Luan van hoan chinh

Phương pháp xác định thành phần hóa học các ankaloit Phân tích và nhận dạng sơ bộ thành phần hóa học của dịch chiết từrễ cây cau với các dung môi khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng

về thành phần hóa học của một số cây thuốc nói trên Cây cau cũng đã có nhiềucông trình nghiên cứu về lá, vỏ và hạt quả cau với rất nhiềutác dụng Cụ thể, lá caudùng chữa bệnh kinh giật ở trẻ em; vỏ quả cau và hạt cau chữa bệnh phù toàn thân,chướng bụng, khó tiêu, tiểu tiện khó khăn…

Rễ cau, thường là rễ cau nổicó tác dụng chữa căn bệnh phổ biến ở đàn ông đó

là bệnh yếu sinh lí Theo những tài liệu mà chúng tôi cập nhật được, thì chưa thấy

có công trình nào ngiên cứu về thành phần hoá học và dược tính của các hợp chấtancaloit có trong rễ cau.Vì vậy đây là một vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu

1.2 Tính cấp thiết của đề tài

Việc chữa trị chứng bệnh yếu sinh lí là một trong những nhu cầu cần thiết

vì nó đem lại lợi ích về sức khỏe và tinh thần cho nhiều người.Theo chúng tôiđược biết, đã có nhiều loại thuốc được sản xuất nhằm giúp cải thiện tình hìnhtrên.Tuy nhiên một số người lại cho rằng những bài thuốc dân gian thì thíchhợp với họ hơn

Ở nước ta thuốc y học cổ truyền được người dân ưa dùng bởi lý do vừa ítđộc, vừa tiện dùng lại rẻ tiền Đa số các người bệnh sử dụng bài thuốc rễ cauđược hỏi đều cho rằng nó có tác dụng tốt đồng thời không gây ảnh hưởng xấuđến sức khỏe.Để làm cơ sở cho việc ứng dụng một cách khoa học, rộng rãi vàhiệu quả,chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần vàcấu tạo một số ancaloittừ rễ cây cau”

2 Đối tượng và mục đích nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Rễ cây cau tại huyện Bình Sơn – tỉnh Quảng Ngãi

2.2 Mục đích nghiên cứu

- Nghiên cứu quá trình chiết các hợp chất ankaloit từ rễ cây cau

- Xác định thành phần hóa học, công thức cấu tạo của một số ankaloic chính

- Nghiên cứu tách và xác định cấu trúc một số cấu tử chính

- Thử nghiệm hoạt tính sinh họccủa một số ankaloit trong rễ cau

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu lý thuyết:

* Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo trong và ngoài nước có liênquan đến đề tài

* Hội thảo, trao đổi kinh nghiệm với các chuyên gia, thầy cô giáo và đồngnghiệp

3.2 Nghiên cứu thực nghiệm

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu: Cách lấy mẫu, xử lý mẫu.

3.2.2 Phương pháp vật lý và hóa học xác định một số chỉ tiêu hóa lý

* Xác định độ ẩm : Xác định độ ẩm bằng phương pháp trọng lượng

* Xác định hàm lượng một số kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp thụnguyên tử

3.2.3 Phương pháp chiết tách ankaloit từ rễ cây cau

*Chọn dung môi để chiết : Clorfom, ancol

*Điều kiện chiết

3.2.4 Phương pháp xác định thành phần hóa học các ankaloit

Phân tích và nhận dạng sơ bộ thành phần hóa học của dịch chiết từrễ cây cau với các dung môi khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ HPLC-MS, ESI-MS, sắc kí khí GC-MS

3.2.5 Phương pháp phân lập các ankaloit

- Sắc kí bản mỏng

- Phân tích sắc kí cột

- Đo phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC, H-H COSI

3.2.6 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

- Hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật

- Hoạt tính kháng oxi hóa

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Giải thíchkhoa học một số kinh nghiệm dân gian về ứng dụng của rễ cau

- Tổng hợp kiến thức về hợp chất thiên nhiên để giảng dạy bộ môn hóa trong nhà trường phổ thông được tốt hơn

5 Bố cục luận văn

Luận văn gồm có 70trang không kể phụ lục, trong đó có 25 hình, 20 biểu bảng

vàđược bố cục như sau: Mở đầu (3 trang); Tổng quan lí thuyết (30trang); Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (11 trang); Kết quả và bàn luận 22 trang); Kết luận

và kiến nghị (2 trang); Tài liệu tham khảo (2 trang) Nội dung của luận văn được

chia thành 3 chương:Chương 1 ( Tổng quan), Chương 2 (Nghiên cứu thực nghiệm),Chương 3 (Kết quảvà bànluận)

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN 1.1 Khái quát về họ Cau [2]

Họ Cau hay họ Cọ, họ Cau dừa hoặc họ Dừa (danh pháp khoa học:

Arecaceae, đồng nghĩa Palmae) là một họ thực vật có hoa, thuộc về lớp thực vật

một lá mầm và nằm trong bộ Arecales (bộ Cau) Hiện nay, bộ Cau được biết có 202chi với khoảng 2.600 loài, phần lớn sinh sống ở vùng nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới.Trong các họ thực vật thì họ Cau có lẽ là dễ nhận biết nhất Loài điển hình trong họnày là cau, ngoài ra còn có các loài khác như chà là, cọ, dừa, mây (hình 1.1) Cácloài cây thuộc họ này đã được tìm thấy trong các hóa thạch có niên đại khoảng70÷80 triệu năm trước, trong thời kỳ cuối của kỷ Phấn trắng (Cretaceous)

Cây dừaCây cau

Hình 1.1 Một số loài cây thuộc họ Dừa

1.1.1 Phân loại khoa học [23]

Tên khoa học của cây cau là Areca catechu L Ngoài ra nó còn được gọi là

Mạy làng (Tày), Pơ lạng (K’ho), Tân lang hay Binh lang (Trung Quốc), Pinang (Malaysia), Aréquier (Pháp), Arecanut (Anh),

Cây cau được trồng ở nhiều nơi, nhất là được trồng nhiều tại khu vực nhiệt đới

châu Á và Thái Bình Dương cũng như ở phía đông châu Phi

Ở nước ta Cau trồng được ở khắp các tỉnh thành trên toàn quốc, trồng nhiều ởThanh Hóa, Nghệ An,Quảng Ngãi, Quảng Nam, Tam Quan-Bình Định

