Sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao nấm men saccharomyces boulardii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Lê Thị Hồng Lụa M

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

SỬ DỤNG KỸ THUẬT VI GEL ĐỂ VI BAO

NẤM MEN SACCHAROMYCES BOULARDII

GVHD: ThS LÊ HOÀNG DU SVTH: LÊ THỊ HỒNG LỤA MSSV: 11116035

S K L 0 0 3 9 3 8

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MÃ SỐ: 2015-11116035

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 07/2015

SỬ DỤNG KỸ THUẬT VI GEL ĐỂ VI BAO

NẤM MEN SACCHAROMYCES BOULARDII

GVHD: TH.S LÊ HOÀNG DU SVTH: LÊ THỊ HỒNG LỤA MSSV: 11116035

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: Lê Thị Hồng Lụa MSSV: 11116035

 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ gelatin/ soy protein đến khả năng sống sót của

tế bào nấm men Saccharomyces loulardii được vi bao trong môi trường giả lập

dạ dày, giả lập dịch ruột

4 Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 20/01/2015

5 Ngày hoàn thành đồ án: 15/07/2015

6 Họ tên người hướng dẫn: ThS Lê Hoàng Du

Nội dung và yêu cầu đồ án tốt nghiệp đã được thông qua bởi

Trưởng Bộ môn Công nghệ Thực phẩm

Tp.HCM, ngày 15 tháng 07 năm 2015

Trưởng Bộ môn Người hướng dẫn

SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang iii

Gia đình đã luôn động viên ủng hộ, làm chỗ dựa tinh thần cho em

Ban giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP Hồ Chí Minh

Quý thầy cô Khoa công nghệ Hóa học và Thực phẩm - Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật

TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện học tập và nghiên cứu hoàn thành đồ án tốt nghiệp Đặc biệt em chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Lê Hoàng Du đã trược tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ, truyền đạt những kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành đề tài

Tập thể lớp 111160 đã giúp đỡ và đồng hành cùng tôi trong suốt quãng đời sinh viên Cuối cùng em xin chúc quý Thầy, Cô sức khỏe và thành công

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn

TP Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 07 năm 2015

Sinh viên thực hiện

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung được trình bày trong khóa luận tốt nghiệp là của riêng tôi Tôi xin cam đoan các nội dung được tham khảo trong khóa luận tốt nghiệp đã được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo qui định

Ngày 15 tháng 07 năm 2015

Ký tên

SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang v

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Gelatin hoặc soy protein kết hợp với sodium alginate, được sử dụng như một hệ

chất bao để vi bao tế bào nấm men Saccharomyces boulardii với mục tiêu tăng khả năng

sống sót của tế bào nấm men khi tiếp xúc với các điều kiện bất lợi ở dạ dày cũng như ở

đường ruột Phân bố kích thước hạt được đo bằng cách sử dụng kỹ thuật nhiễu xạ laser,

kích thước của hạt vi bao có gelatin trung bình 270.4 µm và kích thước hạt vi bao có soy

protein 360.2 µm Mẫu hạt vi bao sử dụng màng bao có 0.75% gelatin và mẫu 15% soy

protein cho hiệu suất vi bao cao nhất, tương ứng lần lượt là 85.72% và 82.46% Mật độ tế

bào của hạt vi bao đạt 8.47 – 8.83 log cfu/g gel đối với mẫu gelatin, 8.72 – 8.95 log cfu/g

gel ứng với mẫu soy protein Khi vi bao bằng gelatin (0.5, 0.75 và 1%) hoặc soy protein (5,

10 và 15%) với alginate đã cải thiện đáng kể khả năng sống sót của tế bào nấm men trong

môi trường giả lập dạ dày (pH = 1.55), kết quả số tế bào sống ở nồng độ gelatin 0.75 % và

soy protein 15% cao nhất, cao hơn đáng kể (p < 0.05) so với tế bào tự do và tế bào được

bao một lớp bằng alginate Sau khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày 120 phút, số lượng tế

bào sống sót là 6.78 log cfu/g gel cho màng bao có gelatin 0.75% và 7.12 log cfu/g gel cho

màng bao có soy protein 15%, trong khi tế bào tự do là 4.06 log cfu/g Khi ủ hạt vi bao

trong môi trường giả lập dịch ruột, màng bao có chứa 0.75% gelatin hoặc 15% soy protein

cho kết quả vi bao tốt nhất tương ứng 7.65 log cfu/g gel và 7.89 log CFU/ g gel so với đối

với tế bào tự do 5.74 log cfu/g Như vậy, khi vi bao bằng gelatin hoặc soy protein với

alginate, số lượng tế bào sống sót phù hợp với yêu cầu tối thiểu khi sử dụng probiotics (6 –

