Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease của HIV 1 trên nấm men pichia pastoris

MỞ ĐẦU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đặng Thị Thanh Nhàn NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE CỦA HIV-1 TRÊN NẤM MEN PICHIA PASTORIS LUẬN VĂN THẠC SỸ KH

MỞ ĐẦU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Đặng Thị Thanh Nhàn

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE CỦA HIV-1 TRÊN

NẤM MEN PICHIA PASTORIS

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội, 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đặng Thị Thanh Nhàn

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE

CỦA HIV-1 TRÊN NẤM MEN PICHIA PASTORIS

Chuyên nghành: Di truyền học

Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Đinh Nho Thái

TS Nguyễn Thị Hồng Loan

Hà Nội, 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đinh Nho Thái,

người thầy đã tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thí nghiệm và viết luận văn Thầy đã không ngại khó khăn hướng dẫn, giúp đỡ tôi làm quen từ những nguyên tắc và thao tác đầu tiên trong nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Hồng Loan, đã tận tình hướng

dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này

Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các cán bộ, thành viên trong nhóm nghiên cứu tại bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học

và phòng protein tái tổ hợp, phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzym và protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN Tôi xin chân thành cảm ơn

về sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo trong bộ môn Di truyền học cũng như các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN

đã giảng dạy và chỉ bảo cho tôi những kiến thức và kỹ năng cần thiết trong quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp

Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo cùng các đồng nghiệp tại Trường THPT Nguyễn Du, Thanh Oai, HN, đã ủng hộ, tạo điều kiện cho tôi trong thời gian học tập vừa qua

Lời cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, chồng, con, những người thân trong gia đình tôi đã chia sẻ, động viên và hết lòng giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học viên:

Đặng Thị Thanh Nhàn

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED

1.1.TỔNGQUANVỀAIDSVÀHIV E RROR ! B OOKMARK NOT DEFINED 1.1.1 Lịch sử hình thành AIDS Error! Bookmark not defined 1.1.2 Thực trạng nhiễm HIV-1 Error! Bookmark not defined 1.1.3 Cấu trúc hình thể và hệ gen của HIV-1 Error! Bookmark not defined 1.1.4 Các thuốc điều trị HIV/AIDS hiện nay Error! Bookmark not defined

1.2.TỔNGQUANVỀPROTEASEHIV-1 E RROR ! B OOKMARK NOT DEFINED 1.2.1 Protease HIV-1 Error! Bookmark not defined 1.2.2 Chức năng của protease HIV – 1 Error! Bookmark not defined 1.2.3 Sơ lược về nghiên cứu biểu hiện protease HIV-1 trên thế giới Error! Bookmark not defined.

1.2.4 Thực trạng sản xuất protease HIV-1 ở Việt NamError! Bookmark not defined.

1.3.GIỚITHIỆUCHUNGVỀ P.PASTORIS ERROR ! B OOKMARK NOT DEFINED

1.3.1 Đặc điểm của P pastoris Error! Bookmark not defined 1.3.2 Ưu nhược điểm của hệ thống biểu hiện P pastorisError! Bookmark not

defined.

1.3.3 Chủng nấm men P pastoris biểu hiện protease HIV-1Error! Bookmark

not defined.

1.3.4 Vector nhân dòng và biểu hiện ở P pastorisError! Bookmark not defined.

1.3.5 Cơ chế sát nhập gen ngoại lai vào hệ gen P pastorisError! Bookmark

not defined.

1.3.6 Quá trình tiết protein ngoại bào ở P pastorisError! Bookmark not defined.

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1.NGUYÊNLIỆU E RROR ! B OOKMARK NOT DEFINED

2.1.1 Chủng vi sinh vật Error! Bookmark not defined 2.1.2 Các hóa chất, nguyên liệu khác Error! Bookmark not defined

2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU E RROR ! B OOKMARK NOT DEFINED 2.2.1 Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng kỹ thuật PCR Error! Bookmark not defined.

2.2.2 Điện di DNA trên gel agarose Error! Bookmark not defined 2.2.3 Gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện: Error! Bookmark not defined.

2.2.4 Tách chiết và định lượng DNA plasmid Error! Bookmark not defined 2.2.5 Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1Error! Bookmark not defined.