1.1.3 Đặc tính thực vật

Cây cau là cây sống lâu năm Thân mọc thẳng, không chia cành, có nhiều đốt

do vết lá cũ rụng Lá tập trung ở ngọn, cuống phát triển thành bẹ to ôm lấy thân,phiến lá to, rộng, xẻ lông chim Hoa tự mọc thành buồng, ngoài có mo bao bọc, hoađực ở trên, hoa cái ở dưới Hoa đực nhỏ màu trắng, thơm, màu lục Hoa cái to, baohoa không phân hoá Quả hạch hình trứng, lúc còn non có màu xanh, vỏ bóng nhẵn,khi già có màu vàng, vàng cam hoặc đỏ Quả bì có sợi Hạt có nội nhủ xếp cuốn.Hạt hình nón cụt, đầu tròn giữa đáy hơi lõm, màu nâu nhạt, vị chát Rễ caucó hailoại: rễ cau nổi và rễ cau chìm Rễ cau nổi to hơn rễ cau chìm, có màu trắng hồng.Cau có 2 loại chính là cau vườn và cau rừng.Cau vườn cao độ 10 ÷ 20m,đường kính khoảng 10 ÷ 15cm, lá có bẹ to dài từ 1,5m đến 2m, hình lông chim Hoanhỏ, màu trắng ngà, thơm (hình 1.2) Rễ cau một phần mọc nổi trên mặt đất, gọi là

rễ nổi Phần kia đâm sâu dưới đất, rễ chìm nhỏ và dài hơn rễ nổi (hình 1.3):

Hình 1.2 Một số hình ảnh về cau vườn (Gia tân lang)

Hình 1.3.Các bộ phận của cau

Cau rừng (Areca laosensis O.Becc): cây bé, thân trụ mọc thẳng đứng đơn độc,cao 2 - 6m, có đốt đều đặn, cách xa nhau 8 - 10cm, lá dài khoảng 1m, dạng kép lôngchim, các lá chét xếp vào rất sát nhau, không đều hình cong liềm, mép hơi có răng,

lá tập trung ở ngọn, hoa vàng nhạt Quả nhỏ, nhọn, chắc, hình trứng, khi chín có Cây cau,quả cau,hạt cau Rễ cau nổi Rễ cau chìm

màu vàng cam Nước ta, vùng núi Nghệ An, Thanh Hóa có nhiều cau rừng (hình1.4):

a

1.1.4.Công dụng của rễ cau

Cây cau có rất nhiều công dụng sinh học đồng thời còn có một vị trí quantrọng trongvăn hóa Việt Nam Ngày xưa trầu cau là những thứ không thể thiếu trongcác dịp xã giao hay lễ hội của người Việt.Tục ăn trầuthể hiện nếp sinh hoạt mangđậm tính dân tộc độc đáo của người Việt Nam Ngày nay phong tục này tuy đã mất

đi khá nhiều songnó vẫn còn mang ý nghĩa sâu đậm trong văn hóa và văn chươngnước ta

Hạt cau có nhiều tác dụng như chữa bệnh ăn không tiêu, chướng bụng, ợ chua

Ăn trầu còn có tác dụng bảo vệ hàm răng Chất chát của cau làm cho chânrăng co lại, ôm sát răng Răng trở nên chắc, không lung lay Ngoài ra hạt cau còn córất nhiều công dụng khác

Rễ cau, theo kinh nghiệm dân gian, nhữngngười yếu sinh lý có thể dùng rễ causắc với nước hoặc ngâm rượu uống

* Một sốđơn thuốc có rễ cau [24]

Hình 1.4 Một số hình ảnh về cau rừng

Thường dùng loại rễ màu trắng mọc lộ ra trên mặt đất, gọi là rễ cau nổi Dượcliệu được thu hái quanh năm, rửa sạch, phơi hay sấy khô.

* Chữa đái rắt, đái són: Rễ cau 10g, rễ trầu không 10g (có thể dùng thân và

lá) thái nhỏ, phơi khô, sắc với 400ml nước còn 100ml, uống làm hai lần trong ngày.Dùng liền vài ngày cho đến khi khỏi Phụ nữ có thai không được dùng

* Chữa thận hư, yếu sinh lý: Rễ cau nổi dùng độc vị với liều 20 – 30g dưới

dạng nước sắc Hoặc rễ cau 8g, ba kích 20g, thục địa 20g, hoài sơn 20g, sâm bốchính 40g, quế thanh 8g Tất cả thái nhỏ, phơi khô, sao vàng (trừ quế), tán nhỏ, râybột mịn, trộn với mật hoặc sirô làm thành viên to bằng quả táo Ngày uống 5 viêntrước khi đi ngủ Dùng liên tục trong một tháng

*Chữa phù thũng: Rễ cau non 4g, rễ dứa dại 8g, nướng, vỏ cây đại 8g, sao

vàng, hương phụ 8g, hoắc hương 8g, tía tô 8g, hậu phác 8g, rễ si 8g Sắc uống trongngày (Kinh nghiệm của nhân dân ở các tỉnh phía Nam)

*Chữa hen suyễn: Rễ cau 30g, mốc cây cau 20g, sắc uống trong ngày.

1.2 Ancaloit [14]

1.2.1 Khái niệm:

Theo Polonopski: "Ancaloit là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, đa số cónhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong độngvật, thường có hoạt tính sinh học mạnh và cho phản ứng hóa học với một số thuốcthử gọi là thuốc thử chung của ancaloit”

Có một số hợp chấtNitơ không ở dị vòng mà ở mạch nhánh cũng được xếpvào ancaloit nhưephedrin trong cây ma hoàng, conchixin trong hạt cây tỏi độc.Một số ancaloitkhông có phản ứng kiềm nhưconchixin, không có phản ứng acidyếu như arecaidin và guraxin trong hạt cau

1.2.2 Phân bố ancaloit trong tự nhiên [16]

1.2.2.1 Sự phân bố địa dư

Các nghiên cứu tổng quan của Mc Nair (1931, 1935) và Levin 1976chothấyđại đa số cây có ancaloit sống ở vùng nhiệt đới, mọc ở độ cao tương đối thấp sovới mặt nước biển Những điều kiện thuận lợi nhất cho sự sinh trưởng của cây cũng

đồng thời là những điều kiện thuận lợi nhất cho quá trình sinh tổng hợp ancaloit(James, 1950, 1953: Mothes, 1960).

