Chẩn đoán vi khuẩn tả ở người đến xét nghiệm tại bệnh viện quân y 103 năm 2013 bằng kỹ thuật PCR

Cholerae đã được nghiên cứu để thiết kế mồi .... cholera O1 đã được sử dụng để thiết kế mồi .... cholera O1 El Tor đã được sử dụng để thiết kế mồi ... cholera O1 đã được nghiên cứu để th

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Kiều Chí Thành và PGS.TS Phạm Văn Ty những người đã trực tiếp hướng dẫn về khoa học và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi nghiên cứu, hoàn thành đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị cán khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn – Bệnh viên Quân y 103 đã nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo và chia sẻ với tôi trong thời gian thực tập

Nhân dịp này, tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh học, và các thầy giáo, cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học đã động viên, chỉ dẫn, đóng góp ý kiến và tạo những điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

Hà Nội tháng 12-2014

Học viên: Trương Thị Lan Hương

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH VẼ

DANH MỤC VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

1.Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 1

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 1.1 Tình hình bệnh tả Error! Bookmark not defined 1.1.1 Tình hình bệnh tả trên thế giới Error! Bookmark not defined 1.2 Vi khuẩn tả Error! Bookmark not defined 1.2.1 Đặc điểm hình thái Error! Bookmark not defined 1.2.2 Phân loại Error! Bookmark not defined 1.2.3 Kháng nguyên và cấu trúc lớp vỏ vi khuẩn Error! Bookmark not defined 1.2.4 Độc tố của vi khuẩn tả Error! Bookmark not defined 1.2.5 Khả năng gây bệnh Error! Bookmark not defined 1.2.6 Diễn biến bệnh Error! Bookmark not defined 1.2.7 Chẩn đoán Error! Bookmark not defined

1.2.7.1 Thời kỳ ủ bệnh Error! Bookmark not defined 1.2.7.2 Thời kỳ khởi phát Error! Bookmark not defined 1.2.7.3 Thời kỳ toàn phát Error! Bookmark not defined

1.2.8 Một số phương pháp chẩn đoán tả Error! Bookmark not defined 1.3 Tổng quan về kĩ thuật PCR Error! Bookmark not defined 1.3.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR Error! Bookmark not defined 1.3.2 Các giai đoạn của một chu kì phản ứng PCR Error! Bookmark not defined 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR Error! Bookmark not defined

1.3.4 Ứng dụng kĩ thuật PCR trong y học Error! Bookmark not defined Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2 Vật liệu nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.2.1 Chủng giống vi sinh vật Error! Bookmark not defined 2.2.2 Mồi PCR Error! Bookmark not defined

2.3 Hóa chất và thiêt bị Error! Bookmark not defined

2.3.1 Hóa chất Error! Bookmark not defined 2.3.2 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.3.3 Môi trường nuôi cấy và dung dịch đệm Error! Bookmark not defined

2.4 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.4.1 Phương pháp mô tả Error! Bookmark not defined 2.4.1.1 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu Error! Bookmark not defined 2.4.1.2 Các kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển bệnh phẩm Error! Bookmark not defined

2.4.2 Phương pháp cấy truyền và giữ giống vi sinh vật Error! Bookmark not

defined

2.4.3 Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen appA và phyC Error! Bookmark not defined

2.4.4 Tách chiết ADN khuôn mẫu bằng KIT QIAGEN Error! Bookmark not defined

2.4.5 Phương pháp m-PCR dùng để xác định nhanh serogroup O1, O139 và hai

biotype của V cholerae serogroup O1 Error! Bookmark not defined

2.4.5.1 Phản ứng m-PCR1 Error! Bookmark not defined 2.4.5.1 Phản ứng m-PCR2 Error! Bookmark not defined 2.4.6 Điện di sản phẩm PCR Error! Bookmark not defined CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 3.1.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới tính, lứa tuổi Error! Bookmark not defined

3.2 Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen mã hóa cholera toxin ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và

rstR Error! Bookmark not defined 3.2.1 Phân tích trình tự gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR Error! Bookmark not

defined

3.1.2 Thiết kế mồi nhân gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR từ V Cholerae Error!

Bookmark not defined

3.3 Khuếch đại gen ctxA, rfb từ V Cholerae bằng phản ứng m-PCR1 Error!

Bookmark not defined

3.4 Khuếch đại gen tcpA, rstR từ V Cholerae bằng m-PCR2 Error! Bookmark not

defined

3.5 So sánh phương pháp chẩn đoán tả bằng kĩ PCR với kĩ thuật chẩn đoán tả bằng

kĩ thuật nuôi cấy kết hợp sử dụng kháng huyết thanh 63

KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO 3

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Phân lập V cholerae týp cổ điển và týp El Tor 3

