Nghiên cứu xây dựng quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm men yarrowia lipolytica

Chúng có khả năng sử dụng chất béo để sinh trưởng và sản sinh các hợp chất có giá trị như axit hữu cơ, chất hoạt động bề mặt, enzyme, chất thơm, lipid đơn bào, protein đơn bào… Trong đó,

vbbvb BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VÕ THỊ MỸ THU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH BAO GÓI

CAROTENOID SỬ DỤNG TẾ BÀO NẤM MEN YARROWIA

LIPOLYTICA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VÕ THỊ MỸ THU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH BAO GÓI

CAROTENOID SỬ DỤNG TẾ BÀO NẤM MEN YARROWIA

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình

bao gói Carotenoid sử dụng tế bào nấm men Yarrowia Lipolytica” là công trình

nghiên cứu của cá nhân tôi và chƣa từng đƣợc công bố trong bất cứ công trình khoa học khác cho tới thời điểm này

Nha Trang, Ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Võ Thị Mỹ Thu

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của quý phòng ban trường Đại học Nha Trang, đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được hoàn

thành đề tài Đặc biệt là sự hướng dẫn tận tình của TS.Tạ Thị Minh Ngọc đã giúp đỡ

tôi hoàn thành tốt đề tài Qua đây, tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ của cô

Xin cám ơn quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm và các cán bộ - Trung tâm thí nghiệm thực hành Trường Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian qua Xin cám ơn các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng

Cuối cùng tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Võ Thị Mỹ Thu

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC KÝ HIỆU viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH xi

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xiii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 5

1.1 Giới thiệu về nấm men ưa béo Yarrowia lipolytica 5

1.1.1 Nguồn gốc 5

1.1.2 Đặc tính sinh lý 5

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của Y lipolytica 7

1.1.4 Ứng dụng 12

1.2 Chất kị nước và tế bào nấm men 14

1.3 Carotenoid 16

1.3.1 Phân loại 17

1.3.2 Chức năng sinh học của carotenoid 22

1.4 Bao gói BC bằng tế bào nấm men Y lipolytica 23

1.4.1 Sự tương đồng giữa cấu trúc tế bào nấm men và bao vi nang 27

1.4.2 Ưu điểm của việc bao gói vi nang bằng tế bào nấm men 27

1.4.3 Cơ chế của quá trình bao gói 28

1.4.4 Điều kiện giải phóng BC ra khỏi tế bào 29

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.2 Môi trường nuôi cấy nấm men 31

2.3 Hóa chất và thiết bị sử dụng 31

2.3.1 Hóa chất 31

2 3.2 Thiết bị sử dụng 32

2.4 Phương pháp nghiên cứu 32

2.4.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS 32

2.4.2 Phương pháp nuôi cấy nấm men 33

2.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng BC thấm qua màng tế bào 33

2.4.4 Phương pháp đếm tỷ lệ sống chết của tế bào nấm men 35

2.4.4.1 Phương pháp nhuộm xanh methylene 35

2.4.4.2 Phương pháp đếm tế bào sống chết bằng buồng đếm hồng cầu 35

2.4.4.3 Phương pháp đếm khuẩn lạc 36

2.4.5 Phương pháp xác định tính kỵ nước và tính acid/base của bề mặt tế bào nấm men 37

2.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm 38

2.5.1 Xây dựng quy trình bao gói hợp chất carotenoid sử dụng tế bào nấm men được thể hiện thông qua sơ đồ 38

2.5.2 Xác định tỉ lệ nồng độ BC đối với tế bào nấm men 39

2.5.3 Xác định nhiệt độ tiếp xúc của BC với tế bào nấm men 40

2.5.4 Xác định điều kiện tiếp xúc 42

2.5.5 Xác định thời gian tiếp xúc giữa BC với tế bào nấm men 44

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 45

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 Xác định nồng độ BC thích hợp cho quá trình tiếp xúc tế bào nấm men 46

3.2 Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình tiếp xúc giữa BC với tế bào 47

3.4 Xác định thời gian tiếp xúc giữa BC với tế bào 51

3.5 Đánh giá tính chất bề mặt của tế bào nấm men Y lipolytica 56

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 59

4.1 Kết luận 59

4.2 Kiến nghị 59

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC

PHẦN THỦ TỤC

A0 : Độ hấp thụ tại bước sóng 600 nm của tế bào trước khi trộn với dung môi

A : Độ hấp thụ đo tại bước sóng 600 nm của tế bào sau khi trộn với dung môi

PFC perfluorocarbon

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Nguồn C được vi sinh vật sử dụng 9

Bảng 1.2 Nguồn N được vi sinh vật sử dụng 10

Bảng 1.3 Nồng độ carotenoid trong một số thực phẩm 17

Bảng 1.4 Một số bước sóng của caroten khi chiết trong các dung môi khác nhau 21

Bảng 1.5 Một số nguyên liệu thích hợp để chế tạo vi nang 25

Bảng 2.1 Thành phần môi trường (g/L) 31

Bảng 3.1 Số khuẩn lạc của tế bào nấm men 0544 và W29 trên đĩa thạch (CFU/ml) 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tế bào nấm men Y lipolytica 5

Hình 1.2 Hình thái khuẩn lạc của Y lipolytica W29 trên môi trường YPDA ở 27°C 6

Hình 1.3 Hình thái tế bào Y lipolytica W29 trên YPDA ở 27 °C 6

Hình 1.4 Hình thái khuẩn lạc Y lipolytica 0544 trên môi trường YPDA ở 27 °C 6

Hình 1.5 Hình thái tế bào Y lipolytica 0544 trên môi trường YPDA ở 27 °C 6

Hình 1.6 Sơ đồ phân loại carotenoid 18

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của β-caroten 18

Hình 1.8 Công thức cấu tạo của  -caroten 19

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của Lutein và zeaxanthin 20

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của astaxanthin 20

Hình 1.11 Sơ đồ quy trình tạo vi nang BC bằng tế bào nấm men 27

Hình 1.12 Cấu trúc tế bào nấm men và bao vi nang 27

Hình 1.13 Sự vận chuyển hợp chất kỵ nước qua màng tế bào 29

Hình 1.14 Sự giải phóng hoạt chất khỏi màng tế bào 30

Hình 2.1 Sơ đồ xác định hàm lượng BC thấm qua màng tế bào bằng phương pháp UV-VIS 34

Hình 2.2 Trình tự pha loãng mẫu theo dãy thập phân 36

Hình 2.3 Quy trình bao gói hợp chất carotenoid sử dụng tế bào nấm men 39

Hình 2.4 Sơ đồ lựa chọn nồng độ carotene/dầu ăn thích hợp 40

Hình 2.5 Sơ đồ lựa chọn nhiệt độ tiếp xúc thích hợp giữa BC với nấm men 41

Hình 2.6 Sơ đồ lựa chọn điều kiện tiếp xúc thích hợp giữa BC với nấm men 43

Hình 2.7 Sơ đồ lựa chọn thời gian tiếp xúc thích hợp giữa BC với nấm men 44

Hình 3.1 Nồng độ BC đối với tế bào nấm men 0544 và W29 sau khi tiếp xúc 16 h 46

Hình 3.2 Hàm lượng BC (µg/g) thấm qua màng tế bào nấm men sau khi tiếp xúc với nhũ tương dầu ở điều kiện nhiệt độ khác nhau 47

Hình 3.3 Tỉ lệ tế bào còn sống trước khi tiếp xúc và sau khi tiếp xúc với BC tại điều

kiện nhiệt độ khác nhau 48

Hình 3.4 Hàm lượng BC (µg/g) thấm qua màng tế bào nấm men theo hai điều kiện tiếp xúc 50

