Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen mã hóa protein ESAT6 CFP10 phục vụ việc chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- HÀ THỊ HIÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ESAT6/CFP10 PHỤC VỤ VIỆC CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

HÀ THỊ HIÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ESAT6/CFP10 PHỤC VỤ VIỆC CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN NHIỄM LAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

HÀ THỊ HIÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ESAT6/CFP10 PHỤC VỤ VIỆC CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN NHIỄM LAO

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN THÁI SƠN PGS.TS NGÔ TỰ THÀNH

Hà Nội – Năm 2014

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thái Sơn- người thầy đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn PGS.TS Ngô Tự Thành đã giúp đỡ và thông qua cho tôi luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy, cô trong bộ môn Vi sinh vật học, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích trong suốt quá trình tôi học tập tại trường

Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tập thể phòng Sinh học phân tử-Khoa Miễn dịch và sinh học phân tử- Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin được cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa học này

Hà Nội, ngày 12 tháng 4 năm 2014

Học viên

Hà Thị Hiên

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 8

Chương 1: TỔNG QUAN Error! Bookmark not defined 1.1 KHÁI QUÁT VỀ BỆNH LAO Error! Bookmark not defined 1.4 VI KHUẨN LAO Error! Bookmark not defined 1.4.1 Đặc điểm phân loại Error! Bookmark not defined 1.4.2 Đặc điểm hình thái Error! Bookmark not defined 1.4.3 Cấu trúc thành tế bào Error! Bookmark not defined 1.4.4 Đặc điểm nuôi cấy Error! Bookmark not defined 1.4.4.1 Môi trường và dạng khuẩn lạc Error! Bookmark not defined 1.4.4.2 Chu kì tế bào Error! Bookmark not defined 1.4.5 Khả năng gây bệnh Error! Bookmark not defined 1.4.6 Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao Error! Bookmark not defined

1.4.6.1 Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosisError! Bookmark not

defined

1.4.6.2 Đặc điểm di truyền của vùng gene biệt hóa RD1.Error! Bookmark not defined

1.5 PROTEIN ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined 1.5.1 Cấu trúc phân tử của phức hệ protein ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined

1.5.2 Kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6-CFP10 và tiềm năng ứng dụng Error! Bookmark not defined

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.3 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined

2.4 PHƯƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.4.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử Error! Bookmark not defined 2.4.2.1 Tách chiết ADN Error! Bookmark not defined 2.4.2.2 PCR khuếch đại gen mã hóa protein ESAT6-CFP10 Error! Bookmark not defined

2.4.2.3 Tách dòng gen mã hóa protein ESAT6-CFP10.Error! Bookmark not defined

2.4.2.4 Giải trình tự ADN Error! Bookmark not defined

2.4.2.5 Thiết kế vector tách dòng pGEMT chứa đoạn gen mã hóa protein

CFP10/ESAT6 Error! Bookmark not defined

2.4.2.6 Thiết kế vector biểu hiện pET21a chứa đoạn gen mã hóa protein

CFP10/ESAT6 Error! Bookmark not defined

2.4.2.7 Biểu hiện protein ESAT6-CFP10 trong tế bào vi khuẩn Escherichia

coli chủng BL21(DE3) Error! Bookmark not defined 2.4.2.8 Tinh sạch protein ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Error! Bookmark not defined

3.1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO KHÁNG

NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined 3.1.1 Xác định tính ổn định của gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined

3.1.1.1 Kết quả khuếch đại trình tự gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 của

M.tuberculosis Error! Bookmark not defined 3.1.1.2 Xác định tính ổn định của gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined

3.1.2 Kết quả tách dòng Error! Bookmark not defined

3.1.2.1 Kết quả khuếch đại, nối 2 gen mã hóa protein ESAT6-CFP10 của

M.tuberculosis Error! Bookmark not defined 3.1.2.2 Kết quả tách dòng Error! Bookmark not defined

3.1.2.3 Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen ESAT6-CFP10

Error! Bookmark not defined 3.1.2.3.1 Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen pET21a+ Error! Bookmark not defined

3.1.2.3.2 Gắn đoạn gen đích vào vector biểu hiện pET21a+ Error! Bookmark not defined

3.1.2.3.3 Chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng

PCR-colonies Error! Bookmark not defined

3.2 KẾT QUẢ BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN ESAT6/CFP10

Error! Bookmark not defined

3.2.1 Biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/ESAT6-CFP10 vào E.coli chủng

BL21(DE3) Error! Bookmark not defined 3.2.2 Kiểm tra sự biểu hiện gen CFP10/ESAT6Error! Bookmark not defined

