Ngọc, Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 3 tháng

thường

không sử dụng trong vòng 3 tháng

Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 3 tháng

Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 3 tháng

Ngọc, Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 3 tháng

Ngọc, Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 3 tháng

Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 3 tháng

Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 3 tháng

Ngọc, Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 3 tháng

Lập, Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 3 tháng

Lập, Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 3 tháng

Nguyên, Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 8 tháng

Nguyên, Nha Trang

Bình thường

không sử dụng trong vòng 6 tháng

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ 03/2015 đến 10/2015 tai phòng thí nghiệm Vi sinh và Sinh học phân tử, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Đại học Nha Trang

- Đệm rửa Wash Buffer I

- Đệm rửa Wash Buffer II

- Đệm Elution (10 mM Tris-Cl, pH 9.0, 0.5 mM EDTA)

- Cột GeneJET Genomic DNA Purification

 Bộ kít thôi gel "QIAquick® Gel Extraction" Qiagen, Mỹ

- Các cặp mồi được thiết kế sử dụng phần mềm thiết kế mồi PRIMER 3

- Trình tự các cặp mồi Azu 441F/R và Azu 677F/R (IDT, Mỹ) (Bảng 2.1.)

- Enzym My Taq (Bioline, Anh)

- Nước loại nuclease

Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi Azu 441F/R và Azu 677F/R

Tm (nhiệt

độ bắt cặp)

Sản phẩm

dự kiến (bp)

 Hóa chất cho điện di

- Agarose, Biobasic, Canada

- Thang DNA chuẩn 1 Kb (Fermentas, Mỹ)

- Thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas, Mỹ)

2.2.3 Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng

- Máy PCR DNA Engine (Biorad, Mỹ)

- Bộ điện di (Biorad, Mỹ)

- Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)

- Cân phân tích BL 3200H (Shimadzu, Nhật)

- Tủ âm sâu DF 9007 (Labkorea, Hàn Quốc)

- Tủ cấy (Telstar AV 100, Tây Ban Nha)

- Tủ sấy ED115 (Binder, Đức)

- Nồi hấp khử trùng (Sturdy industrial Co., Ltd, Đài Loan)

- Lò vi sóng (LG, Hàn Quốc)

- Máy vortex Maxi mix II M37615 (Thermolyne, Mỹ)

- Máy ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ)

- Tủ ấm Binder BF115 (Binder, Đức)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Cách tiếp cận tổng quát của đề tài được trình bày trên Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 2.3.1.Thu mẫu phân

Để nghiên cứu khu hệ vi sinh đường ruột của người, đề tài đã tiến hành thu 23 mẫu phân, từ những người tình nguyện trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa Các mẫu này được ký hiệu từ K3- K25 Quy trình lấy mẫu được trình bày chi tiết trong Phụ lục 1 Ngoài ra

Giải trình tự gen

Thôi

gel

Phân tích trình tự, xây dựng cây phát sinh chủng loại

Điện

di kiểm tra

Tách chiết DNA đa hệ gen

những người tham gia lấy mẫu cũng được khảo sát qua phiếu thông tin lấy mẫu được trình bày chi tiết trong Phụ lục 2 Hồ sơ này được lưu giữ tại phòng thí nghiệm

2.3.2 Phân lập chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

Quy trình phân lập được thực hiện theo các bước sau:

 Đồng nhất mẫu

 Tăng sinh qua đêm

 Cấy trên đĩa thạch

 Giữ chủng

Các mẫu được thu trong các dụng cụ vô trùng, sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm trong đá lạnh và bảo quản ngay sau đó ở -80°C trong các ống, mỗi ống chứa khoảng 20 g mẫu cho đến khi sử dụng

Lấy 10 g mẫu cho vào ống falcon có chứa 50 ml BPW Vortex mẫu cho đồng nhất Ủ ở 37oC trong 24 giờ Cấy 1 ml dịch tăng sinh vào đĩa petri, sau đó rót môi trường LAB108 có bổ sung X107 vào và lắc đều Đợi môi trường trong đĩa petri đông lại, sau đó úp ngược các đĩa petri đã được cấy mẫu vào tủ ấm 37oC Sau 48 h đọc kết quả Mỗi thí nghiệm ít nhất lặp lại 2 đĩa petri cho mỗi mẫu phân tích