Hình 3.5 Hàm lượng BC thấm qua màng tế bào theo thời gian 52

Hình 3.6 Phổ hấp thụ BC và dịch chiết từ sinh khối W29 và 0544 sau tiếp xúc 53

Hình 3.7 Tỉ lệ tế bào còn sống trước khi tiếp xúc và sau khi tiếp xúc với BC 54

Hình 3.8 Tính chất bề mặt của tế bào nấm men 56

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Yarrowia lipolytica là chủng nấm men ưa béo điển hình và các nhà nghiên cứu

hiện nay đang quan tâm đến việc chuyển hóa các hợp chất kị nước nhằm sản xuất và bao gói các hợp chất thiên nhiên có giá trị cao như tinh dầu gừng, polyphenol, curcumin, beta-caroten Chúng có khả năng sử dụng chất béo để sinh trưởng và sản sinh các hợp chất có giá trị như axit hữu cơ, chất hoạt động bề mặt, enzyme, chất thơm, lipid đơn bào, protein đơn bào… Trong đó, carotenoid là một trong những hợp chất được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, mỹ phẩm, nhưng có nhược điểm là không tan trong nước, nhạy cảm với nhiệt độ và cần được bảo vệ Những nghiên cứu gần đây về carotenoid như beta-caroten, lycopen, lutein, zeaxanthin, astaxanthin cho thấy các hợp chất này có khả năng chống oxy hóa, tăng cường khả năng miễn dịch, giúp ngăn ngừa đáng kể các bệnh Do đó ngày nay, các hợp chất carotenoid rất được quan tâm nghiên cứu, nhằm mục đích ứng dụng trong sản xuất thuốc chữa bệnh và thực phẩm chức năng

Việc sử dụng màng tế bào nấm men trong công nghệ bao gói vi nang sẽ là bước quan trọng giúp loại bỏ việc sử dụng hóa chất độc hại trong quy trình, đồng thời cũng làm đơn giản hóa quy trình Sử dụng tế bào nấm men làm vật liệu bao gói các hoạt chất theo phương pháp vi sinh là một vấn đề hoàn toàn mới

Do đó, mục tiêu của đề tài nhằm: nghiên cứu xây dựng quy trình bao gói

carotenoid sử dụng tế bào nấm men Y lipolytica, đồng thời nghiên cứu quá trình thẩm

thấu các hợp chất kị nước qua màng tế bào nấm men, ứng dụng để bổ sung vào thực phẩm và nuôi trồng thủy sản, sử dụng màng tế bào nấm men bao gói các hợp chất kị nước

Các tế bào nấm men Y lipolytica chủng W29 và chủng 0544 được nuôi cấy trên

môi trường YPD tại 27°C, tốc độ lắc 150 rpm và cho tiếp xúc với hợp chất kị nước Sau đó, thu sinh khối, đem sinh khối nấm men tiếp xúc với dầu carotene theo các điều kiện khác nhau bao gồm: tỉ lệ nồng độ beta caroten/dầu ăn, thời gian tiếp xúc với nhũ tương dầu beta caroten, nhiệt độ tiếp xúc Bên cạnh đó, tỉ lệ sống chết của tế bào trước

và sau khi tiếp xúc được xác định bằng phương pháp nhuộm xanh methylen Tính chất

bề mặt của tế bào được xác định theo phương pháp test Microbial adhesion to solvents (Test MATS)

Từ đó, đề tài đã rút ra được các điều kiện tốt nhất cho quy trình bao gói

carotenoid sử dụng tế bào nấm men Y lipolytica là: nồng độ BC/dầu ăn sử dụng:

1mg/ml, tiến hành tiếp xúc tế bào nấm men với nhũ tương dầu caroten, nhiệt độ tiếp xúc 27°C và thời gian tiếp xúc là 16 h

tế bào nấm men và các hợp chất kỵ nước (hay khả năng thấm của màng tế bào) với yếu

tố ảnh hưởng như: tỉ lệ nồng độ caroten/dầu ăn khi sử dụng, thời gian tiếp xúc, nhiệt

độ, quá trình tiếp xúc theo điều kiện khác nhau, tính chất tế mặt tế bào Từ đó, góp phần tìm ra được quy trình bao gói hợp chất carotenoid hiệu quả nhất, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất hoặc bao gói các hợp chất kị nước có hoạt tính sinh học Đề tài cũng giúp mở ra một hướng nghiên cứu mới: ứng dụng công nghệ vi nang sinh học trong việc bảo vệ hoạt tính sinh học của các hợp chất thiên nhiên khác, giúp chúng ta chủ động trong quá trình chuyển hóa các hợp chất này nhằm nâng cao hiệu quả quá trình sản xuất và bao gói sản phẩm

Từ khóa: Yarrowia lipolytica, beta-caroten, vi nang sinh học, tính thấm qua màng tế bào nấm men

MỞ ĐẦU

Ngày nay, khi chất lượng cuộc sống của con người ngày càng được nâng cao hơn, nhiều lĩnh vực sản xuất đòi hỏi phải đổi mới về công nghệ để tạo sản phẩm tốt hơn Những yêu cầu đó buộc các nhà khoa học phải không ngừng nghiên cứu, phát triển các sản phẩm có tính năng vượt trội, chất lượng tốt Một trong số những công nghệ đang phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thực phẩm,

mỹ phẩm, dược phẩm đó chính là công nghệ vi nang

Đây là một giải pháp bao gói hữu hiệu giúp chuyển đổi các hợp chất dạng lỏng, khí sang dạng bột đồng thời bảo vệ hoạt tính của các hợp chất này nhờ có màng bao bọc bên ngoài, hạn chế tác động của môi trường như: ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, oxy;

là công cụ giúp bảo vệ các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như enzyme, tế bào (probiotic), chất thơm, chất màu thực phẩm … đồng thời nâng cao giá trị sử dụng của các hợp chất này Phạm vi ứng dụng của công nghệ vi nang trên thế giới hiện nay rất rộng rãi trong các lĩnh vực: thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp tẩy rửa, sản phẩm gia dụng, công nghiệp sơn, in ấn, công nghệ môi trường … Ở Việt Nam, công nghệ này chỉ mới ứng dụng trong dược phẩm, mỹ phẩm, nuôi trồng thủy sản… Với sự phát triển của ngành công nghiệp thực phẩm nói chung và thực phẩm chức năng nói riêng hiện nay cùng với nguồn thực thẩm phong phú ở Việt Nam, việc phát triển công nghệ vi nang trong ngành thực phẩm ở nước ta là rất có triển vọng

Hiện tại, phương pháp sử dụng tế bào nấm men trong công nghệ bao gói vi nang vẫn còn ít được công bố trên thế giới và trong nước Cụ thể, đó là các nghiên cứu về:

- Nghiên cứu của TS.Waché, Agrosup Dijon–France về bao gói bằng tế bào nấm

men Trong đó, nghiên cứu này sử dụng chủng nấm men ưa béo Y lipolytica để bao

gói beta-caroten [39]

- Nghiên cứu của Amaral và cộng sự về tính chất màng tế bào Y lipolytica và sự

tương tác của nó với perfluorocarbon (PFC) [9]

- Nghiên cứu của Aguedo và cộng sự về tính chất bề mặt của Y lipolytica và sự

liên quan của nó đến sự hình thành γ-decalactone từ cơ chất methyl ricinoleate [8]

- Nghiên cứu của Aguedo và cộng sự về quá trình cho và nhận điện tử, ảnh

hưởng của sự bám dính giữa các giọt dầu với tế bào nấm men Y lipolytica được đánh

giá theo phương pháp Cytometric, 2003 [7]

Hầu hết các nghiên cứu trên chỉ dừng lại ở việc đánh giá tính chất bề mặt màng

tế bào nấm men, sự hình thành hợp chất thơm γ-decalactone mà chưa đề ra một quy trình bao gói hợp chất kị nước và việc sử dụng tế bào nấm men trong công nghệ bao gói vi nang theo phương pháp vi sinh

Ngoài ra, carotenoid là một trong những hợp chất được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, mỹ phẩm, nhưng có nhược điểm là không tan trong nước, nhạy cảm với nhiệt độ và cần được bảo vệ Những nghiên cứu gần đây về carotenoid như beta-caroten, lycopen, lutein, zeaxanthin, astaxanthin cho thấy các hợp chất này có khả năng chống oxy hóa, tăng cường khả năng miễn dịch, giúp ngăn ngừa đáng kể các bệnh Do đó, ngày nay, các hợp chất carotenoid rất được quan tâm nghiên cứu, nhằm mục đích ứng dụng trong sản xuất thuốc chữa bệnh và thực phẩm chức năng

