Xác định hàm lượng axit amin trong bia

- Nghiên cứu các tính chất của axit amin và protein - Tính chất hoá học, vật lý và phương pháp định tính, định lượng protein và axit amin - Nghiên cứu quy trình xác định hàm lượng axit amin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - Từ hàm lượng axit amin thu được tiến hành đánh giá chất lượng protein trong bia

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật ứng dụng, đặc biệt là ngànhcông nghệ sinh học, y học và công nghệ thực phẩm thì việc đánh giá chất lượng thựcphẩm đang rất được quan tâm và chú ý Trong số các chỉ tiêu dùng để đánh giá chấtlượng thực phẩm như hàm lượng đường, hàm lượng lipid, các chất khoáng, các chấtvitamin thì hàm lượng protein chứa trong thực phẩm là chỉ tiêu quan trọng nhất.Giá trị của một loại thức ăn không những phụ thuộc vào số lượng chất đạm cótrong thức ăn ấy mà còn phụ thuộc vào số lượng và tỷ lệ cân đối các axit amin, nghĩa

là chất lượng của protein thức ăn Hàm lượng protein (chất liệu căn bản của cơ thể)

mà mọi người cần được cung cấp mỗi ngày tối thiểu là 1g/kg trọng lượng cơ thể Đốivới các nước đang phát triển, thức ăn động vật mà protein có chất lượng tốt chưa đủ,

mà cần bổ sung thêm những loại thức ăn từ thực vật giàu protein lại càng cần thiết

Nò giúp chúng ta có định hướng để phối hợp các thức ăn với nhau nhằm nâng caochất lượng của protein trong khẩu phần hàng ngày của người dân

Ngày nay đời sống kinh tế xã hội phát triển nhu cầu tiêu thụ bia của con ngườingày càng tăng, thậm chí trở thành loại nước giải khát không thể thiếu hàng ngày đốivới mỗi người dân Lượng tiêu thụ bia trên thế giới ngày càng tăng, ở Việt Nam lượngtiêu thụ bia năm 2003 là 1.29 tỷ lít, năm 2008 đã lên đến 2 tỷ lít Và dự kiến đến 2015

là 4 tỷ lít

Như ta đã biết bia không những là thức uống giải khát mà trong bia còn có cácthành phần dĩnh dưỡng có giá trị Trong đó đáng chú ý nhất là thành phần proteintrong bia Trong bia có đầy đủ 17 loại axit amin thông dụng Tuy nhiên, hầu hết cácnghiên cứu trong nước mới chỉ dừng ở việc xác định hàm lượng protein tổng mà chưaxác định được hàm lượng axit amin cũng như tỷ lệ các axit amin cần thiết có trong nótức là chưa xác định rõ chất lượng protein trong bia

Xuất phát từ thực tế đó tôi chọn đề tài luận văn là: “Xác định hàm lượng axit amin trong bia”

2 Nhiệm vụ nghiên cứu

 Nghiên cứu các tính chất của axit amin và protein

 Tính chất hoá học, vật lý và phương pháp định tính, định lượng protein và axitamin

 Nghiên cứu quy trình xác định hàm lượng axit amin bằng phương pháp sắc ký lỏnghiệu năng cao

 Từ hàm lượng axit amin thu được tiến hành đánh giá chất lượng protein trong bia

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Bia [1]

Bia là loại nước giải khát có truyền thống lâu đời, có giá trị dinh dưỡng cao và

có độ cồn thấp, mùi vị thơm, ngon và bổ dưỡng Uống bia với lượng thích hợp khôngnhững có lợi cho sức khoẻ, ăn cơm ngon, dễ tiêu hoá mà còn giảm được sự mệt mỏisau ngày làm việc mệt nhọc Khi đời sống kinh tế xã hội phát triển nhu cầu tiêu thụbia của con người ngày càng tăng, thậm chí trở thành loại nước giải khát không thểthiếu hàng ngày đối với mỗi người dân

So với những loại nước giả khát khác, bia có chứa một lượng cồn thấp (3 – 8 %)

và nhờ có CO2 giữ được trong bia nên tạo nhiều bọt khi rót và có tác dụng làm giảmnhanh cơn khát của người uống, bọt là đặc tính ưu việt của bia

Về mặt dinh dưỡng, một lít bia có chất lượng tương đương với 25 g thịt bò hoặc

150 g bánh mỳ loại một, hoặc tương đương với nhiệt lượng là 500 kcal Vì vậy biađược mệnh danh là bánh mỳ nước

Ngoài ra trong bia còn có 17 loại axit amin, vitamin B1, B2, nhiều vitamin PP vànhiều loại vi lượng tố như Calci, Phosphore, sắt rất cần thiết cho cơ thể TheoHopkins, trong 100 ml bia có 10 % chất khô có: 2,5 – 5 mg vitamin B1, 35 – 36 mgvitamin B2 và PP Chính vì vậy từ lâu bia đã trở thành thứ đồ uống quen thuộc rấtnhiều người ưa thích

1.1.1 Khởi nguồn đầu tiên về bia [1]

Những sản phẩm lên men đầu tiên từ lúa mạch đã được biết đến từ 8000 nămtrước công nguyên (TCN) Người ta cho rằng Osiris (vị thần nông nghiệp Ai Cập) là

người đầu tiên đã hướng dẫn con người làm bia từ lúa mạch Tuy nhiên, theoHerodotus viết ở thế kỷ thứ năm trước công nguyên lại cho rằng công lao đó thuộc về

vợ của ông Osiris là Iris Bằng phỏng đoán chúng ta có thể tin rằng người ta suy tônOsiris và Iris vì coi sự phát triển một cách ngấu nhiên về lên men là do có “sự canthiệp của các vị thần thánh”mà Osiris và Irí chính là người đã thực hiện

Nhiều tài liệu lịch sử chỉ ra rằng cách đây hơn 5000 năm (TCN), người Sumerien

và Assyrien đã sản xuất được một loại đồ uống lên men từ các loại ngũ cốc Từ4000TCN, theo nhưng bản thảo và di tích khảo cổ ở bảo tàng Ai Cập học củaBruxelle, nhưng người Ai Cập đã có những loại bia xếp thứ hạng cao, như là “bia củacác nhà Qúi tộc”, “bia của AiCập” Vào khoảng 2000 TCN, dưới thời vuaHammourabi, người Babilon đã viết thành sách các nguyên tắc nấu bia và quá trìnhnấu được quản lý khá chặt chẽ

Thời trung cổ, những thầy tu đã là những người đầu tiên công nghiệp hoá việcsản xuất bia Ở tu viện của St Gall, Thuỵ sĩ, người ta vẫn giữ được những xưởng bia

cổ nhất Cũng ở thời này, người ta đã bắt đầu tạo hương cho bia bằng cách thêm vàodịch hèm những vị thảo mộc có vị đắng và hương thơm Những người đứng đầu(Seigneur) giữ bí mật về hỗn hợp chất tạo hương này và thu được từ đây một nguồnlợi nhuận rất lớn Đến thế kỷ thứ 8, người ta đã biết sử dụng hoa houblon

Những nghiên cứu về khoa học sản xuất bia chỉ thực sự bắt đầu từ năm 1876,cùng với việc xuất bản các “Nghiên cứu về bia của Louis Pasteur” Trước tiên, ông đãchỉ ra những “bệnh” của bia là do sự phát triển của vi sinh vật đã đưa ra những nềntảng đầu tiên của một quy trình sản xuất hợp lý Ông cung đã phát minh ra phươngpháp thanh trùng mang tên ông, pasteur, mà cho đến nay người ta vẫn áp dụng đểtránh nhiễm khuẩn cho bia

Do vậy, nghiên cứu khoa học đã tạo ra những bước phát triển nhanh trong sảnxuất bia và tạo nên một nghành công nghiệp lớn mạnh ngày càng phát triển

Sản xuất bia ở nước Anh cổ xưa

Theo nhiều tài liệu kịch sử, vào thế kỷ đầu tiên sau công nguyên người Briton vàngười Ailen bắt đầu sản xuất “Corim” (tên xưa của bia vàng) từ lúa mạch Phươngpháp mà nhưng người Briton xưa sản xuất bia cũng tương tự như người Ai Cập cổđại: Thóc lúa được ngâm trong nước và cho nảy mầm, rồi làm khô và nghiền thànhbột, sau đó pha vào một lượng nước nhất định, lên men, tạo ra một đồ uống êm dịu,

ấm nóng, đầm đà và có cảm giác lâng lâng

Lịch sử của bia vẫn luôn gắn kết với nhà thờ St.Brigid là nơi sản xuất bia vàng ởMiền Đông để cung cấp cho tất cả các nhà thờ trong vùng Sau này, từ các tu việnxuất hiện những nhà sản xuất bia vàng đầu tiên ở đảo quốc sưng mù Tất cả các tuviện và giới tu sĩ đều có những nơi sản xuất bia riêng cho họ Các thầy tu sử dụng kýhiệu X, XX, XXX như là một đảm bảo về phẩm chất nổi tiếng cho bia theo độ mạnhtăng dần Năm 1295 Tu viện trưởng Burton- on-Trent bắt đầu lợi dụng lợi thế củanguồn nước giếng có tiếng của họ để sản xuất bia, mà cho đến ngày nay, những nguồn

ấy cũng vẫn được xem như là quà tặng của Thượng đế Các tu viện truyền những kỷxảo về sản xuất bia về nhà riêng của mình.Vào khoảng thời Trung Cổ, bia vàng đã trởthành đồ uống được cho bữa sáng, bưa trưa và bữa tối Chè và cà phê thời dó vẫnchưa phát triển