2.3.3 Bảo quản chủng

Có nhiều phương pháp bảo quản vi khuẩn khác nhau như cấy truyền định kỳ lên môi trường mới, phương pháp cấy trên thạch nghiêng, phương pháp lạnh đông, phương pháp đông khô, phương pháp bảo quản bằng nitơ lỏng…Tuy nhiên trên thực tế không có một phương pháp bảo quản nào là vạn năng dùng chung cho các nhóm vi sinh vật mà mỗi nhóm vi sinh vật chỉ thích hợp với một hoặc một vài phương pháp bảo quản nhất định Tùy theo mục đích sử dụng, loại vi sinh vật cần bảo quản, thời gian bảo quản và điều kiện kinh tế, cơ sở vật chất mà ta lựa chọn phương pháp bảo quản thích hợp nhất

Ở đây chúng tôi sử dụng phương pháp bảo quản lạnh sâu ở nhiệt độ -80oC Với phương pháp này tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu do việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước đá trong tế bào Vì thế, để khắc phục nhược điểm này người ta thường bổ sung các chất

làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide) Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng glycerol bổ sung vào sao cho dịch đem đi bảo quản có nồng độ cuối glycerol là 30%

- Cách tiến hành:

Dịch vi khuẩn được nuôi trong môi trường LAB108 có b ổ sung thêm X107, lắc 180 vòng/phút, sau đó tiến hành bảo quản vi khuẩn Dùng pipet hút 300 µl glycerol cho vào eppendorf 1,5 ml vô trùng sau đó hút 700 µl dịch vi khuẩn trên cho vào eppendorf trên, trộn đều Ghi tên chủng, môi trường nuôi cấy, ngày, tháng tiến hành bảo quản lên trên eppendorf sau đó cho vào trong túi đem bảo quản trong tủ lạnh -

80oC Chú ý đầu tube, eppendorf, glycerol phải được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút để tránh tạp nhiễm

2.3.4 Tách chiết DNA

2.3.4.1 Tách chiết DNA đa hệ gen

DNA đa hệ gen được tách chiết nhờ sử dụng bộ kit QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen, Mỹ) Các bước tiến hành tách chiết DNA với bộ kit QIAamp DNA Stool Mini như sau:

- Dùng đầu tip 200 µl vô trùng lấy 180 – 220 mg mẫu cho vào ống eppendorf 2

ml, đặt ống mẫu trên khay đá

- Bổ sung 1,4 ml đệm phá tế bào ASL vào mỗi ống Vortex trong 1 phút hoặc hơn cho đến khi mẫu đồng nhất hoàn toàn

- Ủ trên block nhiệt ở 70oC trong 5 phút

- Vortex trong 15 giây, sau đó ly tâm ở 13000 vòng trong 1 phút ở nhiệt độ phòng (25oC)

- Hút 1,2 ml dịch nổi chuyển sang một ống eppendorf 2 ml mới, loại bỏ cặn

- Bổ sung 1 viên InhibitEX vào mỗi ống mẫu và vortex ngay trong 1 phút hoặc hơn cho đến khi viên thuốc tan hoàn toàn Để mẫu ở nhiệt độ phòng trong 1 phút để các chất ức chế bị hấp phụ hết vào InhibitEX

- Ly tâm ở 13000 vòng trong 3 phút ở nhiệt độ phòng (25oC)

- Hút toàn bộ dịch nổi sang một ống eppendorf 2 ml mới, loại bỏ phần cặn Ly tâm tiếp ở 13000 vòng trong 3 phút ở nhiệt độ phòng (25oC)

- Chuẩn bị một ống eppendorf 2 ml mới, bổ sung vào 15 µl proteinase K

- Hút 200 µl dịch nổi từ bước trên cho vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa proteinase K ở bước trên, trộn đều

- Thêm 200 µl đệm AL và vortex nhẹ trong 15 giây

- Ủ ống ở 70oC trong 10 phút

- Ly tâm nhẹ (spin down) 10 giây, rồi bổ sung 200 µl ethanol 96% và trộn đều bằng máy vortex

- Chuyển toàn bộ dịch sang cột QIAamp chuẩn bị sẵn được đặt trên 1 ống hứng

- Đậy nắp cột, ghi tên mẫu, ly tâm ở 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC

- Chuyển cột sang một ống hứng mới, loại bỏ phần dịch vừa ly tâm

- Rửa cột bằng 500 µl đệm rửa AW1 Đậy nắp cột và ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC

- Tiếp tục rửa cột bằng 500 µl đệm rửa AW2 Đậy nắp cột và ly tâm 12000 vòng trong 3 phút ở 4oC