B Ozcelik và cộng sự [34] đã nghiên cứu tạo vi nang bằng các kỹ thuật bao gói khác nhau như: sấy phun, đông khô, bẫy alginat để tạo lớp vỏ bao bọc bảo vệ beta carotene bên trong Khi tạo vi nang BC bằng kỹ thuật sấy phun sử dụng chất nhũ hóa

là Tween 80 với vật liệu bao gói là maltodextrin đạt hiệu suất bao gói tốt nhất (81%), sản phẩm vi nang BC tạo thành cũng có khả năng hòa tan trong nước cao nhất đạt 87% Trong khi đó, Trần Hải Đăng và cộng sự [5] đã nghiên cứu công nghệ vi nang để bao gói dầu gấc đạt tiêu chuẩn thực phẩm từ các hệ nhũ tương theo các phương pháp khác nhau: đông tụ và sấy phun Đối với phương pháp sấy phun, vi nang tạo thành có màu vàng cam và tồn tại dưới dạng bột mịn với 86,2% hạt có kích thước < 10 μm, hiệu suất tạo vi nang cao nhất đạt 70,4% Đối với phương pháp đông tụ, vi nang tạo thành

có dạng hạt tròn, màu cam đến đỏ Hiệu suất tạo vi nang đạt tới 96% với kích thước vi nang < 40 μm…

Nhìn chung, các phương pháp bao gói thông thường này gặp phải một số hạn chế như:

- Cấu tạo vỏ bao không liên tục Vỏ có thể bị đứt gãy do quá trình sấy (mất nước cục bộ) làm cho khả năng bảo vệ của vỏ suy giảm

- Hạn chế trong việc chọn vật liệu bao gói, tương tác với lõi, tính ổn định…

- Quá trình chế biến phức tạp, đôi khi không đạt chuẩn thực phẩm như chọn hệ dung môi để rửa…

Do đó, dựa trên sự tương đồng giữa cấu trúc của tế bào nấm men và vi nang cùng với những đặc tính ưu việt của nó, màng tế bào nấm men được xem là một màng bao bảo vệ rất tốt cho các chất chứa bên trong nó Trong đó, một số chủng nấm men ưa

béo như Y lipolytica đang được các nhà nghiên cứu quan tâm trong nghiên cứu ứng

dụng các hợp chất kị nước nhằm sản xuất và bao gói các hợp chất thiên nhiên có giá trị cao như tinh dầu gừng, polyphenol, curcumin, beta-caroten Sử dụng màng tế bào nấm men sẽ là bước quan trọng giúp loại bỏ việc sử dụng hóa chất độc hại trong quy trình, đồng thời cũng làm đơn giản hóa quy trình tạo vi nang

Xuất phát từ thực trạng trên tôi đã chọn hướng đề tài: “Nghiên cứu xây dựng

quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm men Yarrowia Lipolytica”

Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu xây dựng quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm men Y

lipolytica nhằm ứng dụng để bổ sung vào thực phẩm và nuôi trồng thủy sản

Tính mới của đề tài

Công nghệ bao gói vi nang dùng trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt

là bao gói BC hiện nay đều dựa trên tính chất vật lý, hóa lý, hóa học giữa vật liệu vỏ

và hoạt chất lõi.Việc sử dụng tế bào nấm men làm vật liệu bao gói các hoạt chất theophương pháp vi sinh là vấn đề hoàn toàn mới, giúp loại bỏ việc sử dụng hóa chất độc hại trong quy trình, đồng thời cũng làm đơn giản hóa quy trình tạo vi nang

Nội dung nghiên cứu

 Xây dựng quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm men qua các thông

số sau:

 Nồng độ beta carotene/dầu ăn khi sử dụng

 Nhiệt độ tiếp xúc

 Điều kiện tiếp xúc giữa BC với tế bào nấm men

 Thời gian tiếp xúc

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả của đề tài này có thể góp phần tìm ra được quy trình bao gói hợp chất carotenoid hiệu quả nhất, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất

và bao gói một số hợp chất kị nước có giá trị

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về nấm men ưa béo Yarrowia lipolytica

1.1.1 Nguồn gốc

Yarrowia lipolytica thuộc họ Saccharomycetaceae, và thuộc giới nấm

Ascomyces (dưới họ Sacchromycetoideae) [31] Nó thường được tìm thấy trên các cơ

chất có nguồn gốc động vật hoặc thực vật mà các nguồn cacbon chính dưới dạng các ankan; lipid hoặc protein Mặt khác nó được phân lập đầu tiên trên magarine Nấm men này có thể phân lập từ các thực phẩm giàu lipid và protein [36] như pho mai [37]

hoặc xúc xích [24] Yarrowia lipolytica là một loài chiếm ưu thế trong pho mát

camembe và các pho mát xanh với nồng độ cực cao 106-107 UFC [19]

Hình 1.1 Tế bào nấm men Y lipolytica [1 ] 1.1.2 Đặc tính sinh lý

Ngược với Candida albicans và Candida tropicalis, Y lipolytica không gây bệnh [33] Nó rất nhạy cảm với nhiệt độ cao từ 32-34°C [24] Nhiều nguồn Y

lipolytica không có khả năng phát triển ở nhiệt độ 32°C và là vi sinh vật hiếu khí bắt

buộc Y lipolytica đã được Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ FDA

(American food and drug administration) cấp chứng nhận GRAS (Generally Recognized As Safe) là sản phẩm tuyệt đối an toàn Điều này cho phép chúng được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm hoặc dược phẩm

Đây là một nấm men lưỡng hình hình thành các tế bào chồi, các sợi nấm hoặc giả sợi nấm tùy theo điều kiện nuôi cấy như thông gió, nguồn carbon hoặc nguồn nitơ,

pH… [30] Khuẩn lạc của Y lipolytica có nhiều hình dạng khác nhau như nhẵn và lấp

lánh, cuộn xoắn, sần sùi và màu trắng đục

Hình 1.4 Hình thái khuẩn lạc Y

lipolytica 0544 trên môi trường YPDA

ở 27 °C

Hình 1.5 Hình thái tế bào Y lipolytica

0544 trên môi trường YPDA ở 27 °C

Hình 1.2 Hình thái khuẩn lạc của Y

lipolytica W29 trên môi trường YPDA ở

27°C

Hình 1.3 Hình thái tế bào Y lipolytica

W29 trên YPDA ở 27 °C

Y lipolytica có khả năng đồng hóa nhiều loại đường như glucose, galactose

hoặc manitol nhưng nó không có khả năng đồng hóa saccharose do thiếu hoạt động của enzyme invertase [9] Ngược lại, nấm men này có khả năng sử dụng các chất kỵ nước như alcan (hexadecan, decan), các acid béo (như acid palmitic, acid rininoleic,

acid lauric), và các triglycerid (trioleine, tripalmitine) Y lipolytica cũng có thể sử dụng acetate như một nguồn cacbon duy nhất [9] Y.lipolytica cũng có thể tăng trưởng

trong môi trường có bổ sung lipid như ricinoleic (dầu thầu dầu), sử dụng lipid để tổng hợp thành lactone do hoạt động của enzyme lipase và esterase [8]

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của Y lipolytica

 Nguồn cacbon

Y lipolytica là nấm men hiếu khí bắt buộc có khả năng phân hủy một cách hiệu

quả các chất kỵ nước như n-ankan, acid béo, chất béo và các loại dầu theo các con đường chuyển hóa đặc biệt [28] Nguồn dinh dưỡng cacbon của nấm men chính là các loại đường và dẫn xuất, các rượu, acid hữu cơ, acid amin… [22]

Hầu hết các loài nấm men không có enzyme polyhydrolase, amylase và cellulase cho nên không sử dụng trực tiếp được tinh bột, cellulose, hemicellulose mà

sử dụng đường hexose Y lipolytica có khả năng phân hủy nhiều loại đường hexose như glucose, fructose và mannose Đối với Y lipolytica hệ thống vận chuyển glucose

hoạt động không phụ thuộc vào nồng độ glucose trong môi trường [27, 32]

