Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào một số chủng nấm men Moniliella phân lập được.. Vị trí các chủng đại diện phân lập được thuộc chi Moniliella.. Tế bào sinh dưỡng của Moniliella carnis KFP 2
Trang 2`Lời cảm ơn
Lời cảm ơn
Trang 3Lời cảm ơn
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Nguyên Thành và PGS TS Bùi Thị Việt Hà - những người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp em thực hiện luận văn này
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp - Viện Công nghiệp Thực phẩm đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, hỗ trợ
kỹ thuật, chia sẻ tài liệu và kinh nghiệm nghiên cứu
Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian sinh viên và học viên cao học
Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân bạn
bè những người luôn động viên, khích lệ em trên con đường học tập, và nghiên cứu khoa học
Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2014 Học viên
Đinh Đức Hiền
Trang 4DANH MỤC HÌNH
Hình 1 Hình thái tế bào đặc trưng của Phaeococcus catenatus CBS 650 76
Hình 2 Hình ảnh tế bào Exophiala salmonis CBS 157.67
Hình 3 Hình ảnh tế bào Aureobasidium pullulans
Hình 4 Hình ảnh tế bào Moniliella suaveolens CBS 120.63 (trái) và Moniliella
acetoabuten CBS 169.66 (phải)
Hình 5 Cây phả hệ mô tả mối quan hệ giữa các loài thuộc chi Moniliella
Hình 6 Hình ảnh tế bào của Geotrichum candidum (trái) và
Trichosporon beigelii (phải)
Hình 7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu phát hiện
Candida albicans và Candida dubliniensis
Hình 8 Một số mẫu hoa phân lập được Moniliella
Hình 9 Vị trí các địa điểm thu thập mẫu phân lập Moniliella tại Việt Nam
Hình 10 Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào một số chủng nấm men Moniliella phân lập
được
Hình 11 Phổ fingerprinting của 126 chủng Moniliella phân lập được
Hình 12 Vị trí các chủng đại diện phân lập được thuộc chi Moniliella
Hình 13 Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 của các chủng Moniliella carnis
và Moniliella dehoogii
Hình 14 Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 của các chủng Moniliella byzovii
Hình 15 Tế bào sinh dưỡng của Moniliella carnis (KFP 246T) sinh trưởng trên môi trường YM ở 25C sau 5 ngày (trái) và trên môi trường tinh bột ngô Dalmau agar sau 7 ngày (phải)
Trang 5Hình 16 Tế bào sinh dưỡng của Moniliella dehoogii KFP 211T sinh trưởng trong
YM ở 25C sau 5 ngày (trái) trên môi trường Dalmau tinh bột ngô sau 7 ngày (phải)
Hình 17 Tế bào sinh dưỡng của chủng TBY 2041.7T sinh trưởng trên môi trường Dalmau tinh bột ngô sau 5 ngày
Hình 18 Sự hình thành Chlamydospore ở chủng TBY 2041.7T sinh trưởng trên môi trường Yeast Cacbon Base agar không có nguồn nito
Hình 19 Hình thái khuẩn lạc của Moniliella byzovii TBY 2041.7T
(trái) và TBY 2041.8 (phải) trên môi trường Malt-Glucoseagar sau 45 ngày nuôi cấy ở 28C
Hình 20 Hình thái khuẩn lạc của M dehoogii KFP 211T và TBY 2041.5 trên môi trường Malt glucose 2°Bx sau 10 ngày nuôi cấy ở 28°C
Trang 6DANH MỤC BẢNG
Bảng 1 So sánh đặc điểm của chi Moniliella và một số chi khác
Bảng 2 Phương pháp trộn lẫn tế bào các chủng trong cùng 1 loài để phát hiện pha
sinh sản hữu tính
Bảng 3 Các chủng nấm men đen Moniliella phân lập được
Bảng 4 Ký hiệu các chủng trong PCR fingerprinting
Bảng 5 Kết quả phân nhóm các chủng bằng fingerprinting
Bảng 6 Danh sách chủng Moniliella trong mô tả loài mới
Bảng 7 Danh sách các chủng thuộc 2 nhóm M byzovii
Bảng 8 Sự khác nhau những đặc tính quan trọng giữa M carnis, M dehoogii, M
byzovii và những loài đã biết thuộc chi Moniliella
Bảng 9 Phân lập Moniliella tại Việt Nam và trên thế giới
Trang 7DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CBS – Centraalbureau voor Schimmelcultures (Bảo tàng giống Vi sinh vật Hà Lan)
h – hour (giờ)