3.2.3 Tối ƣu điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp CFP10-ESAT6 Error! Bookmark not defined

3.2.3.1 Kết quả tối ƣu nhiệt độ cảm ứng Error! Bookmark not defined

3.2.3.2 Kết quả tối ƣu nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng trên

gen CFP10/ESAT6 Error! Bookmark not defined 3.2.4 Tinh sạch protein ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined 3.2.5 Kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm Error! Bookmark not defined 3.2.6 Kết quả kiểm tra protein tái tổ hợp bằng kháng thể đặc hiệu Error! Bookmark not defined

3.2.7 Xác định hoạt tính kháng nguyên Error! Bookmark not defined

KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined

TÀI LIỆU THAM KHẢO 9

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các sinh phẩm hóa chất chính Error! Bookmark not defined Bảng 2.2 Các máy và thiết bị chính Error! Bookmark not defined Bảng 2.3 Các cặp mồi dùng trong nghiên cứuError! Bookmark not defined

Bảng 3.1 Mức độ tương đồng của gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 từ các

chủng vi khuẩn lao Việt Nam so sánh với chủng chuẩn H37Rv Error! Bookmark not defined

Bảng 3.2 Mức độ biểu hiện CFP10/ESAT6 tại các điều kiện khác nhau.

Error! Bookmark not defined Bảng 3.3 Nồng độ độc tố trong sản phẩm Error! Bookmark not defined Bảng 3.4 Đáp ứng với các nồng độ kháng nguyên khác nhau Error! Bookmark not defined

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Vi khuẩn lao M tuberculosis trên kính hiển vi điện tử [57] Error!

Bookmark not defined.

Hình 1.2 Trực khuẩn M tuberculosis sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen [57].

Error! Bookmark not defined Hình 1.3 Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn lao [72].Error! Bookmark not defined.

Hình 1.4 Khuẩn lạc M tuberculosis trên môi trường Lowenstein - Jensen

Error! Bookmark not defined Hình 1.5 Vùng gen RD [31] Error! Bookmark not defined Hình 1.6 Mô phỏng cấu trúc của phức hệ protein ESAT6/CFP10 [49] Error! Bookmark not defined.

Hình 3.1 Kết quả khuếch đại gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.2 Kết quả khuếch đại gene mã hóa protein CFP10 và ESAT6 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.3 Khuẩn lạc sau khi biến nạp plasmid.Error! Bookmark not defined.

Hình 3.4 Sản phẩm PCR được khuếch đại trên các plasmid tái tổ hợp, sử

dụng cặp mồi P1, P4 Error! Bookmark not defined Hình 3.5 Kết quả mở vòng pET21a+ và pGEMT/ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.6 Trình tự khung đọc mở mã hóa protein CFP10/ESAT6 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.7 Kết quả kiểm tra khuẩn lạc chứa pET21a+/CFP10-ESAT6 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.8 Kết quả kiểm tra protein đích trên gel SDS.Error! Bookmark not defined.

Hình 3.9 Kết quả cảm ứng ở điều kiện nhiệt độ khác nhau.Error! Bookmark not defined.

Hình 3.10 Kết quả tinh sạch protein tái tổ hợp.Error! Bookmark not defined.

Hình 3.11: Westerm blot trên Error! Bookmark not defined Hình 3.12: Westerm blot Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

BCG Bacillus Calmette-Guérin

(Cặp bazo) CFP10 Culture Filtetrate Protein 10

CTCLQG Chương trình chống lao Quốc gia

DNA Deoxyribonucleotide acid

ESAT6 Early Secretory Antigenic Target 6

INF γ Interferon gamma

IS Insert sequence

(Trình tự chèn) MDR Multi drug resistant

(Chủng lao đa kháng thuốc) ORF Open reading frame

(Khung đọc mở) PCR Polymerase chain reaction

(Phản ứng chuỗi polymerase) RD1 Region deletion 1

RFLP Restriction fragment length polymorphisms

(Đa hình độ dài đoạn cắt bởi enzym giới hạn)

TST Tuberculin Skin Test

(Phản ứng quá mẫn muộn với tuberculin) WHO World Health Organization

(Tổ chức Y tế Thế Giới) XDR Extensively drug resistant

(Chủng lao kháng thuốc tuyệt đối)