Các hexose nội bào đi vào chu trình đường phân sau giai đoạn photpho hóa Glucose, fructose và mannose được phosphoryl hóa bằng hexokinases Hầu hết các hexokinases bị ức chế bởi threalose -6P, một thành phần quan trọng trong thủy phân

glucose ở S cerevisiae Hexokinases ở Y lipolytica chưa được bị ức chế bởi trehalose

[30]

Nồng độ glucose cao không ảnh hưởng đến tốc độ hô hấp, hàm lượng và tỉ lệ

phân tử của cytochrome hoặc tính chất của ti lạp thể trong Y lipolytica Tuy nhiên, sản xuất Y lipolytica IMUFRJ 50682 dưới sự kiềm chế hay không kiềm chế glucose thì không phụ thuộc vào chất cảm ứng Saccharose không thể được sử dụng bởi chủng Y

lipolytica hoang dã vì thiếu enzyme chuyển hóa saccharose

Bên cạnh đó, Y lipolytica cũng có thể sử dụng ethanol làm nguồn C ở nồng độ

lên đến 3% Nồng độ ethanol cao hơn sẽ là chất độc Một số enzyme NAD+ và NADP+

dehydrogenases đã được nghiên cứu có trong nấm men Y lipolytica Sự tổng hợp của

hai enzyme dường như không bị kiềm chế bởi glucose hoặc cảm ứng bởi ethanol

Glycerol cũng được sử dụng như một nguồn C trong điều kiện hiếu khí ở nhiều loài nấm men [5], được đồng hóa thông qua con đường glycerol-3-phosphate hoặc dihydroxyacetone Một số nấm men được cho là đồng hóa glycerol qua dihydroxyacetone Ban đầu glycerol được oxy hóa thành dihydroxyacetone bởi glycerol dehydrogenase và sau đó được phosphoryl hóa thành phosphate dihydroxyacetone bởi dihydroxyacetone kinase Papanikolaou và cộng sự đã sử dụng

thành công glycerol thô trong việc nuôi Y lipolytica và sản xuất acid citric Môi

trường glycerol ban đầu cao (40 g/l) với N hạn chế dẫn đến việc tiết ra acid citric lên đến 35 g/l (sản lượng 0,42 – 0,44 g acid/g glycerol tiêu thụ)

Y lipolytica có khả năng sử dụng các acid hữu cơ như: axetic, lactic, propionic,

malic, succinic, citric và acid oleic như nguồn carbon và năng lượng duy nhất, trong nhiều trường hợp, khả năng này không phụ thuộc vào độ pH của môi trường Khi nấm men phát triển trong môi trường chứa đường và acid citric hoặc acid lactic thì có sự tăng trưởng diauxic và việc sử dụng hai loại acid này phải chịu sự kiềm chế bởi glucose

Hầu hết các chủng Y lipolytica phát triển rất hiệu quả trên acetat như nguồn

carbon duy nhất Nồng độ natri axetat lên đến 0,4% được dung nạp tốt, nồng độ cao hơn làm giảm tốc độ tăng trưởng và nồng độ cao hơn 1,0% thì ức chế sự phát triển [16]

Nấm men Y lipolytica thường được phân lập từ môi trường có chứa chất béo,

trong các sản phẩm sữa, môi trường ô nhiễm và gia cầm sống đặc biệt phù hợp với chất kị nước

Theo Aguedo và cộng sự [7, 8] đã nghiên cứu các tính chất bề mặt của Y

lipolytica W29 bằng các thử nghiệm Microbial adhesion to solvents và quan sát thấy

đặc tính ưa nước của bề mặt các tế bào phát triển trong đường hoặc dầu, với tính

cho/nhận điện tử trong sự có mặt của methyl ricinoleate Ngược lại, chủng Y lipolytica khác (Y lipolytica IMUFRJ 50.682), được phân lập từ Vịnh Guanabara ở Rio de

Janeiro, Brazil, cho thấy sự bám dính của tế bào rất cao đối với các dung môi không

phân cực, một dấu hiệu của tính kị nước cao [10], cho thấy cơ chế của chất kị nước thay đổi từ chủng này đến chủng khác

Trong quá trình lên men hydrocarbon, pha dầu được phân tán dưới dạng giọt trong pha nước và sự tương tác bề mặt là xu hướng để tạo thành các giọt dầu Những giọt nhỏ kết hợp liên tục và phân phối kích thước của nó phụ thuộc vào tương tác bề mặt, thể tích phần hydrocarbon và cường độ khuấy Gutierrez và Erickson quan sát thấy sự giảm đường kính trung bình của các giọt dầu đồng thời với sự giảm tương tác bề mặt trong môi

trường ở quá trình tăng trưởng của Y lipolytica trong hexadecan do hiện tượng sản xuất

tác nhân hoạt động bề mặt bởi nấm men Trong thực tế, Cirigliano và Carman đã phát hiện và cô lập một chất nhũ hóa có khả năng ổn định hệ nhũ tương nước/dầu, trong môi

trường phát triển ankan của Y lipolytica Chất nhũ hóa sinh học này được gọi là Liposan bao gồm 83% carbohydrate và 17% protein Một chủng Y lipolytica khác cũng có khả

năng sản xuất chất nhũ hóa sinh học, với thành phần tương tự, chỉ có mặt của glucose như nguồn cacbon, cho thấy việc sản xuất các tác nhân hoạt động bề mặt là một đặc tính cấu thành của nấm men này [29]

Bảng 1.1 Nguồn C được vi sinh vật sử dụng [2]

galactose, lactose, mannite, cellobiose, cellulose,

hemicellulose, chitin

acid béo bậc thấp, aminoacid

nucleic

 Nguồn nitơ

Nguồn Nitơ cần thiết cho tổng hợp chính là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi trường, có tác dụng cung cấp cho tế bào nguyên liệu để hình thành các

nhóm amin (-NH2) và imin (-NH-) nhằm tổng hợp protein và các hợp chất khác trong nguyên sinh chất

Các hợp chất hữu cơ chứa nitơ của tế bào là các acid amin, các nucleotide purin, protein, pirimidin và một số vitamin

Nguồn nitơ vô cơ như: các muối amoni của acid vô cơ cũng như hữu cơ: amoni phosphate, muối acetat, lactat, malat… dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân

Nấm men có thể tự tổng hợp các acid amin Tuy nhiên nếu cho các acid amin vào môi trường thì quá trình sinh sản và phát triển của tế bào sẽ nhanh hơn Nấm men đồng hóa các acid amin bằng cách amin hóa (tách NH3 ra khỏi các chất), do đó các nguồn nitơ khác nhau sẽ có ảnh hưởng rất lớn tới hàm lượng acid amin trong tế bào nấm men

Ngoài ra, nguồn nitơ thường được vi sinh vật sử dụng là protein và các sản phẩm phân hủy của protein (peptone, peptide, aminoacid…), muối amon, nitrat, N phân tử, purine, pyrimidin, ure, amin, amid, cyanid [3]

nhóm vi sinh vật mới có thể đồng hoá được)

 Oxy

Trong quá trình sinh trưởng và chuyển hóa của nấm men Y lipolytica thì oxy là một trong những yếu tố quan trọng Suốt quá trình nuôi cấy liên tục Y lipolytica N1,

nhu cầu oxy cho sự tăng trưởng và tổng hợp axit citric được tìm thấy phụ thuộc vào nồng độ sắt trong môi trường [9] Việc bổ sung các perfluorocarbon (PFC) vào môi

trường nuôi cấy Y lipolytica là phương pháp mới để tăng cường sự hấp thu oxy [11]

Tính thấm oxy trên PFC cao hơn nhiều so với trong nước với khả năng hòa tan cao

hơn 10-20 lần Khi tăng nồng độ PFC và tốc độ lắc thì Y lipolytica có tốc độ tăng

trưởng cao hơn Amaral và cộng sự [9] cũng quan sát thấy một phân vùng lạ của tế bào giữa các pha dung dịch và pha PFC hữu cơ, với sự ưa thích bất ngờ của các tế bào với các dung môi hữu cơ