Khi việc sản xuất bia vàng trở lên phổ biến, bắt đầu xuất hiện các xưởng sản xuấtbia có quy mô lớn hơn Có 2 nhóm sản phẩm chính được sản xuất bia khi dó: mộtđược lên men theo xu hướng ngâm ủ trong các thùng (bia mạnh) và một sản xuất biathông qua các loại dịch đường pha lỏng hơn (bia nhẹ), Các thùng lên men bia vàngkhi đó làm bằng gỗ hoàn toàn

Việc đánh giá chất lượng bia vàng đã có từ năm 1266, và từ đầu năm 1305, các

cơ sở sản xuất bia bắt buộc phải có giấy phếp sản xuất

Bia Anh bắt đấu sang Pháp khi Becket cùng với Chancellor được vua Henryđược sang Pháp để câu hôn công chúa Pháp Ông đã đem khá nhiều bia vàng Anh đểlàm quà Thứ đồ uống này đã gây ngạc nhiên cho người Pháp: đồ uống lành mạnh

nhất, không có một chút cặn bã nào, cạnh tranh với rượi vang về màu sắc và vượt trội

Sản xuất bia ở các nước khác

Các đồ uống lên men cũng được sản xuất

Ở Nga, đồ uống dân gian là Quass (nước Kvas), được làm từ lúa mạch nha, đôikhi được làm dịu đi bằng cách thêm nho khô (để tạo bọt), một mẫu bánh mỳ lúa mạchđen (để tạo vị chua nhẹ) và những hoa quả khác để tạo màu

Ở các vùng núi Nam Mỹ có sản phẩn đồ uống Chica từ ngô và những thổ sản củavùng núi được sản xuất Để tạo ra sản phẩm này, ngô được nghiền và tạo thành bộtnhão sau đó để lắng, cháo ngô thu được vào một quả bầu, cho thêm nước để lên men,sản phẩm cuối cùng là đặc sản mời khách

Ở vài nước bao gồm Trung Quốc và Nhật Bản, các sản phẩm lên men truyềnthống dựa trên cơ sở lúa gạo, ví dụ ruợu Sake, được lên men ở trạng thái rắn Ở TrungQuốc, sự phát triển quan trọng của công nghiệp sản xuất bia, thông qua các thành viênhội buôn, bao gồm các nhà sản xuất bia hàng đầu thế giới, đã có những thành tựu lớntrong thời gian gần đây, thể hiện là quốc gia lớn về sản xuất bia trên thế giới TạiNhật, từ nguồn gốc ban đầu trong nhà máy bia thực nghiệm của công ty Mỹ Wiegland

và Copeland trong thung lũng Spring-Yolohama, công ty bia Kirin được thành lậpnăm 1907

Các nước phương đông khác bia vẫn chỉ là một thứ đồ uống thứ yếu

Sự hình thành các đại gia sản xuất bia

Những năm cuối của thế kỷ 18, sản xuất tại gia đình đã suy giảm, thay vào đó làcác cơ sở sản xuất bia có quy mô mang tính công nghiệp, trừ các vùng nông thôn còngiữ lại kiếu sản xuất mang tính truyền thống

Sự phát triển của đường bộ và đường sắt cho phép những nhà sản xuất bia lớnphân phối các sản phẩm của họ Vào năm 1815, Barcalay Perkins đã sản xuất trên300.000 thùng bia một năm ở Luân Đôn, việc sử dụng những động cơ hơi nước mớinhất lúc đó đã tạo thuận lợi cho cách mạng công nghiệp

Năm 1777, William Bass (57 tuổi ) bắt đầu một xưởng bia ở Burton Vào năm

1797, số lượng tăng lên tới 2000 thùng Một nửa được tiêu thụ tại chỗ, còn lại đượcđưa đi bằng đường sông và kênh đào tới Hull để vận chuyển hàng bằng tàu biển đếncác cảng Baltic nhằm tiêu thụ ở Phần Lan, Nga và Ba Lan Các khó khăn trong vậnchuyển bia đã gợi ý cho các nhà sản xuất ở Luân Đôn thành lập xưởng sản xuất biariêng của họ tại miền trung đông: Ind Coope năm 1856, Charrington năm 1871 vàMann & Crossman năm 1875

Samuel Whitbread (22 tuổi, người Bedfordshire) thành lập nhà sản xuất bia củamình năm 1742 ở Luân Đôn, chủ yếu là sản suất bia đen, và anh đã chuyển tới phốChiswell năm 1750, và trở nên nổi tiếng ngay Tới năm 1796, Whitbread đã đạt năngxuất 200.000 thùng bia một năm

Một số tên tuổi nổi tiếng khác cũng xuất hiện: Charrington & Moss lập nên cửahàngowr Mile End năm 1766; Nhà máy bia Stag đã thành lập đầu năm 1636, rồi đếnWhatney năm 1836 và sau đó là hàng loạt các nhà máy bia khác ra đời Guinnessbawts đầu sản xuất bia ở Dublin năm 1759

Ở Úc, vào giữa thế kỷ 19 có những tên tuổi trong nghành bia đã xuất hiện như:Tooth, Tooher, Carlton, South Australia Brewing, Cascade,Cooper, Swan, Boag,Foster Một trong nhưng tên tuổi đứng đầu đã dịnh cư tới những thành phố lớn: ví dụnhư Resch thay đổi vị trí trí từ Wilcannia tới Brisbane, Castlemaine tới thành phốvàng Victorian Úc đã nhanh chóng áp dụng khoa học kỹ thuật tiên tiến vào sản xuấtbia cuối thế kỷ 19 Những nhà sản xuất bia lớn hơn lắp đặt những máy làm lạnh và

ứng dụng học thuyết của Pasteur Các máy lạnh cơ khí đã được lắp đặt lần đầu tiên ởnhà máy bia Bendingo năm 1857

Một nhà máy bia khác là Auguste De Bavay người Bỉ, đã mang theo mình tớicông ty sán xuất bia Fosters (Anh em Fosters là người di cư từ New York) cả nhữngvăn minh thuần tuý của Emil Christian và cả những công thức lager (bia nhẹ của Đức)thu được từ trường đại học Cologne, đã nhanh chóng bỏ qua bia vàng cổ truyền đểthay thế bằng kiểu bia ưa thích ở Australia

1.1.2 Định nghĩa về bia [1]

Công nghiệp bia được xếp và các ngành “công nghiệp nông nghiệp” bởi nó tácđộng lên các sản phẩm của nông nghiệp và nó cũng được xếp vào nhóm “công nghiệplên men” vì biến đổi chính được thực hiện trong sản xuất bia là kết quả của quá trìnhlên men

Đĩnh nghĩa về bia của Pháp: “Bia là một loại đồ uống thu được từ quá trình lên mendịch các chát chiết từ đại mạch nảy mần, có bổ sung không quá 15% nguyên liệuđường khác và hoa houblon”

Một số nước đặc biệt là ở Đức, định nghĩa chính thức về bia như sau “Bia là mộtloại đồ uống thu nhận được nhờ lên men, và không qua chưng cất và ở đây chỉ sửdụng hạt đại mạch nảy mầm, hoa houblon, nấm men và nước” Do đó, ở Đức người tacấm sử dụng nguyên liệu khác ngoài bốn thứ kể trên; Tuy nhiên đối với một vài loạibia, người ta cho phép sử dụng các loại ngũ cốc chưa nảy mầm, các loại đường vàngay cả các chất hoá học làm dịu vị

Còn ở Việt Nam, bia được định nghĩa như sau: “ Bia là loại đồ uống lên men có

độ cồn thấp, được làm từ nguyên liệu chình là malt đại mạch, hoa huoblon, nấm men

và nước ’’

Bia phân biệt với rượu bởi hàm lượng rượu thấp hơn nhiều và hàm lượng cácchất chiết không lên men lại cao hơn nhiều Đặc tính để phân biệt bia với các loại đồuống khác là độ bền của lớp bọt được hình thành sau khi giải phóng axit cacbonic cótrong đó

Hàm lượng rượu trung bình của một loại bia tính theo % khối lượng là 3.8%, hay4.5% thể tích

1.1.3 Tình hình sản xuất bia và tiêu thụ bia trên thế giới hiện nay [1, 22]

1.1.3.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia trên thế giới

Đối với các nước có nền công nghiệp phát triển, đời sống kinh tế cao thì biađược sử dụng như một thứ nước giải khát thông dụng

Hiện nay trên thế giới có trên 25 nước sản xuất bia với sản lượng trên 100 tỷ lít/năm, trong đó: Mỹ, Đức, mỗi nước sản xuất trên dưới 10 tỷ lít/ năm Trung Quốc 7 tỷlít/năm

Thống kê trung bình mức tiêu thụ hiện nay ở một số nước công nhiệp tiên tiếntrong năm 2004 như sau: Cộng hoà Szech hơn 150 lít/người/năm, Đức 115lít/người/năm, Úc khoảng 110 lít/người/năm

Quốc gia

Xếp hạng trong năm 2004

Tổng lượng tiêu thụ (triệu hl)

Lượng tiêu thụ tính bình quân cho một người (l)

Tỷ lệ tăng so với năm 2003 (%)

Bảng 1.2: Tình hình tiêu thụ bia trên thế giới năm 2004

Trong khi sản xuất bia ở Châu Âu có giảm thì ở Châu Á, trước kia nhiều nước cómức tiêu thụ bia trên đầu người thấp đến nay đã tăng bình quân 6.5%/năm Thái Lan

có mức tăng bình quân cao nhất 26.5%/năm, tiếp đến là Philippin 22.2%/năm,Malaysia 21.7%/năm, Indonesia 17.7%/năm Đây là những nước có tốc độ tăng nhanhtrong khu vực Các nước xung quanh như Singapore đạt 18 lít/người/năm, Philippinđạt 20 lít/người/năm…(theo số liệu của Viện Rượu Bia NGK VN)

Công nghiệp bia của Trung Quốc phát triển là nguyên nhân chủ yếu thúc đẩy sựtăng trưởng của ngành công nghiệp bia Châu Á Trung Quốc là thị trường bia lớn nhấtthế giới, trong khi thị trường này ở Ấn Độ tăng trưởng từ 12 đến 15%/năm Mức tiêuthụ bia rượu tính theo đầu người ở Trung Quốc dự kiến sẽ tăng từ 37,8 lít năm 2008lên hơn 53 lít vào năm 2013.