7 log cfu/g hoặc ml)

Từ khóa:S boulardii, gelatin, soy protein, alginate, vi bao, khả năng sống sót

MỤC LỤC

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ii

LỜI CẢM ƠN iii

LỜI CAM ĐOAN iv

TÓM TẮT KHÓA LUẬN v

MỤC LỤC vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Probiotics 2

1.2.1 Định nghĩa về probiotics 2

1.2.2 Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotics 2

1.2.3 Cơ chế hoạt động của probiotics 3

1.2.4 Tính chất chức năng & lợi ích đối với cơ thể 5

1.3 Nấm men S boulardii 7

1.3.1 Giới thiệu 7

1.3.2 Đặc điểm S boulardii 7

1.3.3 Cơ chế hoạt động của S boulardii 8

1.4 Kỹ thuật vi bao 10

1.4.1 Định nghĩa, phân loại 10

1.4.2 Một số kỹ thuật vi bao thường sử dụng 10

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu 20

2.2 Phương pháp 20

2.2.1 Chuẩn bị giống vi sinh vật S boulardii 20

2.2.2 Chuẩn bị dung dịch màng bao 20

SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang vii

2.2.3 Phương pháp vi bao 21

2.2.4 Bố trí thí nghiệm 22

2.2.5 Phân tích mật độ tế bào vi bao 24

2.2.6 Xác định hiệu suất bao 24

2.2.7 Xác định phân bố thước hạt bao 25

2.2.9 Khảo sát khả năng sống sót của tế bào được vi bao trong môi trường giả lập dịch dạ dày 25

2.2.11 Phân tích xử lý số liệu 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Mật độ tế bào vi sinh vật được bao gói 27

3.3 Kích thước hạt vi bao S Boulardii với chất bao gelatin-alginate và soy protein-alginate 32

3.4 Bề mặt hạt vi bao chụp dưới kính hiển vi điện tử quét 33

3.5 Khả năng sống sót của tế bào nấm men được vi bao trong môi trường giả lập dạ dày 34

3.6 Khả năng sống sót của tế bào nấm men S boulardii được vi bao trong môi trường giả lập dịch ruột 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotics 3 Bảng 1.2: Một số loại màng bao và kích thước hạt bao tương ứng 17

Bảng 2.1 Công thức phối trộn màng bao và tế bào S boulardii 21

Bảng 3.1: Mật độ tế bào nấm men S boulardii được vi bao trong màng bao gelatin –

alginate (log cfu/g) 27

Bảng 3.2: Mật độ tế bào nấm men S boulardii được vi bao trong màng bao gelatin – soy

protein (log cfu/g) 27

Bảng 3.3: Hiệu suất vi bao nấm men S boulardii trong màng bao gelatin – alginate 29 Bảng 3.4: Hiệu suất vi bao nấm men S boulardii trong màng bao gelatin – alginate 30

Bảng 3.5 Khả năng sống của tế bào nấm men theo thời gian (log cfu/g) trong môi trường giả lập dạ dày 35

Bảng 3.6: Khả năng sống của tế bào nấm men S boulardii theo thời gian (log cfu/g) trong

môi trường giả lập dịch ruột 40

SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang ix

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Tế bào S boulardiiquan sát dưới kính hiển vi 7

Hình 1.2: Cấu trúc alginate và quá trình hình thành gel khi có mặt ion Ca2+ 16

Hình 1.3 Quy trình vi bao nấm men 22

Hình 3.1: A Mật độ tế bào nấm men S boulardii được vi bao 28

Hình 3.2: Hiệu suất vi bao S boulardii 30

Hình 3.3: Biểu đồ phân bố kích thước hạt vi bao 33

Hình 3.4: Cấu trúc bề mặt hạt vi bao A hạt vi bao bằng alginate, B hạt vi bao bằng soy protein – alginate, C hạt vi bao bằng gelatin-alginate 34

Hình 3.5: Khả năng sống của tế bào nấm men S boulardii trong môi trường giả lập dạ dày (pH = 1.55) 36

Hình 3.6: Khả năng sống của tế bào nấm men S boulardii trong môi trường giả lập dịch

ruột Error! Bookmark not defined.

SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu

Trong đường ruột của chúng ta, có khoảng hơn 100 ngàn tỉ khuẩn, chúng bao gồm cả

vi sinh vật có lợi và vi sinh vật có hại Sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột là rất quan trọng để duy trì lượng vi sinh vật có lợi, hỗ trợ các chức năng về tiêu hóa và miễn dịch Tuy nhiên, trong cuộc sống hằng ngày hệ tiêu hóa của chúng ta rất dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài, gây rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột Chẳng hạn như sự lão hóa, dùng kháng sinh, chế độ ăn uống không hợp lý,…Các nhân tố này làm giảm hệ vi sinh vật có lợi, tạo điều kiện cho vi sinh vật gây hại gia tăng, ảnh hưởng đến sức khỏe Qua đó cho thấy tầm quan trọng của hệ vi sinh đường ruột trong duy trì sức khỏe và phòng bệnh

Việc bổ sung probiotics được xem như là một biện pháp hữu hiệu để tăng cường hệ

tiêu hóa giúp nâng cao lượng vi sinh vật có lợi Trong đó Saccharomyces boulardii (S

boulardii) một loại nấm men không gây bệnh hiện đang được sử dụng rộng rãi như là một

loại thuốc để tăng cường hệ vi sinh vật có lợi cho đường ruột (Duong thi ngoc Diep,

2013.) Tuy nhiên, một số probiotics cũng như nấm men S boulardii khi vào trong cơ thể

bị bất hoạt, phá hủy do pH thấp của dạ dày và tác động của môi trường dịch ruột (Klein và cộng sự, 1993), một số khác có thể sống sót qua khỏi dạ dày như vi khuẩn trong sữa chua,

Lactobacillus delbruecklii, Streptococcus thermophilus chúng có khả năng chịu được acid

thấp (Marteau và cộng sự, 2003) Do lượng lớn probiotics không thể tồn tại cho đến ruột già nên cần phải thực hiện một biện pháp nào đó để đảm bảo lượng probiotics còn tồn tại khi đến ruột già Hiện nay, một trong những phương pháp hữu hiệu nhất là bao gói và vi bao chúng, nghĩa là tạo ra một lớp màng bao quanh chúng tránh các tác động của pH dạ dày, muối mật nhưng vẫn đảm bảo vi sinh vật có khả năng phóng thích đúng lúc (Duong thi ngoc Diep, 2013) Vì vậy để giải quyết vấn đề này, chúng tôi thực hiện đề tài ―Sử dụng

kỹ thuật vi gel để vi bao S boulardii ‖ với mục tiêu bảo vệ S boulardii trong chất bao

gelatin, soy protein, kết hợp với gel alginate tránh các tác động tiêu cực của hệ tiêu hóa lên khả năng sống sót của tế bào Nội dung nghiên cứu chính của đề tài bao gồm:

 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ gelatin, soy protein lên hiệu suất vi bao S

boulardii

 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ gelatin, soy protein lên khả năng sống sót của S

boulardii sau vi bao trong môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột

1.2 Probiotics

1.2.1 Định nghĩa về probiotics

Định nghĩa về probitics lần đầu tiên được Lilly và Stillwell sử dụng vào năm 1965 để chỉ những ―chất bí mật được tạo ra bởi một loài vi sinh vật có tác động kích thích sự phát triển của một loài vi sinh vật khác‖ (Lilly và cộng sự, 1965) Probiotics được định nghĩa là các vi sinh vật được dùng với một số lượng đủ để tồn tại trong hệ đường ruột và có tác động tích cực đến hệ vi sinh đường ruột, chúng được tạo thành từ một hoặc nhiều chủng của một loài đơn lẻ hoặc hỗn hợp của một số loài, trong đó có các thành phần chung của hệ thực vật đường ruột bình thường và đã được phân lập từ phân của người khỏe mạnh (Gismondo và cộng sự, 1999) và còn nhiều định nghĩa khác đã được đưa ra bởi các nhà khoa học nổi tiếng như Charteris và cộng sự, 1997; Fioramonti và cộng sự, 2003; Marteau

và cộng sự, 2011 Mặc dù có nhiều định nghĩa, thuật ngữ đã được đề cập, song phổ biến nhất và có giá trị khoa học là định nghĩa của tổ chức Y tế thế giới và tổ chức nông lương thế giới (WHO/FAO,2001), được kiểm chứng bởi Hiệp hội các nhà khoa học quốc tế về probiotic và prebiotic đây là định nghĩa chính xác nhất: ―probiotic là những vi sinh vật sống được đưa trực tiếp vào cơ thể, với một lượng đầy đủ sẽ có lợi về mặt sức khỏe cho người sử dụng (Araya và cộng sự, 2002) Như vậy, theo định nghĩa này thì những vi sinh

vật sống không chỉ bao gồm vi khuẩn mà còn có nấm men như nấm men S boulardii Hầu

hết các chủng probiotics thường được sử dụng để sản xuất thực phẩm thuộc nhóm vi khuẩn

acid lactic như là Lactobacillus và Bifidobacteria (Lê Văn Việt Mẫn và cộng sự, 2008)