Các phản ứng thích nghi của Y lipolytica gây ra bởi các chất oxy hóa hydrogen

peroxid, menadion, và juglone đã được nghiên cứu bởi Biryukova và cộng sự [19] Sự thích ứng của các tế bào nấm men đối với các tác nhân oxy hóa có liên quan với sự gia tăng hoạt động của enzyme catalase tế bào, superoxide dismutase, glucose-6-phosphat dehydrogenase và glutathione reductase, các enzyme chính liên quan đến bảo vệ tế bào

để chống lại quá trình stress oxy hóa Lopes và cộng sự đã sử dụng lò phản ứng sinh

học áp lực để tăng khả năng hòa tan oxy trong môi trường nuôi cấy Y lipolytica Tăng

oxy có khả năng gây ra sự cảm ứng của các enzyme chất chống oxy hóa như superoxide dismutase, liên quan đến các cơ chế phòng thủ của tế bào chống lại sự oxy hóa một cách hiệu quả và các tế bào có thể đối phó với tăng áp suất Khi áp suất dưới 6 bar thì khối lượng sinh khối và tốc độ phát triển tăng tương ứng 5 và 3,4 lần

 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng không những đối với sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật mà còn đối với sự trao đổi chất của chúng (ảnh hưởng đến tốc độ của các phản ứng hóa học và sinh hóa học)

Nấm men là những vi sinh vật ưa mát (chúng có nhiệt độ tối ưu ở khoảng 25°C, nhưng cũng có thể thích nghi ở 0°C), nhưng cũng có một số nấm men có thể phát triển được ở 45°C

Nhiệt độ thấp thường không làm chết vi sinh vật ngay mà nó tác động lên khả năng chuyển hóa các hợp chất, làm giảm hoạt động của các hệ enzyme, làm chậm quá trình trao đổi chất của vi sinh vật Vì vậy nhiệt độ càng thấp sẽ làm cho vi sinh vật mất khả năng phát triển và sinh sản Nhiều trường hợp vi sinh vật sẽ bị chết nhưng khả năng gây chết hết sức từ từ không giống như đối với nhiệt độ cao Nhiệt độ cao thường

gây chết vi sinh vật một cách nhanh chóng, do gây biến tính protein, làm ức chế nhanh hoạt động của hệ enzyme, vi sinh vật dễ dàng bị tiêu diệt

Phát triển tốt ở nhiệt độ 27-28°C, và không có khả năng phát triển ở nhiệt độ 32°C

 pH

pH môi trường tác động trực tiếp lên vi sinh vật Ion H+ nằm trong thành phần môi trường làm thay đổi trạng thái điện tích của màng tế bào Tùy theo nồng độ của chúng mà làm tăng hay giảm nồng độ thẩm thấu của tế bào với những ion nhất định Mặt khác, chúng cũng làm ức chế phần nào các enzyme có mặt trên màng tế bào

Sự phát triển của vi sinh vật có thể rất nghiêm ngặt ở môi trường acid hay môi trường kiềm Đối với vi khuẩn thuận lợi nhất là chúng phát triển trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu Đối với nấm men và nấm mốc thì phát triển ở môi trường acid Trong điều kiện phòng thí nghiệm phần lớn chúng ta sử dụng những môi trường

có pH đối vi khuẩn là từ 7,0 - 7,6; đối với nấm men và nấm mốc 3,0 – 6,0

1.1.4 Ứng dụng

Nhờ sự phát triển của các công cụ di truyền tiên tiến, phương pháp tiếp cận hiện

đại đã đem lại những hiểu biết đáng kể về quá trình sinh học của nấm men này và ứng dụng công nghệ sinh học Các acid hữu cơ, chất thơm, enzyme (protease, lipase, esterase và phosphatase), các protein của tế bào… là những sản phẩm chính đạt được

với nguồn Y.lipolytica hoang dã được thay đổi về mặt di truyền học [11], [16], [39],

[41] Các ứng dụng trong lĩnh vực môi trường cũng được nghiên cứu khi sử dụng

Y.lipolytica Cụ thể như:

 Trong sản xuất enzyme [21]

Y lipolytica được coi là giải pháp thay thế S cerevisiae để sản xuất protein Nó

có khả năng sản sinh các protein khác nhau với hiệu suất cao bao gồm các protease, lipase, RNase, esterase, phosphatase gắn với các điều kiện đặc biệt Ví dụ như, với pH

môi trường nuôi cấy thay đổi, nó tiết ra hai loại protease (Barth &Gaillardin, 1997): Y

lipolytica khi nuôi trong môi trường chứa peptone và pH 6 thì sẽ sản sinh ra 1-2 g/L

protease kiềm (AEP), còn khi pH môi trường dưới 4,5 thì protease acid (AXP) sẽ được sản sinh ra

 Trong sản xuất acid hữu cơ [29, 23]

Y lipolytica có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại acid hữu cơ như acid

α-cetoglutaric, acid pyruvic, acid citric và acid isocitric Các acid này có thể được tổng hợp bởi nấm men từ các nguồn cacbon khác nhau như glucose, alcan, glycerol,

ethanol… Y lipolytica có thể tiết ra môi trường một lượng lớn acid α-cetoglutaric lên

đến 108,7 g/L Sản phẩm này phụ thuộc đặc biệt vào thiamin khi nuôi cấy trên môi trường glucose Còn trong môi trường chứa glucose và glycerol nhưng vắng mặt

thiamin thì Y lipolytica tiết ra acid pyruvic Tỷ lệ acid pyruvic tổng hợp được chiếm

75 – 80% so với acid α-cetoglutaric (20 – 25%) Nồng độ acid pyruvic do Y lipolytica

tiết ra có thể lên đến 50 g/L Acid citric là một acid chiếm ưu thế hơn so với acid isocitric khi nấm men được nuôi cấy trên môi trường glucose Tỷ lệ này có thể điều chỉnh khi thêm alcan (ví dụ như hexadecan) vào môi trường nuôi cấy

 Sản xuất chất thơm

Sử dụng Y lipolytica để sản xuất chất thơm như γ-decalactone Năm 1983,

Farbood & Willis là người đầu tiên mô tả con đường chuyển hóa sinh học dầu thầu dầu thành γ-decalactone Trên thế giới γ-decalactone được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm Nó được dùng làm chất tạo hương thơm cho sản phẩm kem đánh răng, đồ uống, nước hoa, sản phẩm làm mềm vải…

Kể từ đó Y lipolytica được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu sản xuất ra lactone

[35], [39] Các con đường chuyển hóa đến tổng hợp lactone được nghiên cứu trên loài

nấm men này cách đây vài năm và Y lipolytica được xem như mô hình tốt cho các

nghiên cứu cơ bản về cơ chế liên quan đến chuyển hóa sinh học

 Trong xử lý môi trường

Như chúng ta đã biết Y lipolytica có khả năng sử dụng các chất kị nước, vì vậy

chúng được sử dụng trong xử lý sinh học của việc ô nhiễm dầu mỏ hoặc dầu trong đất,

trong môi trường nước và trong xử lý hoặc làm tăng giá trị của rác thải công nghiệp [31] Nấm men này cũng có thể được xem như nguồn dung nạp kim loại nặng (đồng, niken, kẽm) và có khả năng khử độc

1.2 Chất kị nước và tế bào nấm men

Các chất kị nước không tan trong nước sẽ xâm nhập vào tế bào qua thành và màng tế bào Sự xâm nhập này đòi hỏi các thay đổi về mặt hình thái và sinh lý, nhất là các tính chất của bề mặt tế bào có liên quan tới sự kết dính của các giọt nhỏ lipid trên thành tế bào (tính kị nước trên bề mặt) hoặc sự tạo thành các chất nhũ hóa (các chất hoạt động bề mặt).Về bản chất, các tương tác giữa phân tử kị nước và tế bào gồm ba giai đoạn: giai đoạn tiếp xúc và hấp thụ trên bề mặt tế bào, giai đoạn thấm qua cấu trúc thành tế bào và màng tế bào, giai đoạn nhả hấp thụ để đi vào tế bào chất