Bảng 2.1 Các đoạn mồi dùng trong kỹ thuật m-PCR phát hiện gen đặc hiệu của V cholerae 27

Bảng 2 2 Hỗn hợp phản ứng cho m-PCR1 đa mồi bằng Master-Mix (promega) 32

Bảng 2 3 Hỗn hợp phản ứng cho m-PCR2 đa mồi bằng Master-Mix (promega) 33

Bảng 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi 35

Bảng 3.2 Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi 36

Bảng 3.3 Phân bố bệnh nhân dương tính V cholerae theo giới tính 37

Bảng 3.4 Danh sách các chủng V Cholerae đã được nghiên cứu để thiết kế mồi 38

Bảng 3.5 Danh sách các chủng V cholera O1 đã được sử dụng để thiết kế mồi 40

Bảng 3.6 Danh sách các chủng V cholera O139 đã được sử dụng để thiết kế mồi 41

Bảng 3.7 Danh sách các chủng V cholera O1 El Tor đã được sử dụng để thiết kế mồi 42

Bảng 3.8 Danh sách các chủng V cholera O1 đã được nghiên cứu để thiết kế mồi nhân gen rstR 44

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của các thông số trong chu kỳ nhiệt đến phản ứng PCR khuếch đại gen ctxA, rfb 48

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của các thông số trong chu kỳ nhiệt đến phản ứng PCR khuếch đại gen tcpA, rstR từ V Cholerae bằng m-PCR2 51

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Tình hình bệnh tả tại Việt Nam từ năm 2002 – 2011 7

Hình 1.2 Phân bố ca bệnh tả tại Việt Nam, 2007 – 2011 8

Hình 1.3 Hình thái ngoài vi khuẩn tả V cholerae 8

Hình 1.4 Biểu đồ khu trú của vi khuẩn trong ruột 13

Hình 1.5 Cơ chế gây bệnh của Vibrio bên trong cơ thể người 14

Hình 1 6 Các bước thực hiện phản ứng PCR một chu kỳ 20

Hình 3.1 Biểu đồ phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới tính 35

Hình 3.2 Biểu đồ đánh giá độ tuổi trong thu thập mẫu 37

Hình 3.3 Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của 4 gen mã hóa cholera toxin có nguồn gốc từ V cholerae 39

Hình 3.4 Trình tự gen ctxA mã hóa cholera toxin từ V cholerae được sử dụng để thiết kế mồi 39

Hình 3.5 Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của 2 gen rfbQ có nguồn gốc từ V cholerae O1 40

Hình 3.6 Trình tự gen rfbQ từ V cholerae O1 được sử dụng để thiết kế mồi 41

Hình 3.7 Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của gen IS1358 từ 3 chủng V cholera O139 41

Hình 3.8 Trình tự gen IS1358 từ V cholerae O139 được sử dụng để thiết kế mồi 42

Hình 3.9 Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của gen tcpA từ 6 chủng V cholera O1 biotype El Tor 43

Hình 3.10 Trình tự gen tcpA từ V cholerae O1 được sử dụng để thiết kế mồi 44

Hình 3.11 Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của 6 gen mã hóa toxin coregulated pilus có nguồn gốc từ V cholera O1 biotype Classical 45

Hình 3.12 Trình tự gen rstR từ V cholerae O1 được sử dụng để thiết kế mồi]…………46

Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm m-PCR1 nhân gen ctxA, gen rfb O1 và rfb O139………….… … 49

Hình 3.14 Kết quả điện di sản phẩm m-PCR2 nhân gen tcpA, rstR từ V Cholerae 52

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Tên đầy đủ

TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose ( Môi trường

chọn lọc nuôi cấy vi khuẩn tả )

V.cholerae Vibriocholerae (Vi khuẩn tả )

CT Cholerae Toxin ( Độc tố tả )

N.A.G Non Aglutinable Vibrios

NCBI National Center for Biomedical Informatics

m- PCR MultiplexPolymerase Chain Reaction

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Vibrio cholerae là tác nhân quan trọng nhất gây bệnh dịch tả trên người, đặc biệt

hai serogroup O1, O139 [49], gây chết hàng triệu người mỗi năm trên thế giới [60]

Dịch tiêu chảy cấp đang có chiều hướng gia tăng ở các địa phương ở nhiều địa phương Khống chế dịch tả là mục tiêu lớn trong chương trình quốc gia phòng chống bệnh tiêu chảy của Việt Nam Với những thành tựu và kinh nghiệm phòng chống dịch tả trong nhiều năm qua, ngày nay bệnh tả không còn là nỗi khiếp đảm của mỗi người dân, của các tổ chức chính quyền và xã hội Các điều kiện chuẩn mực về kiểm soát môi trường