2.2.6 Biến nạp vector vào nấm men bằng phương pháp xung điện Error! Bookmark not defined.

2.2.7 Điện di protein trên gel polyacyamide (SDS-PAGE)Error! Bookmark not defined.

2.2.8 Thẩm tách miễn dịch (Western Blotting) Error! Bookmark not defined.

2.2.9 Phương pháp biểu hiện và thu nhận protein 35 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………37 3.1.NHÂNDÒNGĐOẠNGENMÃHÓAPROTEASEHIV-1 E RROR !

3.1.1 Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCRError! Bookmark not defined.

3.1.2 Tinh sạch plasmid pPIC9 từ E coli Error! Bookmark not defined

3.1.3 Cắt sản phẩm PCR và cắt mở vòng plasmid bằng enzym giới hạn Error! Bookmark not defined.

3.1.4 Tạo vector tái tổ hợp pPIC9 chứa gen mã hóa protease HIV-1 bằng phản

ứng ligase Error! Bookmark not defined

3.1.5 Kết quả giải trình tự xác định sự có mặt của protease HIV-1 trong vector

biểu hiện pPIC9 Error! Bookmark not defined

3.2.TẠODÒNGVÀBIỂUHIỆNGENMÃHÓAPROTEASEHIV-1TRÊN P.

PASTORIS .ERROR ! B OOKMARK NOT DEFINED

3.2.1 Tạo dòng nấm men P pastoris có chứa plasmid tái tổ hợp mang gen mã

hóa protease HIV-1 Error! Bookmark not defined

3.2.2 Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 trên P pastoris Error!

Bookmark not defined.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED

1.KẾTLUẬN E RROR ! B OOKMARK NOT DEFINED

2.KIẾNNGHỊ E RROR ! B OOKMARK NOT DEFINED

TÀI LIỆU THAM KHẢO 3

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Cấu trúc của một hạt virus HIV-1 6

Hình 2 Cấu tạo của hệ gen virus HIV-1. 7

Hình 3 Mô hình cấu trúc bậc hai của protease HIV-1 12

Hình 4 Bản đồ vector biểu hiện pPIC9 .21

Hình 5 Cơ chế trao đổi chéo xảy ra tại locus HIS4 giữa bộ gen của tế bào với vector biểu hiện 22

Hình 6 Kết quả nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng

PCR Error! Bookmark not defined.

Hình 7 Điện di sản phẩm tách chiết

plasmid Error! Bookmark not defined.

Hình 8 Điện di sản phẩm cắt mở vòng plasmid và sản phẩm PCR bằng các enzym

giới hạn NotI và

EcoRI Error! Bookmark

not defined.

Hình 9 Điện di sản phẩm PCR của các khuẩn lạc E coli

DH5α Error! Bookmark not defined.

Hình 10 So sánh trình tự cấu trúc Prot trên khuẩn lạcvới cấu trúc Prot lý

thuyết Error! Bookmark not defined.

Hình 11 Sự hình thành khuẩn lạc trên P pastoris

SMD1168 Error! Bookmark not defined.

Hình 12 Sản phẩm PCR khuẩn lạc thu đƣợc sau biến nạp vector tái tổ hợp vào nấm

men E rror! Bookmark not defined.

Hình 13 Đường cong sinh trưởng của các chủng P pastoris SMD1168 sau khi biểu

hiện ở môi trường có chứa 0.5% methanol theo thời

gian………Error! Bookmark not defined.

Hình 14 Điện di SDS-PAGE kiểm tra sự có mặt của protease HIV-1 trong chủng

tái tổ hợp

SMD1168 Error! Bookmark not defined.