Sự tiếp xúc giữa cơ chất và tế bào

Để đi được vào trong tế bào, các chất kị nước phải tương tác với bề mặt tế bào Hai giả thuyết đã được đưa ra để giải thích cho sự vận chuyển một phân tử ít tan trong nước vào trong tế bào:

+ Sự hòa tan hoặc giả hòa tan của hợp chất được xem xét khi có mặt của các chất hoạt động bề mặt

+ Sự kết dính trực tiếp ở thành tế bào

Trong trường hợp của Y lipolytica, hai cơ chế này được làm nổi bật Quá trình

cảm ứng của sự kết dính giữa cơ chất kị nước và tế bào có thể làm tăng khả năng kị nước của bề mặt tế bào Và sự thay đổi khả năng kị nước này sẽ tương quan với sự hình thành các chỗ lồi trên bề mặt của các tế bào được nuôi cấy trong n-ankan Cấu

trúc này cũng có thể quan sát ở Candida tropicalis, nó phụ thuộc vào pha tăng trưởng

và cảm ứng bởi ankan hoặc acid oleic [33]

Tính thấm của thành tế bào

Osumi và cộng sự [33] đã quan sát trên kính hiển vi điện tử quét và thấy rằng bề

mặt của Candida tropicalis trở nên sần sùi khi tăng trưởng trong môi trường ankan,

trong khi đó bề mặt của nó sẽ trơn nhẵn nếu nguồn cacbon là glucose Trên các mặt cắt của nấm men được quan sát dưới kính hiển vi cắt lớp, tại các chỗ lồi xuất hiện các thành phần dưới đơn vị mà tập trung lại tạo thành kênh, bền khi rửa với dung môi hữu

cơ, ló ra khỏi bề mặt tế nấm men Các chỗ lồi cũng được quan sát ở Y lipolytica được

nuôi cấy trong môi trường methyl oleat là nguồn cacbon duy nhất

Dường như các loại nấm men có thể thay đổi cấu tạo thành tế bào của chúng khi

có mặt của các chất kị nước nhằm tăng khả năng đồng hóa Giả thiết này có thể được

củng cố khi quan sát Y lipolytica trong môi trường alkan sẽ có thành tế bào với chiều

dày lớn trong môi trường glucose [26]

Tính thấm của màng tế bào chất

Cơ chế thấm của các acid béo mạch dài qua màng tế bào chất vẫn còn đang được tranh cãi [17] Các nghiên cứu chỉ ra rằng các acid béo tự do có thể thấm qua màng lipid rất nhanh ở pH sinh lý Đối với nấm men, sự thấm qua của các acid béo

như acid lauric, acid oleic trong tế bào S cerevisiae và Y lipolytica đã được chứng

minh là dựa trên sự khuếch tán đơn giản ở nồng độ cao 10 µM và dựa trên các chất tải không sử dụng năng lượng ở nồng độ thấp hơn Kiểu vận chuyển có điều kiện này theo

nồng độ acid béo trong môi trường cũng được quan sát bởi [38] ở Saccharomyces

uvarum và Y lipolytica khi sử dụng phương pháp đánh dấu bằng phóng xạ Đối với Candida tropicalis, việc vận chuyển oleate ở các tế bào phát triển trong môi trường có

chứa oleate đạt bão hòa và diễn ra nhanh hơn so với ở các tế bào sinh trưởng trong môi trường có glucose Điều này cho thấy việc vận chuyển các chất kị nước có tính cảm ứng

Tính thấm bị động qua màng của các chất béo phụ thuộc vào nhiều yếu tố [17] + Gradient pH

+ Sự phân phối tương đối của các vùng cố định các acid béo ở hai bên của màng tế bào

+ Sự chuyển đổi các acid béo tự do thành chất dẫn xuất không thấm qua màng

tế bào (este CoA)

+ Sự phân hủy các acid béo trong tế bào

Tính thấm của các acid béo qua màng tế bào có thể thực hiện dễ dàng nhờ sự

acyl hóa bởi các enzyme Acyl-CoA synthetase (ACS) [18] Đối với S cerevisiae, 6

enzyme ACS đã được làm rõ đặc tính và được đặt tên Faa1p, Faa2p, Faa3p, Faa4p, Fat1p và Fat2p Các enzyme Faap xúc tác hoạt động của các acid béo từ 8 đến 12 cacbon; enzyme Fat1p thì chuyên biệt xúc tác lên các mạch có số cacbon lớn hơn 20 trong khi các cơ chất của Fat2p còn chưa được xác định [31]

Tóm lại, tính thấm các acid béo qua màng tế bào có thể diễn ra nhờ tác động của protein màng tế bào hoặc có thể là sự khuếch tán đơn giản qua màng phospholipid, qua lỗ hoặc ống và hai loại này đều có bản chất protein

Sự nhả các acid béo khỏi màng tế bào để đi vào tế bào chất

Do có ái lực lớn đối với lớp kép phospholipid, tốc độ nhả các acid béo ra khỏi màng diễn ra chậm hơn tốc độ kết hợp chúng vào màng cũng như tốc độ dịch chuyển của chúng bên trong màng

Một nhóm protein nội bào có khả năng kết hợp với acid béo, tạo điều kiện dễ dàng cho việc chuyển các acid béo từ bề mặt trong của màng vào tế bào chất Động học của sự nhả phụ thuộc vào chiều dài của mạch acid béo [25]

1.3 Carotenoid

Carotenoid là các sắc tố tự nhiên tạo ra màu vàng, da cam, đỏ trong rất nhiều các loại hoa quả (gấc, chanh, đào, mơ, cam…), rau (cà rốt, cà chua…), nấm và hoa Chúng cũng có mặt trong các sản phẩm động vật như trứng, cá, động vật giáp xác… Đây là nhóm chất màu hòa tan trong chất béo, không tan trong nước, giúp chống lại các tác nhân oxy hóa từ bên ngoài Carotenoid không phải là tên riêng của một chất mà

nó là tên của một nhóm các hợp chất có công thức cấu tạo tương tự nhau Carotenoid khá quen thuộc với chúng ta là β-caroten hay còn gọi là tiền chất của vitamin A Trong những năm gần đây, người ta còn nói nhiều đến các carotenoid khác như: lycopen, lutein và astaxanthine…

Một số tính chất quan trọng của β-caroten như:

− Trong thực vật, động vật carotenoid có thể ở dạng tinh thể chất rắn vô định hình

− Carotenoid không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ và dầu béo thành dung dịch, phân tán keo hoặc tạo phức với protein trong môi trường nước

− Nhờ có hệ thống nối đôi liên hợp dài mà β-caroten có ái lực mạnh với oxy đơn bội nên dễ bị oxy hoá, đồng phân hóa dưới tác dụng của oxy không khí, ánh sáng, nhiệt độ và enzyme

− Rất nhạy cảm với axit và chất oxy hoá, bền với kiềm

− Quang phổ hấp thụ cực đại của β-caroten là ở bước sóng 450 nm

− Cấu tạo:

Carotenoid thuộc nhóm tetraterpenoid có cấu trúc hydrocacbon (phân tử chứa

40 nguyên tử C) được tạo nên bởi 8 đơn vị isoprence (C5); nhưng cũng có những cấu trúc C30 hoặc C50

Chúng tạo ra màu vàng, màu cam và màu đỏ với cường độ màu rất mạnh trong nhiều loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật

CH2 = C – CH = CH2

CH3

Hình 1.6 Sơ đồ phân loại carotenoid [4]

Các caroten: có màu đỏ, cam, là những hydrocarbon (C40H58) có 1 mạch ngang

18 cacbon mang 4 nhóm CH3 và 9 dây nối đôi liên hợp, chúng khác nhau ở các đầu chuỗi; gồm 4 loại caroten quan trọng là:, , -caroten và lycopen

− β-caroten: màu vàng, cam, xanh lá, thường thấy trong các loại trái cây và rau quả có màu cam như: cà rốt, bí ngô, đào, gấc…; ở dạng tinh thể có màu đỏ đậm; tan trong CS2, benzen, chloroform; ít tan trong methanol, ethanol và không tan trong nước