NRRL-Northern Regional Research Laboratory (hiện là National Center For Agricultural Utilization Research) (Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ)
DGGE-Denaturing gradient gel electrophoresis
rDNA-Ribosomal DNA
rRNA-Ribosomal RNA
PCR – Polymerase Chain Reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi)
RFLP-Restriction Fragment Length Polymorphism (đánh giá đa hình DNA theo phương pháp cắt hạn chế)
T – Type strain (chủng chuẩn)
Trang 8MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 10
1.1 NHÓM NấM MEN ĐEN ERROR ! B OOKMARK NOT DEFINED
Một số chi nấm men đen Error! Bookmark not defined
1.1.1 Chi Phaeococcomyces Error! Bookmark not defined
1.1.2 Chi Exophiala Error! Bookmark not defined
1.1.3 Chi Aureobasidium Error! Bookmark not defined
1.1.4 Chi Moniliella Error! Bookmark not defined
1.2 MộT Số PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOạI NấM MEN ERROR ! B OOKMARK NOT DEFINED
1.2.1 Các phương pháp phân loại truyền thống Error! Bookmark not defined
1.2.2 Các phương pháp hóa phân loại và sinh học phân tử Error! Bookmark not defined
1.3 MộT Số PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIệN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DạNG VI SINH VậTE RROR ! B OOKMARK NOT DEFINED
2.1 ĐốI TƯợNG ERROR ! B OOKMARK NOT DEFINED
2.2 HÓA CHấT, DụNG Cụ, TRANG THIếT Bị MÁY MÓC ERROR ! B OOKMARK NOT DEFINED
2.2.1 Hóa chất Error! Bookmark not defined
2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc Error! Bookmark not defined
2.3 THÀNH PHầN MÔI TRƯờNG Sử DụNG TRONG NGHIÊN CứUE RROR ! B OOKMARK NOT DEFINED
2.3.1 Môi trường làm giàu có nồng độ đường cao Error! Bookmark not defined
2.3.2 Môi trường Malt-Glucose 2Bx có axit lactic 1‰ Error! Bookmark not defined
2.3.3 Môi trường Malt-Glucose 2Bx không có axit lactic Error! Bookmark not defined
2.3.4 Môi trường thử khả năng chuyển hóa các nguồn cacbon khác nhauError! Bookmark not defined
2.3.5 Môi trường thử khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhauError! Bookmark not defined
2.3.6 Thử khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và muối caoError! Bookmark not defined.
2.3.7 Môi trường xác định khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác
nhau
2.3.8 Môi trường thử khả năng hình thành tinh bột Error! Bookmark not defined
2.3.9 Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải urea Error! Bookmark not defined
2.3.10 Môi trường đánh giá khả năng sinh trưởng khi có mặt CycloheximideError! Bookmark not defined 2.3.11 Môi trường đánh giá khả năng chống chịu acid acetic 1 %Error! Bookmark not defined
2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CứU ERROR ! B OOKMARK NOT DEFINED
2.4.1 Phương pháp phân lập Error! Bookmark not defined
2.4.3 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào Error! Bookmark not defined
2.4.4 Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm men Error! Bookmark not defined
2.4.5 Phương pháp tinh chế DNA Error! Bookmark not defined
2.4.6 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprintingError! Bookmark not defined
2.4.7 Phương pháp điện di Error! Bookmark not defined
2.4.8 Nhuộn gel và đọc kết quả Error! Bookmark not defined
Trang 92.4.9 Phương pháp phân loại nấm men dựa vào đọc trình tự rDNAError! Bookmark not defined
2.4.10 Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhauError! Bookmark not defined
2.4.11 Đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn nito khác nhau.Error! Bookmark not defined
2.4.12 Đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và nồng độ
muối cao Error! Bookmark not defined
2.4.13 Đánh giá khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhauError! Bookmark not defined 2.4.14 Thử khả năng hình thành tinh bột Error! Bookmark not defined
2.4.15 Thử khả năng phân giải urea Error! Bookmark not defined