Công ty nghiên cứu thị trường Euromonitor International cũng cho rằng châu Á

là khu vực tiêu thụ nhiều bia nhất trên toàn cầu, với mức tăng trưởng trung bình hàngnăm là 8% trong giai đoạn năm 2003 đến năm 2008

Do thị trường bia trên thế giới đang phát triển một cách năng động, các hãng bia

sử dụng các chiến lược kinh doanh khác nhau

Tại Mỹ và Châu Âu, do thị trường bia đã ổn định, chiến lược kinh doanh bia làdành thị phần, giảm chi phí sản xuất Ngược lại, tại Trung Quốc là nơi thị trường đangtăng trưởng (nhất là đối với các loại bia chất lượng cao) chiến lược là phát triển sảnxuất, tăng sản lượng và nâng cao chất lượng

1.1.3.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ bia ở Việt Nam

Bia được đưa vào Việt Nam từ năm 1890 với sự có mặt của nhà máy bia Sài Gòn

và nhà máy bia Hà Nội Như vậy ngành bia đã có lịch sử trên 100 năm

Hiện nay do nhu cầu của thị trường chỉ trong một thời gian ngắn ngành sản xuấtbia có những bước phát triển mạnh mẽ thông qua việc đầu tư và mở rộng các nhà máybia đã có từ trước và xây dựng các nhà máy bia mới thuộc trung ương và địa phươngquản lý, các nhà máy liên doanh với các hãng nước ngoài Công nghiệp bia phát triểnkéo theo sự phát triển của các ngành sản xuất khác

Mặc dù dự báo tăng trưởng kinh tế chỉ đạt 2,9% trong năm 2009, giảm so vớimức trung bình ấn tượng hàng năm là 7,2%/năm của 10 năm trước đây nhưng tìnhhình kinh doanh bia ở Việt Nam vẫn vượt mức dự kiến Dự báo mức tăng trưởng kinhdoanh của ngành bia trong nước về mặt số lượng sẽ đạt từ 4,5%/năm trở lên trongngắn hạn kể từ năm 2009 trở đi

Thực tế cho thấy, cùng với tốc độ gia tăng dân số nhanh và vững, sản lượng bia

ở Việt Nam cũng đã tăng theo, từ mức 1,29 tỷ lít năm 2003 lên 1,37 tỷ lít năm 2004;1,5 tỷ lít năm 2005; 1,7 tỷ lít năm 2006; 1,9 tỷ lít năm 2007 và trên 2 tỷ lít năm 2008.Theo thống kê của Bộ Kế hoạch - đầu tư, bốn tháng đầu năm 2011 các doanh nghiệptrong nước đã sản xuất 714,6 triệu lít bia các loại, tăng 9,2% so với cùng kỳ nămngoái Tốc độ tăng trưởng ngành bia tại VN, theo thống kê của các công ty nghiêncứu thị trường, ước đạt 15%/năm

Hiện nay, Việt Nam có khoảng 350 cơ sở sản xuất bia có trụ sở ở hầu khắp cáctỉnh, thành trên cả nước và tiếp tục tăng về số lượng Trong số này, có hơn 20 nhàmáy đạt công suất trên 20 triệu lít/năm; 15 nhà máy có công suất lớn hơn 15 triệulít/năm và có tới 268 cơ sở có năng lực sản xuất dưới 1 triệu lít/năm

Hai hãng hàng đầu trong lĩnh vực công nghiệp bia của Việt Nam hiện nay làSabeco và Habeco, chiếm giữ khoảng 50% thị phần, trong đó Sabeco chiếm khoảng35% thị phần, Habeco khoảng 15% thị phần bia cả nước Sabeco tiếp tục là con chimđầu đàn của ngành Bia tại Việt Nam, đồng thời từ vị trí thứ 54 vươn lên vị trí thứ 33tăng 21 bậc theo xếp hạng của Tập đoàn BARTH - HAAF GROUP (được đánh giátheo sản lượng sản xuất hàng năm của các tập đoàn sản xuất bia lớn nhất thế giới)năm 2009 Hai hãng này vẫn đang tiếp tục có những kế hoạch mở rộng hoạt động sảnxuất để đáp ứng ngày càng tốt hơn nhu cầu tiêu thụ mạnh mẽ trong nước, tạo thế cạnhtranh lớn trên thị trường và phục vụ xuất khẩu Tính đến 2009 sản lượng tiêu thụ biađạt 895 triệu lít, tăng trưởng 15%, thì năm 2010, sản lượng tiêu thụ đã đạt 1,088 tỉ lít,tăng trưởng 21% Dự kiến, năm 2011, Sabeco phấn đấu đạt con số 1,3 tỉ lít bia tiêuthụ Ngoài thị trường trong nước, SABECO còn xuất khẩu các sản phẩm bia sangchâu Âu, Nhật Bản, Ðài Loan (Trung Quốc), Australia, Cam-pu-chia… Ngoài hai đạigia trên, các hãng bia trong nước và nhiều hãng nước ngoài: heniken, tiger, laure,…cũng tích cực trong việc mở rộng sản xuất và tiếp thị bia tới thị trường đầy hấp dẫn ởViệt Nam với nhiều dự án có quy mô lớn

Hình 1.1: Lượng bia tiêu thụ ở Việt Nam trong những năm qua và dự kiến tới năm

2015

1.2 Protein và axit amin

1.2.1 Giới thiệu về protein và axit amin [2, 3, 10]

Khái niệm protein (protit hay đạm) ngày nay rất quen thuộc với chúng ta songtrước đây chỉ mới đầu thế kỷ thứ 19 người ta vẫn coi protein là một vấn đề bí ẩn vàkhó hiểu

Quan niệm xưa của Hypocrates cho rằng mọi thức ăn chỉ có một chất dinh dưỡngphổ biến đẫ tồn tại cho đến thế kỷ 19 Tuy nhiên vào năm 1816 nhà y học PhápFrancois Magendie (1783-1855) đã chỉ ra rằng các chất chứa nitơ trong thực phẩm làthiết yếu đối với chó và nhà y học Anh Willam Prout (1785-1850) năm 1834 đã phânbiệt được saccarin, chất béo và albumin trong nhóm các chất dinh dưỡng Nhà khoahọc và y học Hà Lan Gerard Mulder (1802-1880) đã dùng thuật từ protein lần đẩu tiên

và năm 1839 (từ tiếng Hy Lạp protos nghĩa là đầu tiên) từ đó protein được xem là chấtdinh dưỡng quan trọng nhất

Trong thế kỷ 19 phần lớn các axit amin được phân lập và xác định được cấu trúc.Vào năm 1906, nhà khoa khoa học Anh F G Hopkinr (1861-1947) đã thấy rằng dùngngô là nguồn protein duy nhất không thể duy trì sự sống của súc vật thì nghiệm trừphi được bổ sung thêm trytophan, điều đó xác định tính thiết yếu của một số axitamin Phát hiện đó đã mở đường cho rất nhiều công trình xác định giá trị của sinh họccủa protein, chủ yếu bởi các nhà khoa học Mỹ trong khoảng thời gian từ 1890-1924

(K Thomas 1909, Osborn et al 1919, Mitchell 1924)

Sau khi hai axit amin cuối cùng được xác định (methionin vào năm 1922 vàthreonin vào năm 1935) người ta đã có thể điều chỉnh chất lượng protein dựa vàothành phần các axit amin cần thiết và tiến hành các thực nghiệm xác định nhu cầu cácaxit amin cho động vật thực nghiệm và người (W C Rose 1957)

1.2.2 Axitamin thiết yếu và không thiết yếu [3,6,15,16,19]

Axitamin là cấu tử cơ bản của protein, hay nói một cách khác, axitamin là những

“viên gạch” để xây nên “các toà lâu đài muôn hình vẽ” của phân tử protein

Cơ thể người chỉ khi được cung cấp các loại axitamin thì mới có thể hợp thànhprotein Có những loại axitamin có thể tổng hợp được trong cơ thể, gọi là các

“axitamin không thiết yếu”, có những loại axitamin không thể tổng hợp được trong cơthể, hoặc tốc độ tổng hợp không thể đáp ứng được nhu cầu sinh lý sinh trưởng pháttriển bình thường của cơ thể, mà đòi hỏi lấy từ trong thức ăn, gọi là các “axitaminthiết yếu”

Theo nhiều tài liệu có tám axitamin thiết yếu cần thiết cho người lớn: valin,lơxin, izolơxin, metionin, treonin, phenylalanin, triptophan và lyzin Đối với trẻ em cóthêm hai axitamin cần thiết: arginin và histidin

Vai trò của các axitamin không chỉ giới hạn ở sự tham gia của chúng vào tổnghợp protein cơ thể mà mỗi một axitamin đều cần thiết cho sự hoàn thành nhiều chứcphận phức tạp và quan trọng khác:

- Trytophan: Một trong những loại axitamin cần thiết, một loại chất dẫn truyền

thần kinh quan trọng có thêt tạo ra trong não người, chất 5-hydroxytryptamin có tácdụng trung hoà adrenalin và noradrenalin, đồng thời cải thiện được thời gian liên tụccủa giấc ngủ Khi chất 5-hydroxytryptamin trong não động vật giảm sẽ có những biểuhiện hành vi không bình thường, kể cả mất ngủ… Ngoài ra, chất 5-hydroxytryptamincòn có trong tổ chức tiểu cầu và tế bào niêm mạc ruột,… có tác dụng làm co mạchmáu rất mạnh Con người khi bị thương trong cơ thể sẽ phóng thích 5-hydroxytryptamin để cầm máu