Hình 15 Kết quả kiểm tra protein bằng thẩm tách miễn dịch Western

Blot Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Một số chủng P pastoris phổ biến được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ

hợp Er ror! Bookmark not defined

Bảng 2 Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng

PCR Error! Bookmark not defined

Bảng 3 Thành phần phản ứng

PCR Error! Bookmark not defined Bảng 4 Thành phần phản ứng cắt enzym giới

hạn Error! Bookmark not defined

Bảng 5 Thành phần gel tách và gel cô trong SDS-PAGE

Error! Bookmark not defined

Bảng 6 Khả năng sinh trưởng của các dòng nấm men tái tổ hợp thông qua chỉ số

OD600 theo thời gian lên men, lặp lại thí nghiệm 3

lần Error! Bookmark not defined

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AIDS

ART

AOX

Amp

BMGY

Bp

DNA

ddNTP

E coli

HIV

HIS:

KLPT

kb

kDa

LB

mRNA

MM:

P pastoris

PCR

PI

RNA

SDS

SDS-PAGE:

UNAIDS

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immuno Deficiency Syndrome) Liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus(Antiretroviral drug therapy) Alcohol oxidase

Ampicillin Buffered Minimal Glycerol Yeast Base pair

Axit deoxyribonucleic dideoxyribonucleotide – triphosphate

Escherichia coli

Virus gây suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency virus) Histidine

Khối lượng phân tử

Kilobase Kilo Dalton Luria-Bertani RNA thông tin (Messenger RNA) Môi trường Minimal Methanol

Pichia pastoris

Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase Chain Reaction) Chất ức chế protease (Protease Inlibitor)

Axit ribonucleic Sodium dodecyl sunfat phương pháp điện di trên gel polyacrylamid có SDS (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)

Chương trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc ( United Nation Program on HIV/AIDS)

1

MỞ ĐẦU

Virus gây suy giảm miễm dịch ở người (Human Immuno Deficiency Virus- HIV) là nguyên nhân chính gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người (AIDS) Đây là một trong các bệnh đã làm nhiều người chết nhất trong lịch

sử loài người [49] Có hai type HIV gây nên AIDS là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV - 2), nhưng HIV-1 độc hơn HIV-2 và là nguyên nhân chính của các ca nhiễm HIV trên toàn thế giới từ khi xuất hiện cho tới nay [28]

Để tồn tại và phát triển, HIV-1 cần đến 3 enzym quan trọng không thể thiếu trong sao chép, đóng gói và hình thành virus hoàn chỉnh đó là: enzym phiên mã ngược reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease Nếu một trong ba enzym này bị ức chế chu kì sống của HIV sẽ bị ảnh hưởng, chính vì vậy hướng nghiên cứu tìm ra chất ức chế các enzym trên để sản xuất thuốc điều trị cho các bệnh nhân AIDS đã được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm Các điều trị theo hướng sử dụng chất ức chế 3 enzym đó gọi là liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus ART (antiretroviral drug therapy) [28]

Enzym protease của HIV-1 (được gọi tắt là protease HIV-1) được mã hoá bởi

gen pol của virus có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag – pol) thành các

protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus có thể tiếp tục lây nhiễm Nếu protease bị mất hoạt tính, HIV-1 sẽ không được đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh [19] Tuy nhiên, do HIV-1 có tốc độ sinh sản nhanh, có khoảng 10 triệu hạt virus mới được tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót của enzym reverse transcriptase là 1/10.000 base dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm bệnh thậm chí khi chưa điều trị Ngày càng có nhiều chất ức chế protease (PI) chống HIV được phát triển và thương mại hóa nhưng vẫn chưa tìm được chất ức chế nào thực sự có hiệu quả Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra chất ức chế protease một cách hiệu quả là nhiệm vụ quan trọng góp phần đẩy lùi HIV/AIDS Quá trình nghiên cứu nhằm tìm ra chất ức chế protease này cần một lượng lớn protease nên việc sản xuất, tinh sạch protease HIV-1 là rất cần thiết

2

Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 trên toàn thế giới Trong thực tế nghiên cứu, protease HIV-1 không dễ dàng biểu hiện trong tế bào vật chủ do đặc tính gây độc tế bào, khó tan, lượng protease thu được sau biểu hiện thường thấp, khó phát hiện Do đó, cần có những nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 có tính tan và hiệu quả hơn

Phần lớn các công trình nghiên cứu sản xuất protease HIV-1 ở Escherichia

coli (E coli), vì đây là hệ thống biểu hiện đơn giản, dễ nuôi cấy [3; 18; 41] Tuy

nhiên, E coli là một sinh vật nhân sơ và thiếu các cơ quan nội bào chẳng hạn như

mạng lưới nội chất và bộ máy golgi như trong sinh vật nhân chuẩn (có chức năng cải biến protein sau tổng hợp) Nhiều protein của sinh vật nhân chuẩn khi biểu hiện