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của β-caroten [13]

Caroten Oxy-carotenoid

(Xanthophylls) Carotenoid

Lutein)

Canthaxanthin Astaxanthin

Ester của acid apocarotenique

β-caroten là một loại carotenoid phổ biến nhất được tìm thấy trong thực phẩm và

là tiền chất của vitamin A Tuy nhiên khi bị thừa thì vitamin A bị đào thải, còn caroten được dự trữ trong gan đến lúc cần thiết β-caroten tham gia và ảnh hưởng đến một số quá trình sinh lí trong cơ thể như tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa một số ung thư ở đường tiêu hoá [21] β-caroten có nhiều trong gấc, cà rốt, dưa đỏ, củ cải đỏ, dâu tây, bí ngô…

β-β-caroten có công thức hóa học là C40H56, với khối lượng phân tử là 536,88 caroten bền trong môi trường kiềm và không bền môi trường axit β-caroten tan trong dầu và các dung môi hữu cơ như acetone, methanol… đặc biệt tan tốt trong dầu, ete, hexan nhưng lại không tan trong nước Nhờ có hệ thống nối đôi liên hợp dài mà β-caroten có ái lực mạnh với oxy đơn bội nên dễ bị oxy hóa, đồng phân hóa khi tiếp xúc với không khí, ánh sáng hay nhiệt độ β-carotene nhạy cảm với oxy, sự đồng phân hóa xảy ra dưới sự ảnh hưởng bởi ánh sáng, nhiệt độ, và oxy Vì vậy phải giữ ở điều kiện tránh ánh sáng, bảo quản trong bao bì kín

β-− ,  -caroten: dạng tinh thể có màu đỏ đậm; tan dễ dàng trong CS2, trong cloroform, và không tan trong nước; trong cơ thể -carotene chuyển hoá tạo thành một phân tử vitamin A; -caroten có trong củ cà rốt, quả cà chua, trong một số loài rong biển

Hình 1.8 Công thức cấu tạo của  -caroten [13]

− Lycopen: đồng phân mở vòng hai đầu của -caroten; màu đỏ nhạt (do nhiều liên kết đôi của cacbon kết hợp với nhau); có trong cà chua và các loại quả có màu đỏ; không tan trong nước; không có khả năng chuyển hoá thành vitamin A

Lycopen có khả năng bảo vệ tế bào khỏi sự oxy hoá và góp phần vào quá trình hấp thụ ánh sáng khi quang hợp Một số nghiên cứu gần đây định xác định rằng lycopen có khả năng làm chậm quá trình phát triển của ung thư tuyến tiền liệt, ruột kết

và thực quản [21] Lycopen phân bố khá rộng rãi trong tự nhiên, thường gặp trong cà chua, ổi, dưa đỏ, đu đủ, nho…

− Xanthophylls: là sắc tố màu vàng; là sản phẩm hydroxyl hóa của caroten; gồm các hợp chất: Zeaxanthin; Lutein; Anteraxanthin; Violaxanthin; Astaxanthin… Các nguyên tử oxy liên kết trong các nhóm hydro Cacboxy, acetoxy, metoxy, epoxy Bước sóng hấp thụ cực đại của xanthophyll ở 451 – 482 nm

- Lutein là dẫn xuất của α-caroten (lutein là từ tiếng Latinh, luteus có nghĩa là

màu vàng) Lutein có nhiều trong lòng đỏ trứng gà Trong các đồng phân của lutein có fucoxantin (C40H56O6) là Xantophyl chủ yếu ở tảo nâu

- Zeaxanthin là dẫn xuất của β-caroten, lần đầu tiên được chiết ra từ hạt cây ngô (Zea mays), từ đó người ta đặt tên cho sắc tố này

- Violaxantin (C40H56O4) được chiết ra từ cánh hoa của cây Panxe vàng (Viola

tricolor)

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của Lutein và zeaxanthin [13]

- Astaxanthin: là dẫn xuất 3,3 dihydroxy-4,4-diketo--caroten; ’-caroten có công thức phân tử C40H52O4

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của astaxanthin [20]

Astaxanthin hấp thụ rất mạnh bức xạ trong vùng 470-510 nm Đặc tính hấp thụ của astaxanthin có thể bị thay đổi khi nó ở trạng thái liên kết với các phân tử khác Đây là hợp chất ít phân cực nên kém tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ

có độ phân cực thấp hay trung bình như: cồn, aceton, metanol, ete dầu mỏ, dầu ăn… Nhiệt độ nóng chảy là: 215-216°C

Bước sóng hấp thụ của một số carotene trong các dung môi chiết khác nhau được giới thiệu ở Bảng 1.4

Bảng 1.4 Một số bước sóng của caroten khi chiết trong các dung môi khác nhau

[20]

α-caroten

Acetone Chloroform Ethanol Hexane, petroleum ether

(429) (435) (425) (425)

1.3.2 Chức năng sinh học của carotenoid

Nhìn chung các carotenoid có tác dụng trong việc ngăn chặn một vài loại bệnh như bệnh về mắt DMLA, bệnh tim mạch, một vài bệnh ung thư và ban đỏ do ánh sáng gây ra, có vai trò trong việc điều chỉnh hệ thống miễn dịch và bảo vệ sự ổn định trong

di truyền [20]

Các carotenoid có vòng beta-ionone ở đầu phân tử nên có thể chuyển hóa thành vitamin A, được xem là provitamin A Beta-carotene có hoạt tính provitamin A cao nhất vì nó có cả hai nhóm beta-ionone ở hai đầu Khi bổ sung các loại này vào cơ thể, chúng sẽ tích lũy trong các tế bào gan, khi cần thiết sẽ chuyển hóa thành Vitamin A Đây là loại vitamin giữ vai trò quan trọng trong cơ thể, giúp bảo vệ biểu bì mô, tham gia tạo rhodopsin duy trì tính nhạy ánh áng mặt trời của mắt, vận chuyển oxy nhờ hệ nối đôi liên hợp, tham gia trao đổi protein, lipid, muối khoáng…

Dựa trên nghiên cứu những gốc tự do người ta thấy rằng, gốc tự do là một phân

tử nguy hiểm, bởi vì nó không bền và hoạt động mạnh Nó có khả năng kết hợp rất nhanh đối với các phân tử khác đặc biệt là lipid và có thể gây nên một phản ứng dây chuyền Chính các gốc tự do này là nguyên nhân gây nên phản ứng dị ứng, ung thư, các bệnh tim mạch, tai mũi họng, da, niệu bộ, các trạng thái suy nhược, mệt mỏi, giảm trí nhớ, giảm khả năng tư duy, quá trình lão hóa Cùng với vitamin C, E, đồng, mangan thì vitamin A và β-caroten có vai trò quyết định sự ngăn ngừa, chống lại các gốc tự do này [12]

Đối với động vật có vú, β-caroten giữ chức năng sinh học quan trọng trong quá trình phát triển các thể như: phát triển thị giác, vị giác, tăng đáp ứng miễn dịch, tăng sự sinh sản và tạo tinh trùng Tác động chủ yếu của β-caroten không chỉ là chống oxy hóa mà còn trao đổi thông tin từ tế bào này đến tế bào khác, tác động tới cấu trúc và chức năng của màng tế bào, tăng cường sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể Chính vì vậy mà nó được xác định là chất điều hòa dinh dưỡng

Ngày nay, tác dụng phụ của chất hóa học trong thức ăn và sản xuất nông nghiệp

là mối quan tâm lớn của các nhà khoa học Màu nhân tạo, hàn the, chất bảo quản trong quy trình sản xuất thực phẩm, sự phân hủy của chất bảo vệ thực vật tích tụ trong cơ thể

sẽ gây ra bệnh ung thư và nhiều căn bệnh nguy hiểm khác Từ lý do này, chất chống oxy hóa từ nguồn tự nhiên là nhu cầu rất lớn trong thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm, trong đó lycopen và β-caroten có nhiều đóng góp trong các lĩnh vực này