- Lysin: Một trong những loại axitamin cần thiết Có thể cung cấp thành phần

cấu tạo hợp thành cytocilin, cytocilin là chất quan trọng thúc đẩy sự hợp thành cácaxit béo trong tế bào

Nhiệm vụ quan trọng nhất của loại axít amin này là khả năng hấp thụ canxi, giúpcho xương chắc khỏe, chống lão hóa cột sống, duy trì trạng thái cân bằng nitơ cótrong cơ thể, do đó tránh được hiện tượng giãn cơ và mệt mỏi Ngoài ra, lysin còn cótác dụng giúp cơ thể tạo ra chất kháng thể và điều tiết hormone truyền tải thông tin.Người bình thường mỗi ngày cần 1g lysine Tuy nhiên, cơ thể không tự tổng hợpđược chất này mà phải được cung cấp qua thực phẩm Trong khẩu phần ăn của ngườiViệt Nam, lượng ngũ cốc chiếm đến 70-80% nên thường bị thiếu lysine, đặc biệt lànhững người ăn chay (chủ yếu dùng ngũ cốc và một lượng rất nhỏ rau họ đậu) Đểcung cấp đủ vi chất này, cần cân đối lại khẩu phần, ăn đủ các thực phẩm như trứng,

cá, sữa tươi Tuy nhiên, lysine trong thực phẩm rất dễ bị phá huỷ trong quá trình đunnấu Theo các chuyên gia dinh dưỡng, cách cung cấp lysine tiện lợi và hiệu quả nhất

là sử dụng các loại thực phẩm chế biến sẵn có bổ sung chất này với một lượng nhỏ,vừa đủ cho nhu cầu của người bình thường, chẳng hạn như sữa tươi, các sản phẩm lênmen…

- Phenylalanin và tyrosin: Phenylalanin là loại axitamin cần thiết.

Phenylalanine là một axít amin có chức năng bồi bổ não, tăng cường trí nhớ, và tácđộng trực tiếp đến mọi hoạt động của não bộ Ngoài ra, nó có thể làm tăng lượng chất

dẫn truyền xung động thần kinh, và tăng tỷ lệ hấp thụ tia UV từ ánh sáng mặt trời,giúp tạo ra vitamin D nuôi dưỡng làn da Tuy nhiên, nếu dùng phenylalanine nhiều,

có thể dẫn đến độc hại, nên cần hạn chế Phenylalanine có trong sữa, hạnh nhân, bơ,lạc, các hạt vừng

Cơ thể có thể chuyển hoá phenylalanin thành tyrosin, nhưng hầu như không thểxảy ra phản ứng ngược lại Trong những cơ thể bình thường, hầu như tất cả cácphenylalanin chưa được dùng để hợp thành protein đều sẽ chuyển hoá thành tyrosin.Cho nên, khi tyrosin trong bữa ăn dồi dào thì sẽ tiết kiệm được phenylalanin Tyrosintrong cơ thể sẽ chuyển hoá thành noradrenalin và adrenal do adrenal medlla tiết ra, và

chất mẫn triiodothryonin Ngoài ra, hắc sắc tố melanin được sinh ra ở da và võng mạc

mắt cũng là do tyrosin chuyển hoá thành nhờ tác dụng của các enzym Những ngườithiếu phenylalanin decarboxylase do nhân tố di truyền sẽ không thể chuyển hoáphenylalanin thành tyrosin được, và sẽ mắc một loại bệnh khiếm khuyết bẩm sinh, gọi

là chứng phenylceton niệu Bệnh nhân loại này không thể tận dụng được protein trongthức ăn và không thể ăn uống bình thường được

- Methionin, cystein và cystin: Ba loại axit amin có lưu huỳnh này là nguồn chủ

yếu của lưu huỳnh trong thức ăn Lưu huỳnh là chất không thể thiếu trong việc hìnhthành nen coenzym A và taurin trong cơ thể Sự chuyển hoá của 3 loại axit amin này

có mối quan hệ tương hỗ với nhau, khi cysrein và cystin có thể chuyển hoá cho nhau.Trong cơ thể, methionin có thể biến thành cystein và cystin nhưng cystein và cystinlại không thể biến thành methionin, cho nên cystein và cystin là các loại axit aminkhông thiết yếu, còn methionin là loại axit amin thiết yếu Khi cystein và cystin đượccung cấp trong bữa ăn dồi dào thì sẽ tiết kiệm được sự tiêu hao methionin

Sự chuyển hoá methionin có liên quan tới rất nhiều quá trình sinh hoá quan trọngtrong quá trình chuyển hoá, trước tiên hình thành một axit amin cung ứng gốc methylhoạt tính, đó là S-adenosin methionin (còn gọi là methione hoạt tính) Theo nghiêncứu, trong cơ thể có 50 loại chất đòi hỏi S-adenosin methionin cung cấp gốc methyl,

như sự sản sinh các chất adrenalin, cholin, creatin,… axit đều có liên quan đến việc dichuyển gốc methyl.

Trong những năm gần đây, đã có những phát hiện thú vị về cysteine và nhiềuchức năng của nó trong cơ thể Nó có thể được sử dụng để giúp điều trị một loạt cácvấn đề Cysteine có thể hình thành glutathione (cùng với axit glutamic và glycine),một chất chống oxy hóa mạnh mẽ và giải độc có chức năng trong các hệ thốngenzyme Glutathione là một đồng yếu tố trong các enzyme quan trọng giúp bảo vệchúng ta khỏi tác hại của kim loại nặng, hóa chất, và khói thuốc Cysteine ngày càngtrở nên quan trọng hơn như một chất chống oxy hóa - giải độc - bảo vệ hữu ích vớigia tăng ô nhiễm và độc tính của thời đại công nghiệp này Như là một chất ổn địnhmàng tế bào, nó có thể làm giảm nguy hiểm của việc hút thuốc và uống rượu Nó đặcbiệt giúp trung hòa các aldehyde sản xuất bởi gan như một sản phẩm của sự trao đổichất của rượu, chất béo, chất gây ô nhiễm không khí, và một số loại thuốc Nó cũng

có thể hữu ích trong vấn đề này bằng cách giảm thiểu tác hại của gốc tự do, cũng gópphần vào một loạt các quá trình thoái hóa Nó giúp hồi phục các mô sau khi phẫuthuật hoặc bỏng, và nó cũng có thể kích thích hoạt động tế bào máu trắng để giúp đỡtrong khả năng kháng bệnh và cung cấp bảo vệ từ đột biến của tế bào và quá trình gâyung thư, mặc dù trong các lĩnh vực này cần được nghiên cứu thêm

Methionin đặc biệt cần thiết cho nam giới nếu muốn phát triển cơ bắp vì nónhanh chóng phân hủy và đốt cháy chất béo, đồng thời tăng thêm lượng testosteronesinh dục nam Ngoài ra, menthinine hỗ trợ chống chữa kiệt sức, viêm khớp và bệnhgan Nguồn thực phẩm chứa methinnine: Thịt, cá, đậu đỗ tươi, trứng, đậu lăng, hành,sữa chua, các loại hạt

- Isoleucin, leucin và valin: Cả ba loại này đều là các axit amin thiết yếu Trong

kết cấu của chúng đều là mạch nhánh (mạch bên hoặc phần nhánh); gọi là các axitamin mạch nhánh

Các axit amin mạch nhánh chủ yếu là các axit amin tiến hành sự oxy hoá ở cơxương, còn các axit amin khác phần nhiều là oxy hoá ở gan Trong các trạng thái kích

ứng như phẫu thuật, chấn thương,… thì sự hợp thành và phân giải protein có vai tròquan trọng riêng biệt Các axit amin mạch nhánh có thể làm nguyên liệu để tổng hợpprotein cơ bắp; và sẽ bị cơ bắp dùng làm nguồn cung ứng oxy hoá cho các chất lànguồn năng lượng; ngoài ra người ta còn phát hiện thấy leucin có thể kích ứng sự tổnghợp riêng protein, đồng thời khống chế sự phân giải nó, những năm gần đây đã khiếncho rất nhiều học giả phải chú ý tới trong nghiên cứu về dinh dưỡng ngoại khoa vàdinh dưỡng cho vận động viên.

- Axit glutamic: Axit glutamic là chất dẫn truyền thần kinh, tham gia vào các

kích thích thần kinh nên được xếp vào loại amino acid kích thích cùng với acidaspartic Acid glutamic hoạt hóa ion calci, gián tiếp làm tăng tiết adrenalin - có tácdụng làm tăng tần số và tăng lực bóp cơ tim; làm tăng mức tiêu thụ oxy của cơ tim,tăng lưu lượng mạch vành

- Histidin: Khử carboxyl (khử - COOH) dưới tác dụng của histidin

decarbo-xylase để hình thành nên histamin Histamin làm giãn các mạch máu nhỏ, tiểu độngmạch, mao mạch và tiểu tĩnh mạch làm giảm sức cản ngoại vi, giảm huyết áp và tăngcường dòng máu đến mô; Histamin có tác dụng trực tiếp trên cơ tim và thần kinh nộitại làm tăng co bóp cả tâm nhĩ, tâm thất, chậm khử cực nút xoang và chậm dẫn truyềnnhĩ thất; Histamin làm tăng bài tiết nước mắt, nước mũi, nước bọt, dịch tụy; Kíchthích đầu mút sợi thần kinh ngoại vi gây ngứa, đau Trên thần kinh trung ươnghistamin gây giảm thân nhiệt, gây mất ngủ, có thể chán ăn

