Bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate vào cây đậu tương nhờ vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- NGUYỄN THỊ LIỄU “BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ GLYPHOSATE VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG NHỜ VI KHUẨN AGROBACTERIU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ LIỄU

“BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ GLYPHOSATE VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG NHỜ

VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS”

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ LIỄU

“Bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ

glyphosate vào cây đậu tương nhờ vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens”

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 0114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS Đặng Trọng Lương

(Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam)

2 GS.TS Phan Tuấn Nghĩa (Đại học Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN)

Hà Nội – Năm 2014

I

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Đặng Trọng Lương và GS.TS Phan Tuấn Nghĩa

đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã truyền thụ các kiến thức và tạo mọi điều kiện

thuận lợi trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Bộ môn Kỹ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp về sự giúp đỡ nhiệt tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Hà Nội, ngày 19 tháng 11 năm 2014

Học viên

Nguyễn Thị Liễu

II

KÝ HIỆU VIẾT TẮT

BAP: 6-benzylaminopurin

CaMV: Virus khảm súp lơ (Cauliflower Mosaic Virus)

Car: Carbenicillin

FAO: Tổ chức lương thực và Nông nghiệp (Food and Agriculture

Organization) GA3: Gibberellic acid

GFP: Green Fluorescent Protein

GMC: Cây trồng biến đổi gen (Genetically modified crop)

GMO: Sinh vật biến đổi gen (Genetically modified origanism)

GUS: β-1,4-Glucuronidase

IAA: Indoleacetic acid

IBA: Indole-3-butyric acid

ISAAA: Tổ chức quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học

(International Services for the Acquisition of Agri-Biotech Application)

LB: Luria Bertani

L-Cys: L-Cystein

MS-B5: Môi trường Murashige and Skoog có bổ sung vitamin B5

α-NAA: α-Napthalene acetic acid

nptII: Neomycin Phosphotransferase II

PCR: Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction)

T-DNA: Transfer-DNA

Ti-plasmid: Tumor-including Plasmid

TAE: Tris - acetate - EDTA

USDA: Bộ Nông nghiệp Mỹ (The United States Department of Agriculture) Vir: Virulence

III

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây Error!

Bookmark not defined

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam những năm gần đây Error!

Bookmark not defined

Bảng 1.3 Hệ thống các gen chọn lọc (selectable marker genes) và các gen chỉ thị

(screenable marker genes) Error! Bookmark not defined

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của H2O2 đến khả năng khử trùng của hạt giống đậu tương

DT2008 và giống ĐT26 39

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP và IBA lên khả năng tạo cụm chồi từ lá mầm Error!

Bookmark not defined

Bảng 3.3 Khả năng kéo dài chồi của hai giống đậu tương DT2008 và ĐT26 Error!

Bookmark not defined

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ giống đậu tương DT2008

Error! Bookmark not defined

Bảng 3.5.Biểu hiện tạm thời của gen gus khi lây nhiễm các chủng Agrobacterium

khác nhau với nốt lá mầm giống đậu tương DT2008 và ĐT26 Error! Bookmark not defined

Bảng 3.6 Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ dung dịch vi khuẩn

(OD600) đến khả năng biểu hiện gen gus của DT2008 và ĐT26 50

Bảng 3.7 Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp đối với giống

đậu tương DT2008, ĐT26 Error! Bookmark not defined

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến biểu hiện tạm thời của gen gus

Error! Bookmark not defined

Bảng 3.9 Hiệu quả ức chế vi khuẩn A.tumefaciens và ảnh hưởng của tổ hợp kháng

sinh cefotaxim và vancomycin đến khả năng tái sinh của hai giống ĐT26

và DT2008 Error! Bookmark not defined

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của kháng sinh kanamycin đến khả năng tái sinh của mẫu lá

mầm giống đậu tương DT2008 và ĐT26 Error! Bookmark not defined

IV

V

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc Ti-plasmid Error! Bookmark not defined Hình 1.2 Cấu trúc T-DNA Error! Bookmark not defined Hình 1.3 Quá trình chuyển gen vào thực vật Error! Bookmark not defined Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp Error! Bookmark not defined Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc vector nhị phân Error! Bookmark not defined Hình 1.6 Cấu trúc chung của vector pCAMBIA Error! Bookmark not defined