1.2.2 Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotics

Vi sinh vật probiotics có thể tìm thấy ở nhiều nơi như ở các cơ chất chứa carbohydrat, các môi trường khác nhau như niêm mạc người và gia súc (khoang bụng, ruột

và âm đạo), ở thực vật hoặc các vật liệu có nguồn gốc thực vật, trong phân và thực phẩm lên men

Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotics chủ yếu

thuộc Lactobacillus và Bifidobacterium, ngoài ra còn có Enterococcus và Streptococis Những vi khuẩn này thường cư trú ở ruột Một số chủng tiêu biểu gồm Lactobacillus

SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang 3

acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus rhamnous, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, bên cạnh đó còn có nấm men Saccharomyces Boulardi (Berni Canani và cộng sự, 2011; Hong và cộng sự, 2005)

Bảng 1.1: Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotics

Bacillus cereus Eschiarichia coli Propionibacterium freudenreichii Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces boulardii

(Taylor & Francis, 2004)

1.2.3 Cơ chế hoạt động của probiotics

Cơ chế tác động của probiotics chủ yếu thể hiện trên ba phương thức: cạnh tranh loại trừ, tổng hợp các chất đối kháng vi sinh vật gây bệnh, điều chỉnh miễn dịch (Steiner và cộng sự, 2006)

1.2.3.1 Cạnh tranh loại trừ

Đặc điểm cạnh tranh điển hình là cạnh tranh chỗ bám dính Các vi sinh vật probitics

cư ngụ và nhân lên trên bề mặt của biểu mô ruột, khóa chặt các vị trí thụ cảm và ngăn cản

sự bám dính của các vi sinh vật khác như E coli, Salmonella,… Nấm men là probiotics (S

boulardii) không những tranh vị trí bám dính với các vi khuẩn khác mà còn gắn kết với các

vi khuẩn có roi (đa số là vi khuẩn có hại) thông qua các cơ quan thụ cảm mannose và đẩy

chúng ra khỏi vị trí bám dính ở niêm mạc ruột (Czeruckap và cộng sự, 2002.) Bên cạnh việc cạnh tranh loại trừ probiotics còn cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng với vi sinh vật gây bệnh, vì sự sinh trưởng và phát triển số lượng lớn vi sinh vật gây bệnh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát tiển của các vi khuẩn có lợi

1.2.3.2 Tổng hợp các chất đối kháng vi sinh vật gây hại

Bên cạnh cạnh tranh lọai trừ, các vi sinh vật probiotics còn sản sinh các chất kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn khác như lactoferrun, lysozym, hydrogen peroxide cũng như một số acid hữu cơ khác Các chất này gây tác động bất lợi đối với các vi khuẩn khác đặc biệt là các vi khuẩn gây hại (Conway và cộng sự, 1996)

Hoạt động này có được là do:

 Làm giảm pH của môi trường trong khoang ruột thông qua tổng hợp các acid hữu

cơ như acid lactic, acid acetic, acid propionic

 Làm giảm khả năng oxi hóa khử của môi trường ruột

 Sản xuất H2O2 trong điều kiện kị khí

 Đặc biệt tạo những hợp chất ức chế vi sinh vật có hại như Bacteriocin

a Ảnh hưởng của acid lactic và acid acetic

Sư tích tụ acid lactic và acid acetic làm giảm pH của môi trường và hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) với phổ rộng Ở pH ruột có chứa 8.4% acid acetic và 1.1% acid lactic ở dạng không phân ly Đây là yếu tố quan trọng vì ở dạng không phân ly chúng được xem như chất đối kháng chống lại sự tăng trưởng của nhiều vi khuẩn gây bệnh cũng như vi khuẩn gây thối (Đỗ Thị Liễu, 2011) Những acid acetic và acid lactic ở dạng không phân ly có thể thấm vào màng tế bào vi khuẩn, khi ở môi trường nội bào với pH cao chúng phân ly tạo ra ion hydrogene, ảnh hưởng đến các chức năng trao đổi chất của tế bào (Đỗ Thị Liễu, 2011)

b Khả năng kháng khuẩn của dehydrogene peroxide (H 2 O 2 )

H2O2 được hình thành bởi vi khuẩn acid lactic (LAB) và ảnh hưởng đến nhiều vi sinh vật khác nhau đã được nhiều tác giả nghiên cứu Các chủng LAB tạo ra H2O2 trong môi trường chứa glucose với điều kiện kỵ khí