1.2.2.2 Sự phân bố ancaloit trong tổ chức cây

Ngày nay người ta đã biết khoảng hơn 6000 ancaloit từ hơn 4000 loài hầu hết

là thực vật bậc cao (chiếm khoảng 15-20% tổng số các loài) Các họ thực vật giàualcaloit nhưApocynaceae,Papaveraceae, Fabaceae Một số động vật, vi khuẩncũng chứa ancaloit nhưSamandarin, samandaron (từ Kỳ nhông lửa), Batrachotoxin(từ Ếch độc), Bufotenin từ tuyến da Cóc

* Các bộ phận chứa ancaloit: Trong cây, ancaloit thường tập trung ở

một số bộ phận nhất định vói mức độ vết hoặc ở tỷ lệ phần vạn, mười vạn

Ví dụ:

+ Hạt: mã tiền, cà dược + Quả: anh túc, tiêu, ớt, cau

+ Lá: thuốc lá, lá trầu + Hoa: cà dược

+ Thân: ma hoàng+ Rễ: ba gạc, lựu

+ Vỏ thân: canhkina + Củ: bình vôi, bách bộ

* Hàm lượng ancaloit:

Thay đổi theo điều kiện dinh dưỡng, sinh lý của cây Mặc dù ancaloit tậptrung chủ yếu ở các tổ chức sinh trưởng hoạt động nhất nhưng nồng độ ancaloit caonhất không phải ở các tế bào non của tổ chức này mà là ở các tế bào đang hoákhông bào Vì vậy, tại các không bào có chứa nhiều ancaloit Sự biến đổi hàmlượng ancaloit của 1 tổ chức trong quá trình sinh trưởng rất đáng kể Nói chung hàmlượng ancaloit tăng nhanh trong giai đoạn phát triển tế bào và hoá không bào, giảmdần trong giai đoạn già cỗi Hiện tượng này thể hiện rõ nhất ở lá.Trong quá trìnhsinh trưởng của cây, thời kỳ ra hoa kết quả ảnh hưởng nhiều đến sự tạo thànhancaloit Sự phân bố ancaloit trong hạt và thời kì hạt nẩy mầm rất khác nhau Trongnicotiana, papaver, datura, erythroxylon không có hoặc có rất ít ancaloit ở hạt.Ngược lại, trong hạt của coffea, delphinium, physostima thì hàm lượng ancaloit làcao nhất trong cây Đối với một số hạt, ancaloit có thể bắt đầu xuất hiện một vàingày (nicotiana, lycopersicon) hoặc vài tuần (datura) sau khi hạt nẩy mầm Điều nàycho thấy sự cần thiết phải xác định đúng thời điểm thu hái dược liệu

Một cây được xem là có ancaloit phải chứa ít nhất 0,05% ancaloit so với dượcliệu khô.Trong cây, ancaloit và các chất khác có liên quan chặt chẽ với nhau Câychứa nhiều ancaloit thường chứa ít hoặc không chứa tinh dầu, tanan và ngược lại.

*Dạng ancaloit trong cây: Đa số ancaloit tồn tại ở dạng muối với axit vô cơ

hoặc hữu cơ và một số ít ancaloit ở dạng glicozit

1.2.3 Cấu trúc và phân loại ancaloit

Đến nay đã biết trên 16.000 ancaloit thiên nhiên với trên 300 dạng cấu trúckhác nhau Việc phân loại chủ yếu dựa vào cấu trúc nhân cơ bản hoặc dựa vàonguồn gốc tạo ra ancaloit [11],[12]

1.2.3.1 Phân loại theo cấu trúc [16]

* Ancaloit không có N ở dị vòng (Proto ancaloit):

Cocain+ Pyrrolizidin

N

N

H

CH2-OH HO

Retronecin+ Quinolizidin

N

N

CH2-OH

Lupinin+ Indol

N H

H HO

Serotonin

+ Quinazolin

N N

O

-N N

O

CH3 Glicorin+ Mocphinan

1.2.3.2 Phân loại theo thực vật học:

Chỉ dựa vào thực vật học, dựa vào nguồn tạo ra các ancaloit Theo cách phânloại này thì mỗi một ancaloit được bắt nguồn từ một loài thực vật nào, ví dụ:ancaloit từ canhkina, ancaloit từ thuốc phiện hoặc có thể bao quát hơn là từ một họthực vật

1.2.3.3 Phân loại theo sự phát sinh sinh học:

Cách phân loại này dựa vào qúa trình sinh tổng hợp các ancaloit trong tế bàosống, bao gồm:

* Ancaloit là dẫn xuất của ornithin

Từ axit amin nithin tạo ra sản phẩm mất nhóm cacboxyl là putrescin cùng vớiprolin, tạo ra các ancaloit có khung tropan, nicotin, ecgonin, necin và stachydrin

* Ancaloit là dẫn xuất của lysin

Từ axit amin lysin tạo ra sản phẩm mất nhóm cacboxyl là cadaverin cùng vớiaxit pipecolic, sau cùng tạo ra các ancaloit có khung piperidin, quinolizidin

* Ancaloit là dẫn xuất của phenuyalanin, tyrosin, và dihidroxy phenylalanin

* Ancaloit là dẫn xuất của tryptophan

Axit amin tryptophan và sản phẩm mất nhóm cacboxyl là tryptamin là tiềnchất của các ancaloit có nhân indol

1.2.4 Một số ancaloit trong cau

Các cây cùng họ thường chứa các ancaloit cùng nhóm Ví dụ cây cà phê chứa

các ancaloit chứa nhân purin, cây canhkina chứa các ancaloit nhân quinolin, cây cau

chứa những ancaloit có nhân piridin và piperidin.

Theo kết quả nghiên cứu trước đây, hoạt chất chính trong hạt cau

gồm:arecolin, arecaidin, guvacolin, guvaxin (bảng 1.1):

Bảng 1.1 Một số ancaloit trong hạt cau

NH

C

OO

CH3

NH

C

OOH

1.2.5 Tính chất chung của ancaloit [4]

1.2.5.1 Lý tính

* Trạng thái tự nhiên: Phần lớn ancaloit trong công thức cấu tạo có oxi thường

ở thể rắn ở nhiệt độ thường Ví dụ: Morophin (C17H19NO3), codein (C18H21NO3)…Những ancaloit trong công thức cấu tạo không có oxi thường ở thể lỏng.Ví dụ như

Coniin (C8H17N), nicotin (C10H14N2)…Các ancaloit ở thể rắn thường kết tinh được

và có điểm nóng chảy rõ ràng

* Mùi vị: Đa số các ancaloit không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị caynhư capsaicin, piperin…

* Màu sắc:Hầu hết các ancaloit đều không màu trừ một vài ancaloit có màu

vàng nhưberberin, palmatin, chelidonin

* Độ tan:Hầu hết ancaloit ở dạng bazơ thường không tan trong nước nhưngtan trong dung môi hữu cơ như clorofom, ete, benzen và các ancol bậc 1 có số Cnhỏ như CH3OH, C2H5OH Một số ancaloit do có thêm nhóm phân cực nên tan mộtphần trong nước hoặc kiềm Ví dụ: mocphin, cephalin do có nhóm -OH phenol nêntan trong dung dịch kiềm và các bazơ của chúng thì gần như không tan trong ete.Ngược lại với bazơ, các muối ancaloit nói chung tan được trong nước và cồn nhưnghầu như không tan trong dung môi hữu cơ nhưCHCl3, ete, benzen Có một sốtrường hợp ngoại lệ nhưephedrin, colchixin, ecgovonin, các bazơ của chúng tanđược trong nước đồng thời cũngtan trong dung môi hữu cơ và các muối của chúngthì ngược lại Dựa vào độ tan khác nhau của ancaloit dạng bazơ và dạng muối người

ta sử dụng dung môi thích hợp để chiết xuất, phân lập và tinh chếancaloit

* Năng suất quay cực: Phần lớn ancaloit có khả năng quay cực vì trong phân

tử có cacbon bất đối Năng suất quay cực là hằng số giúp ta kiểm tra độ tinh khiếtcủaancaloit Ancaloit có dạng L bao giờ cũng có hoạt tính sinh học mạnh hơnancaloit dạng D hoặc dạng biến thể raxemic

1.2.5.2 Hóa tính

a Tính bazơ: Ancaloit nói chung có tính kiềm yếu là do trong phân tử có nitơ.