Trong lĩnh vực tạo màu thực phẩm: màu đỏ cam của lycopene và β-carotene có nguồn gốc tự nhiên đã được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và nước giả khát Chúng được cho là an toàn hơn các màu nhân tạo khác Những sắc tố này có thể được tổng hợp hoặc chiết xuất từ những nguồn tự nhiên Chúng được được sử dụng làm chất màu trong kem, nhiều loại phomai, nước giải khát, nước sốt, các sản phẩm thịt và bánh kẹo, bơ Ngoài ra, chúng có thể được sử dụng như là chất chống oxy hóa để kéo dài tuổi thọ của sản phẩm

β- carotene được bổ sung vào thực phẩm để làm tăng giá trị dinh dưỡng trong các sản phẩm đặc biệt như sữa, nước uống tăng lực và nước trái cây Ngoài ra, β- carotene

có thể được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để làm tăng chất lượng của trứng và sữa Trong lĩnh vực dược phẩm và y học: lycopene và β-carotene là một loại biệt dược rất hữu hiệu trong việc phòng, chữa trị các bệnh nan y, ứng dụng quan trọng trong việc điều chế thuốc chống ung thư và hỗ trợ điều trị bệnh ung thư, chất hỗ trợ chống oxy hóa, sức khỏe tim mạch và da [41] Những nghiên cứu gần đây cho thấy β-carotene nhân tạo có liên quan đến hiện tượng biến đổi nhiễm sắc thể, dẫn đến nguy cơ ung thư Trong khi đó thì β-carotene tự nhiên lại có khả năng ngăn ngừa và hỗ trợ bệnh ung thư

Đối với β-carotene khi ở dạng tiền vitamin A, nó bảo vệ nhiễm sắc tố da để chống lại hiệu ứng có hại của các tia tử ngoại Người ta khuyên nên dùng bổ sung β-carotene trước khi làm việc lâu dài dưới ánh nắng mặt trời Nó có thể giúp da phòng chống không những các tia tử ngoại gây hại mà còn phòng chống lại bệnh ung thư da khi dùng trong thời gian dài

1.4 Bao gói BC bằng tế bào nấm men Y lipolytica

Gần đây tế bào nấm men đã được các nhà nghiên cứu quan tâm trong việc ứng dụng chất thơm và cải thiện khả năng sinh học của các thuốc kém hòa tan Thực vậy, theo Shark thì tế bào nấm men được nghiên cứu từ những năm 1970 khi phòng thí

nghiệm Serozyme (Pháp) và Swift (Mỹ) đã sáng chế ra một kỹ thuật sử dụng tế bào nấm men chứa hơn 40% lipid Họ đã mô tả việc bao gói thuốc nhuộm, thuốc và chất thơm khi sử dụng vi sinh vật sống và chết bao gồm nấm và động vật nguyên sinh Cơ chế của quá trình bao gói trong nấm men liên quan đến ái lực tương đối của nguyên liệu được bao gói với pha lipid trong của tế bào nấm men Các thành phần chất thơm

mà tương tác với dung dịch lí tưởng với pha lipid sẽ được bao gói với mức độ tốt nhất

Bao gói vi nang là quá trình bao bọc một hoạt chất bên trong (rắn hay lỏng) bởi một chất khác (thường là các polymer) để tạo thành những viên nang có kích thước rất nhỏ Nhờ có lớp vỏ bao bọc này mà các hoạt chất bên trong được bảo vệ khỏi bị phân hủy bởi các tác nhân có trong môi trường bên ngoài như các chất oxy hóa, nhiệt, acid, kiềm, ẩm làm tăng độ bền của hoạt chất [34] Kỹ thuật này còn nhằm mục đích chuyển giao hoạt chất bên trong đến cơ quan mong muốn trong cơ thể cũng như kiểm soát tốc độ phóng thích hoạt chất Ngoài ra, bao gói vi nang còn có tác dụng che mùi

và vị khó chịu của một số hoạt chất

Hiện nay, bao gói vi nang được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực như: dược phẩm, mỹ phẩm, phụ gia thực phẩm, hóa chất bảo vệ thực vật, tinh dầu thơm, vi sinh vật, tế bào, chất xúc tác phản ứng…

Trong công nghiệp, người ta tạo vi nang nhằm mục đích: bảo vệ, tạo sự tương quan và tăng độ bền vững của chất hoạt động trong khi phối trộn nhằm tạo ra dạng đồng nhất, che dấu mùi vị, thay đổi và kiểm soát cách thức giải phóng chất hoạt động nhằm mục đích kéo dài thời gian tác dụng

Trong lĩnh vực thực phẩm và thực phẩm chức năng, việc tạo vi nang có tác dụng che dấu vị đắng (của vitamin B); thậm chí lớp vỏ bao còn có thể được bổ sung thêm hương liệu để tăng hiệu quả Ngoài ra, tạo vi nang còn giúp ngăn ngừa những tương tác giữa các thành phần trong thực phẩm cũng như bảo vệ chất hoạt động (chất cần bao nang) khỏi những tác động của quá trình oxy hóa (bảo vệ các chất thơm), của

độ ẩm (tạo vi nang cho muối, đường…) Tạo vi nang cho các enzyme hay các probiotic là nhằm kiểm soát và làm chậm quá trình của chúng

Trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, việc tạo vi nang cho các chất hoạt động ưa nước hay kị nước (vitamin, tinh dầu, chất hydrat hóa) không chỉ có tác dụng bảo vệ mà còn giúp các chất trên được giải phóng từ từ và giúp chúng tác động đến đúng mục tiêu

Trong ngành sản xuất thức ăn gia súc, tạo vi nang dùng để tạo các hỗn hợp thức

ăn dạng bột hay để che dấu mùi vị sản phẩm

Đối với ngành in thì vi nang có khả năng bám dễ dàng lên giấy, bìa carton hay plastic nhờ kỹ thuật in offset khô hay ẩm, mực thơm… Kỹ thuật này được dùng chủ yếu trong quảng cáo, nhất là với những phân tử có mùi thơm Hương thơm sẽ được giải phóng khi vi nang bị phá vỡ bằng cơ học hay bằng cách thấm qua vỏ

Có rất nhiều phương pháp để tạo vi nang, các phương pháp này có sự khác biệt nhau về nhiều mặt như khả năng hòa tan của polyme vỏ, kích thước vi nang, độ dày vỏ

và tính thấm của màng bao, các tính chất vật lý… Tuy nhiên người ta phân ra 3 nhóm phương pháp chính:

- Phương pháp hóa lý: tách pha đông tụ, bốc hơi dung môi, tĩnh điện…

- Phương pháp hóa học: polyme hóa liên bề mặt, polyme hóa nhũ tương

- Phương pháp cơ học: sấy phun, sấy tầng sôi, nghiền, ly tâm…

Các kỹ thuật khác nhau được nghiên cứu và ứng dụng để tạo thành các viên nang trong các ngành công nghiệp khác nhau, bao gồm công nghệ phun: sấy phun, phun lạnh, phun đông, phương pháp đùn, bẫy liposome, sấy tầng sôi, đông tụ đơn giản

và phức tạp, nhũ tương polymer hóa …

Dưới đây là một số loại vật liệu dùng để bao gói:

Bảng 1.5 Một số nguyên liệu thích hợp để chế tạo vi nang dùng trong công

Thực vật

Cellulose: các dẫn xuất của cellulose

Các protein phân tách (từ đậu Hà Lan, đậu tương)

Các glyceride

Shellac)

Như đã đề cập, BC tan tốt trong dung môi không phân cực, đồng thời Y

lipolytica có khả năng sử dụng các chất kỵ nước Với BC ở dạng tinh thể, chúng ta có

thể dùng dung môi không phân cực hòa tan BC, cụ thể là dùng lipid để hòa tan BC sau

đó cho tiếp xúc với tế bào nấm men, giúp cho quá trình khuếch tán thuận lợi hơn Khi

sự khuếch tán của BC từ nơi có nồng độ cao (ngoài màng tế bào) đến nơi có nồng độ thấp (trong tế bào) diễn ra, BC sẽ được tế bào bảo vệ khỏi các tác nhân bên ngoài