Hình 1.7 Đột biến xảy ra trong EPSP-synthase làm cho cây kháng thuốc diệt cỏ

glyphosate Error! Bookmark not defined

Hình 2.1 Vector pCAMBIA2300 mang gen CP4-EPSPSError! Bookmark not

defined

Hình 3.1 Hình ảnh khử trùng đậu tương bằng H2O2 ở nồng độ 15% trong thời gian

10 phút 40 Hình 3.2 Hình ảnh cụm chồi trên môi trường có bổ sung tổ hợp 2mg/l BAP +

0,1mg/l IBA sau 3 tuần, 6 tuần và 9 tuần nuôi cấyError! Bookmark not defined

Hình 3.3 Hình ảnh kéo dài chồi đậu tương sau 3 tuần nuôi cấy 44 Hình 3.4 Hình ảnh ra rễ của cây đậu tương trên môi trường bổ sung 0,5 mg/l

α-NAA……….…………46 Hình 3.5 Sơ đồ quy trình tái sinh hai giống đậu tương DT2008 và ĐT26….…….47

Hình 3.6 Biểu hiện tạm thời của gen gus trên đậu tương DT2008 sau lây khi nhiễm

với các chủng khuẩn Error! Bookmark not defined

Hình 3.7 Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ của dung dịch vi

khuẩn đến khả năng biểu hiện gen gus của hai giống đậu tương DT2008

và ĐT26 50

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến sự biểu hiện tạm thời của gen gus

trên cây đậu tương DT2008 và ĐT26 Error! Bookmark not defined Hình 3.9 Các mẫu giống đậu tương trên môi trường đồng nuôi cấy Error!

Bookmark not defined

VI

Hình 3.10 Các mẫu đậu tương ở công thức đối chứng (A, B), giống DT2008, ĐT26

sau khi rửa khuẩn (C, D) và trên môi trường chọn lọc sau 2 tuần nuôi cấy

(E, G) Error! Bookmark not defined

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến khả năng tái sinh chồi từ lá

mầm của giống đậu tương DT2008 Error! Bookmark not defined

Hình 3.12 Sơ đồ quy trình chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ CP4-EPSPS thông qua vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens 60 Hình 3.13 Một số hình ảnh quy trình chuyển gen CP4-EPSPS vào cây đậu tương

thông qua vi khuẩn Agrobacterium Error! Bookmark not defined

Hình 3.14 Sản phẩm điện di phản ứng PCR nhân gen CP4-EPSPS từ mẫu DNA

genome của các cây đậu tương DT2008 đã biến nạpError! Bookmark not defined

Hình 3.15 Sản phẩm điện di phản ứng PCR nhân gen CP4-EPSPS từ mẫu DNA

genome của các cây đậu tương ĐT26 đã biến nạpError! Bookmark not defined

VII

MỤC LỤC

MỞ

ĐẦU

Error! Bookmark not defined

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 1.1 Giới thiệu chung về đậu tương Error! Bookmark not defined 1.1.1 Nguồn gốc Error! Bookmark not defined 1.1.2 Phân loại Error! Bookmark not defined 1.1.3 Vai trò của đậu tương Error! Bookmark not defined 1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam Error! Bookmark not defined

1.1.4.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giớiError! Bookmark not defined

1 1.4.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt NamError! Bookmark not defined

1.2 Tổng quan về cây trồng chuyển gen và đậu tương chuyển gen trên thế giới và

ở Việt Nam Error! Bookmark not defined 1.2.1 Tổng quan về cây trồng chuyển gen trên thế giới và Việt Nam Error! Bookmark not defined

1.2.2 Tổng quan về cây đậu tương chuyển gen trên thế giới và Việt NamError! Bookmark not defined

1.3 Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào trong việc xây dựng hệ thống tái sinh trên cây