Histidine giúp cơ thể phát triển và liên kết mô cơ bắp với nhau Nó còn có tácdụng hình thành màng chắn myelin, một chất bảo vệ bao quanh dây thần kinh và giúptạo ra dịch vị, kích thích tiêu hóa Histidine có nhiều trong các dạng thực phẩm nhưthịt, sữa, cá, gạo, bột mì

Lượng nhu cầu của các axit amin cần thiết được chỉ ra trong bảng 1.3 sau:

Bảng 1.3: Trị số ước lượng về đòi hỏi các axit amin cần thiết

(mg/kg cân nặng/ngày)

Bảng 1.4: Đối chiếu các loại axit amin thiết yếu

Axit amin

Gạo Tỷ lệ đòi hỏi các axit amin

thiết yếu ở người lớn

axit amin cần thiết của người lớn làm ví dụ, thì lượng nhu cầu về trytophan là ít nhất, lượng nhu cầu mỗi ngày cho mỗi kilogam cân nặng là 3.5 mg, lượng nhu cầu về leusin là 14 mg, vậy trytophan : leusin = 3.5 : 14; nếu trytophan là 1 thì leusin là 4, cứnhư vậy mà suy ra (bảng 1.3) Sau khi tiêu hoá, lượng protein được hấp thu mà càng tiếp cận được với nhu cầu protein được tổng hợp trong cơ thể, thì hiệu suất tạn dụng trong cơ thể sẽ càng cao

Vì vậy, hàm lượng các axit amin không thay thế và tỉ lệ giữa chúng trong phân

tử protein là một tiêu chuẩn quan trọng để đánh giá chất lượng protein

1.2.2 Nguồn protein và axit amin [3, 1]

1.2.2.1 Trong thực phẩm:

Các thức ăn chủ yếu cung cấp protein cho cơ thể có thể là: các loại thịt gia cầm.gia súc, các loại thủy sản, hàm lượng protein trong đó thường là 10 – 20%; trong sữatươi các loại là 1,5 – 3,8%; trong trứng các loại là 11 – 14%; trong đậu khô các loại là

20 – 40% - là loại có hàm lượng protein tương đối cao trong các loại thức ăn từ thựcvật; các loại quả cứng như hồ đào, hạt sen… cũng chứa 15 – 30% protein; hạt cố cácloại thường chỉ chứa 6 – 10% protein; khoai lang chiếm 2 – 3%

Thực phẩm nguồn gốc động vật (thịt, cá, trứng, sữa) là nguồn protein quý,nhiềuvề số lượng, và cân đối hơn về thành phần và đậm độ axit amin cần thiết cao.Thực phẩm nguồn gốc thực vật (đậu tương, gạo, mì, ngô, các loại đậu khác ) lànguồn protein quan trọng Hàm lượng axit amin cần thiết cao trong đậutương còn cácloại khác thì hàm lượng axit amin cần thiết không cao, tỉ lệcác axit amin kém cân đối hơn so với nhu cầu cơ thể Nhưng việc có sẵntrong thiên nhiên một khối lượng lớn với giá rẻ nên protein thực vật có vai tròquan trọng đối với khẩu phần ăn của con người

Về việc cung cấp protein trong bữa an hiện nay nên xem xét trên cơ sở lươngthực mà gia giảm thêm một lượng nhất định protein từ động vật và protein từ đậu cácloại Nếu lượng protein hấp thu mỗi ngày về mặt số lượng đạt tới tiêu chuẩn lượng

cần cung cấp, trong đó có trên 30% có nguồn gốc từ động vật và đậu các loại thì sẽđáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng một cách tốt nhất

polypeptid, các axit amin, nitơ amoniac) (20-30%)

Trong quá trình lên men sử dụng các axit amin của nhóm A thì nó sẽ không sử dụng Valin của nhóm B Các axit amin được sử dụng theo sự sắp xếp ở bảng 5

Bảng 1.5: Các axit amin nấm men sử dụng

AlaninGlyxinePhenylalaninTryptophanTyrosin

prolin

Nấm men bắt đầu hoạt động bằng việc sử dụng các axit amin của nhóm A màkhông sử dụng các axit amin của nhóm B các axit amin của nhóm C và D khôngđược sử dụng trong quá trình lên men chìm cũng như lên men nổi ngoại trừ khi lênmen trong thùng sâu ở đó có sự sử dụng các axit amin của nhóm C, các axit amin củanhóm D thì rất ít được sử dụng

1.2.3 Định nghĩa và cấu trúc của protein và axit amin [8, 20, 12]

1.2.3.1 Định nghĩa:

Protein là polyme sinh học của L- - axitamin kết hợp với nhau bằng liên kết peptit

1.2.3.2 Phân loại:

Chủng loại protein rất phức tạp, đại đa số các kết cấu hoá học vẫ chưa được làm

rõ, chỉ có thể dựa vào mức độ phức tạp về thành phần hoá học của chúng, mà chia rathành hai loại là protein đơn thuần và protein kết hợp

 Protein đơn giản: được tạo thành chỉ từ các α-amino axit , polypeptid gồm hai hayvài chục amino acid liên kết với nhau

 Protein phức tạp: được tạo thành từ các protein đơn giản kết hợp với các phân tửkhông phải protein (phi protein) như axit nucleic, lipit, cacbohiđrat…

Nếu dựa vào tính chất lý hoá, protein còn có thể được chia thành 7 loại làanbumin, globulin, prolamin, histon, protamin và scleroprotein

Về mặt dinh dưỡng học, thường dựa vào giá trị dinh dưỡng của protein để chiaprotein thức ăn ra thành:

 Protein hoàn toàn: Chứa tất cả các loại axit amin cần thiết, số lượng đầy đủ, tỷ lệthoả đáng, không chỉ có thể duy trì được sức khoẻ của người lướn mà cón thức đẩy sựdinh trưởng và phát triển của trẻ nhỏ, Như casein, lecithoprotein trong các loại thịt;protein trong đậu nành, glutelin trong ngô

 Protein nửa hoàn toàn: Có dầy đủ tất cả các loại axit amin cần thiết, nhưng có loại

số lượng không đủ, tỷ lệ không hợp lý, có thể duy trì được sự sống, nhưng lại khôngthể thúc đẩy sự sinh trưởng, phát triển, như gliadin trong tiểu mạch, đại mạch

 Protein không hoàn toàn: Các loại axit amin cần thiết có chứa trong đó không đầy

đủ, vừa không thể duy trì được sự sống lại vừa không thể thúc đẩy được sự sinhtrưởng, phát triển Như protein trong ngô, protein chất keo trong mô liên kết và da thịtđộng vật, legumin trong đậu Hà Lan…

1.2.3.3 Cấu tạo phân tử protein [8, 15, 17, 18]

1.2.3.3.1 Thành phần nguyên tố của protein

Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, H, O, N Một số còn chứa một lượng nhỏ

S Tỷ lệ % khối lượng các nguyên tố này trong phân tử protein như sau:

N: 15 – 18% S: 0 – 0.24%

Ngoài các nguyên tố trên, một số protein còn chức một lượng rất nhỏ các nguyên

tố khác như: P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca…

1.2.3.3.2 Đơn vị cấu tạo cơ sở của protein

Tuy protein rất đa dạng về cấu trúc và đảm nhận nhiều chức năng như vậy songhầu như đều xây dựng nên các đại phân tử của mình chủ yếu từ 20 L-- axitaminbằng liên kết peptit Do vây, cũng có thể xem các axitamin nay là sản phẩm cuối cùngcủa sự thuỷ phân peptit và protein

Axit amin là những hợp chất hữu cơ mạch thẳng hoặc mạch vòng trong phân tử

có chứa ít nhất một nhóm amin (-NH2) và một nhóm cacboxyl (-COOH)

Các axit amin thường gặp trong các protein (trong tự nhiên) là những L-axitamin có nhóm amin dính vào nguyên tử cacbon  đứng cạnh nhóm cacboxyl.Công thức cấu tạo tổng quát của axit amin:

-R: được gọi là mạch bên hay nhóm bên, vậy là các axit amin chỉ khác nhau ởmạch R

Đa số các protein được cấu tạo từ 20 L-- axitamin và 2 amit tương ứng

1.2.3.3.2.1 Phân loại axit amin

Dựa vào cấu tạo gốc R để phân 20 axit amin cơ bản thành các nhóm Một trongcác cách phân loại là 20 axit amin được phân thành 5 nhóm như sau:

Nhóm 1: các axit amin có gốc R không phân cực kị nước, thuộc nhóm này có 6

axit amin : Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L), ILe (I), Pro (P)

Nhóm 2: các axit amin có gốc R là nhân thơm, thuộc nhóm này có 3 axit amin :

Phe (F), Tyr (Y), Trp (W)

Nhóm 3: các axit amin có gốc R bazơ, tích điện dương, thuộc nhóm này có 3 axit

amin : Lys (K), Arg (R), His (H)

Nhóm 4: các axit amin có gốc R phân cực, không tích điện, thuộc nhóm này có 6

axit amin : Ser (S), Thr (T), Cys (C), Met (M), Asn (N), Gln (Q)

Nhóm 5: các axit amin có gốc R axit, tích điện âm, thuộc nhóm này có 2 axit

amin : Asp (D), Glu (E)

Như vậy cấu tạo của chúng giống nhau ở chỗ cùng có nhóm cacboxyl – COOH

và nhóm amin – NH2 đều gắn vào nguyên tử C ở vị trí  , còn khác nhau ở cấu tạomạch bên R

Khi thiếu thậm chí chỉ một axit amin cần thiết có thể làm cho protein được tổnghợp ít hơn protein bị phân giải, kết quả dẫn đến mất cân đối với nitơ Hàm lượng cácaxit amin không thay thế và tỷ lệ giữa chúng trong phân tử protein là yếu tố quantrọng quyết định chất lượng protein