ở nước ta còn lạc hậu Các vấn đề cung cấp nước, vệ sinh thực phẩm, dinh dưỡng an toàn

và vấn đề xử lý vệ sinh chất thải chưa làm được bao nhiêu, nhiều nơi còn bị buông lỏng hoặc quên lãng Bệnh nhân mắc bệnh tả nếu không được phát hiện sớm và điều trị kịp

thời sẽ bị mất nước và chất điện giải dẫn đến tử vong [53]

Bệnh tả lây truyền rất nhanh qua đường tiêu hoá và môi trường (nước, chất nôn, phân, rác) do vậy việc phát hiện sàng lọc mẫu âm tính nhanh có ý nghĩa hết sức quan trọng, không những giúp đỡ bệnh nhân có ngay phác đồ điều trị mà còn giúp các nhà dịch

tễ có hướng xử lý khoanh vùng, chủ động trong phòng chống dịch, không để dịch lây lan rộng trong cộng đồng Trong đó phương pháp nuôi cấy và phân lập được thực hiện phổ biến để định danh loài vi khuẩn này và được xem như tiêu chuẩn vàng Tuy nhiên chi phí cao, tốn nhiều thời gian và nhân công đồng thời cũng không thể phân biệt một cách chính

xác giữa V cholerae chủng sinh độc tố và không sinh độc tố [15]

Vấn đề phát hiện nhanh và chính xác V cholerae là việc làm cần thiết Cho nên m-PCR được xem là công cụ hữu hiệu để giúp xác định nhanh Vibrio gây bệnh, nhất là xác định nhanh các serogroup và biotype của V cholerae [38] Đáp ứng với tình hình thực

tiễn kể trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: "Chẩn đoán vi khuẩn tả ở người đến xét nghiệm tại bệnh viện Quân y 103 năm 2013 bằng kỹ thuật PCR"

2 Mục đích nghiên cứu

 Xác định tỷ lệ bệnh nhân dương tính với Vibrio cholerae (V cholerae) trong giai

đoạn từ tháng 3 năm 2013 đến tháng 7 năm 2013

 Phát hiện V cholerae, xác định nhanh serogroup O1, O139 và hai biotype của V

cholerae serogroup O1 bằng m-PCR

3 Nội dung nghiên cứu

Sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu để khuếch đại các đoạn gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR mã hóa V.cholerae O1, O139, NAG và độc tố tả (cholera toxin A) bằng phản

ứng chuỗi m-PCR Quá trình này được lặp lại nhiều lần để tổng hợp hàng triệu bản sao của đoạn gen từ một vài phân tử ADN ban đầu qua đó có thể phát hiện được các đoạn gen dưới đèn UV sau khi điện di

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt

1 Trần Linh Thước (2009), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục

2 Nguyễn Vũ Trung và Nguyễn Thị Hồng Nhung (2008), Hoàn thiện kỹ thuật tách chiết ADN của Shigella và EIEC trực tiếp từ phân, Nghiên cứu y học, 55(3):

p.104-109

3 Nguyễn Vũ Trung và Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2008), Phát triển và hoàn thiện qui trình tách chiết AND xác định trực tiếp Escherichia coli gây tiêu chảy bằng PCR,

Nghiên cứu y học, 56(4): p 92-97

4 Phạm Thế Vũ (2008), Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh Vibrio cholerae gây dịch tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008, Luận văn

thạc sĩ Sinh học: 29 – 31

Tài liệu tiếng Anh

5 Agarwal, V., et al., 1995 Rapid detection of Vibriocholerae 0139 in faecal specimens by coagglutination Indian J Med Res 101: p 55-6

6 Albert, M J (1993) Personal reflections on the discovery of Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal: a tribute to team work and international collaboration J

Diarrhoeal Dis Res 11:207-210

7 Alvarez, J., et al., 2004 Development of a multiplex PCR technique for detection and epidemiological typing of salmonella in human clinical samples J Clin Microbiol 42(4): p 1734-8

8 Bani, S., et al., (2007) Molecular characterization of ICEVchVie0 and its disappearance in Vibrio cholerae O1 strains isolated in 2003 in Vietnam FEMS Microbiol Lett 266(1): 42-88

9 Bauer A and L.M Rørvik, (2003) A novel multiplex PCR for the identification of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus, Letters in Applied Microbiology ISSN 0266-8254