đậu tương Error! Bookmark not defined

VIII

1.4 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển T-DNA của vi

khuẩn vào tế bào thực vật Error! Bookmark not defined

1.4.1 Khái quát chung về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Error!

Bookmark not defined

1.4.2 Ti-plasmid Error! Bookmark not defined

1.4.3 Quá trình vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chuyển T-DNA vào tế

bào thực vật trong tự nhiên Error! Bookmark not defined

1.5 Quá trình chuyển gen thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens Error!

Bookmark not defined

1.5.1 Khái quát chung về chuyển gen thực vật Error! Bookmark not defined

1.5.2 Hệ thống vector chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens Error! Bookmark not defined

1.5.3 Các gen chọn lọc và gen chỉ thị Error! Bookmark not defined

1.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens

Error! Bookmark not defined

1.6 Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate trên cây đậu tương

Error! Bookmark not defined 1.6.1 Cơ chế kháng glyphosate Error! Bookmark not defined 1.6.2 Đậu tương chuyển gen kháng glyphosate Error! Bookmark not defined 1.7 Phương pháp PCR và việc xác định cây chuyển genError! Bookmark not defined

1.7.1 Kỹ thuật PCR và các yếu tố cần thiết Error! Bookmark not defined 1.7.2 Xác định sự có mặt của gen được chuyển bằng kỹ thuật PCR Error! Bookmark not defined

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark

not defined

2.1 Vật liệu nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Vật liệu thực vật Error! Bookmark not defined 2.1.2 Vật liệu vi khuẩn Error! Bookmark not defined

IX

2.2 Hóa chất thiết bị Error! Bookmark not defined 2.2.1 Hóa chất và môi trường Error! Bookmark not defined 2.2.2 Các thiết bị thí nghiệm Error! Bookmark not defined 2.3 Địa điểm và thời gian tiến hành Error! Bookmark not defined

2.3.1 Địa điểm……….28

2.3.2 Thời gian tiến hành Error! Bookmark not defined 2.4 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.5 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Xây dựng quy trình tái sinh cây đậu tương Error! Bookmark not defined

3.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của H2O2 đến khả năng khử trùng hạt

Error! Bookmark not defined

3.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng tạo

chồi từ lá mầm và nốt lá mầm của các giống đậu tương nghiên cứu Error! Bookmark not defined

3.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của

các giống đậu tương nghiên cứu Error! Bookmark not defined

3.1.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng hình thành rễ

của các giống đậu tương nghiên cứu Error! Bookmark not defined

3.2 Tối ưu hóa quá trình chuyển gen và xây dựng quy trình chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào hai giống đậu tương DT2008 và ĐT26 thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens Error! Bookmark not defined

3.2.1 Kết quả nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn Agrobacterrium

tumefaciens phù hợp để chuyển gen CP4-EPSPS vào giống đậu tương DT2008,

ĐT26 Error! Bookmark not defined

3.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ dung dịch vi khuẩn (OD) đến

hiệu quả chuyển gen vào giống DT2008 và ĐT26Error! Bookmark not defined

X

3.2.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens đến hiệu quả chuyển gen trên giống đậu tương DT2008, ĐT26

Error! Bookmark not defined

3.2.4 Kết quả nghiên cứ u ảnh hưởng của thời gian đ ồng nuôi cấy đến hiệu quả

chuyển gen vào DT2008 và ĐT26 Error! Bookmark not defined

3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp kháng sinh cefotaxim và vancomycin

đến hiệu quả ức chế vi khuẩn Error! Bookmark not defined

3.2.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến sức sống và

khả năng tái sinh của mẫu lá mầm giống DT2008 và ĐT26Error! Bookmark not defined

3.3 Kiểm tra sự có mặt của gen CP4-EPSPS ở các mẫu đậu tương DT2008 và ĐT26

đã biến nạp Error! Bookmark not defined

3.3.1 Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen CP4-EPSPS ở các mẫu đậu tương

DT2008 đã biến nạp Error! Bookmark not defined

3.3.2 Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen CP4-EPSPS ở các mẫu đậu tương

ĐT26 đã biến nạp Error! Bookmark not defined Chương IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Error! Bookmark not defined

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 PHỤ LỤC 7

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1 Đái Duy Ban, Lữ Thị Cẩm Vân (1994), Công nghệ gen và công nghệ sinh học ứng dụng trong nông nghiệp hiện đại, NXB Nông nghiệp, tr 11-22