Trong dung dịch các axit amin thường ở dạng lưỡng tính mang cùng một lúcđiện tích (+) do nhóm – NH2 ở dạng NH3+ và điện tích (-) do nhóm – COOH ở dạngCOO- Chúng hấp thụ ánh sáng đặc biệt là 3 axit amin chứa nhân thơm: trytophan,tyrozin và phenylalanin hấp thụ khá mạnh ánh sáng UV ở gần bước sóng 280nm.Trong dung dịch tùy thuộc vào pH của môi trường nó có thể là ion lưỡng tính ,mang điện tích (+) hoặc mang điện tích (-) Giá trị pH mà ở đó ion tồn tại ở trạng tháilưỡng cực gọi là điểm đẳng điện, và pH còn gọi là pI Vì các mạch bên R của mỗi axitamin khác nhau nên mỗi axit amin có điểm đẳng điện riêng Tại điểm đẳng điện tổng

điện tích của axit amin bằng 0 Còn ở bất kỳ điểm pH nào thấp hơn pI hoặc cao hơn

pI thì các axit amin đều mang điện tích (+) hoặc (-), điều này tùy thuộc vào điện tíchmạch bên R của chính nó Vì vây, trong thực tế đặc tính này được dùng để phân tích

và xác định hàm lượng các axit amin

1.2.3.3.3 Peptid

Là những phân tử sinh học cấu tạo từ một cho tới vài chục axit amin

Peptid tạo thành từ những axit amin thông qua phản ứng nối đầu – NH2 của phân

tử này với đầu – COOH của phân tử kia tạo nên liên kết peptid

Cấu trúc của liên kết peptid cho thấy hầu hết các liên kết bất biến –C=O và –N-H

là song song hoặc gần song song và hơi bị xoắn xung quanh liên kết C-N Chính sự laitạo của obital  trong liên kết đôi C=O với đôi điện tử còn lại của N đã làm cho mặtphẳng liên kết trở nên vững chắc và nhờ các mặt phẳng này đã tạo ra liên kết bậc 2đối với cấu trúc protein

Ngoài liên kết peptid, đôi khi giữa các axit amin xìn có liên kết disunfua nối 2gốc xystein với nhau Liên kết này có vai trò quan trọng giúp hình thành cấu trúckhông gian của rất nhiều protein, đặc biệt protein ngoại bào có chức năng sinh họcquan trọng như hocmon, immunoglobulin và kháng thể

Peptid có tính chất hóa lý không khác nhiều so với axit amin vì cùng chứa mộtnhóm –NH2 và –COOH tự do giống như axit amin Sự khác nhau ở đây chỉ là do cácmạch bên R của gốc axit amin tham gia chuỗi peptid gây ra Các peptid bị thủy phânhoàn toàn bởi dung dịch HCL 6M ở 110oC trong 24h, hoặc bởi dung dịch kiềm để chocác axit amin tự do

Liên kết peptid còn bị thủy phân bởi enzym proteazơ Chúng có mặt ở tất cả các

tế bào và mô tế bào để thực hiện nhiệm vụ chủ yếu là phân giải protein

1.2.4 Một số tính chất hóa lý của protein và axit amin

1.2.4.1 Tính chất biến tính:

Protein dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như nhiệt độ cài, áp suất lớn hoặccác tia UV, tia X hoặc các chấn động cơ học, các tác nhân hóa học (kiềm hay axit),

ion kim loại nặng Cu2+, Pb2+,… làm cho cấu trúc bậc 2,3,4 bị phá hủy cón cấu trúc bậc

1 vẫn giữ nguyên làm cho tính chất của protein bị thay đổi đó là hiện tượng protein bịbiến tính

Tính chất của protein sau khi bị biến tính như sau:

 Giảm khả năng hòa tan do làm lộ các nhóm kỵ nước

 Giảm khả năng giữ nước

Nhiệt độ là tác nhân biến tính protein thường gặp nhất Dưới tác dụng của nhiệt

độ thì phân tử protein bị giãn mạch Vân tốc biến tính phụ thuộc rất mạnh vào nhiệt

độ Phần nhiều phản ứng hóa học, vận tốc tăng gấp đôi khi tăng nhiệt độ lên 100C,như vậy năng lượng liên kết làm bền cấu trúc của protein là yếu Sự biến tính protein

do nhiệ độ phụ thuộc vào bản chất và nồng độ của protein, hoạt độ nước, pH, lực ioncũng như bản chất của các ion có mặt

Sau khi biến tính nhiệt độ hòa tan của protein giảm xuống là do xuất hiện cácnhóm kỵ nước ở bề mặt phân tử làm dễ dàng cho các phân tử protein bị giãn mạch vàtập hợp lại

Không những nhiệt độ cao mà nhiệt độ thấp cũng làm biến tính nhiều protein Cónhiều enzym bền khi ở nhiệt độ thường nhưng lại bị vô hoạt khi ở 00C Một số proteinnhư protein 11S của đậu tương, gliadin, protein của trứng và sữa thường bị tập hợp vàkết tủa khi để ở nhiệt độ đông lạnh Và ngược lại, nhiệt độ thấp cũng có thể làm phân

ly hoặc sắp xếp lại các phần dưới đơn vị của oligome

Nói chung, các protein có tỉ lệ axit amin kỵ nước/axit amin có cực cao thi rất dễ

 pH

Phần lớn các protein bị biến tính khi ở Ph quá cao hoặc quá thấp Vì ở pH cực trịnày sẽ tạo ra lực đẩy tĩnh điện giữa các nhóm bị ion hóa do đó sẽ làm giãn mạch cácphân tử protein

 Các ion kim loại

Các ion kim loại kiềm (như Na, K) chỉ tác dụng một cách hạn chế với proteintrong khi đó các kim loại kiềm thổ hoạt động hơn Các ion kim loại chuyển tiếp như

Cu, Fe, Hg, Ag phản ứng một cách nhanh chóng với protein, trong đó có những chấttạo được phức bền với nhóm tiol

 Dung môi hữu cơ

Phần lớn những dung môi hữu cơ là những tác nhân biến tính của protein Vìchúng làm biến đổi hằng số điện môi của môi trường và do đó cũng làm biến đổi cáclực tĩnh điện vốn làm bền phân tử protein

Các dung môi hữu cơ không phân cực có thể xâm nhập vào các vùng kỵ nước,phá hủy các tương tác kỵ nước và làm biến tính protein

Các hợp chất hữu cơ như ure, muối guanidin có khả năng phá hủy các liên kếthydro do đó cũng làm biến tính protein

Các yếu tố làm biến tính protein thường được sử dụng để loại bỏ protein khỏidung dịch, làm ngừng phản ứng enzym

1.2.4.2 Tính chất lưỡng tính:

Axit amin và protein đều có tính chất lưỡng tính tức là vừa có tính axit vừa cótính bazơ Phân tử axit amin có nhóm amin và nhóm carboxyl trong phân tử Ở pHtrung tính axit amin tồn tại ở dạng ion lưỡng cực và trạng thái ion phụ thuộc vào pHcủa môi trường Khi đặt axit amin trong điện trường thì tùy thuộc vào pH mà dichuyển về catot hay anot, ở một pH nào đó thì axit amin không di chuyển về bên nào,

đó là điểm đẳng điện của axit amin

Như vậy, protein cũng là lưỡng tính vì trong phân tử có nhiều nhóm axit amin

1.2.4.3 Tính kỵ nước:

Dựa vào độ kỵ nước trung bình của một protein có thể biết trước được mức độđắng của dịch thủy phân (hydrolyzat) từ protein đó, hoặc biết trước được vị trí củamột protein màng nào đó là ở trong hay ngoài màng phospholipit

Có thể tính độ kỵ nước trung bình của một protein đi từ thành phần axit amin củanó

Mức độ đắng của dịch thủy phân protein được tính theo hệ thức:

Độ kỵ nước trung bình = G o =

Nếu G o > 5.85 kJ thì dịch thủy phân có vị đắng

Nếu G o < 5.43 kJ thì dịch thủy phân không có vị đắng

1.2.4.4 Tính chất hóa học của protein và axit amin

Do trong phân tử protein có nhiều chuỗi polypeptid nên ta có thể chia thành cácnhóm phản ứng sau:

- Phản ứng của nhóm liên kết peptid

- Phản ứng thủy phân bởi enzym

- Phản ứng đặc trưng của một số gốc axit amin trong phân tử

- Phản ứng của nhóm  - amin tự do của chuỗi polypeptid

Phản ứng Biure

Là phản ứng đặc trưng của liên kết peptid, tất cả các chất có chứa từ hai liên kếtpeptid trở lên đều cho phản ứng này (axit amin và dipeptid đều không có phản ứngnày) Trong môi trường kiềm mạnh, liên kết peptid trong phân tử protein phản ứngvới CuSO4 tạo thành phức chất màu tím hoặc tím đỏ.