10 Beltran, P., Delgado, G., Navarro, A., Trujillo, F., Selander, R K & Cravioto, A

(1999) Genetic diversity and population structure of Vibrio cholerae J Clin

Microbiol 37, 581–590

11 Bhanumathi R, Sabeena F, Isac SR, Radhakutty G & Singh DV, (2002)

Characterization of a toxigenic Vibrio cholerae O139 strain belonging to a new ribotype and isolated from a diarrheal patient J Clin Microbiol 40: 4779–4781

12 Bik EM, Bunschoten AE, Gouw RD & Mooi FR, (1995) Genesis of the novel epidemic Vibrio cholerae O139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesis EMBO J 14: 209–216

13 Bik, E M., A E Bunschoten, R D Gouw, and F R Mooi, (1995) Genesis of the novel epidemic Vibrio cholerae O139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesis EMBO J 14:209–216

14 Calia KE, Murtagh M, Ferraro MJ & Calderwood SB, (1994) Comparison of Vibrio cholerae O139 with V cholerae O1 classical and El Tor biotypes Infect

Immun 62: 1504–1506

15 Chakraborty S, Garg P, Ramamurthy T et al (2001) Comparison of antibiogram, virulence genes, ribotypes and DNA fingerprints of Vibrio cholerae of matching serogroups isolated from hospitalised diarrhoea cases and from the environment during 1997–1998 in Calcutta, India J Med Microbiol 50: 879–888

16 Chakraborty S, Mukhopadhyay AK, Bhadra RK et al, (2000) Virulence genes in environmental strains of Vibrio cholerae Appl Environ Microbiol 66: 4022–4028

17 Chow, K H., Ng, T K., Yuen, K Y & Yam, W C (2001) Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae by PCR J Clin Microbiol 39, 2594–2597

18 Chow, K.H., et al., 2001 Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae by PCR

J Clin Microbiol 39(7): p 2594-7

19 Comstock, L E., J A Johnson, J M Michalski, J G Morris, Jr., and J B Kaper,

(1996) Cloning and sequencing of a region encoding a surface polysaccharide of Vibrio cholerae O139 and characterisation of the insertion site in the chromosome

of Vibrio cholerae O1 Mol Microbiol 19:815–826

20 DePaola, A (1981) Vibrio cholerae in marine foods and environmen-tal waters: a literature review J Food Sci, 66-70

21 Devarati Dutta, Goutam Chowdhury, Gururaja P Pazhani, Sucharita Guin,

Sanjucta Dutta, et al (2013) Vibrio cholerae Non-O1, Non-O139 Serogroups and Cholera-like Diarrhea, Kolkata, India www.cdc.gov/eid, Vol 19, No 3, March

2013

22 Dong Tu Nguyen, Tuan Cuong Ngo, Huy Hoang Tran, Thanh Huong Le, Hoai Thu

Nguyen, (2012), Characterization of Vibrio cholerae O139 of an Aquatic Isolate in Northern Vietnam Open Microbiol J, 6: 14-21

23 Dutta B, Ghosh R, Sharma NC, Pazhani GP, Taneja N, Raychowdhuri A, et al

(2006) Spread of cholera with newer clones of Vibrio cholerae O1 El Tor, serotype Inaba, in India J Clin Microbiol; 44 : 3391-3

24 Faruque SM, Roy SK, Alim ARMA, Siddique AK, Albert MJ (1995) Molecular epidemiology of toxigenic Vibrio cholera in Bangladesh studied by numerical analysis of rRNA gene restriction patterns J Clin Microbiol; 33 : 2833-8

25 Faruque SM, Sack DA, Sack RB, Colwell RR, Takeda Y & Nair GB

(2000).Emergence and evolution of Vibrio cholerae O139 Proc Natl Acad Sci

USA 100: 1304–1309

26 Faruque, S M., Tam, V C., Chowdhury, N., Diraphat, P., Dziejman, M.,

Heidelberg, J F., Clemens, J D., Mekalanos, J J & Nair, G B (2007) Genomic analysis of the Mozambique strain of Vibrio cholera O1 reveals the origin of El Tor strains carrying classical CTX prophage Proc Natl Acad Sci USA 104, 5151–

5156

27 Fields, P.I., et al., 1992 Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 strains from the Latin American cholera epidemic J Clin Microbiol 30(8): p 2118-21

28 Garg P, Nandy RK, Chaudhry P, Chaudhry NR, De K, Ramamurthy T, et al

(2003) Emergence of V cholerae O1 biotype EI Tor serotype Inaba from prevailing O1 ogawa serotype strains in India J Clin Microbiol; 4249-53