Tính bazơ của các ancaloit không giống nhau do mật độ electron tự do trên nguyên

tử N của các ancaloit khác nhau So với các bazơ vô cơ thì tính bazơ của ancaloit

yếu hơn Tính bazơ thể hiện qua giá trị pKb, các bazơ yếu trị số pKb cao và ngượclại Với các ancaloit có tính bazơ yếu cần môi trường axit mạnh hơn để tạo thànhmuối trong dung dịch nước Vì vậy trong môi trường axit yếu một số ancaloit bazơmạnh có thể chuyển thành muối trong khi các bazơ yếu vẫn tồn tại trong dung dịch

dưới dạng bazơ Đặc tính này được ứng dụng trong việc tách các nhóm ancaloit cótrị số pKb khác nhau khỏi hỗn hợp của chúng Người ta có thể tính được độ kiềmcủa các chất thông qua giá trị pKb (bảng 1.2):

Bảng 1.2 Giá trị pK b của một số ancaloit

Dựa vào pKb người ta xếp độ kiềm của các ancaloit như sau:

+ Ancaloit có độ kiềm mạnh thì giá trị pKb :<3

+ Ancaloit có độ kiềm trung bình thì pKb: 3 ÷ 7

+ Ancaloit có độ kiềm yếu thì pKb: 7 ÷ 10

+ Ancaloit có độ kiềmrất yếu thì pKb : 10 ÷ 12

Ngoại lệ: ancaloit không còn tính kiềm như ricinin, colchicin, hoặc có chất cóphản ứng axit yếu nhưarecaidin, guvacin Do có tính kiềm nên một số ancaloit cóthể làm xanh quì tím; tác dụng với axit tạo muối; làm kết tủa Fe (OH)3, Al (OH)3

c.Hoạt tính sinh lí cao

Các ancaloit có tác dụng và hệ thần kinh rất mạnh và có tác dụng lí hóa đốivới cơ thể người và động vật Con người đã sử dụng các ancaloit với liều lượng nhỏ

để chữa bệnh hay giải khát như cacao, cà phê, Nhiều ancaloit là chất gây nghiệncực kì nguy hiểm đối với con người như thuốc phiện, heroin chúng là những chất

ma túy cực kì nguy hiểm, cần phải lánh xa chúng Các ancaloit có chứa lưu huỳnhthường có độc tính rất mạnh, người ta thấy các ancaloit này trong các loại nấm độc

1.2.6 Thuốc thử của ancaloit

* Các thuốc thử thông thường tạo kết tủa với ancaloit :

+ Thuốc thử Dragendorff tạo kết tủa vàng da cam đến đỏ với ancaloit

+ Thuốc thử Mayer tạo kết tủa màu trắng hoặc vàng cam với ancaloit

+ Thuốc thử Wagner (Bouchardat) tạo kết tủa vàngnâu với ancaloit

+ Dung dịch axit picric

* Các thuốc thử thông thường tạo màu với ancaloit :

+ Dung dịch H2SO4 đậm đặc (D = 1,84 g/ml)

+ Dung dịch HNO3 đậm đặc (D = 1,4 g/ml)

+ Dung dịch AgNO3 1%

1.2.7 Quá trình sinh tổng hợp ancaloit trong tự nhiên

Sinh tổng hợp ancaloit đã được Vinterstein và Trier chứng minh vào năm

1931 Ông cho rằng, ancaloit là dẫn xuất của các axit amin Sau này người ta sửdụng axit amin có gắn đồng vị phóng xạ (13C, 15N) đã chứng minh hầu hết cáckhung cơ bản của ancaloit đều do các ancaloit kết hợp với 1 số gốc như axetat, hemihoặc monotecpin tạo ra

Những phản ứng chung trong quá trình tạo thành ancaloit

Sinh tổng hợp ancaloit tạo thành liên kết C-N ở dị vòng, trong đó N ở axitamin mạch thẳng được coi là tiền chất do đó phải thực hiện một số phản ứng

1.2.7.1 Sự tạo thành hợp chất amit

Sự tạo thành hợp chất amit thường do phản ứng của nhóm cacbonyl hoạt độngvới nhóm amino Để hoạt hóa axit thường dùng ATP (Adenosin triphotphat) để tạothành dẫn xuất AMT (Adenosin monophotphat) Sau đó biến đổi tiếp tạo thành

CH3H

N CH NH

CH3H

Harman

Tetrahydroharman

1.2.7.4 Sự ngưng tụ amin vào hệ thống quinoid

Sự ngưng tụ amin vào hệ thống quinoit thường xảy ra ở vị trí octo và para, tạo

ra hợp chất có C-N:

1.2.8 Tình hình nghiên cứu về hợp chất ancaloit trong cây cau

Theo các công trình nghiên cứu trước đây cho thấy trong hạt cau chứa cácthành phần sau:Hoạt chất chính là 4 ancaloit, hàm lượng 2,38 mg/g,chủ yếu làarecolin (C8H13NO2), arecaidin (C7H11NO2), một lượng nhỏ guvacin (C6H9NO2),guvacolin (C7H11NO2) Hàm lượng tanin catechin có trong hạt non khoảng 70%nhưng trong hạt già chỉ còn khoảng 15% đến 20%.Hàm lượng mỡ béo khoảng14% gồm laurin, olein, myristin Hàm lượng gluxit chiếm khoảng 50% và tồntại dưới dạng muối natri

Ngoài các axit béo (axit lauric, axit myristic, axit palmitic, axit stearic,axit phtalic) cau còn chứa những axit amin, một ít tryptophan, methionin, hơn15% prolin, hơn 10% tyrosin, phenylalanin arginin, muối vô cơ 5%, tinh dầugôm, một lượng nhỏ tinh dầu dễ bay hơinhưlignin

Năm 2007 tại Đà Nẵng [16] bằng phương pháp chiết Soxhletvới hệ dung môiCHCl3 tác giả Đào Hùng Cường và cộng sự đã nghiên cứu về thành phầnancaloit

trong hạt cau ở huyện Hòa Vang - thành phố Đà Nẵng.Kết quả đo GC-MS và

LC-MS khẳng định thành phần hóa học dịch chiết hạt cau già và hạt cau xanh trongdung môi CHCl3 được trình bày trong các bảngsau đây:

Thời gian lưu M thực

nghiệm

M chuẩn

Hàm lượng

Bảng 1.4 Thành phần hóa học dịch chiết ancaloit trong hạt cau xanh (LC-MS)

Thời gian lưu M thực

nghiệm

M chuẩn

Hàm lượng% Chất phân tích.