Phản ứng này được ứng dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng protein Độnhạy của phản ứng tăng lên nhiều lần khi có thuốc thử Folin – ciocalteau

Phản ứng với thuốc thử Folin – ciocalteau:

Thuốc thử Folin – ciocalteau có chứa axit phosphomolipdic và axitphosphovolframic Các chất này một mặt làm tăng độ nhạy phản ứng biure, mặt khácphản ứng với gốc Tyr và Trp trong phân tử protein Các gốc axit amin mày tham giatrong quá trình tạo phức chất màu Phức được tạo thành có màu xanh da trời, cường

độ màu tỷ lệ với hàm lượng protein trong một giới hạn nhất định và có thể đo đượcbằng máy đo quang và dựa vào đường chuẩn ta có thể xác định được hàm lượng củaprotein thành phần

Phản ứng thủy phân với enzym

Dưới tác dụng của enzym, protein bị thủy phân thành axit amin và mỗi phản ứngcần một enzym đặc hiệu cho phản ứng đó

Phản ứng với ninhidrin

Phản ứng màu đặc trưng và quan trọng để định tính và định lượng axit amin.Tất cả các  - axit amin của protein đều phản ứng với ninhidrin tạo thành hợpchất màu xanh tím, riêng aminoaxit như prolin tạo thành màu vàng Phản ứng này rấtnhạy, có thể phát hiện đến ppm, vì vậy được dùng nhiều trong phân tích định tính vàđịnh lượng axit amin Cơ chế phản ứng khá phức tạp và có nhiều chỗ chưa thống nhất

Có thể nêu một số phản ứng chính như sau:

Phản ứng của nhóm  - axit amin với formaldehit

Đây là phản ứng quan trọng thường dùng để đánh giá mức độ thủy phân protein.Formaldehit phản ứng với nhóm amin tạo thành dẫn xuất metilen của axit amin theophản ứng sau:

Phương pháp xác định nitơ theo phương pháp này gọi là phương pháp đinhlượng nitơ formol

Ngoài ra axit amin còn có một số tính chất khác như sau:

 Axit amin có khả năng kết tinh

 Bền với nhiệt độ khoảng 1000C đến 2000C trong 2 giờ

 Khá bền trong môi trường axit, không bền trong môi trường kiềm (trong môitrường axit chỉ có trytophan bị phá hủy)

 Tính chất đồng phân quang học

 Tất cả các axit amin đều có đồng phân quang học (trừ Glycin)

 Đa số các axit amin tự nhiên đều tồn tại ở dạng L – axit amin (chỉ ở dạng này thìcác axit amin mới có giá tị dinh dưỡng cho con người và động vật)

1.3 Tổng quan về phương pháp định lượng protein và axit amin

Các phương pháp thông thường chủ yếu dựa vào sự có mặt của nitơ trong phân

tử axit amin Vì khối lượng phân tử của các axit amin khác nhau nên kết quả thườngbiểu thị bằng nitơ axit amin

1.3.1 Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl [ 5, 8, 9, 10]

Phương pháp định lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjeldahl đơn giản và

dễ thực hiện

Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số.Nitơ có trong thành phần axit amin của protein là nitơ protein Nitơ không có trongthành phần của protein như các muối vô cơ, axit nitric, các amin tự do, các peptit, urê

và các dẫn suất của urê, các ancaloit, các bazơ purin và pyrimidin… là nitơ phiprotein…

Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein

Để định lượng nitơ protein người ta thường xác định nitơ tổng số và nitơ phiprotein theo phương pháp Kjeldahl, sau đó lấy hiệu số giữa hai dạng nitơ này rồi nhânvới hệ số tương úng

Lưu ý: các protein thực vật có tỷ lệ nitơ protein khoảng 16.8%, do vậy trongtrường hợp này hệ số nhân sẽ là 5.95 (100 : 16.8) các protein động vật có tỷ lệ nitơprotein khoảng 16%, do vậy trong trường hợp này hệ số nhân sẽ là 6.25 (100 : 16)

1.3.1.1 Xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl

Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúctác Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:

O H SO

H2 4 2 2

2  +2SO2  + O2Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxy hóa các nguyên tố khác Các phân tử chứanitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3 Ví dụ như các protein bị thủy phânthành các axit amin, cacbon và hydro của axit amin tạo thành CO2 và H2O, còn nitơđược giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trongdung dịch

NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4Sau khi vô cơ hóa nitơ tồn tại dưới dạng muối amoni sunfat (NH4)2SO4, dùngmột kiềm mạnh (NaOH hoặc KOH) để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 thành NH3 tự do

và định lượng NH3 bằng axit

(NH4)2SO4 + 2NaOH  Na2SO4 + H2O + 2NH32NH4OH + H2SO4  (NH4)2SO4 + H2O

Từ số ml axit dùng để chuẩn độ tính ra được nitơ toàn phần trong mẫu thử

Nguyên liệu và hóa chất

 Vật phẩm chứa nitơ

 H2SO4 đậm đặc

 K2SO4 tinh khiết

 CuSO4 tinh khiết

Vô cơ hóa nguyên liệu:

Cân 1g mẫu tươi hoặc 1 ml mẫu cho cẩn thận vào đáy bình kjeldahl Cho thêm 5– 10ml H2SO4 đặc Nếu mẫu là bột khô, trước khi cho thêm axit cần cho vài giọt nướccất không có nitơ để thấm ướt bột Nếu mẫu lỏng như nước mắm, xì dầu…dùng pipetlấy 2 – 5ml, còn nước quả hộp lấy 20 -30ml Khi cho mẫu vào bình không được chomẫu dính bám cổ bình

Để tăng quá trình vô cơ hóa thêm hỗn hợp xúc tác, tốt nhất là dùng 0.5g K2SO4 :CuSO4 : Se (100:10:1) Hỗn hợp xúc tác có tác dụng làm tăng nhiệt độ sôi do đó đẩynhanh quá trình phản ứng Sau khi thêm chất xúc tác, đun nhẹ cho đến khi dung dịchhoàn toàn mất màu Chỉ đun mạnh khi hỗn hợp đã chuyển sang hoàn toàn dịch lỏng.Trong quá trình thỉnh thoảng lắc nhẹ, tráng khéo léo sao cho không còn một vết đencủa mẫu thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại trên thành bình Đun cho đến khi dịch cómàu trắng

Sau đó chuyển toàn bộ dịch đã vô cơ hóa sang bình định mức 100 ml, định mứcđến vạch bằng nước cất, lắc đều Dụng cụ trước khi cất phải rửa sạch, lấy vào bìnhtam giác 10 ml H2SO4 0.1N, thêm vài giọt chỉ thị phnolphtalein và lắp vào máy như

mô hình Đun sôi nước trong bình cầu tạo hơi nước, mở van nước chảy vào ống sinhhàn Sau đó từ phễu cho vào 10 ml dung dịch mẫu từ bình định mức và cho tiếp 8 –

10 ml dung dịch NaOH 40% Tráng phễu bằng một lượng nhỏ nước cất rồi đóngkhóa Hơi nước từ bình cầu sục qua bình phản ứng kéo theo NH3 sang bình hấp thụ.Quá trình cất kết thúc sau 15 phút

Sau khi đã lấy bình hấp thụ, đặt bình nước cất vào, đóng khóa, đồng thời mởkhóa ở bình rửa, tháo bỏ sung dịch bẩn đi Sau thi nghiệm tráng máy qua HCl loãng

và rửa lại nhiều lần bằng nước cất

Tính kết quả

Hàm lượng nitơ tính theo công thức:

X = X: hàm lượng nitơ (g/l)

a: Số mol H2SO4 0.1N đem hấp thụ NH3

b: Số mol NaOH 0.1N đã dùng

V: Số ml mẫu đem vô cơ hóa

0.0014: Lượng g nitơ ứng với 1ml H2SO4 0.1N

1.3.1.2 Xác định nitơ phi protein

Để xác định nitơ phi protein cần dùng dung môi thích hợp để chiết rút tất cả cácdạng nitơ phi protein (ví dụ dung môi là etanol 70%) Tuy nhiên, trong dịch chiết vẫncòn lẫn một vài loại protein, vì vậy cần dùng chất kết tủa để tách phần protein hòa tantrong quá trình chiết rút

Kết tủa protein có thể tiến hành theo nhiều các như: bằng etanol, axeton, cácmuối kim loại nặng, axit hoặc đun ở nhiệt độ cao… nhưng thông dụng nhất là dùngcác chất kết tủa sau đây: TCA 10-20%, poly nhôm clorua (PAC) với chất trợ keo tụdạng âm A101, CuSO4 10% trong hỗn hợp với NaOH 10% tỷ lệ 1 : 1, sau khi đã loại

bỏ kết tủa dịch lọc chỉ còn dạng nitơ phi protein Đem vô cơ hóa dịch này và tiếp tụctiến hành xác định hàm lượng nitơ theo phương pháp Kjeldahl.

1.3.1.3 Định lượng protein trong nguyên liệu

Nitơ tổng số bao gồm nitơ phi protein và nitơ protein Muốn xác định hàmlượng nitơ trong nguyên liệu cần xác định nitơ phi protein và nitơ tổng số

Hàm lượng protein trong mẫu được tính theo công thức sau:

Protein (mg) = (N tổng số - N phi protein ) 6,25

 Phương pháp dùng axit tricloacetic (theo Greenwald)

Chiết protein từ thực phẩm bằng nước đun sôi Kết tủa protein bằng axittricloacatic để qua đêm Tách kết tủa bằng cách lọc qua giấy lọc, rửa sach kết tủabằng axit tricloacetic loãng Định lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjendahl

 Phương pháp sử dụng tananh (theo Mothes)

Chiết protein từ thực phẩm bằng nước đun sôi Kết tủa protein bằng tananh Táchkết tủa bằng cách lọc qua giấy lọc, rửa sạch kết tủa bằng nước cất Định lượng nitơtoàn phần bằng phương pháp Kjendahl

 Phương pháp sử dụng natrisulfat và cồn ở môi trường axit

Kết tủa protein bằng dung dịch ntrisulfat bão hòa và cồn 78oC ở trong môitrường axit Định lượng phần nitơ phi protein trong dịch lọc bằng phương phápKjedahn nitơ protein được tính bằng nitơ tổng số trừ đi nitơ phi protein.