2.4.16 Thử khả năng chống chịu với cycloheximit Error! Bookmark not defined
3.1 KếT QUả PHÂN LậP ERROR ! B OOKMARK NOT DEFINED
3.2 QUAN SÁT HÌNH THÁI KHUẩN LạC, Tế BÀO ERROR ! B OOKMARK NOT DEFINED
3.3 PHÂN NHÓM BằNG Kỹ THUậT FINGERPRINTING ERROR ! B OOKMARK NOT DEFINED
3.5 MÔ Tả CÁC NHÓM LOÀI MớI THUộC CHI M ONILIELLA E RROR ! B OOKMARK NOT DEFINED
3.5.1 Phân tích đặc tính di truyền của 3 loài mới Error! Bookmark not defined
3.5.2 Đặc tính kiểu hình, sinh lý, sinh hóa của 3 loài mới Error! Bookmark not defined
3.6 Sự ĐA DạNG M ONILIELLA PHÂN LậP TạI VIệT NAM ERROR ! B OOKMARK NOT DEFINED
TÀI LIỆU THAM KHẢO 11
PHỤ LỤC
Trang 10MỞ ĐẦU
Chi Moniliella được thiết lập bởi bởi Stolk và Dakin năm 1966 để xác lập vị trí phân loại cho 2 loài mới tìm được khi đó là Moniliella acetoabutens và Moniliella tomentosa Năm 2009, căn cứ vào sự tương đồng nhất định về di truyền cũng như
một số đặc tính sinh lý, sinh hóa quan trọng, Rosa và cộng sự đã xếp một chi khác
là Trichosporonoides vào Moniliella Như vậy, trước khi nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện, chi Moniliella bao gồm 9 loài, đó là Moniliella acetoabutens, M fonsecae, M megachiliensis, M mellis, M nigrescens, M oedocephalis, M pollinis,
M spathulata và M suaveolens Phân loại của Moniliella thực sự vẫn chưa rõ ràng Trình tự gần nhất của Moniliella fonsecae trong Genbank là Phylloporia pectinata, một thành viên của Agaricomycotina Với những trình tự khác, Moniliella thuộc Ustilagionomycotina Hơn nữa, sự khác biệt về mặt di truyền giữa các loài thuộc chi Moniliella lại rất lớn, có thể tới 15-16% trong đoạn D1/D2 Do vậy việc tìm kiếm
những loài trung gian giữa các loài đã biết sẽ góp phần làm sáng tỏ phân loại của
Moniliella
Moniliella được sử dụng trong công nghiệp sản xuất erythriltol, một loại đường
chức năng có giá trị thương mại cao Gần đây, Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã phát hiện một số đặc tính công nghệ ít hoặc chưa
được biết tới của Moniliella như khả năng chuyển hóa thầu dầu thành γ-declactone
(tinh dầu đào) với độ tinh khiết cao, khả năng sinh lipase, khả năng sinh một loại kháng sinh (zymocin) mới Các nội dung nghiên cứu trong bản luận văn này được
thực hiện nhằm đánh giá đa dạng nấm men Moniliella tại Việt Nam, góp phần củng
cố hệ thống phân loại của chi và tạo cơ sở cho nghiên cứu công nghệ có sử dụng
Moniliella, cụ thể những nội dung nghiên cứu bao gồm:
- Phân lập nấm men Moniliella từ các nguồn mẫu khác nhau tại các địa điểm
khác nhau ở Việt Nam
- Phân nhóm, phân loại Moniliella phân lập được bằng hình thái; PCR
fingerprinting; giải trình tự DNA; phân tích cây phả hệ
- Phân tích sự đa dạng nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam về số loài,
phân bố
Trang 11TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục
Tiếng Anh
2 Altschul, S F., Madden, T L., Schaffer, A A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller,
W & Lipman, D J (1997), “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new
generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Research,
25, pp 3389-3402
3 Begerow D, Stoll M, Bauer R.(2006), “A phylogenetic hypothesis of
Ustilaginomycotina based on multiple gene analyses and morphological data”, Mycologia, 98: 906–916
4 Boekhout T, Fell JW, O’Donnell K (1995), “Molecular systematics of some
yeast-like anamorphs belonging to the Ustilaginales and Tilletiales”, Studies
in Mycology, 38: 175–183
5 De Hoog, G S., A H Gerritis van den Ende, J M Uijthof, and W A Untereiner (1995), “Nutritional physiology of type isolates of currently
accepted species of Exophiala and Phaeococcomyces”, Antonie Van Leeuwenhoek, 68, pp 43-49
6 De Hoog, G S & Guého E (1984), “Deoxyribonucleic acid base
composition and taxonomy of Moniliella and allied genera”, Antonie Leeuwenhoek, 50, pp 135-141