ở E coli không tạo thành dạng protein hoàn chỉnh có chức năng bởi những cải biến

sau dịch mã không diễn ra Hạn chế này được khắc phục bằng cách sử dụng các hệ thống biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn như nấm men và động vật có vú Nấm men

có cấu trúc đơn giản, nhưng chúng mang đầy đủ các đặc điểm của một cơ thể và là một mô hình tiêu biểu cho cấu trúc tế bào nhân chuẩn Nhiều protein của tế bào

nhân thực đã được sản xuất thành công bằng hệ thống biểu hiện nấm men

Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae) [10] Ngoài S cerevisiae, nấm men Pichia pastoris (P pastoris) cũng bắt đầu được quan tâm sử dụng để biểu hiện protein của

sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt từ khi promoter alcohol oxidase được phân lập và tạo

dòng P pastoris còn là hệ thống biểu hiện đáng tin cậy và có tiềm năng hơn E coli hay S cerevisiae để sản xuất protein ngoại lai dạng hòa tan [27].

Để tạo ra chế phẩm protease HIV-1 nhằm phát triển chất ức chế sự nhân lên của virus HIV-1, làm cơ sở cho việc nghiên cứu tìm ra thuốc điều trị HIV/AIDS,

cùng với thuận lợi của hệ thống biểu hiện của nấm men P pastoris so với E coli,

chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa

protease của HIV-1 trên nấm men P pastoris” với các nội dung:

- Nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện

- Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa protease HIV-1 trên nấm men P

pastoris

3

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I Tài liệu Tiếng Việt

1 Phan Trọng Hoàng, Ngô Văn Trường, Lê Văn sơn, Lê Trần Bình, Chu Hoàng

Hà (2007) “Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa tiểu đơn vị p66 của enzym

phiên mã ngược của virus HIV-1”, Tạp chí khoa học Công nghệ Sinh học, 5,

tr 463-470

2 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thành Hổ, Chương 20 – Di truyền học vi sinh vật

học, giáo trình Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Việt Nam

3 Nguyễn Thị Hồng Loan (2012), Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số

tính chất của protease từ HIV-1 tại Việt Nam, Luận án Tiến sỹ Sinh học,

Trường Đại học khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

4 Đỗ Thị Hồng (2005), Nghiên cứu biểu hiện vùng gen pre M- env của virus Dengue typ 2 trong nấm men Pichia pastoris, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh

học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

5 Phan Tuấn Nghĩa (2012), Hóa sinh học thực nghiệm, giáo trình, NXB Giáo

dục Việt Nam, tr 91-109

6 Phạm Đức Minh, Đặng Xuân Kiên, Trần Văn Tuấn, Trần thị Oanh, Lê Bách

Quang, (2013), “Đặc điểm phân bố các subtyp HIV-1 tại Việt nam”, tạp chí

Y-Dược học quân sự (số 5-2013) tr 33-40

7 Đồng Văn Quyền, Hoàng Anh, Bạch Thị Như Quỳnh, Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thanh Tùng, Lê Thị Tâm, Đinh Duy Kháng (2008), “Tách dòng và biểu hiện gen p24 từ chủng HIV lưu hành ở Việt Nam và nghiên cứu phản ứng của protein tái tổ hợp với kháng thể HIV trong huyết thanh bệnh nhân”,

Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6, tr 27-34

8 Bạch Thị Như Quỳnh, Vũ Thị Hiền, Hà Thị Thu, Nguyễn Phương Hoa, Lê Phương Hằng, Nguyễn Thanh Tùng, Nguyễn Xuân Bắc, Đồng Văn Quyền,

Lê Văn Phủng, Đinh Duy Kháng (2011), “ Biểu hiện protein GP41 của virus

HIV phân type CRF01_ AE trong E coli ứng dụng để phát hiện kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân bằng Western blot và ELISA”, Tạp

chí Công nghệ Sinh học, 9, tr 29-36