1.3.2.2 Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp so màu [5]

Trong môi trường kiềm protein kết hợp với Cu2+ thành phức chất màu tím (phảnứng Biure)

Màu sắc của phức tỷ lệ với số lượng mạch peptid (-CONH-) của protein gần nhưkhông phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và globulin Dựa vào việc sosánh tỷ lệ màu của dãy chuẩn protein và mẫu thử protein đã được tách ra khỏi thựcphẩm bằng máy quang kế ở bước sóng = 550 nm tính được hàm lượng protein hòatan trong thực phẩm

1.3.3 Định lượng protein tiêu hóa bằng pepsin

Mẫu thực phẩm được trộn trực tiếp với mem pepsin trong một cốc thủy tinh, ủtrong tủ ấm 37 – 400C trong 48 giờ, thỉnh thoảng lắc Lọc lấy phần không hòa tan loạiprotein không tiêu hóa bằng pepsin, định lượng nitơ trong phần không hóa tan bằngphương pháp Kjeldahl Nitơ của protein tiêu hóa bằng pepsin được tính bằng hiệu nitơtoàn phần trừ đi nitơ của phần không hòa tan

1.3.4 Định lượng nitơ axit amin bằng phương pháp chuẩn độ [5, 10]

1.3.4.1 Định lượng nitơ formol (hóa sinh học)

Axit amin hòa tan trong nước có tính chất muối nội phân tử, các nhóm amin vàcacboxyl trung hòa lẫn nhau Nhóm –COO- của axit amin bị cản trở bởi nhóm aminnên không thể chuẩn độ trực tiếp được Trong formandehit, nhóm amin của axit aminphản ứng với nhóm andehit cho metylen Kết quả của phản ứng là nhóm amin mất

tính chất cơ bản của nó, ngược lại nhóm cacboxyl trong axit amin tồn tại dạngmetylen không bị cản trở và có thể chuẩn độ

Số nhóm cacboxyl tự do bằng số nhóm amin liên kết với fomandehit, khi chuẩn

độ nhóm cacboxyl thì xác định được nhóm amin Vì vậy cho phép định lượng đượcaxit amin có trong dung dịch nghiên cứu

Nguyên liệu và hóa chất

 Dung dịch axit amin khoảng 0.1% hoặc các nguyên liệu có axit amin cần địnhlượng

 Dung dịch NaOH 0,1N

 Dung dịch HCl 0,1N

 Dung dịch formandehit trung hòa 30%

 Dung dịch tymolphtalein 0,1% trong etanol 90%

 Dung dịch KOH 0,01N trong etanol 90%

 Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu vàng nhạt trở lại (pH= 9) Thínghiệm kiểm tra cũng được tiến hành tương tự với các hóa chất trên nhưng thaydung dịch chứa axit amin bằng nước cất cùng thể tích

Kết quả

1ml dung dịch NaOH 0,1N tương ứng với 1.4mg nitơ Số mg nitơ amin của dungdịch nghiên cữu được tính theo công thức:

mgN = (A – B) 1,4Trong đó: A - số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm

B - số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm traPhương pháp chuẩn độ formol các axit amin trực tiếp và thuận lợi Nó được sửdụng để định lượng axit amin trong dung dịch nghiên cứu Đồng thời cũng cần nhớrăng phương pháp này không cho kết quả hoàn toàn chính xác giá trị nitơ amin, vì nếutrong dung dịch có prolin, nó sẽ không bền với formandehit nên làm giảm kết quảđịnh lượng Ngược lại nếu dung dịch nghiên cứu có tirozin, nó lại làm tăng kết quảđịnh lượng vì nó có nhóm phenol Phương pháp định lượng bằng chuẩn độ formolkhông thể sử dụng với mẫu có muối amoni, vì formol sẽ cho hexamin, đồng thời giảiphóng ra axit

4NH4Cl + 6HCHO  N4(CH2)6 + 6H2O + 4HClNhóm cacboxyl của các axit amin lưỡng tính, các peptit lớn và protein có thểđược xác định bằng kỹ thuật chuận độ trong dung dịch nước–etanol không cóformalin Môi trường nước - etanol gây cản trở sự phân ly nhóm amin, kết quả là nótrơ trong môi trường nước, axit amin trở thành axit, nhóm cacboxyl của axit amin cóthể được chuẩn độ lại bằng kiềm Với đặc tính cơ bản này có thể định lượng axit aminbằng phương pháp micro:

Lấy 2ml dung dịch chứa axit amin, cho thêm 2 giọt dung dịch tymolphtalein0,1% trong etanol 90% và chuẩn độ bằng KOH 0,01N trong etanol 90% đến khi xuấthiện màu xanh Sau đó thêm 10 thể tích dung dịch cồn tuyệt đối vào và 1 thể tíchdung dịch cần xác định lượng axit amin Màu dung dịch biến mất, chuẩn độ lại dung

dịch cho đến màu xanh Mẫu để so sánh với mãu chuẩn độ có thể sử dụng dung dịchamoniac CuCl2 0,0025M

Phương pháp này đặc biệt dùng cho nghiên cứu quá trình động học enzym, biểudiễn dưới ảnh hưởng tác động lên các enzym proteolitic protein và peptit

1.3.4.2 Định lượng nitơ axit amin bằng Iốt

Trong môi trường dung dịch đệm borat hoặc phosphat, các axit amin phản ứngvới muối đồng tạo thành một phức chất “axit amin – đồng” hòa tan, theo phản ứng:

Định lượng Cu2+ trong phức chất keo theo phương pháp định lượng gián tiếp bằng Iốt

Định lượng Cu2+ trong phức theo phương pháp định lượng gián tiếp bằng Iốt

2Cu2+ + 4KI  2CuI + I2

I2 + Na2S2O3  Na2S4O6 + 2NaI

Từ đó tính được hàm lượng axit amin trong mẫu thử

1.3.4.3 Định lượng axit amin theo phương pháp Van Slyke

Axit amin trong môi trường axit nitric sẽ phản ứng tạp ra khí N2 ở thể tự do theophản ứng:

Axit amin trong môi trường axit nitric sẽ tạo ra khí N2 ở thể tự do theo phản ứng

Khí N2 giải phóng một nửa là từ axit amin, một nửa từ axit nitric Xác định thểtích N2 ở điều kiện nhiệt độ và áp suất, tra bảng tính sẵn, sẽ có trọng lượng nitơ từ đótính ra hàm lượng nito axit amin có trong mẫu thử.

1.3.5 Các phương pháp tách và xác định đồng thời axit amin

Nhược điểm của các phương pháp xác định axit amin và protein đã đề cập ở trênchỉ là xác định được tổng số nitơ mà không thể xác định được riêng rẽ từng axit amin

Để khắc phục nhược điểm này thì phải tách từng chất nhóm axit amin trước khi xácđịnh chúng Điều này ngoài việc xác định được từng axit amin riêng biệt mà cần tránhđược sự ảnh hưởng của các nitơ khác đến việc xác định axit amin Có nhiều phươngpháp để định lượng axit amin, mỗi phương pháp có độ nhạy và khả năng phân tíchkhác nhau Phần lớn các phương pháp phân tích định lượng riêng biệt từng axit amindựa trên việc tách axit amin thành dạng tự do bằng sắc ký trao đổi ion sau đó pháthiện bằng dẫn suất trước cột hoặc sau cột Kỹ thuật xác định sau cột được áp dụngvới mẫu có hàm lượng muối tạp thấp Kỹ thuật tách và xác định amin bằng phản ứngdẫn suất trước cột và sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược cho độnhạy cao hơn so với dẫn suất sau cột và đặc biệt là kỹ thuật trước cột có thể áp dụngphân tích với các mẫu có chứa nhiều muối

1.3.5.1 Các phương pháp sắc ký cổ điển [ 4, 10, 11, 12, 13, 14]

1.3.5.1.1 Phương pháp sắc ký bản mỏng

Phương pháp sắc ký bản mỏng được triển khai bởi Bailey, J L, rất dễ thực hiện

Vì thế nó cũng được sử dụng để xác định axit amin Tác giả Phạm Văn Sổ và Bù ThịNhư Thuận đã dùng pyridin làm dung môi triển khai cháy sắc ký bản mỏng, dựa vàochiều cao, diện tích vết của mẫu so với vết mẫu chuẩn sẽ tính ra được hàm lượng axitamin Phương pháp này tách tốt nhưng phải sử dụng dung môi rất độc, độ chính xáckhông cao Ngày nay với sự pháp triển của các phương pháp sắc ký hiện đại, việc tách

và xác định axit amin không áp dụng trên sắc ký lớp mỏng nữa

10 pM với prolin Mặc dù phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã thực sựphát triển và áp dụng xác định axit amin ở nhiều đối tượng, nhưng phương pháp sắc

ký cột với dẫn xuất ninhydrin vẫn được áp dụng và tiếp tục hoàn thiện cho tận đếnngày nay do sử dụng thiết bị rẻ tiền, thuận tiện cho việc phân tích lượng lớn Bằngviệc thay chuẩn hóa thời gian, ổn định nhiệt độ, nhiệt độ dẫn suất, pH và môi trườngđệm chạy sắc ký, đặc biệt là thay thế dung dịch rửa giả là hỗn hợp lithi hydroxyl/ axitacetic được thay thế bằng natri hydroxyl/axit acetic Shi-Wen Sunm Yi-cheng Lin vàcộng sự đã rút ngắn được thời gian chỉ còn 30 phút khi tách và xác định đồng thời 10axit amin

Phương pháp sắc ký cột với dẫn suất sau cột là o-phthalaldehyd (OPA), các axitamin sau khi được tách ra khỏi cột trao đổi ion được dẫn suất bằng OPA tạo phức chất

có tính phát huỳnh quang, đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích 348nm và bướcsóng phát xạ 450nm Phương pháp có thể tách và xác định đồng thời các axit aminbậc 1 với giới hạn phát hiện đạt tới 20 pM Dẫn xuất OPA có hạn chế lớn là khôngphát hiện được các axit amin bậc 2

Phương pháp sắc ký cột cổ điển là phương pháp đơn giản có thể áp dụng cho bất

kỳ phòng thí nghiệm nào Tuy nhiên, do thời gian tách lâu, khả năng tách không cao

so với các kỹ thuật hiện đại nên nó chỉ được phép áp dụng trong cac đối tượng táchđơn giản