7 De Hoog, G S., J Guarro, J Gene, and M J Figueras (2000), Atlas of Clinical Fungi, 2nd ed, vol 1, Centraalbureau voor Schimmelcultures,
Utrecht, The Netherlands
8 De Hoog, G S., Smith, M T & Rosa, C A (2011), “Moniliella Stolk & Dakin (1966)”, The Yeasts, a Taxonomic Study, 5th edn, pp 1837-1846
Edited by C.P Kurtzman, J.W Fell, Teun Boekhout London: Elsevier
Trang 129 De Hoog G.S (1999), Ecology and evolution of black yeast and their relative, the Royal NetherlDNAs Academy of Arts and Sciences
10 Edgar, R C (2004), “MUSCLE: multiple sequence alignment with high
accuracy and high throughput”, Nucleic Acids Res, 32, pp 1792-1797
11 Esteve-Zarzoso, B., Belloch, C., Uruburu, F & Querol, A (1999),
“Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the
two ribosomal internal transcribed spacers”, Int J Syst Bacteriol, 49, pp
329-337
12 Felsenstein, J (1985), “Confidence limits on phylogenies: an approach using
the bootstrap”, Evolution, 39, pp 783-791
13 Günther Laufenberg, Pietro Rosato, Benno Kunz (2004), “Adding value to vegetable waste: Oil press cakes as substrates for microbial decalactone
production”, Eur J Lipid Sci Technol, 106: 207–217
14 Haase, G., L Sonntag, Y van de Peer, J M Uijthof, A Podbielski, and B Melzer-Kric (1995), “Phylogenetic analysis of ten black yeast species using
nuclear small subunit rRNA gene sequences”, Antonie Van Leeuwenhoek,
68, pp 19-33
15 Inglis, G D., Sigler, L & Goettel, M S (1992), “Trichosporonoides megachiliensis, a new Hyphomycete associated with alfalfa leafcutter bees, with notes on Trichosporonoides and Moniliella”, Mycologia, 84,
p p 555-570
16 Kimura, M (1980), “A simple method for estimating evolutionary rates of
base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences”, J Mol Evol, 16, pp 111-120
17 Kurtzman C P., Blanz P A (1998), “Ribosomal RNA/DNA sequence
comparisons for assessing phylogentic relationships”, Elsevier Science Publishers, pp 69-74
18 Kurtzman C P., Jack W Fell, T Boekhout, (2011), The Yeasts: A Taxonomic Study, 5th, Elsevier
Trang 1319 Kurtzman, C P & Robnett, C J (1998), “Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S)
ribosomal DNA partial sequences”, Antonie van Leeuwenhoek, 73, pp 331-371
20 Lachance, M A., Starmer, W T., Rosa, C A., Bowles, J M., Barker J S & Janzen, D H (2001), “Biogeography of the yeasts of ephemeral flowers and
their insects”, FEMS Yeast Res, 1, pp 1-8
21 Martinez A T (1979), “Ultrastructure of Moniliella, Trichosporonoides and Hyalodendron”, Stud Mycol, 19, pp 50-57
22 Martínez A T., Hoog GS de, Smith M T (1979), “Physiological
characteristics of Moniliella, Trichosporonoides and Hyalodendron”, Studies
in Mycology, 19: 58–68
23 Perko, R & DeCock, P (2007), “Erythritol”, Sweeteners and Sugar Alternatives in Food Technology, pp 151-176 Edited by H Mitchell
Oxford: Wiley-Blackwell
24 Rosa, C A., Jindamorakot, S., Limtong, S., Nakase, T., Lachance, M A., Fidalgo-Jiménez, A., Daniel, H M., Pagnocca, F C., Inácio, J & Morais, P
B (2009), “Synonymy of the yeast genera Moniliella and Trichosporonoides and proposal of Moniliella fonsecae sp nov and five new species combinations”, Int J Syst Evol Microbiol, 59, pp 425-429
25 Saitou, N & Nei, M (1987), “The neighbor-joining method: a new method
for reconstructing phylogenetic trees”, Mol Biol Evol, 4, pp 406-425
26 Sawada, K., Taki, A., Yamakawa, T & Seki, M (2009), “Key role for
transketolase activity in erythritol production by Trichosporonoides megachiliensis SN-G42”, J Biosci Bioeng, 108, pp 385-390
27 Sipiczki, M (2012), “ Detection of yeast species also occurring in substrates associated with animals and identification of a novel
dimorphic species in Verbascum flowers from Georgia”, Antonie van Leeuwenhoek, 103, pp 567–576
28 Stolk, A C & Dakin, J C (1966), “Moniliella, a new genus of Moniliales”,