MỞ ĐẦU

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới Hàng năm có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và có khoảng 3 triệu người chết vì lao [6] Tuy nhiên, theo ước tính tỷ lệ phát hiện bệnh chỉ đạt 37% Như vậy số bệnh nhân mắc lao nhưng không được phát hiện và chữa trị kịp thời chiếm đến 63%, đây sẽ là nguồn lây nhiễm rất khó kiểm soát

Việt Nam là 1 trong 22 nước có tỉ lệ nhiễm lao cao trên thế giới Tính riêng khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ 3, chỉ sau Trung Quốc và Philipine [6, 70 ] Điều này đồng nghĩa với việc Việt Nam đang phải đối mặt với nguy cơ lây nhiễm lao trong cộng đồng mà một trong những nguyên nhân chính là do lây nhiễm lao trước chẩn đoán Số người mắc mới bệnh lao ngày càng tăng, số người không được phát hiện, điều trị càng nhiều sẽ là nguồn lây nhiễm đến cộng đồng Mặt khác, trong số những người mắc được phát hiện, điều trị thì có đến 20% bệnh nhân không khỏi do kháng thuốc làm tăng nguy cơ lây lan nhanh bệnh lao [6]

Trước diễn biến nghiêm trọng đó, WHO đã kêu gọi các quốc gia trên thế giới quan tâm đặc biệt đến phòng chống và kiểm soát bệnh lao Bệnh lao ngày càng trở nên nguy hiểm hơn, đặc biệt là lao kháng đa thuốc gây tử vong rất lớn, vì vậy việc phát hiện và điều trị sớm càng trở nên cần thiết Việc kiểm soát bệnh lao phụ thuộc vào việc chẩn đoán nhanh và chính xác Tuy nhiên việc chẩn đoán còn gặp rất nhiều khó khăn

Trong nhiều thập kỉ nay, phản ứng tuberculin skin test (TST) vẫn được sử dụng để chẩn đoán nhiễm lao Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra TST có độ đặc hiệu thấp đặc biệt trên các đối tượng có chủng ngừa BCG Một phương pháp mới dựa trên đáp ứng miễn dịch tế bào thông qua việc xác định interferon gamma được tiết ra bởi tế bào T khi được kích thích bằng kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn lao đã được chứng minh có

độ đặc hiệu cao hơn TST Hai kháng nguyên 10 Kdal Culture Filtetrate Proteinn (CFP10)

và 6 Kdal Early Secretory Antigenic Target (ESAT6) được mã hóa bởi gen Ihp nằm trên

vùng đặc hiệu RD1 của vi khuẩn lao Vùng RD1 có chiều dài 9,5 kb và có chứa 9 khung đọc mở (ORFs) [36, 55] Những năm gần đây, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng

minh RD1 chỉ quan sát được trên các chủng Mycobacterium tuberculosis, không có mặt trên các chủng BCG và các chủng Mycobacteria trong môi trường [42,49] Do vậy việc

nghiên cứu, ứng dụng gen mã hóa protein ESAT6 và CFP10 trong chẩn đoán lao và có thể phát triển 1 vacxin có hiệu quả bảo vệ cao được coi là một hướng đi mới và đã được nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới [29, 59, 65]

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu quy trình biểu

hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 phục vụ cho việc chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao” Đề tài này thuộc một phần nghiên cứu của nhiệm vụ

Nghị định thư Hoa Kỳ:״ Hợp tác nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm

ELISPOT chẩn đoán nhiễm lao ở quy mô phòng thí nghiệm״

Mục tiêu đề tài:

1 Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10

2 Biểu hiện và tinh sạch protein ESAT6/CFP10 trong tế bào vi khuẩn E coli tạo nguyên liệu chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt

1 Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu sự đáp ứng miễn dịch trong một số thể bệnh lao,