đã cho kết quả như sau:

Bảng 1.6 Thành phần hóa học dịch chiết ancaloit trong hạt cau xanh

1.3 Cơ sở lý thuyết các phương pháp phân tích định tính và định lượng ancaloit

1.3.1.Phương pháp chiết tách ancaloit [17]

Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy mộtchất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu Chiết có thể nhằm mục đíchđiều chế hay phân tích (định tính,định lượng).Chiết là phương pháp tách dựa vào sựphân bố giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau Do đó việc chọn dung môi thích hợp

là một khâu rất quan trọng trong quá trình chiết tách hợp chất thiên nhiên

1.3.1.1.Dung môichiết

Như đã biết những chất tương tự nhau thì tan tốt trong nhau, vì vậy khi lựachọn dung môi có thể theo một trong hai tiêu chí sau : dung môi phải hòa tan càngnhiều càng tốt chất cần tách và hòa tan càng ít càng tốt chất không cần tách Hoặcdung môi hòa tan càng ít càng tốt chất cần tách và hòa tan càng nhiều càng tốt chấtkhông cần tách Theo quy tắc trên, dung môi chiết ancaloit phải có độ phân cực phùhợp với dạng muối hoặc dạng dạng bazơ của ancaloit Cụ thể, ancaloit là các bazơyếu, dùng dung môi có độ phân cực yếu, ancaloit là các bazơ trung bình, mạnh thìdùng dung môi có độ phân cực trung bình hay mạnh Đối với các ancaloit chưa biếtthì bắt đầu thăm dò từ dung môi kém phân cực đến dung môi phân cực mạnh Đểcác vết ancaloit di chuyển cao hơn và tách phù hợp có thể thêm vào dung môi mộtchất kiềm

Trong cây, ancaloit thường không tồn tại dạng tự do do nó có khả năng kếthợp với tanin (nhất là những cây có nhiều tanin) tạo thành muối Vì vậy, đối vớidược liệu có nhiều tanin, cần tẩm bột dược liệu bằng kiềm một thời gian để chuyểnancaloit thành dạng bazơ tự do trước khi chiết Cần dùng dung môi có độ phân cựcmạnh hơn hoặc chiết nóng để tách ancaloit ra khỏi tanin và hoà tan vào dung môi.Việc chiết xuất ancaloit dựa vào tính chất của nó Hầu hết ancaloit ở dạngbazơ tan được trong dung môi hữu cơ ít phân cực, không tan trong nước Ngược lại,

ở dạng muối, ancaloit tan trong nước etanol không tan trong dung môi hữu cơ ítphân cực Đối với các nguyên liệu nhiều chất béo, chất màu nên có giai đoạn loại

tạp sơ bộ bằng cách ngâm bột dược liệu với ete dầu hỏa hoặc ete trong vài giờ đếnmột ngày trước khi tiến hành chiết ancaloit.

Hiện nay người ta thường dùng hệ dung môi hữu cơ hoặc hệ dung môi ancol để chiết tách ancaloit

axit-a.Chiết bằng dung môi hữu cơ

Các dung môi hữu cơ nhưclorofom, ete, benzen, etyl clorua hòa tan tốt cácancaloit dạng bazơ, Clorofom là dung môi thích hợp nhất cho hầu hết ancaloit bazơ(trừ ancaloit N bậc 4 và N-oxit có cách xử lí riêng) Các bước tiến hành:

* Bột dược liệu tẩm dung dịch amoniac đặc (hoặc dung dịch Na2CO3, NaOH,vôi) để yên 1 ÷ 2 giờ

 Mục đích: Việc tẩm dung dịch NH3 đặc vì ancaloit tồn tại trong rễ cau ởdạng muối không tan trong CHCl3, NH3 có tính bazơ mạnh hơn ancaloit nên đẩyancaloit ra khỏi muối Ancaloit dạng bazơ tan trong CHCl3 Có thể dùng các dungdịch bazơ nhưCa (OH)2, Na2CO3, NaOH, trong đó NH3 là sự lựa chọn tối ưu nhất

* Cho bột dược liệu đã tẩm NH3 vào bình soxhlet Cho CHCl3 vào ngập bộtdược liệu, ngâm 1÷ 2 giờ.Tiến hành chiết nóng, trong khoảng thời gian từ 10÷12giờ thu lấy dịch chiết clorofom và phần xác cau

* Dịch chiết clorofom, cất thu hồi dung môi còn độ 1/2 hay 1/3 thể tích Sau

đó lắc với dung dịch axit hữu cơ hoặc vô cơ 1 ÷ 2% Các axit có thể dùng là axittactric, axit axetic, axit sunfuric, axit clohidric

 Mục đích: Trong rễ cau có nhiều hợp chất tan trong CHCl3 nhưng không tantrong dung môi phân cực (nước axit) Lắc dịch chiết với axit nhằm chuyển ancaloitthành dạng muối tan trong H2O Do đó, loại được các tạp chất còn lại trong CHCl3.Lượng dung dịch axit mỗi lần chiết không cần nhiều nhưng cần chiết nhiềulượt Với 100 ml dung dịch CHCl3 thì cần dùng 20 ÷ 30 ml dung dịch axit và cáclần sau (5÷7 lần) chỉ cần dùng 15 ml mỗi lần Theo dõi quá trình chiết sau bằngthuốc thử ancaloit

Phải chiết kiệt nhưng không để dung dịch bị nhũ hoá Thường mỗi lần chiếtlắc bình qua lại nhiều lần Nếu bị nhũ hoá không nhiều ta có thể xử lý bằng cách ly

tâm hoặc lọc qua lớp giấy lọc khô Nếu nhũ hoá nhiều phải để lắng một thời giantrong tủ lạnh.