2 Báo cáo tóm tắt số 39-2008 của ISAAA (2008), “Hiện trạng cây trồng CNSH/cây trồng chuyển gen trên toàn cầu năm 2008”, http://agbiotech.com.vn/

3 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr 62-78

4 Nguyễn Đức Doanh (1998), “Tổng quan về cây chuyển gen từ 1986- 1997” Báo cáo Hội nghị toàn quốc lần thứ nhất về công nghệ sinh học cây lúa, Huế, tháng

5/1998

5 Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen (động vật, thực vật), NXB Đại học Huế, tr 117-120

6 Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây Đậu tương, NXB Nông Nghiệp Hà Nội, tr

3-8

7 Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2003), “Tạo cây Hông

(Paulownia fortunei) chuyển gen kháng sâu thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2003, tr 1088-1090

8 Phạm Thị Hạnh, Lê tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2005), Khảo sát khả năng tái sinh cây cải ngọt (Brassica integrifolia) từ lá mầm và trụ mầm phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, tr

498-450

9 Nguyễn Thị Lan Hoa, Doãn Thị Hòa, Đặng Trọng Lương, Vũ Đức Quang, Phí Công Nguyên, Đặng Thị Minh Trang, Đỗ Minh Huy (2003), “Những kết quả ban

đầu chuyển gen Anti-ACO vào cây hoa cúc”, Thông tin công nghệ sinh học ứng dụng, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn-Viện Di truyền Nông nghiệp,

2+3/2003, tr 20-26

10 Trần Thị Cúc Hòa (2008), “Hiệu quả tạo dòng đậu tương biến đổi gen từ giống MTĐ 176, KL202, Maverick và William 82 bằng phương pháp nốt lá mầm qua

trung gian Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 1, tr 14-19

11 Trần Thị Cúc Hòa (2008),“Tối ưu hóa quá trình chuyển gen đậu tương

bằng cải tiến phương pháp lây nhiễm với Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 9, tr 8-11

12 Phạm Xuân Hội, Trần Duy Quý (2002), “Công nghệ gen trong việc tăng sản

lượng lúa”, Thông tin công nghệ sinh học ứng dụng, Bộ Nông nghiệp và Phát triển

nông thôn - Viện Di truyền Nông nghiệp, 3+4/2002, tr 1-10

13 Lê Thị Ánh Hồng (2000), Cơ sở khoa học công nghệ chuyển gen ở thực vật,

NXB Nông Nghiệp, tr 51- 84

14 Lê Thị Thu Hiền (2003), Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện khoa

học và Công nghệ Việt Nam

15 Nguyễn Thị Thuý Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng

Mậu (2009), “ Phát triển hệ thống tái sinh in vitro ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merill) phục vụ chuyển gen”, Tạp chí khoa học & công nghệ, 52(4), tr 89-93

16 Trần Bích Lan, Nguyễn Đức Doanh, Nguyễn Lan Hương, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (1998),“Kết quả bước đầu nghiên cứu chuyển gen vào giống lúa trồng ở

Việt Nam qua Agrobacterium tumefaciens”, Báo cáo hội nghị toàn quốc về công nghệ sinh học cây lúa, Huế, tháng 5/1998

17 Đặng Trọng Lương, Vũ Đức Quang, Nguyễn Đức Doanh, Nguyễn Hữu Đống

(2000), “Nghiên cứu chuyển gen CryIAc kháng sâu vào một số giống cải bắp”, Kết quả nghiên cứu khoa học 1999 – 2000, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, tr 120-128

18 Lã Tuấn Nghĩa, Trần Lan Hương, Nguyễn Đức Doanh, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (1995), “Bước đầu nghiên cứu chuyển gen vào cà chua qua

Agrobacterium”, Tạp chí công nghệ sinh học ứng dụng, 2, tr 18-23

19 Đỗ Tiến Phát, Đinh Thị Phòng, Chu Hoàng Hà (2008), “Đánh giá ảnh hưởng

của thời gian nhiễm khuẩn tới hiệu quả chuyển gen vào cây bông (Gossypium hirsutum L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí công nghệ sinh học,

6(4A), tr 689-695