Luận án Tiến sỹ Sinh học

2 Đặng Đức Anh, Hồ Minh Lý, Trần Thị Thanh Hoa, Hoàng Thị Minh Tú, Nguyễn

Thị Nguyệt (2006), ″Giải trình tự và phân tích gen ESAT6 của Mycobacterium

tuberculosis phân lập từ bệnh nhân lao màng não″, Tạp chí Y học dự phòng tập

XVI, số 6(85), tr 14-18

3 Nguyễn Đình Bảng (1992), Vi sinh vật y học, Học viện quân y

4 Bộ Y tế.( 2012), Báo cáo tổng kết chương trình chống lao quốc gia 2012

5 Bộ Y tế (2010), Chiến lược phòng chống lao quốc gia giai đoạn 2011-2015

6 Bộ Y tế, Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2005), Báo cáo tổng kết Chương

trình chống lao quốc gia 2005

7 Lê Huy Chính (2001), Vi sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, Tr 207-214

8 Nguyễn Thị Chính, Trương Thị Hoà (2005), Vi sinh vật Y học, NXB Đại học Quốc gia

Hà Nội

9 Chương Trình Chống Lao Quốc Gia (2011), Báo cáo tổng kết Chương trình Chống lao

Quốc gia năm 2010 và phương hướng hoạt động năm 2011

10 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học,

NXB Giáo dục

11 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2004), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục

12 Phan Thị Thu Hương, Đỗ Quỳnh Nga, Vũ Tân Trào (2005), “Phát hiện

M tuberculosis trong môi trường bệnh viện lao sử dụng kỹ thuật PCR”, Hội

nghị khoa học toàn quốc về công nghệ sinh học, Tháng 12/2005

13 Nguyễn Văn Hưng (2001), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của

Mycobacterium tubeculosis phân lập tại Viện lao và Bệnh phổi, Luận án Tiến sỹ

Y học

14 Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kĩ thuật di truyền và ứng dụng,

NXB Giáo dục

15 Lê Thị Luyến, Bộ Y tế (2007), Tình hình dịch tễ, điều trị, dự phòng và nghiên

cứu Lao tại Việt Nam, Hội thảo về sinh học phân tử về bệnh lao, Đại học Quốc

gia Hà Nội, Tháng 8/2007

16 Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng và điều trị,

NXB Giáo dục

17 Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ, Lê Quốc Tuấn (2007),

“Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình PCR đa mồi (multiplex PCR) dùng trong

chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao” Tạp chí Y học Việt Nam, 337(1), p.27-31

18 Quyền Đình Thi (2005), Công nghệ sinh học, NXB Khoa học kỹ thuật

19 Nguyễn Xuân Triều (2006), “Chẩn đoán lao”, Bài giảng Lao và Bệnh phổi sau đại

học, Học Viện Quân Y

20 Nguyễn Văn Việt (2011), ″Mycobacterium tuberculosis״, Vi sinh y học , NXB Quân

đô ̣i nhân dân, Hà Nội, Tr 228 - 235

Tài liệu tiếng Anh

21 A.S.Mustafa., F Oftung., H.A Amoudy., N.M Madi., A.T Abal., F Shaban., et

al (2000), ″Multiple Epitopes from the Mycobacterium tuberculosis ESAT6

Antigen are recognized by antigen-Specific –Human T Cell Lines″, Clinical

Infectious Diseases, Vol 30, S201-S205

22 Ashtekar M.D and Vidis S.S (1993), ″T lymphocytes in pulmonary tuberculosis,″

Indian J.Med.Res, 97, pp 14-17

23 Barrett-Connor E (1979), "The epidemiology of tuberculosis in physicians," JAMA,

241, pp.33-38

24 Behr MA., Wilson MA., Gill WP., Salamon H., Schoolnik GK., Rane S., et al

(1999), "Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA

microarray," Science 1999, 284(5419), 1520-1523

25 Bluberg H M., Watkins D L., Berschling J.D and Antle A "Moore tuberculosis,"

Ann Internal Med, 122, pp.658-663

26 Brosch R., G.S.V., Marmiesse M and et al (2002), "A new evolutionary scenario

for the Mycobacterium tuberculosis complex," Proc Nalt Acad Sci USA, 99,

3684-3689

27 Capewell S., Leaker AR and Leitch AG (1988), "Pulmonary tuberculosis in health

service staff-is it still a problem," Tubercle, 69, pp 113-118

28 Collins D M , D M Stephens (1991), “Identification of an insertion sequence, IS1081,

in Mycobacterium bovis”, FEMS Microbiol Lett, 15(67), 11-15

29 Cooper M.A., Dalton D and Orme I.M (1993), "Disseminated tuberculosis in

interferon gamma gene-disrupted mice," Jounal of Experimental Medicine 178,

pp.2243-2247

30 Ellner J.J and Wallis R.S (1989), "Immunologic aspects of mycobacterial

infections," Review of Infectious Diseases II, pp.S455-S459

31 F.X Berthet., P.B Rasmussen., I Rosenkrands., P Andersen And B Gicquel