Dung dịch chiết này chứa một số tạp nhưng số trường hợp đã có thể dùng đểđịnh lượng sơ bộ bằng phép cân hoặc so màu

* Để loại tạp (clorophyl, chất màu, nhựa) có thể lắc dung dịch chiếtaxit trên

với dung môi hữu cơ như ete, ete dầu, CHCl3 một vài lần

* Chiết ancaloit bằng dung dịch NH3: Cho dung dịch chiết axit chứa ancaloitdạng muối vào bình gạn, sau đó cho từ từ dung dịch NH3 10% đến các khoảngpHkhác nhau

 Mục đích: Thu ancaloit từng phần hoặc toàn phần Trước tiên cho dung dịch

pH = 2 ÷ 3 để chiết lấy riêng các ancaloit bazơ yếu Sau đó, nângpH dung dịch lên 6

÷ 7 để chiết lấy các ancaloit bazơ trung bình Sau cùng nâng dung dịch lên pH = 10

÷ 12 để chiết lấy ancaloit bazơ mạnh Nếu lượng ancaloit quá bé nênkết tủa ancaloittoàn phần bằng cách kiềm hóa dung dịch chiết axit đến môi trường pH = 10 ÷12

* Chiết ancaloit vào CHCl3:Cho dung dịch chiết axit ancaloit đã kiềm hóabằng dung dịch NH310% vào bình gạn, rót vào đó một lượng ete hoặc CHCl3 vào vàchiết 4 lần, mỗi lần 10 ml CHCl3, chiết trong phễu chiết

* Xác cau: Ngâm kiệt với hỗn hợp dung môi C2H5OH 960 + HCl 2% (4:1)trong hai ngày đêm, chiết theo phương pháp chiết ngược dòng thu dịch chiết cómàu

đỏ nâu Trung hòa dịch chiết này bằngdung dịch NH3 10%, để yên ba ngày đêm.Lọc bỏ chất rắn thu phần dịch lỏng, sau đó chiết bằng CHCl3 ở pH môi trường (7 ÷

12) để thu ancaloit toàn phần Tiến hành chiết 4 lần, mỗi lần 10 ml CHCl3

Mục đích:Lấy kiệt ancaloit còn lại trong xác cau sau khi chiết với CHCl3.Tuy đã được loại tạp sơ bộ ban đầu bằng ete dầu hỏa nhưng khi ngâm kiệt với

C2H5OH 960 + HCl 2% (4:1) thì chiết thêm nhiều tạp như chất béo, chất màu,tanin… Khi trung hòa bằng dung dịch NH3 10% sẽ loại bỏ được tạp chất gây ảnh

hưởng lớn đến quá trình chiết ancaloit sau này

* Loại H2O, cô cạn, định mức dịch chiết cuối: Lấy một ítNa2SO4 khan chovào bình, lắc cho đến khi các hạt chạy tròn trong dịch CHCl3, không còn hạt nào

chảy nhão ra là được Cô cạn dịch chiết thu cặn Định mức cặn trong 10 ml CHCl3,tiến hành xác định thành phần hóa học sản phẩm chiết bằng phương pháp sác kíHPLC và GC - MS.

b.Chiết bằng dung dịch axit hay axit loãng trong ancol

Các ancaloit dạng muối tan tốt trong dung môi phân cực, vì vậy có thểsử dụngdung dịch axit (vô cơ, hữu cơ) hoặc dung dịch axit kết hợp với ancol để chiếtancaloit dưới dạng muối hoà tan Axit thường dùng là axit axetic, axit tactric, axitclohidric, axit sunfuric, axit photphoric Tùy thuộc vào từng loại ancaloit cần chiết

mà lựa chọn axit cho thích hợp

* Chiết bằng axit

Dịch chiết trung hòa axit, cô cạn, hòa tan cặn trong axit, loại tạp, kiềm hoá rồichiết lại bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi, hòa cặn trong clorofom để chấmsắc ký Cách chiết này loại được nhiều tạp và nếu dùng natri hydrocarbonat để kiềmhoá có thể chiết được ancaloit có chứa phenol

* Chiết bằng dung dịch axit loãng trong ancol

Thu dịch chiết dược liệu trong dung môi ancol - axit Bốc hơi dung môi, lắcdịch chiết đậm đặc với dung môi hữu cơ (ete, clorofom) để loại tạp Kiềm hoádungdịch nước axit rồi chiết bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi thu được cặnancaloit thô Với cách chiết này, ancaloit không bị mất nhưng dịch chiết lẫn nhiềutạp

Phương pháp chiết tốt nhất đối với dung môi ancol-axit là ngâm kiệt và ápdụng kĩ thuật chiết ngược dòng (dịch chiết đầu để riêng, phần dịch chiết sau làmdung môi cho mẻ mới) Vì trong môi trường axit, ở nhiệt độ cao, ancaloit dễ bị phânhủy nên dịch chiết cần trung hoà đến pH (7 ÷ 8) trước khi cất thu hồi ancol Dungdịch thu được đem axit hóa, để yên 1÷ 3 ngày rồi tiến hành loại bỏ tạp chất (nhựa,clorophin, protein, hydrat cacbon) bằng cách lọc và thu lấy phần dung dịch chứaancaloit

Trong sản xuất hiện nay chưa có đủ dung môi hữu cơ để chiết ancaloit bazơthìphương pháp thích hợp nhất là chiết bằng dung dịch kiềm: hoà tan ancaloit dạng

bazơ vào dung dịch axit để chuyển về dạng muối amoni, chiết lấy dung dịch muốiamoni sau đó kiềm hóa chuyển về dạng ancaloit bazơ

Để chiết ancaloit được tốt hơn và dễ lắng nên thực hiện ở nhiệt độ 60 ÷ 700C

và để yên trong một đến hai ngày, sau đó tiến hành lọc lấy ancaloit

So sánh - nhận xét :

Nước axit là dung môi rẻ tiền và thích hợp nhất cho sản xuất ancaloit hiện naynhưng nó có nhược điểm là khó bốc hơi Vì vậy trong điều kiện cho phép nên thaynước axit bằngancol - axit Ancol có thể dùng là metylic, etylic hoặc propylic.Ancol - axit có khả năng hoà tan ancaloit mạnh hơn nước- axit, đồng thời ít hoà tantạp chất (protein thực vật, cacbohidrat ) hơn

Ưu điểm nổi bật của cồn là dễ bốc hơi nên dễ dàng cô đặc dịch chiết để kết tủatriệt để ancaloit Vì vậy, hiệu suất chiết ancol bao giờ cũng cao hơn chiết bằngnước

Hiện nay, người ta sử dụng cột nhựa trao đổi cationit để tách ancaloit ra khỏidung dịch chiết Dung dịch nước axit ancaloit cho chảy qua cột nhựa cationit.Ancaloit bị giữ lại trong cột Sau đó dùng dung dịch kiềm NH3 cho qua cột để đẩyancaloit ra khỏi cột nhựa và cuối cùng rửa cột thu ancaloit bazơ

Một số lưu ý trong quá trình chiết xuất:

- Trong cây, ancaloit tồn tại dưới dạng muối của các axit hữu cơ Mộtsốancaloit kết hợp với tanin nhất là những cây có nhiều tanin Vì vậy, đối với dượcliệu có nhiều tanin cần dùng dung môi có độ phân cực mạnh hơn hoặc chiết nóng đểtách ancaloit ra khỏi tanin hoà tan vào dung môi

 Một số ancaloit là các este như atropin, cocain, heliotrin có thể bị thuỷphân trong quá trình chiết xuất nên hạn chế sử dụng nhiệt độ cao

 Ngược lại, một số ancaloit tồn tại trong cây dưới dạng Glycozit nhưsolamacgin trong các loài Solanum Để chiết các ancaloit này cần có giai đoạn thủyphân

 Nói chung, ancaloit là một chất tương đối bền vững so với nhiều hợpchất tự nhiên khác Tuy nhiên, một số hợp chất thuộc dẫn xuất indol rất dễ bị huỷhoặc biến chất bởi ánh sáng và các tác nhân oxi hoá - khửnên cần chú ý khống chếcác yếu tố có thể làm hỏng ancaloit trong quá trình chiết xuất

 Đại đa số ancaloit là chất kết tinh không màu và có điểm chảy xác định,chỉ có một số ancaloit có màu vàng như becberin, palmatin, secpentin,…; có thể sửdụng sự thay đổi màu này theo dõi chúng trong quá trình chiết tách

1.3.1.2.Thiết bị chiết

Chúng tôi sử dụng thiết bị chiết Sohlet và chiếtsiêu âm (hình 1.5):

Chiết Socklet là phương pháp chiết liên tục trên thiết bị chiếtsocklet.Dung môi được đun nóng trong bình cầu cho hơi dung môi đi lên bìnhchiết chứa chất qua ống sinh hàn ngược rồi ngưng tụ lại chảy vào bình chiết.Dung môi lựa chọn phải hoà tan chất hữu cơ nghiên cứu hoặc hoà tan chất phụrồi qua ống nhánh chảy trở lại bình cầu Nếu dung môi hoà tan chất phụ thì chấthữu cơ rắn còn lại trên bình chiết lấy ra làm khô.Nếu dung môi hoà tan chấthữu cơ thì thu được dung dịch chất hữu cơ trong bình cầu và tinh chế theo cácphương pháp thông thường

Chiết siêu âm là phương pháp sử dụng năng lượng điện từ để gây ra sựkhuếch tán hoạt chất vào dung môi.Sóng siêu âm có tần số lớn hơn 20 kHz đượctruyền qua môi trường vật chất (rắn, lỏng, khí) vào tận bên trong tế bào dược liệugây ra những tác động làm tăng vận tốc hòa tan, khuếch tán hoạt chất vào dung môi,

vì vậy rút ngắn được thời gian chiết Ưu điểm của chiết siêu âm là thời gian chiếtnhanh, hiệu suất cao hơn so với chiết thông thường, lượng chiết mỗi lần nhiều hơn

so với chiết Socklet Thiết bị chiết siêu âm dễ sử dụng, an toàn và thân thiện vớimôi trường

Hình 1.5:Bộ chiết soxhlet và siêu âm

1.3.2 Phương pháp phân tích trọng lượng

Phương pháp phân tích trọng lượng là phương pháp phân tích định lượng Dochất phân tích chiếm một tỉ lệ xác định trong sản phẩmnên dựa vào khối lượng củasản phẩm đem cân dễ dàng suy ra lượng chất phân tích trong đối tượng phântích.Quá trình phân tích một chất theo phương pháp trọng lượng:

* Chọn mẫu và gia công mẫu

* Tách trực tiếp chất cần xác định hoặc các thành phần của nó khỏi sản phẩmphân tích dưới trạng thái tinh khiết hóa học hay dạng hợp chất có thành phần xácđịnh bằng phản ứng kết tủa hay điện phân

* Xử lý sản phẩm đã tách bằng các biện pháp thích hợp (rửa, nung, sấy ) rồiđem cân để tính lượng chất rắn thu được

1.3.3 Phương pháp sắc kí [17]

1.3.3.1 Định nghĩa sắc kí

* Định nghĩa của Mikhai S Tsvett (1906): Sắc kí là một phương pháp trong

đó các cấu tử của một hỗn hợp được tách trên một cột hấp thụ đặt trong một hệthống đang chảy

* Định nghĩa của IUPAC (1993): Sắc kí là một phương pháp tách trong đócác cấu tử cần tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứngyên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định

1.3.3.2 Quá trình sắc kí

Sắc kí là một kỹ thuật tách trong đó các cấu tử cần tách trong một hỗn hợpđược vận chuyển bởi pha động đi qua pha tĩnh Mẫu đi vào pha động được mangtheo dọc hệ thống sắc kí (cột, bản phẳng) có chứa pha tĩnh phân bố đều khắp

Pha tĩnh có thể là một lớp phim được phủ trên bề mặt của chất mang trơ hoặcmột bề mặt chất rắn, pha động có thể là chất lỏng hoặc chất khí Do ái lực khácnhau của các chất tan trên pha tĩnh làm chúng di chuyển với những vận tốc khácnhau trong pha động của hệ thống sắc kí, kết quả là chúng được tách thành nhữngdải trong pha động và vào lúc cuối của quá trình các cấu tử tách hiện ra theo trật tựtăng tương tác với pha tĩnh

Cấu tử di chuyển chậm (tương tác yếu) ra trước, cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn rasau dưới dạng đỉnh (pic) riêng rẽ (hoặc bậc thang) tùy thuộc vào cách tiến hành sắc

kí và được ghi lại trên giấy gọi là sắc kí đồ

1.3.3.3 Phương pháp tiến hành sắc kí

Để thực hiện tác sắc kí có thể sử dụng một trong ba phương pháp sau:

* Phương pháp rửa giải: Là kĩ thuật được sử dụng rộng rãi nhất trong cácphương pháp sắc kí hiện nay

* Phương pháp tiền lưu: Phương pháp tiền lưu ít được dùng do không thựchiện được việc tách hoàn toàn các cấu tử, nhất là khi sử dụng việc tách vào mụcđích phân tích

* Phương pháp thế đẩy: Trong phương pháp này, mẫu sau khi đưa vào cột, ta

cho qua cột một dung môi có ái lực với pha tĩnh mạnh hơn bất kì một cấu tử nào củahỗn hợp tách để đẩy các cấu tử cần tách thoát ra khỏi cột Cấu tử thoát ra khỏi cộtđầu tiên là cấu tử tương tác yếu nhất với pha tĩnh, sau đó đến các cấu tử có ái lựcvới pha tĩnh tăng dần Nói chung phương pháp này tạo nên các dải rửa giải khônghoàn toàn được tách khỏi nhau: có dải thu được chất nguyên chất nhưng có dải giữacác dải nguyên chất thì gồm hỗn hợp của chúng

1.3.3.4 Phân loạisắc kí

Người ta phân loại các phương pháp sắc kí dựa vào cơ chế hoạt động sắc kí:hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, và vào tính chất của pha tĩnh cũng như phươngpháp thể hiện sắc kí Cơ chế sắc kí có nhiều nhưng để thực hiện quá trình sắc kí thìchỉ có hai dạng: dạng cột và dạng bản phẳng (bản kính, polime, kim loại, giấy).Thường để đơn giản hóa, tuy không chính xác người ta gọi tắt các phương pháp sắckí: sắc kí khí, sắc kí lỏng, sắc kí lỏng cao áp, sắc kí lớp mỏng, sắc kí gel

a Sắc kí lỏng (Liquid Chromatagraphy – LC): Sắc ký lỏng là quá trình táchmột hợp chất ở trong cột tách ở trạng thái lỏng Vì thế mẫu phân tích phải hoà tantrong một chất lỏng nào đó, thường là pha động của quá trình sắc ký Nó thích hợpcho tất cả các chất có nhiệt độ sôi cao cũng như thấp (trừ các chất ở nhiệt độ thường

là khí) Sắc ký lỏng có hai loại: Sắc ký lỏng áp suất thường (cổ điển) và sắc ký lỏng

áp suất cao (High Performance Liquid Chromatagraphy – HPLC)

* Cách tiến hành phân tích định tính theo sắc ký lỏng:

Trong mỗi điều kiện sắc ký nhất định thì mỗi chất có một thời gian lưu xácđịnh đặc trưng cho nóđó chính là điều kiện để phát hiện định tính một chất tronghỗn hợp mẫu Vì thế nguyên tắc của phân tích định tính theo kỹ thuật sắc ký là: + Chuẩn bị một dãy chất chuẩn đã biết thành phần, được xử lý tương tự nhưmẫu phân tích

+ Trong điều kiện sắc ký đã chọn, bơm các chất chuẩn vào máy sắc ký và xácđịnh thời gian lưu của các chất phân tích theo từng sắc đồ riêng của từng chất Nhưthế ta lập được bảng thời gian lưu của mỗi chất, ví dụ đối với các chất A, B, C, D,

ta có các thời gian lưu tương ứng là: tA, tB, tC, tD,

+ Khi phân tích mẫu chưa biết, ta cũng bơm mẫu và ghi sắc đồ của chất phântích và so sánh với sắc đồ của dãy chuẩn Nếu một chất trong mẫu phân tích có thờigian lưu trùng với thời gian lưu của một chất trong dãy chuẩn, ví dụ tB ta nói rằngchất chưa biết đó là chất B

b Sắc kí khí ( GC): Sắc kí khí là một trong những phương pháp quan trọngnhất hiện nay dùng để tách, định lượng, xác định cấu trúc các chất, đặc biệt có ýnghĩa quan trọng trong nghiên cứu các hợp chất hữu cơ

Pha động trong GC là chất khí nên chất phân tích cũng phải được hoá hơi đểđưa vào cột sắc kí, thường hoá hơi dưới 2500C

Pha tĩnh có thể là chất rắn được nhồi vào cột hay 1 màng film mỏng bám lêntrên bề mặt chất mang trơ, hoặc có thể tạo thành một màng mỏng bám lên mặt trongcủa thành cột (cột mao quản)

một nền là một tấm kiếng, một tấm nhôm hay một miếng plastic Chất hấp phụthường dùng là alumin G và silicagel G.Để sắc ký bản mỏng có kết quả cần phải lựachọn dung môi giải li Các dung môi lựa chọn thường có độ phân cực tăng dầnnhưhexan, benzen, clorofom, ete etylic, etyl axetat, axeton, metanol…

Dung môi thích hợp là dung môi có thể làm cho chất mẫu ban đầu tách thànhnhiều vết khác nhau một cách gọn, rõ, sắc nét và vị trí các vết nằm khoảng 1/3 đến2/3 chiều dài bản sắc ký thì dung môi đó phù hợp.Nếu cần thì phải thử trên các hệdung môi

d Phương pháp khối phổ (MS): Nguyên tắc của phương pháp khối phổ là dựavào chất nghiên cứu được ion hoá trong pha khí hoặc pha ngưng tụ dưới chân khôngbằng những phương pháp thích hợp thành những ion (ion phân tử, ion mảnh…) có

số khối khác nhau, sau đó những ion này được phân tách thành những dãy ion theocùng số khối m (chính xác là theo cùng tỷ số khối trên điện tích ion, m/e) và xácsuất có mặt của mỗi dãy ion có cùng tỉ số m/e được ghi lại trên đồ thị có trục tung làxác suất có mặt (hay cường độ), trục hoành là tỉ số m/e gọi là khối phổ đồ.Phổ khốilượng được ghi lại dưới dạng phổ vạch hay bảng, trong đó cường độ các vạch được

đo bằng phần trăm so với đỉnh có cường đọ cao nhất Đỉnh ion phân tử thường là

đỉnh cao nhất, tương đương với khối lượng phân tử của hợp chất khảo sát

1.3.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực tách

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chúng ra, bao gồm: chất nhồicột (pha tĩnh, chất mang),dung môi rửa giải (pha động), kích thước cột sắc kí, khốilượng chất phân tích, tốc độ của pha động

1.4 Cơ sở lý thuyết các phương pháp thử hoạt tính sinh học

1.4.1 Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa DPPH

Hợp chất tên gọi: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự

do được dùng đểthực hiện mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của cácchất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu củaDPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng  = 517 nm

1.4.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh

Hoạt tínhkháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phươngpháp pha loãng đa nồng độ Đây là phương pháp thử hoạt tínhkháng vi sinh vậtkiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫuthử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (Minimuminhibitorconcentration- nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (nồng độ ức chế 50%), MBC(Minimumbactericidal concentration- nồng độ diệt khuẩn tối thiểu)

1.4.3 Phương pháp xác định hoạt độ peroxydaza máu người

Máu tươi được chống đông bằng ADC (Citrate dextrose adenine), phaloãng 500 lần bằng dung dịch NaCl 0,9%

CHƯƠNG 2 NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

Chúng tôi tiến hành thực nghiệm theo sơ đồ sau:

Khảo sát một số yếu tố chiết tách ( dung môi, điều kiện, nhiệt độ, thời gian)

Thu nguyên liệu

Thu dịch chiết

Thử họat tính sinh học Phân tích sắc kí

Đo

1H-NMR, 13C-NMR Xác định cấu tạo một số

ankaloit

Hình 2.1 Sơ đồ qui trình thực nghiệm

2.1 Thu nguyên liệu và xử lý

Nguyên liệu xuất xứ từhuyện Bình Sơn, tỉnh Quảng Ngãi vào tháng 12/2009

Cây cau được chọn lấy rễ cao khoảng 9m,đường kính thân cây khoảng 10 cm, rễ

cau có hình giống ngón tay, da bóng có điểm ánh hồng Mẫu sau khi lấy được rửa

sạch, để ráo nước, sấy đến khô rồi nghiền thành bột và bảo quản nơi khô ráo (đựng

trong bình hút ẩm)