- Chuyển cột sang một ống eppendorf 1,5 ml mới, ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC để loại bỏ hoàn toàn đệm AW2

- Chuyển cột sang một ống eppendorf 1,5 ml mới, để ở nhiệt độ phòng 1 phút cho bay hết hơi cồn

- Bổ sung 100 µl đệm AE, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC để thôi DNA

- Bảo quản mẫu DNA ở -20oC

- DNA tổng số sau khi tách chiết sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose trong đệm TBE 1X dưới nguồn điện 110V để đọc kết quả DNA được tách chiết thành công sẽ được đem bảo quản để sử dụng cho các phản ứng PCR tiếp theo

2.3.4.2 Tách chiết DNA hệ gen từ chủng vi khuẩn đã phân lập Pseudomonas aeruginosa

 DNA hệ gen từ chủng vi khuẩn đã phân lập P aeruginosa được tách chiết bằng

bộ kit GeneJET Genomic DNA Purification (Thermo, Mỹ) Các bước tiến hành tách chiết DNA với bộ kit GeneJET Genomic DNA Purification như sau:

- Cho khoảng 2.109 tế bào vi khuẩn vào cho vào ống eppendorf 2 ml, ly tâm

13000 vòng trong 1 phút ở Loại bỏ phần dịch nổi

- Bổ sung 180 μl đệm phá tế bào Digestion Solution, sau đó bổ sung thêm 20 μl dung dịch Proteinase K Trộn đều bằng cách vortex hoặc hút nhả mẫu bằng pipet, cho đến khi mẫu đồng nhất hoàn toàn

- Ủ mẫu ở 56oC trong 30 phút

- Bổ sung thêm 20 μl dung dịch Rnase A, trộn đều mẫu bằng cách vortex Ủ mẫu

ở nhiệt độ phòng trong 10 phút

- Bổ sung thêm 200 μl đệm Lysis Solution, vortex trong 15 giây

- Bổ sung thêm 400 μl ethanol 50%, vortex trong 10 giây

- Chuyển mẫu lên cột Gen JET Genomic DNA Purification, phía dưới có gắn ống eppendorf 2 ml Ly tâm ở 13.000 trong 1 phút ở 4oC Chuyển cột sang một ống eppendorf 2 ml mới

- Bổ sung thêm 500 μl đệm rửa Wash Buffer I (đã bổ sung ethanol) Ly tâm

13000 vòng trong 1 phút ở 4 oC Chuyển cột sang một ống eppendorf 2 ml mới

- Bổ sung thêm 500 μl đệm rửa Wash Buffer II (đã bổ sung ethanol) vào cột Gen JET Genomic DNA Purification Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút ở 4oC

- Ly tâm 13000 vòng trong 1 phút ở 4oC để loại bỏ hoàn toàn đệm Wash Buffer

II Chuyển cột sang một ống eppendorf 2 ml mới

- Bổ sung 100 μl đệm Elution Buffer vào cột Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 2 phút và ly tâm 10000 trong 1 phút ở 4oC

- Loại bỏ cột, giữ lại phần dịch chứa DNA tinh sạch

- Bảo quản mẫu DNA ở -200C

2.3.5 Khuếch đại gen bằng PCR

 Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ được tăng lên 94 – 96°C, làm phá vỡ các liên kết

hydrogen để tách hai sợi DNA ra

 Giai đoạn gắn mồi: Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống

nhiệt độ bắp cặp của mồi, vào khoảng 45 – 60oC, để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn

 Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được tăng lên 72oC, enzyme DNA polymerase hoạt động, nối dài mồi để hình thành mạch mới

 Các thành phần và ảnh hưởng của chúng tới hiệu quả của phản ứng PCR

 Khuôn DNA

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch Nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận được trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có xu hướng giảm (1 µg xuống còn 100 ng) với việc sử dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao

 Mồi

Mồi (primer) là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí nghiệm PCR Để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao thì mồi sử dụng phải có tính đặc hiệu cho đoạn DNA khuếch đại và phải tuân thủ theo những nguyên tắc về sự bắt cặp giữa các mồi, cấu trúc kẹp tóc, nhiệt độ biến tính, nồng độ mồi,…

 Nhiệt độ bắt cặp của mồi

Nhiệt độ bắt cặp của mồi thích hợp là nhiệt độ sao cho ở đó đó 1/2 số primer sẽ gắn với DNA khuôn mẫu Công thức dưới đây ứng dụng trong trường hợp primer có

khoảng 20 oligonucleotide: